Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sıçan Diz Artiküler Kondrositlerinin Birincil İzolasyonu, Kültürü ve Fenotipik Doğrulaması

861 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69509

⸱

7 Kasım 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Longfu Hospital, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, sıralı enzimatik sindirim kullanılarak birincil sıçan diz eklem kondrositlerinin izolasyonunu ve kültürünü açıklar. Yöntem, doğrulanmış fenotipik özelliklere sahip kondrositler üreterek araştırmacılara kıkırdak araştırma uygulamaları için güvenilir bir yaklaşım sağlar.

Özet

Travma, yaşlanma veya inflamatuar durumlardan kaynaklanan kıkırdak hasarı, dokunun doğası gereği sınırlı rejeneratif kapasitesi nedeniyle önemli bir klinik sorun olmaya devam etmektedir. Kıkırdağın tek hücresel bileşeni olan kondrositler, hücre dışı matris yapısını ve işlevini korumaktan sorumludur, bu da onları kıkırdak fizyolojisini, patolojisini ve rejenerasyonunu anlamak için gerekli kılar. Bu çalışma, primer sıçan eklem kondrositlerinin diz ekleminden izolasyonu, kültürü ve fenotipik doğrulaması için kapsamlı ve standartlaştırılmış bir protokol sunmaktadır. Prosedür, maksimum hücre canlılığını sağlamak için genç, emziren sıçanları kullanır ve verimli hücre ekstraksiyonu için tripsin ve kollajenaz tip II ile sıralı enzimatik sindirimi kullanır. Kondrosit fenotipi, hücresel kimliği ve inflamatuar yanıtı doğrulamak için tip II kollajen immünofloresansı, akış sitometrik analizi ve İnterlökin (IL)-1β stimülasyon testleri yoluyla doğrulanır. Bu optimize edilmiş ve tekrarlanabilir iş akışı, ilaç taraması, mekanik araştırmalar ve doku mühendisliği uygulamalarına uygun yüksek saflıkta kondrosit kültürlerinin üretilmesini sağlayarak kıkırdak biyolojisi araştırmalarını ilerletir.

Giriş

Kıkırdak, destek, yastıklama veşok emilimi 1 dahil olmak üzere çok sayıda önemli işlevi yerine getiren özel bir bağ dokusu türüdür. İskelet sistemi 2,3 içinde yapısal stabilitenin korunmasında ve hareketliliğin sağlanmasında hayati bir rol oynar. Mekanik yaralanma, dejeneratif değişiklikler, iltihaplanma veya metabolik anormallikler kıkırdak 4,5,6'da hasara neden olabilir. Doğal kan damarları ve sinir eksikliği nedeniyle, kondrositlerin sınırlı proliferatif kapasitesi ile birleştiğinde, kıkırdak onarımı önemli zorluklar ortaya çıkarır. Osteoartrit (dejeneratif değişiklikler ve mekanik yaralanma ile tetiklenen) ve romatoid artrit (otoimmün inflamatuar yanıtların neden olduğu) gibi hastalıklar, geri dönüşü olmayan kıkırdak hasarına neden olarak hastaların yaşam kalitesini büyük ölçüde azaltabilir 7,8,9. Kıkırdak dokusu içindeki özel hücre tipi olan kondrositler, hücre dışı matrisin salgılanması ve bakımı, iskelet gelişiminin desteklenmesi, eklem yastıklama ve onarımına katılım ve kıkırdak büyümesi ve metabolizmasının merkezi düzenlenmesi gibi temel işlevlerden sorumludur 10,11,12.

Kondrositler, avasküler matris boşlukları içinde hapsedilir, bu da kendi proliferasyonları ve doku onarımları için ciddi şekilde sınırlı kapasiteye neden olur13,14. Kondrositlerin fonksiyonel durumu, kıkırdak dokusunun sağlığını doğrudan belirler15. Yaşlanma, inflamasyon, travma veya genetik faktörlerin neden olduğu kondrosit disfonksiyonu, matriks sentezinin azalmasına ve bozulmanın artmasına neden olur16,17. Bu patolojik süreç, kıkırdak dejenerasyonunu (osteoartritte olduğu gibi) tetikleyerek temel destek, yastıklama ve yağlama işlevlerinin bozulmasına yol açar. Kıkırdağın sınırlı rejeneratif kapasitesi, onarımındaki önemli zorluğun temel nedenidir ve modern ortopedi ve rejeneratif tıpta önemli bir araştırma alanı oluşturmaktadır. Kıkırdak üzerine yapılan güncel araştırmalar, ilaç bazlı müdahaleler, doku mühendisliği ve gen terapisi ile in vitro çalışmalar için kondrositlerin izolasyonunu gerektiren bu alanda önemli bir odak noktası haline gelmiştir 18,19,20,21,22,23,24,25. Sonuç olarak, kondrositlerin izole edilmesi ve tanımlanması birçok deneysel yaklaşımda kritik bir adım oluşturur. SW1353 gibi ölümsüzleştirilmiş kondrosit benzeri hücre dizileri bazı çalışmalarda uygun vekiller olarak kullanılırken, kritik fenotipik belirteçlerin, özellikle de otantik kondrosit fonksiyonu ve matris oluşumu için gerekli olan tip II kollajenin ekspresyonundan yoksundurlar26. Bu nedenle, birincil kondrositler, fizyolojik uygunluk gerektiren araştırmalar için altın standart olmaya devam etmektedir. Çoklu enzim kombinasyonları veya kapsamlı mekanik manipülasyon gerektiren daha önce yayınlanmış protokollerle karşılaştırıldığında, basitleştirilmiş enzimatik sindirim yaklaşımı, çoklu enzim kombinasyonları veya kapsamlı mekanik manipülasyon gerektiren yöntemlere kıyasla karmaşıklığı ve işlem süresini azaltır. Ayrıca, kapsamlı doğrulama adımlarının dahil edilmesi, fonksiyonel kondrositlerin tutarlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar ve deneyler ve laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği artırır.

Kondrositler, tip II kollajen salgılamaları ile karakterize edilirken, enflamatuar faktörler tarafından uyarılırken, matriks metaloproteinazları (MMP'ler) kapsamlı bir şekilde sentezler ve serbest bırakırlar27. Bu nedenle, kondrosit izolasyonunu takiben, hücreler tip II kollajen immünofloresan yoluyla tanımlandı ve kondrosit saflığı, akış sitometrisi kullanılarak değerlendirildi. Ve matris metaloproteinazların karakteristik sentezini ve salgılanmasını doğrulamak için İnterlökin (IL)-1β ile uyarılır. Bu çalışma, yenidoğan farelerden kondrosit ekstraksiyonu ve karakterizasyonu sürecini açıklamakta ve daha sonraki kondrosit ile ilgili deneyler için bir temel oluşturmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada hayvan deneklerin kullanımı Çin-Japonya Dostluk Hastanesi deneysel hayvan bakımı ve refahı etik kurulu tarafından onaylanmıştır (No. zryhyy21-21-05-16). Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Deney hayvanları ve hazırlık çalışmaları

NOT: Total diz artroplastisini takiben sıçan, tavşan ve insan eklemlerinden alınan kıkırdak, kondrosit izolasyonu için kullanılabilir. Bununla birlikte, daha yüksek canlılıkları nedeniyle, bu çalışmada kondrosit ekstraksiyonu için emziren sıçanlar kullanılmıştır.

  1. Emziren sıçanları deney hayvanı üretim tesisinden laboratuvara özel transfer kapları kullanarak taşıyın.
  2. Emici sıçanlara CO2 boğulması (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) ile ötenazi yapın ve vücut yüzeylerini steril solüsyonla durulayın.
  3. Yüzey kirleticilerini dezenfekte etmek için ötenazi uygulanmış emziren sıçanları 10 dakika boyunca %75 etanole batırın.
  4. Dezenfekte edilmiş süt farelerini bir biyogüvenlik kabinine aktarın ve steril Petri kaplarına yerleştirin.
    NOT: Emici sıçanların kapsamlı yüzey temizliği ve etanole daldırılması, sonraki deneyleri olumsuz yönde etkileyebilecek bakteri veya mantar kontaminasyonunu önlemek için kritik adımlardır.

2. Eklem kıkırdak dokusunun izolasyonu

NOT: Yenidoğan kıkırdağı, kemikli epifizi kaplayan yarı saydam, mavimsi beyaz bir tabaka olarak görünür. Sonraki deneyleri tehlikeye atabilecek kontaminasyonu önlemek için bu adım sırasında katı aseptik teknikler izlenmelidir.

  1. Bir neşter ve oftalmik makas kullanarak emici sıçan diz eklemini izole edin, ardından üstteki cilt dokusunu çıkarın.
  2. Disseke diz eklemini yeni bir steril Petri kabına aktarın ve neşter ve oftalmik makası değiştirin.
  3. Bir neşter kullanarak diz ekleminden eklem kıkırdağını alın, ardından çevredeki bağ dokusunu oftalmik makasla iyice kesin.

3. Kıkırdak dokusunun sindirimi

NOT: Kıkırdağı çevreleyen bağ dokularını sindirmek için tripsin kullanın, ardından kıkırdak matrisi sindirimi için% 0.2 kollajenaz II kullanın.

  1. Hasat edilen kıkırdağı 3 hacim% 0.25 tripsine ekleyin ve 37 ° C'lik termostatik çalkalayıcıda 30 dakika çalkalayarak inkübe edin.
  2. %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren PBS ekleyerek sindirimi sonlandırın. Oftalmik makas kullanarak kıkırdaktan yapışık dokuları çıkarın. Santrifüjleyin (4 °C, 500 × g, 5 dakika) ve süpernatanı atın.
  3. Kıkırdak dokusunu PBS'de yeniden süspanse edin, santrifüjleyin (4 °C, 500 × g, 5 dakika) ve süpernatanı atın. Bu yıkama adımını 3 kez tekrarlayın.
  4. İşlenmiş kıkırdak dokusuna %0.2 kollajenaz II ekleyin ve 37 °C'lik termostatik çalkalayıcıda 4 saat çalkalayarak sindirin.

4. Kondrosit izolasyonu ve kültürü

NOT: Tüm prosedürler bir biyogüvenlik kabininde steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Deneysel kontaminasyonu önlemek için hücre süzgeci üzerinde bir şırınga pistonu kullanılarak kıkırdak dokusunun mekanik ayrışması sırasında steril eldivenler giyilmelidir. Standart kültür koşulları altında, birincil kondrositlerin ilk geçiş için %80-90 birleşme noktasına ulaşması tipik olarak yaklaşık 2-3 gün sürer.

  1. Steril bir kültür kabının üzerine 200 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve sindirilmiş kıkırdak süspansiyonunu ağdan süzün.
  2. Steril bir şırınga pistonu kullanarak süzgeç üzerinde kalan kıkırdak parçalarını öğütün, ardından süzgeci tam DMEM ortamıyla durulayın.
  3. Tüm süzüntüleri toplayın, santrifüjleyin (4 °C, 500 × g, 5 dakika) ve süpernatanı atın.
  4. Peleti PBS'de yeniden süspanse edin, santrifüjleyin (4 °C, 500 × g, 5 dakika) ve süpernatanı atın.
  5. Hücreleri tam DMEM ortamında yeniden süspanse edin ve bir T25 kültür şişesine aktarın.
  6. Şişeyi nemlendirilmiş bir inkübatörde (37 °C,% 5 CO2) inkübe edin.
  7. Bu birleşme noktasında tripsin-EDTA ve alt kültür kullanılarak 1:2 oranında geçiş hücreleri.

5. Kondrosit tanımlaması için tip II kollajen immünofloresan boyama

NOT: Yapışmış kondrositler, iğ şeklinde ve poligonal bir morfoloji ile karakterize edilir. Bu çalışmada sunulan tüm biyobelirteç analizleri, Pasaj 2'deki hücreler kullanılarak gerçekleştirildi. 3. pasajdaki kondrositler, iğ şeklinde, fibroblast benzeri bir morfolojiye doğru bir kayma ve proliferasyon hızında bir yavaşlama ile karakterize edilen daha belirgin farklılaşma sergilemeye başlar. Bu fenotipik değişiklik 4. pasajdan sonra daha belirgin hale gelir. 6. pasajda, hücrelerin büyük çoğunluğu uzun, fibroblast benzeri bir şekil alır. Antikor dilüsyonları, üreticinin tavsiyesine göre belirlendi ve optimal özgüllük ve sinyal yoğunluğunu sağlamak için ön deneylerimizle doğrulandı.

  1. Hücre yapışmasına izin vermek için kondrositleri 24 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve 24 saat kültürleyin.
  2. Kültür ortamını atın ve hücreleri 3 kez PBS ile yıkayın (her oyuğa PBS ekleyin, 5 dakika inkübe edin, ardından aspire edin).
  3. Hücreleri 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitleyin, ardından PBS ile 3 kez yıkayın.
  4. Hücreleri %0.3 Triton X-100 (PBS'de hazırlanmış) ile 10 dakika geçirgenleştirin.
  5. Hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın, ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca hayvan içermeyen bloke edici solüsyonla (150 μL/kuyu, PBS'de ×5 seyreltilmiş) bloke edin.
  6. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve birincil antikor (anti-Col II, 1:200 seyreltme) ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  7. Birincil antikoru alın ve hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın.
  8. Alexa Fluor 488-konjuge anti-tavşan IgG sekonder antikoru (1:50 seyreltme) ekleyin ve karanlıkta 1,5 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  9. İkincil antikoru çıkarın ve hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın.
  10. DAPI içeren antifade ortamı ile monte edin ve karanlıkta 10 dakika kurutun.
  11. Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleri gözlemleyin ve yakalayın.

6. Kondrosit saflığının akış sitometrik analizi

NOT: Kondrositler, tanımlama için kesin bir belirteç görevi gören tip II kollajeni sentezleme ve salgılama yetenekleri ile karakterize edilir. Kondrosarkom hücre dizisi SW1353, bazı kondrositik özellikler sergilerken, tip II kollajen salgılama kapasitesinden yoksundur ve bu nedenle bu deneyde negatif kontrol görevi görür.

  1. EDTA içermeyen tripsin kullanarak hem kondrositleri hem de SW1353 hücrelerini sindirin.
  2. Tam DMEM ortamı ile sindirimi nötralize edin ve PBS'deki hücreleri yeniden süspanse edin.
  3. Hücreleri fiksasyon/geçirgenleştirme solüsyonu ile 15 dakika inkübe edin, ardından 1 mL yıkama tamponu ekleyin.
  4. Santrifüj (500 × g, 5 dakika), süpernatanı atın ve 100 μL anti-tip II kollajen antikoru (1:100 seyreltme) ile ışıktan korunarak 15 dakika inkübe edin, ardından 1 mL yıkama tamponu ekleyin.
  5. Santrifüj (500 × g, 5 dakika), süpernatanı atın ve Alexa Fluor 488-konjuge anti-tavşan IgG sekonder antikoru ile ışıktan korunarak 30 dakika inkübe edin, ardından 1 mL yıkama tamponu ekleyin.
  6. Santrifüj (500 × g, 5 dakika), süpernatanı atın, her numuneyi 200 μL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi ile analiz edin.

7. Kondrositlerin IL-1β uyarımı

NOT: IL-1β stimülasyonuna yanıt olarak matris metaloproteinazların (MMP'ler) üretimi, kondrositlerin ayırt edici bir özelliğidir. Bu nedenle, bu çalışma, izole kondrositlerde bu fenotipik özelliği doğrulamak için IL-1β stimülasyonunu kullanır.

  1. Kültür şişelerinden kondrositleri sindirin ve tam DMEM ortamında yeniden süspanse edin.
  2. Hücreleri sayın ve tam DMEM kullanarak konsantrasyonu 5 × 105 hücre/mL'ye ayarlayın.
  3. Hücreleri 6 oyuklu bir plakaya (toplam 24 oyuk) tohumlayın, 12 kuyucuk boş kontrol grubu ve 12 kuyu IL-1β stimülasyon grubu olarak belirlenmiştir.
  4. Plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe 12 saat inkübe edin.
  5. Tam hücre yapışmasından sonra stimülasyon grubuna 10 ng/mL IL-1β ekleyin.
  6. Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA) analizi için 24 saat sonra hücre kültürü süpernatantlarını toplayın.
  7. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
  8. Sonraki Western blot analizi için RIPA tamponlu Lyse 6 kontrol kuyusu ve 6 IL-1β ile uyarılmış kuyu.
  9. qPCR analizi için TRIzol kullanarak 6 kontrol kuyusundan ve 6 IL-1β ile uyarılmış kuyudan RNA'yı çıkarın.

8. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR) analizi

NOT: RNA ile ilgili tüm deneyler, DEPC ile işlenmiş sarf malzemeleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kısaca, tüpler ve uçlar 12 saat boyunca %0.1 DEPC'ye batırıldı, hem RNazları hem de artık DEPC'yi inaktive etmek için otoklavlandı (121 °C, 20 dakika) ve kullanımdan önce fırında kurutuldu.

  1. Hücre peletine 1 mL Trizol ekleyin ve bir homojenizatör kullanarak homojenize edin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  2. 0,2 mL kloroform ekleyin ve 30 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
  3. 4 °C'de santrifüjleyin, 12.000 × g'da 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Renksiz sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve eşit hacimde izopropanol ekleyin.
  4. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 4 °C'de santrifüjleyin, 12.000 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve RNA peletini saklayın.
  5. RNA peletine 1 mL önceden soğutulmuş %75 etanol ekleyin. İyice vorteksleyin ve 4 °C'de, 12.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve RNA peletini saklayın.
  6. RNA peletini bir biyogüvenlik kabininde havayla kurutun. RNA'yı 20 μL RNaz içermeyen suda çözün.
  7. Bir Nanodrop spektrofotometresi kullanarak RNA konsantrasyonunu ve kalitesini ölçün.
  8. Bir ters transkripsiyon kiti kullanarak toplam RNA'yı cDNA'ya ters kopyalayın.
  9. Nihai hacmi 20 μL'ye ayarlamak için 1 μg toplam RNA, 4 μL magnezyum klorür çözeltisi, 2 μL dNTP karışımı, 0.5 μL RNaz inhibitörü, 0.6 μL AMV ters transkriptaz, 1 μL rastgele primerler ve RNaz içermeyen su içeren reaksiyon karışımını hazırlayın.
  10. Reaksiyonu 42 °C'de 15 dakika, ardından 95 °C'de 5 dakika inkübe edin. 5 dakika boyunca 4 °C'ye soğutun, ardından cDNA'yı RNaz içermeyen suyla seyreltin.
  11. Her biri 0,2 μmol/L'lik bir nihai konsantrasyonda 2 μL cDNA, 10 μL SYBR Green Real-time PCR Master Mix, ileri ve geri primerler (Tablo 1) ve RNaz içermeyen su içeren PCR reaksiyon karışımını 20 μL'lik bir nihai hacme hazırlayın.
  12. PCR koşullarını şu şekilde ayarlayın: 1 dakika boyunca 95 °C'de ön denatürasyon, ardından 15 saniye boyunca 95 °C, 15 saniye boyunca 60 °C ve 45 saniye boyunca 72 °C'lik 40 döngü. 72 °C uzatma adımı sırasında floresan verilerini toplayın.
  13. Reaksiyondan sonra, her numune için CT değerlerini ve dahili referansı kaydedin. 2-ΔΔCT yöntemini kullanarak hedef genlerin nispi ekspresyon seviyelerini hesaplayın.

9. ELISA testi

NOT: Kullanmadan önce biyotinlenmiş antikor çalışma solüsyonu ve enzim konjugat çalışma solüsyonunu taze olarak hazırlayın.

  1. ELISA kitini 30 dakika önceden buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
  2. Gerekli tüm çözeltileri kit talimatlarına göre hazırlayın.
  3. Belirlenen kuyucuklara 100 μL numune veya standart çözelti (değişen konsantrasyonlarda) ekleyin (sıfır kuyucuklar yalnızca standart/numune seyreltme tamponu içerir). Plakayı yapışkan filmle kapatın ve 37 °C'de 90 dakika inkübe edin (boş kontrol kuyucukları hariç).
  4. Sıvıyı atın ve her bir kuyucuğu 350 μL yıkama tamponu ile yıkayın. 30 saniye inkübe edin, sıvıyı atın ve kalın emici kağıt üzerinde kurulayın. Yıkamayı 4 kez tekrarlayın.
  5. Her kuyucuğa 100 μL biyotinlenmiş antikor çalışma solüsyonu ekleyin. Plakayı kapatın ve 37 °C'de 60 dakika inkübe edin (boş kontrol kuyucukları hariç).
  6. Sıvıyı atın ve her bir kuyucuğu 4. adımda açıklandığı gibi 4 kez yıkayın.
  7. Her kuyucuğa 100 μL enzim konjugat çalışma solüsyonu ekleyin. Plakayı kapatın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin (boş kontrol kuyucukları hariç).
  8. Sıvıyı atın ve her bir kuyucuğu 4. adımda açıklandığı gibi 4 kez yıkayın.
  9. Her kuyucuğa 100 μL substrat çözeltisi ekleyin. Işıktan koruyun ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
  10. Her kuyucuğa 100 μL durdurma solüsyonu ekleyin, iyice karıştırın ve optik yoğunluğu (OD) hemen 450 nm'de ölçün.
  11. CurveExpert yazılımını kullanarak standart bir eğri oluşturun ve numune konsantrasyonlarını hesaplayın.

10. Western blot analizi

NOT: Deneyden önce, elektroforez tamponu, transfer tamponu, TBST,% 5 yağsız süt hazırlayın ve PVDF membranını önceden uygun boyutta kesin. Daha sonra, bir kemilüminesans görüntüleme sistemi kullanarak kemilüminesans sinyallerini yakalayın. Sinyallerin doğrusal dinamik aralıkta yakalanmasını sağlamak ve piksel doygunluğunu önlemek için cihazı tipik olarak 10 s ile 5 dakika arasında değişen gradyan pozlama için otomatik veya manuel moda ayarlayın. Sinyal yakalandıktan sonra, sonraki nicel analiz için hedef bantların net olduğu ve arka planın düşük olduğu pozlama görüntüsünü seçin.

  1. RIPA lizis tamponu (%1 PMSF ve %1 fosfataz inhibitörü içeren) hazırlayın ve 6 oyuklu bir plakanın kuyucuğu başına 250 μL oranında RIPA lizis tamponu ekleyin.
  2. Ultrasonik bir bozucu (3 döngü, her biri 7-10 s) kullanarak hücreleri parçalayın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  3. Lizatı 4 °C, 12.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin, ardından protein ölçümü için süpernatanı toplayın.
  4. Bisinchoninic asit (BCA) testini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
  5. RIPA lizis tamponunu kullanarak protein konsantrasyonlarını aynı seviyeye ayarlayın.
  6. Örneklere 5× Yükleme Tamponu ekleyin 4:1 oranında (örnek: tampon).
  7. Numuneleri 10 dakika kaynatın, ardından 4 °C'de, 12.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve elektroforez için süpernatanı toplayın.
  8. SDS-PAGE jelini elektroforez odasına monte edin ve tarak suya batana kadar elektroforez tamponu ile doldurun.
  9. Tarağı çıkarın, numuneleri kuyucuklara yükleyin ve referans şeritlerine protein merdiveni ekleyin.
  10. Bromofenol mavisi boya jelin dibine ulaşana kadar elektroforezi çalıştırın, ardından aparatı sökün ve jeli alın.
  11. Transfer "sandviçini" monte edin ve sabit voltajda ıslak transfer gerçekleştirin.
  12. PVDF membranını oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBST'de% 5 yağsız sütle bloke edin.
  13. Seyreltilmiş primer antikor ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  14. Birincil antikoru geri kazanın ve membranı TBST ile yıkayın (5 × 5 dakika).
  15. HRP konjuge sekonder antikor ile oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin.
  16. İkincil antikoru geri kazanın ve membranı TBST ile yıkayın (5 × 5 dakika).
  17. ECL substrat solüsyonunu hazırlayın ve ışıktan koruyarak saklayın.
  18. ECL substratını membrana uygulayın ve gradyan pozlamalı bir görüntüleme sistemi kullanarak kemilüminesan sinyalleri yakalayın.
  19. ImageJ yazılımını kullanarak bant yoğunluklarını analiz edin ve daha fazla analiz için bağıl protein ekspresyon seviyelerini hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tip II kollajen için immünofloresan boyama, izole edilen kondrositlerin güçlü bir şekilde pozitif olduğunu gösterdi (Şekil 1A). Akış sitometrik analizi ayrıca hücrelerin %98'inden fazlasının tip II kollajen için pozitif olduğunu (Şekil 1B), negatif kontrol SW1353 hücrelerinin ise negatif olduğunu göstermiştir (Şekil 1C). 24 saat boyunca 10 ng/ml IL-1β ile stimülasyonun ardından, Western blotlama kondrositlerde MMP3 ve MMP13 protein ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, primer sıçan eklem kondrositlerinin izolasyonu ve kültürü için birkaç önemli avantaj sunmaktadır. Genç hayvanlardan alınan kıkırdak, yetişkin kıkırdağa kıyasla daha fazla proliferatif kondrosit ve daha az mineralize matris içerdiğinden, emziren sıçanların kullanımı optimal hücre verimi ve canlılığı elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu yaş seçimi, enzimatik sindirimin ve ardından hücre iyileşmesinin verimliliğini önemli ölçüde artırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması bildirmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin-Japonya Dostluk Hastanesi'nin Ulusal Üst Düzey Hastane Klinik Araştırma Fonu ve Elit Tıp Uzmanları Girişimi (NO. ZRJY2025-QM05).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%4 ParaformaldehitSolarbioP1110
5& kez; Yükleme TamponuSolarbioP1040
Alexa Fluor 488-konjuge anti-tavşan IgGZhongshan Jingqiao BiyoteknolojisiZF-0511
Hayvansız Engelleme ÇözümüHücre Sinyal Teknolojisi15019
Anti-Kolajen II antikorAbcamab34712
Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Test KitiSolarbioPC0020
Kollagenaz IIYeasen Biyoteknolojisi40508ES60
DAPI içeren floresan montaj ortamıZhongshan Jingqiao BiyoteknolojisiZLI-9556
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta ModeliSolarbio11995
Fetal sığır serumu (FBS)SolarbioS9010
Dağ Turu Peroksidaz (HRP) - Konjuge Keçi Anti-Tavşan IgGZhongshan Jingqiao BiyoteknolojisiZB-2301
IL-1βPeprotech400-01B
MMP13 Tavşan mAbABklonalA11148
MMP3 Tavşan mAbABklonalA11418
Yağsız Kuru SütSolarbioD3840
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)SolarbioP1020
PVDF ZarıThermo Fisher Scientific88518
Rat MMP-13 ELISA KitiNouvsNBP3-06931
Rat MMP-3 ELISA KitiNouvsNBP3-06894
Ters Transkripsiyon KitiPromegaA3500
RIPA Liz TamponuSolarbioR0010
RNase-free WaterSolarbioR1600
SDS-PAGE JeliEpizymePG112
SYBR Yeşil Gerçek zamanlı PCR Master MixToyoboQPK-201
Triton X-100SolarbioT8200
TRIzolSolarbio15596026
TripsinSolarbioT1320
Ultra-hassas ECL Kemilyüminsans Substrat KitiNCM BiyoteknolojiP10300
β-Aktin Tavşan mAbABklonalAC026

Kaynaklar

  1. Min, Q., et al. Strong and elastic chitosan/silk fibroin hydrogels incorporated with growth-factor-loaded microspheres for cartilage tissue engineering. Biomimetics (Basel). 7 (2), 41(2022).
  2. Kloppenburg, M., Namane, M., Cicuttini, F. Osteoarthritis. Lancet. 405 (10472), 71-85 (2025).
  3. Barisón, M. J., et al. Functionalized hydrogels for cartilage repair: The value of secretome-instructive signaling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6010(2022).
  4. Han, Y., et al. High-precision, gelatin-based, hybrid, bilayer scaffolds using melt electro-writing to repair cartilage injury. Bioact Mater. 6 (7), 2173-2186 (2021).
  5. Molnar, V., et al. Cytokines and chemokines involved in osteoarthritis pathogenesis. Int J Mol Sci. 22 (17), 9208(2021).
  6. Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
  7. Ouyang, Z., et al. Cartilage-related collagens in osteoarthritis and rheumatoid arthritis: From pathogenesis to therapeutics. Int J Mol Sci. 24 (12), 9841(2023).
  8. Mueller, A. L., et al. Recent advances in understanding the pathogenesis of rheumatoid arthritis: new treatment strategies. Cells. 10 (11), 3017(2021).
  9. Cao, F., et al. Trends and cross-country inequalities in the global burden of osteoarthritis, 1990-2019: A population-based study. Ageing Res Rev. 99, 102382(2024).
  10. Wu, X., Fan, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. The metabolic landscape in osteoarthritis. Aging Dis. 13 (4), 1166-1182 (2022).
  11. Deng, H., et al. Altered expression of the Hedgehog pathway proteins BMP2, BMP4, SHH, and IHH involved in knee cartilage damage of patients with osteoarthritis and Kashin-Beck disease. Cartilage. 13 (1), 19476035221087706(2022).
  12. Hui, L., et al. Effects of androgen receptor overexpression on chondrogenic ability of rabbit articular chondrocytes. Tissue Eng Regen Med. 18 (4), 641-650 (2021).
  13. Drevet, S., Favier, B., Lardy, B., Gavazzi, G., Brun, E. New imaging tools for mouse models of osteoarthritis. Geroscience. 44 (2), 639-650 (2022).
  14. Wu, S., Guo, W., Li, R., Zhang, X., Qu, W. Progress of platelet derivatives for cartilage tissue engineering. Front Bioeng Biotechnol. 10, 907356(2022).
  15. Zhang, Y., et al. DL-3-N-butylphthalide promotes cartilage extracellular matrix synthesis and inhibits osteoarthritis development by regulating FoxO3a. Oxid Med Cell Longev. 2022, 9468040(2022).
  16. Krych, A. J., Saris, D. B. F., Stuart, M. J., Hacken, B. Cartilage injury in the knee: assessment and treatment options. J Am Acad Orthop Surg. 28 (22), 914-922 (2020).
  17. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  18. Morici, L., Allémann, E., Rodríguez-Nogales, C., Jordan, O. Cartilage-targeted drug nanocarriers for osteoarthritis therapy. Int J Pharm. 666, 124843(2024).
  19. Urlić, I., Ivković, A. Cell sources for cartilage repair-biological and clinical perspective. Cells. 10 (9), 2496(2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipein the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  21. Bai, L., et al. Engineering bone/cartilage organoids: Strategy, progress, and application. Bone Res. 12 (1), 66(2024).
  22. Dönges, L., et al. Engineered human osteoarthritic cartilage organoids. Biomaterials. 308, 122549(2024).
  23. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  24. Barisón, M. J., et al. Functionalized hydrogels for cartilage repair: the value of secretome-instructive signaling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6010(2022).
  25. Yu, L., et al. Hyaline cartilage differentiation of fibroblasts in regeneration and regenerative medicine. Development. 149 (2), dev200249(2022).
  26. Gebauer, M., et al. Comparison of the chondrosarcoma cell line SW1353 with primary human adult articular chondrocytes with regard to their gene expression profile and reactivity to IL-1β. Osteoarthritis Cartilage. 13 (8), 697-708 (2005).
  27. Yan, W., et al. Chondrocyte-targeted delivery system of Sortase A-engineered extracellular vesicles silencing MMP13 for osteoarthritis therapy. Adv Healthc Mater. 13 (16), e2303510(2024).
  28. Goldring, M. B. Chondrogenesis, chondrocyte differentiation, and articular cartilage metabolism in health and osteoarthritis. Ther Adv Musculoskelet Dis. 4 (4), 269-285 (2012).
  29. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Des Devel Ther. 16, 1743-1766 (2022).
  30. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  31. Dou, Y., Fang, Y., Zhao, C., Fu, W., Jiang, D. Editorial: Bioengineering and translational research for bone and joint diseases. Front Bioeng Biotechnol. 10, 969416(2022).
  32. Ye, K., et al. Bioengineering of articular cartilage: Past, present and future. Regen Med. 8 (3), 333-349 (2013).
  33. Chen, P., et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kondrosit zolasyonuKondrosit K lt rS an Diz K k rdaEnzimatik SindirimKollajenaz Tip IIAk SitometrisiTip II Kollajenmm nofloresan Analiz
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.