Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
* These authors contributed equally
Bu protokol, sıralı enzimatik sindirim kullanılarak birincil sıçan diz eklem kondrositlerinin izolasyonunu ve kültürünü açıklar. Yöntem, doğrulanmış fenotipik özelliklere sahip kondrositler üreterek araştırmacılara kıkırdak araştırma uygulamaları için güvenilir bir yaklaşım sağlar.
Travma, yaşlanma veya inflamatuar durumlardan kaynaklanan kıkırdak hasarı, dokunun doğası gereği sınırlı rejeneratif kapasitesi nedeniyle önemli bir klinik sorun olmaya devam etmektedir. Kıkırdağın tek hücresel bileşeni olan kondrositler, hücre dışı matris yapısını ve işlevini korumaktan sorumludur, bu da onları kıkırdak fizyolojisini, patolojisini ve rejenerasyonunu anlamak için gerekli kılar. Bu çalışma, primer sıçan eklem kondrositlerinin diz ekleminden izolasyonu, kültürü ve fenotipik doğrulaması için kapsamlı ve standartlaştırılmış bir protokol sunmaktadır. Prosedür, maksimum hücre canlılığını sağlamak için genç, emziren sıçanları kullanır ve verimli hücre ekstraksiyonu için tripsin ve kollajenaz tip II ile sıralı enzimatik sindirimi kullanır. Kondrosit fenotipi, hücresel kimliği ve inflamatuar yanıtı doğrulamak için tip II kollajen immünofloresansı, akış sitometrik analizi ve İnterlökin (IL)-1β stimülasyon testleri yoluyla doğrulanır. Bu optimize edilmiş ve tekrarlanabilir iş akışı, ilaç taraması, mekanik araştırmalar ve doku mühendisliği uygulamalarına uygun yüksek saflıkta kondrosit kültürlerinin üretilmesini sağlayarak kıkırdak biyolojisi araştırmalarını ilerletir.
Kıkırdak, destek, yastıklama veşok emilimi 1 dahil olmak üzere çok sayıda önemli işlevi yerine getiren özel bir bağ dokusu türüdür. İskelet sistemi 2,3 içinde yapısal stabilitenin korunmasında ve hareketliliğin sağlanmasında hayati bir rol oynar. Mekanik yaralanma, dejeneratif değişiklikler, iltihaplanma veya metabolik anormallikler kıkırdak 4,5,6'da hasara neden olabilir. Doğal kan damarları ve sinir eksikliği nedeniyle, kondrositlerin sınırlı proliferatif kap....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu çalışmada hayvan deneklerin kullanımı Çin-Japonya Dostluk Hastanesi deneysel hayvan bakımı ve refahı etik kurulu tarafından onaylanmıştır (No. zryhyy21-21-05-16). Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Deney hayvanları ve hazırlık çalışmaları
NOT: Total diz artroplastisini takiben sıçan, tavşan ve insan eklemlerinden alınan kıkırdak, kondrosit izolasyonu için kullanılabilir. Bununla birlikte, daha yüksek canlılıkları nedeniyle, bu çalışmada kondrosit ekstraksiyonu için emziren sıçanlar kullanılmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tip II kollajen için immünofloresan boyama, izole edilen kondrositlerin güçlü bir şekilde pozitif olduğunu gösterdi (Şekil 1A). Akış sitometrik analizi ayrıca hücrelerin %98'inden fazlasının tip II kollajen için pozitif olduğunu (Şekil 1B), negatif kontrol SW1353 hücrelerinin ise negatif olduğunu göstermiştir (Şekil 1C). 24 saat boyunca 10 ng/ml IL-1β ile stimülasyonun ardından, Western blotlama kondrositlerde MMP3 ve MMP13 protein .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Burada açıklanan protokol, primer sıçan eklem kondrositlerinin izolasyonu ve kültürü için birkaç önemli avantaj sunmaktadır. Genç hayvanlardan alınan kıkırdak, yetişkin kıkırdağa kıyasla daha fazla proliferatif kondrosit ve daha az mineralize matris içerdiğinden, emziren sıçanların kullanımı optimal hücre verimi ve canlılığı elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu yaş seçimi, enzimatik sindirimin ve ardından hücre iyileşmesinin verimliliğini önemli ölçüde artırır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması bildirmemektedir.
Bu çalışma, Çin-Japonya Dostluk Hastanesi'nin Ulusal Üst Düzey Hastane Klinik Araştırma Fonu ve Elit Tıp Uzmanları Girişimi (NO. ZRJY2025-QM05).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %4 Paraformaldehit | Solarbio | P1110 | |
| 5& kez; Yükleme Tamponu | Solarbio | P1040 | |
| Alexa Fluor 488-konjuge anti-tavşan IgG | Zhongshan Jingqiao Biyoteknolojisi | ZF-0511 | |
| Hayvansız Engelleme Çözümü | Hücre Sinyal Teknolojisi | 15019 | |
| Anti-Kolajen II antikor | Abcam | ab34712 | |
| Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Test Kiti | Solarbio | PC0020 | |
| Kollagenaz II | Yeasen Biyoteknolojisi | 40508ES60 | |
| DAPI içeren floresan montaj ortamı | Zhongshan Jingqiao Biyoteknolojisi | ZLI-9556 | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta Modeli | Solarbio | 11995 | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Solarbio | S9010 | |
| Dağ Turu Peroksidaz (HRP) - Konjuge Keçi Anti-Tavşan IgG | Zhongshan Jingqiao Biyoteknolojisi | ZB-2301 | |
| IL-1β | Peprotech | 400-01B | |
| MMP13 Tavşan mAb | ABklonal | A11148 | |
| MMP3 Tavşan mAb | ABklonal | A11418 | |
| Yağsız Kuru Süt | Solarbio | D3840 | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) | Solarbio | P1020 | |
| PVDF Zarı | Thermo Fisher Scientific | 88518 | |
| Rat MMP-13 ELISA Kiti | Nouvs | NBP3-06931 | |
| Rat MMP-3 ELISA Kiti | Nouvs | NBP3-06894 | |
| Ters Transkripsiyon Kiti | Promega | A3500 | |
| RIPA Liz Tamponu | Solarbio | R0010 | |
| RNase-free Water | Solarbio | R1600 | |
| SDS-PAGE Jeli | Epizyme | PG112 | |
| SYBR Yeşil Gerçek zamanlı PCR Master Mix | Toyobo | QPK-201 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| TRIzol | Solarbio | 15596026 | |
| Tripsin | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-hassas ECL Kemilyüminsans Substrat Kiti | NCM Biyoteknoloji | P10300 | |
| β-Aktin Tavşan mAb | ABklonal | AC026 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.