Leptospira Biyofilmlerinin Nicel, Yapısal ve Fonksiyonel Analizi İçin Modüler İş Akışı

Summary

Bu protokol, kristal-mor biyokütle testleri, zaman geçişli faz kontrast kinetikleri, konfokal 3-D/matris haritalama, SEM ultrayapı ve in vivo hamster enfeksiyon modülünü birleştirerek Leptospira biyofilminin işlevsel rolünü geliştirmek, niceliklendirmek, karakterize etmek ve araştırmak için modüler, BSL-2 iş akışı sunar; böylece mutantların standart değerlendirilmesini ve laboratuvarlar arasında anti-biyofilm müdahalelerini mümkün kılar.

Abstract

Burada, Leptospira türleri biyofilmlerinin zaman içinde yetiştirilmesi, nicel izlemesi, yapısal ve fonksiyonel karakterizasyonu için entegre bir protokol paketi sunuyoruz. Bu iş akışı, biyofilm biyokütlesini birden fazla zaman noktasında ölçmek için kristal mor mikrotiter testlerini, bağlı (biyofilm) ve bağlanmamış (sıvı fazlı) bakteri popülasyonlarını ayırt eden zaman çözümlü fraksiyon yaklaşımı, yıkıcı olmayan kinetik gözlem için zaman geçişli faz kontrast görüntüleme, matriks-prob okumalarıyla tam 3D rekonstrüksiyonlar oluşturmak için konfokal lazer taramalı mikroskopi ve ultrastruktural analiz için membran destekli taramalı elektron mikroskopi ile birleştirir. Paralel olarak, sağlam biyofilm agregalarının toplanması ve hassas altın Suriye hamster modeline intraperitoneal enjeksiyon için hazırlanması için standart bir prosedürü detaylandırıyoruz; böylece biyofilm ile ilişkili virülansın in vivo ve eşleşen planktonik kontrollerin doğrudan değerlendirilmesini sağlıyoruz.

Patojenik Leptospira interrogans Manilae L495 sızı için optimize edilmiş olan her modül, biyofilm oluşturma kapasitesini karşılaştırmak için diğer Leptospira türlerine ve mutant kütüphanelere kolayca aktarılabilir. Bu koordine modüller birlikte, anti-biyofilm stratejilerini taramak, genetik belirleyicileri incelemek ve biyofilmlerin Leptospira kalıcılığı ve patogenezi üzerindeki katkısını netleştirmek için sağlam bir temel sağlar.

Introduction

Biyofilmler, hücrelerin polisakkaritler, proteinler, nüklein asitler ve lipidlerden oluşan kendi kendini salgılayan hücre dışı polimerik madde (EPS) matrisine gömüldüğü yapılandırılmış mikrobiyal^{topluluklardır 1}. Bu matris, mekanik stabiliteyi sağlar, yüzeylere yapışmayı aracılık eder ve kuruma, oksidatif stres ve antimikrobiyaller gibi çevresel streslere tolerans sağlayarak^{mikrobiyal hayatta kalma süresini artırır 2,3}. Patojenik bakterilerde biyofilmler kalıcı oluşu, bağışıklık engelini ve kronik enfeksiyonu kolaylaştırır ^4,5.

Planktonik hücrelere kıyasla, ki bu hücreler serbest yüzen ve metabolik olarak daha homojendir, biyofilm ile ilişkili hücreler gen ifadesi, büyüme hızları ve metabolik aktivitede değişmiştir⁶. Bu farklılıklar, çevresel zorluklara, antibiyotiklere ve konak savunmalarına karşı artan tolerans sağlarken, genel algılama, besin tutumu ve mekansal organizasyon gibi koordineli davranışlara olanak^{tanır 7,8}.

Biyofilm oluşumu, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ve Vibrio cholerae gibi model organizmalarda kapsamlı şekilde karakterize edilmiştir; bu organizmalar, biyofilm yaşam tarzının genetik, yapısal ve fizyolojik temellerini anlamımızı birlikte şekillendirmiştir. Pseudomonas üzerine yapılan çalışmalar, ekzopolisakkaridler ve quorum algılayıcı kombinasyonunun birlikte karmaşık üç boyutlu biyofilm mimarileri^{oluşturduğunu ortaya koymuştur 9,10}. Stafilokok üzerine yapılan araştırmalar, yüzey proteinlerinin ve hücre dışı DNA'nın biyofilm kohezyonu ve antibiyotik toleransını artırmadaki rollerini^{vurgulamıştır 11,12}. Vibrio türleri üzerine yapılan araştırmalar, biyofilm morfolojilerinin olağanüstü çeşitliliğini ve su ortamlarındaki ekolojik önemini daha da gözler önüne sermiştir. Bu sistemler birlikte, biyofilm araştırmaları için sağlam bir kavramsal ve metodolojik çerçeve sağlamıştır; bu da standart^{protokoller 14} ve mevcut tekniklerin kritik^{değerlendirmeleri 15,16} ile güçlendirilmiştir; bu sistemler, Leptospira gibi daha az incelenen bakterilerde biyofilm oluşumunu araştırırken uyumlu yaklaşımların gerekliliğini vurgulamaktadır.

Leptospirozun neden olan spiroket cinsine ait olanların uzun süre ağırlıklı olarak planktonik olduğu varsayılıyordu. Son çalışmalar, birden fazla türde sağlam biyofilm oluşumunu deneysel^{olarak göstermiştir 17}. Bazı çalışmalar çevresel¹⁸ ve konak ilişkili¹⁹ bağlamlarda biyofilm oluşumunu önerirken, diğerleri leptospirlerin Rattus norvegicus^20'nin böbrek tübüllerinde ve atların vitreus^{humorunda biyofilm oluşturma yeteneğini deneysel} olarak göstermiş ve çevresel biyofilmlerde leptospiral türleri^{tespit edilmiştir (22,23}). Bu nedenle, Leptospira biyofilmlerini yöneten koşullar ve mekanizmaların çözülmesi, çevresel bulaşım, rezervuar kalıcılığı ve hastalık patogenezini anlamak için^{kritik öneme sahiptir 24,25}.

Mevcut Leptospira biyofilm testleri parçalıdır; nitel mikroskobik^gözlemler 17,26'dan son nokta kolorimetrik veya kristal mor ^{lekelerine (27,28}) kadar değişir. Bu çalışmalar biyofilm oluşumu hakkında değerli bilgiler sağlamış olsa da, biyofilm olgunlaşma ve yayılımını gerçek zamanlı izlemek için gereken kinetik çözünürlükten ve konfokal veya elektron mikroskopi tarafından sağlanan ultrastruktural bağlamdan genellikle yoksundurlar. Biyofilm oluşumu ve yayılımının dinamik doğasını yakalamak için sürekli izleme ve 3D yapısal analiz^{gereklidir 14,15}. Bu sınırlamalar, çalışmalar arasında karşılaştırılabilirliği engeller ve biyofilm oluşumu ile yayılmasını etkileyen faktörlerin veya müdahalelerin sistematik olarak değerlendirilmesini sınırlar; bu da Leptospira biyofilmlerinin yapısal ve fonksiyonel dinamiklerini tekrarlanabilir ve kapsamlı bir şekilde yakalayan standart, çoklu okuma iş akışına olan ihtiyacı vurgular.

Bu boşlukları gidermek için, aynı kültür serisinden alınan altı tamamlayıcı okumayı birleştiren entegre ve modüler bir iş akışı geliştirdik. İlk olarak, yüksek verimli CV mikrotiter testi, bağlı biyokütleyi birden fazla zaman noktasında niceliklerini belirler. İkinci olarak, 96 kuyu plakalarında zaman çözünürlüğüyle çözülen bir fraksiyon testi, oluşma ve yayılma sırasında evrimlerini takip etmek için toplam, sıvı fazlı (bağlı olmayan veya kısmen ayrılmış) ve bağlı (biyofilm) popülasyonları OD₄₀₅ ile böler. Sıvı faz terimi, burada hem planktonik benzeri hem de ayrılmış hücreleri kapsaymak için kullanılır; bu da serbest yaşayan ve yüzeyle ilişkili^{fenotipler 29,30} arasındaki dinamik sürekliliği kabul eder. Üçüncüsü, zaman geçişli faz kontrast görüntüleme, yapışma, toplam hareketlilik ve koalesansın yıkıcı olmayan kinetik sağlamasıdır. Dördüncü olarak, konfokal lazer taramalı mikroskopi (CLSM), canlı/ölü ve matris probu okumalarıyla tam 3D rekonstrüksiyonlar sağlar; bu da derinliğe bağlı geçerlilik ve matris haritalamasını sağlar. Beşinci olarak, membran veya örtü kayışı destekli taramalı elektron mikroskopisi (SEM), hücre dışı mimariyi ve bazal-apikal polariteyi yüksek çözünürlükte çözer. Ayrıca, hassas altın Suriye hamsterı modeline intraperitoneal biyofilm agregaları enjeksiyonu kullanılarak virülansı değerlendirmek için in vivo bir modül dahil edildi; bu model leptospiroz 31,32,33 için hassas ve iyi kurulmuş bir modeldir. Bu yaklaşım, biyofilm fenotiplerini patojenik potansiyelle ilişkilendirir ve in vitro analizleri tamamlayan fonksiyonel bağlam sağlar.

Tek modaliteli yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, bu platform birkaç avantaj sunar: (i) senkronize nicel (CV ve fraksiyonlu OD) ve yapısal (CLSM/SEM) okumalar; (ii) erken yapışma, büyüme, olgunlaşma ve yayılmanın yıkıcı olmayan kinetik izlemesi; (iii) hedefli problar kullanılarak 3-B canlılık ve matris karakterizasyonu; (iv) hücredışı matris mimarisinin ultrastruktural görselleştirmesi; ve (v) hassas bir hamster modelinde biyofilm ile ilişkili ve planktonik virülansın doğrudan fonksiyonel değerlendirmesi; her biri standart BSL-2 altyapısıyla sağlanabilir. Çok kuyu formatları ve çıkarılabilir cam veya polikarbonat tabanlar kullanılarak bu iş akışı, modüller arasında sterillik, veri verimliliği ve çapraz doğrulamayı korurken çevresel değişkenlerin, antimikrobiyal bileşiklerin veya mutant kütüphanelerin ekranlarının çoğaltılmasını destekler.

Ekoloji, kalıcılık, konak-patojenler etkileşimleri veya anti-biyofilm keşfine odaklanan laboratuvarlar, bireysel modülleri veya tüm süreci benimseyebilir. Gerekli kaynaklar, bir plaka okuyucu, çevresel kontrollü ters mikroskop, konfokal mikroskop ve SEM tesisine erişim ile hamster modeli için standart hayvan tesisleriyle sınırlıdır; bu da geniş çapta benimsenmesini ve çalışmalar arasında tekrarlanabilir karşılaştırmaları mümkün kılar.

Protocol

Etik beyan:
Bu araştırma, Yeni Kaledonya Pasteur Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Paris Pasteur Institut Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen yönergeler ile Avrupa Tavsiyesi 2007/526/EC doğrultusunda yürütülmüştür. Hayvan Araştırması Deneyi Kayıt Numarası: IPNC-2018-ARE-001

NOT: Canlı Leptospira kültürleriyle ilgili tüm işlemler, kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak bir biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) laboratuvarında yapılmalıdır. Tüm kültür manipülasyonları, operatörün güvenliğini sağlamak ve çevresel kirliliği önlemek için biyolojik bir güvenlik kabini altında yapılmalıdır.

Bu çalışmada kullanılan Leptospira interrogans serovar Manilae sturu L495, orijinal olarak Paris, Fransa'daki Institut Pasteur koleksiyonundan alınmakta olup Yeni Kaledonya Pasteur Enstitüsü'nde korunmaktadır. Virülansı korumak için suş periyodik olarak enfekte hamsterlardan yeniden izole edilir. Tüm in vitro deneylerde, hayvan konakçısından kurtarıldıktan sonra kültürler altı alt kültürden fazla sürdürülmedi.

Tüm hayvan prosedürleri, kurumsal yönergelere uygun şekilde yapılmalı ve ilgili Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmalıdır. Deneyler, hayvan refahı konusunda Avrupa düzenlemelerine (AB Direktifi 2010/63) ve Halk Sağlığı Servisi'nin önerilerine uymalı, hayvan kullanımının hem haklı hem de etik olarak düzenlenmesini sağlamalıdır.

1. Bakteriyel aşı hazırlanması

1. Leptospira türleri hücrelerini EMJH^{ortamı 34'te} aerobik koşullarda ve sallamadan düz tabanlı, vidalı kapaklı cam tüplerde 30 °C'de yetiştirerek kültür orta günlük faza ulaşana kadar yetiştirilebilir. Bu koşullarda, hamsterlar aracılığıyla düzenli olarak in vivo olarak korunan düşük geçişli L495 süzü olan L. interrogans serovar Manilae sızı genellikle 3-5 gün içinde uygun hücre yoğunluğuna ulaşır. Kültürlerin 405 nm (2 ila 5 x 10⁸ hücre/mL) içinde 0.2-0.4 O.D.'ye ulaştığından emin olun ve taze EMJH ortamında seyreltilmeden önce hareketliliği ve kümelenme eksikliğini 20 x büyütmede karanlık alan mikroskopisiyle doğrulayın.
   NOT: EMJH içsel emilime sahiptir. Spektrofotometreyi steril EMJH ile boşaltın ve bu değeri tüm ölçümlerden çıkarın. Aşı, optik yoğunluk ölçümleriyle veya Petroff-Hausser odası kullanılarak doğrudan hücre sayımı ile standartlaştırılabilir. Doğrulanmış orta log kültürünün 1:100 seyreltilmesi genellikle OD₄₀₅ = 0.02 (≈ 1 x 10⁶ hücre/mL) verir. Nazikçe ters çevirerek karıştırın; Girdap yapma.
2. 10 μL'lik bir aliquotu karanlık alan mikroskopisiyle 20 kat büyütmede inceleyin. Hücrelerin ≥ %90'ının yüksek hareketli olduğundan ve görünür bir küme bulunmadığından emin olun. Doğrulanmış orta log kültürü 1: 100 taze EMJH ile seyreltirin ve OD₄₀₅ = 0.02 (≈ 1 x 10⁶ hücre/mL) elde edilir. Nazikçe ters çevirerek karıştırın; Girdap yapma.
   NOT: Bir çalışan aşı, bu protokolde detaylandırılan tüm aşağı akış testlerini destekler (Şekil 1). 24 kuyu (1 mL/kuyu) tohumlamak için 36 mL veya 96 kuyu (200 μL/kuyyu) bir plaka tohumlamak için 20 mL hazırlayın. Gerekli plaka sayısına göre hacimleri ayarlayın.

Şekil 1. Leptospira biyofilm analizi için küresel iş akışı. Üstel olarak büyüyen Leptospira kültürleri önce büyüme açısından değerlendirilir ve optik yoğunluk ile standartlaştırılır. Kültürler daha sonra cam veya zar içeren plakalara, mikroskopik mikrotablaklara veya 96 delikli plakalara dağıtılır. İş akışı yedi modülden oluşur: (1) aşı hazırlığı; (2) biyokütle niceli olarak kristal mor boyama; (3) SEM ile ultrastruktural görüntüleme; (4) zaman geçişli faz kontrast mikroskopisi ile dinamik biyofilm izleme; (5) CLSM ile canlı/ölü boyama ile 3D görselleştirme; (6) biyofilm oluşumu sırasında bağlı ve bağlanmamış fraksiyonların optik yoğunluk yoluyla zaman çözünürlüklü nicelendirilmesi; ve (7) Suriye hamsterlarında enfeksiyon sırasında biyofilm fonksiyonel rolünün araştırılması. Bu entegre yaklaşım, biyofilm gelişimi, yapısı ve patogenlikte çok modlu analizlere olanak tanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Kristal Mor - Biyofilmlerin örtü veya membran üzerine nicel olarak nitelendirilmesi

1. Bir BSL2 biyogüvenlik başlığının içinde, steril forseps kullanarak her kuyunun dibine bir adet 12 mm steril cam kapak veya bir adet 0,1 μm steril hidrofilik polikarbonat membran döşenir, her kuyunun dibine 24 kuyruklu steril bir plaka ve kapaklı yerleştirilir. Membran/cam kapak örtüsünü 30 °C'de 2 saat boyunca 1 mL steril EMJH ile önceden ıslatın.
   NOT: Zorunlu olmasa da, alt tabakayı EMJH ile önceden ıslatmak ıslanmayı iyileştirir ve bakteriyel yapışmayı hafifçe artırır.
2. Bekletme çözeltisini çıkarın ve her kuyuya 1,5 mL seyreltilmiş bakteriyel süspansiyon (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ hücre/mL) ekleyin. Örtü veya membranın alt kısımda sağlam bir şekilde durduğundan emin olun.
3. Levhayı nemli bir atmosferde statik koşullarda 30 °C'de kuluçkalayın; kultura ortamının buharlaşmasını önlemek için kuluçka içinde su dolu bir tepsi yerleştirilerek korunur. Yavaş büyüyen suşlar için, olgun, yapışkan bir biyofilm oluşumunu sağlamak amacıyla 3 haftalık kuluçka önerilir.
4. İstenilen zamanda, biyofilmi rahatsız etmeden her kuyiden mümkün olduğunca çok kültür ortamını dikkatlice çıkarın. Her kuyuyu 1 mL steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ile nazikçe durulayın; böylece yapışmayan kalıntı hücreleri çıkarın; kırılgan biyofilm hücrelerinin ayrılmasını önlemek için kapak kazağı kuyu tabanına düz tutun. Bu koşullarda, biyofilm büyümesi ağırlıklı olarak örtü yüzeyinin üst yüzeyinde gerçekleşir, alt tarafta ise minimum büyüme olur; bu nedenle kaldırmadan durulama, yüzeye bağlı hücrelerin aşağı akış analizleri için zenginleşmeye yeterlidir.
   NOT: Biyofilmler bu aşamada son derece kırılgandır ve yanlışlıkla kolayca aspirasyon olabilir. Pipetleme, biyofilmin bozulmamasını önlemek için kuyu duvarı boyunca yavaş ve hassas şekilde yapılmalıdır.
5. Biyofilm örneklerini 37 °C'de 30 dakika boyunca PBS'de 1 mL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyerek sabitleyin. Fiksajı çıkarın ve dikkatlice 1 mL PBS ile iki kez durulayın.
   NOT: Fiksasyon için, %4 formaldehit çözeltisi taze hazırlanmış (%16 metanolsüz stok 1:4 PBS oranında seyreltilmiş şekilde) ve kullanımdan sonra atılmıştır, çünkü paraformaldehite polimerizasyon çapraz bağlama aktivitesini azaltır.
6. Her kuyuya 1 mL 0,1% (w/v) Kristal Mor (CV) çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın, böylece membran veya örtü örtüsünün tamamen kaplı olduğundan emin olun.
7. Boyayı atın ve 1 mL PBS ile iki kez durulayın.
   NOT: Kristal mor ve paraformaldehit (PFA) toksiktir ve cildi ile gözleri tahriş edebilir. Her zaman eldiven takın ve her iki kimyasalı da dikkatli kullanın, tercihen bir hava davlumbasında. Atıkları kurumsal güvenlik yönergelerine uygun olarak belirlenmiş tehlikeli boya veya kimyasal atık konteynerlerine bertaraf etmelidir.
8. Plakayı eğin ve kalan sıvıyı boşaltın. Kuyular oda sıcaklığında tamamen kuru görünene kadar (tercihen gece boyunca 4 saat ≥) kurutulabilir.
   NOT: Bu aşamada, kapak veya membran yüzeyinde nokta benzeri veya torlu yapılar görülebilir (Şekil 2A).
9. Her kuyuya 500 μL elution tamponu (%50 etanol, %50 buzul asetik asit (hacim/hacim)) ekleyin. Tabağı 15 dakika kuluçka için. Biyofilme bağlı kristal menekşeyi tamamen çözerek pipet yapın.
10. Her örnekten 200 μL optik olarak berrak 96 kuyruklu bir mikroplakaya aktarın ve 570 nm'de soğurgunluk ölçün. Sadece bir yüzey için kullanılan bir boşluk, inokulasyon olmayan örtü veya membranı fiksasyon, CV boyama, yıkama ve elülasyon yoluyla çıkararak iç bağ/arka plan gider. En az üç teknik kopya için ortalama ± standart sapmayı kaydedin. Emilicilik spektrofotometrenin doğrusal aralığını aşıyorsa, örnekleri elusiyon tamponu ile seyreltin.

3. Taramalı Elektron Mikroskopi (SEM) ile biyofilm görselleştirmesi

1. Bir BSL2 biyogüvenlik başlığının içinde, steril forseps kullanarak her kuyunun dibine bir adet 12 mm steril cam kapak veya bir adet 0,1 μm steril hidrofilik polikarbonat membran döşenir, her kuyunun dibine 24 kuyruklu steril bir plaka ve kapaklı yerleştirilir. Membran/cam kapak örtüsünü 30 °C'de 2 saat boyunca 1 mL steril EMJH ile önceden ıslatın.
2. Bekletme çözeltisini çıkarın ve her kuyuya 1,5 mL seyreltilmiş bakteriyel süspansiyon (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ hücre/mL) ekleyin. Örtü veya membranın alt kısımda sağlam bir şekilde durduğundan emin olun.
3. Levhayı 30 °C'de, nem kontrol kuluçka makinesinde inkübe yapın, böylece kültür ortamının buharlaşmasını önleyin. Yavaş büyüyen suşlar için, olgun ve yapışkan bir biyofilm oluşumunu sağlamak amacıyla 3 haftalık kuluçka önerilir
4. İstenilen zamanda, biyofilmi rahatsız etmeden her kuyiden mümkün olduğunca çok kültür ortamını dikkatlice çıkarın.
5. Sonra her kiyi 1 mL steril PBS ile nazikçe durulayarak yapışmayan kalıntıları çıkarır, kapak kaşagını kuyunun dibine düz tutarak, hassas biyofilm hücrelerinin ayrılmasını önlemek için. Bu koşullarda, biyofilm büyümesi ağırlıklı olarak örtü yüzeyinin üst yüzeyinde gerçekleşir, alt tarafta ise minimum büyüme olur; bu nedenle kaldırmadan durulama, yüzeye bağlı hücrelerin aşağı akış analizleri için zenginleşmeye yeterlidir.
   NOT: Biyofilmler bu aşamada son derece kırılgandır ve yanlışlıkla kolayca aspirasyon olabilir. Pipetleme, biyofilmin bozulmamasını önlemek için kuyu duvarı boyunca yavaş ve hassas şekilde yapılmalıdır.
6. Biyofilmi sabitlemek için %4 paraformaldehit (PFA) ve %1 glutaraldehit içeren sodyum kakodilat tamponunda (0,2 M, pH 7,4) bir çözelti doğrudan kuyuya ekleyin.
7. 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın, ardından fiksatoru çıkarın ve örtü veya membranı PBS ile iki kez durulayın. Bu yaklaşım, yüzeye bağlı biyofilmi korur ve ayrılmayı en aza indirir; çünkü bizim koşullarımızda çoğu biyofilm büyümesi örtü yüzeyinin üst yüzeyinde gerçekleşir.
   NOT: Fiksasyon için, %4 formaldehit ve %1 glutaraldehit çözeltisi taze hazırlanmış (%16 metanolsüz stok, sodyum kakodilat tamponunda 1:4 seyreltilmiş şekilde) ve kullanımdan sonra atılmıştır, çünkü paraformaldehite polimerizasyon çapraz bağlama aktivitesini azaltır.
8. Substratı PBS içinde seyreltilmiş %1 osmiyum tetrooksit (OsO₄) içine batırarak SEM kontrastını artırın. PBS ile iki kez durulayın.
9. Numuneleri, her biri 10 dakika boyunca artan konsantrasyona sahip derecelendirilmiş etanol serilerine sıralı olarak daldırarak kurutun.
10. 500 μL heksametildisilazan ekleyin ve 5 dakika kuluçka yapın, ardından taze HMDS ile değiştirin ve ek 5 dakika kuluçka yapın. Fazla HMDS'yi çıkarın ve numunenin duman kaputu altında tamamen hava kurumasına izin verin.
    NOT: Glutaraldehit, PFA, sodyum kakodilat, osmiyum tetroksit ve heksametildizilazon toksiktir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla kimyasal bir buhar kapüşonu altında tutulmalıdır.
11. Kurutulmuş örnekleri çift taraflı iletken karbon bant kullanarak SEM kıvılcımlarına monte edin. Örnekleri ince bir tabaka (~10 nm) altın veya platin ile Sputter ile kaplamak için yeterli elektron kontrastı sağlanır. Bu, hücre-hücre temasları, hücre dışı matris morfolojisi, yoğunluk ve heterojenlik dahil olmak üzere biyofilm mimarisinin yüksek çözünürlüklü görselleştirmesini sağlar; ek boya veya boyaya ihtiyaç duyulmaz.
12. Stubları uygun örnek tutucuyla SEM'e yükleyin. Mümkün olduğunda görüntü kalitesini artırmak için odayı gece boyunca boşaltın, ardından 5 - 15 kV hızında ikincil elektron görüntüleri alın ve uygun büyütmeler alınarak biyofilm ultrayapısını ortaya çıkarın (Şekil 2).

4. Büyüyen biyofilmin zaman geçişli faz kontrastlı görüntülemesi

1. Çalışan aşıdan 500 μL pipet, ≈menisküs bozulmasını önlemek için düzlem paralel kapakla donatılmış steril 35 mm tabanlı cam tabanlı Hi-Q4 çanakta bırakılır. Baloncuk sokmaktan kaçının ve tabağı hemen kapatın.
   NOT: 35 mm cam tabanlı Hi-Q4 kab, 4 farklı durumu aynı anda görüntülemek için kullanılabilen 4 farklı kültür alanı içerir. Bir bölmeyi steril EMJH ortamına negatif kontrol olarak, diğer üç bölmeyi ise teknik kopyalar veya farklı suşlar/mutantlar için tahsis edin.
2. Çanak, faz kontrast optikleri, motorlu odak sürücüsü (Biostation IMQ) ve 30 °C ile %95 göreli nem ayarlı nemli bir kapasa ile donatılmış ters bir mikroskobun çevresel aşamasına yerleştirin. Bu koşullar, uzun süreli görüntüleme sırasında (8 güne kadar) buharlaşmayı en aza indirmeye yardımcı olur.
3. BioStation IMQ uygulamasını başlatın ve ana arayüzde Yeni Zaman Geçişi Ayarı penceresini açın, yapılandırma paneline erişin. Deneye başlamadan önce, Durum Ekranında çevresel parametreleri kontrol edin; böylece hem Chamber hem de Su sıcaklığı göstergelerinin Stabil gösterdiğinden emin olun; böylece alım sırasında çerçeve kayması önlenir.
4. Yeni Zaman Geçişi Ayarları ekranında, Canlı sekmesini seçin ve görüntüleme parametrelerini Gözlem Durumu panelinde Faz Kontrastı (Ph) filtresi olarak seçerek ve Büyütmeyi 20 X olarak ayarlayarak ayarlayın.
5. Manuel Mod altında, kontrastı optimize etmek ve doygunluğu önlemek için Işık Yoğunluğu ve Pozlama Süresini ayarlayın. Bunu Doygunluk Kontrolü butonu ile doğrulayın. Dört bölmenin merkezlerine karşılık gelen dört toplama noktası tanımlanır.
6. Sahneyi Jog Dial ile veya Canlı Gözlem Görüntü Ekranı'na doğrudan tıklayarak her bölmenin üzerine sıralı olarak konumlandırın.
7. Odak Düğmeleriyle odak noktasını iyileştirin ve her konumu Time-lapse Experiment Point Registration butonuna tıklayarak kaydedin. Kayıtlı noktalar, Gözlem Noktası Doğrulama Ekranında numaralı mavi çerçeveler olarak görünür ve Puanlar Sekmesinde onaylanır.
8. Zaman sekmesini açarak ve Yeni tuşuna tıklayarak Zaman Geçişi Diyalog Kutusu'na erişerek edinim programını programlayın; burada Satın alma Döngüsü 30 dakika, Toplam Süre ise 7 gün olarak ayarlanmıştır.
9. Uygula tuşuna tıkladıktan sonra, yazılım satın alma turlarının sayısını otomatik olarak hesaplar. Başlık çubuğuna sağ tıklayarak, Tercihler'i seçerek ve AF Modu'nu etkinleştirerek her aşama pozisyonunda yeniden odaklanmayı garanti ederek otomatik odaklama etkinleştirin. Tüm noktalarda Pozlama Ayarları, Kazanç ve Işık Yoğunluğu tutarlılığını doğrulayın, ardından tüm yapılandırmayı Kaydet butonuyla kaydedin.
10. Satın alma işlemini başlatın, Timelapse'a Başla tıklayarak. Yazılım otomatik olarak Time-lapse Images'e geçer; böylece 7 günlük deney boyunca alım ilerleyişi ve odanın stabilitesinin sürekli izlenmesini sağlar. Tüm görüntüler, yazılım tarafından oluşturulan deney klasöründe otomatik olarak TIFF formatında kaydedilir.
11. Görüntü serisini FIJI'ye aktararak işleyip nicelikle ölçer (Şekil 3A, B, C).
12. Her konuma uygun görüntü yığınlarını Dosya > İç Aktar > Görüntü Dizisi ile açın, böylece karelerin kronolojik sırayla yüklendiğinden emin olun.
13. Hizalanmış yığınları Image > Type > 8-bit kullanarak piksel yoğunluğunu standartlaştırmak için 8 bit gri tonlamaya dönüştürün.
14. Eşiklendirme uygulamak için Image > Adjust > Threshold ile bakteriyel biyofilm bölgelerini izole edin. Tüm karelerde tutarlı eşik ayarları uygulayarak Uygula seçeneğini seçin, ardından sonucu Process > Binary > Make Binary ile ikili bir maske olarak kaydedin.
15. Parçacıkları Analiz > Analiz Etme ile nicelik gerçekleştirin, Alan, Yüzde Alan ve Ortalama Yoğunluk gibi parametreleri kaydedin.
16. Her karedeki sonuçları kinetik analiz için Sonuçlar penceresi (Dosya > Kaydet > .csv) üzerinden otomatik olarak bir elektronik tabloya dışa aktarın. Tüm ölçümleri, biyofilm tarafından kaplanan alan alanının oranı olarak ifade edin (yüzey kapsamı).

5. Konfokal Taramalı Lazer Mikroskopisi (CLSM) kullanılarak biyofilm görselleştirmesi

1. Çalışan aşıdan 1,5 mL (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ hücre/mL; bkz. Bölüm 1) steril 35 mm cam tabanlı bir kaba içine aşılayın. İstenilen gelişim aşamasına (21 güne kadar) ulaşılana kadar 30 °C sıcaklıkta su rezervuarı içeren nemli bir kutuda statik kuluçka yapın.
2. Seçilen zaman noktasında, ortamı biyofilmi rahatsız etmeden tabak duvarı boyunca dikkatlice aspirasyon yapın. Planktonik hücreleri çıkarmak için 2 mL steril PBS ile bir kez durulayın; biyofilmin ayrılmaması veya bozulmaması için son derece dikkatli olun.
3. Sabitlenmemiş (canlı) biyofilmlerle kuluçka gerektiren boyama çözeltileri hazırlayın (fiksasyondan önce yapın).
   1. Canlı/ölü boyama için, 10 mL PBS'ye 3 μL SYTO9 yeşil floresan nüklein asit boyama (1,67 mM) ve 3 μL propidium iyodid (18,3 mM) eklenerek boyama çözeltisi oluşturulur. 200 μL boyama çözeltisini doğrudan biyofilm oluşturan bakteriye ekleyin, ardından oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika kuluçka yapın ve PBS'de bir kez durulayın.
   2. Canlı hücre izleyicisi, fiksasyondan önce hücreleri boyamak için de kullanılabilir. Canlı hücreleri 10 μM CFDA/SE izleyici ile 30 dakika kuluçka yapın. Alternatif olarak, membranları FM4-64 ile 5 μg/mL konsantrasyonda etiketlemek de kullanılabilir. PBS'de bir kez durulayın.
4. Biyofilmi PBS'de %4 paraformaldehit çözeltisi 2 mL ekleyerek sabitleyin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın. Fiksanti çıkarın ve PBS ile iki kez durulayın.
5. Biyofilmi kapatmak ve kabarcıkları önlemek için bir damla antiifade montaj ortamı ekleyin.
6. Ayarlanabilir beyaz ışık lazeri (WLL) ve HC PL APO CS2 63×/1.4 NA yağ batırıcı objektif ile donatılmış ters konfokal mikroskopta Z-yığınları edinin. CFDA/SE için, uyarımayı 488 nm olarak ayarlayın ve 1 Airy birimi (AU) iğne deliği kullanarak 500-550 nm arasında emisyon toplayın. FM4-64 için, uyarımayı 561 nm olarak ayarlayın ve 630-700 nm arasında emisyon tespit edin, yine 1 AU bir iğne deliği ile.
7. Tüm biyofilm kalınlığı boyunca 0,5-1,0 μm aralıklarla Z-yığınları alın. Lazer gücünü ve dedektör kazancını dinamik aralığı maksimize etmek için ayarlayın ve doygunluğu (<%1 doymuş piksel) önleyin.
8. Sinyal-gürültü oranını iyileştirmek ve tüm görüntüleme parametrelerini (lazer gücü, dedektör bant genişliği, iğne deliği boyutu, tarama hızı) örnekler arasında sabit tutmak için hat ortalaması (2-4×) kullanın.
9. Görüntü yığınlarını 12-bit dosya olarak kaydedin ve FIJI'de nicel analiz için .lif formatında dışa aktarın (ImageJ).
   NOT: Görüntülemeden önce, mikroskop ayarlarının (örneğin, lazer gücü, dedektör kazancı, iğne deliği boyutu) aynı boyalarla boyanmış kontrol örnekleri kullanılarak standartlaştırıldığından emin olun. Bu kalibrasyon adımı, alımlar arasındaki değişkenliği en aza indirmek ve deneyler arasında güvenilir karşılaştırma sağlamak için gereklidir.
10. COMSTAT eklentisi (veya eşdeğer 3D analiz yazılımı) ile donatılmış FIJI kullanarak konfokal görüntü yığınlarını işlemek ve ^{niceliklendirmek10}. Biyohacim, ortalama ve maksimum kalınlık, yüzey kapsamı ve canlı/ölü oranlarını (veya diğer önceden tanımlanmış metrikleri) ölçün. İllütsel amaçlarla ihracatçı temsilci ortogonal görünümler ve maksimum yoğunluk projeksiyonları (Şekil 3D, E).

6. 96 delikli mikrotiter testlerinde biyofilm oluşumu sırasında bağlı ve bağlanmamış fraksiyonların zaman çözünürlüklü nicelendirilmesi

1. Çalışan inokulumdan 200 μL (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ hücre/mL; bkz. Bölüm 1) 96 kuyuyla bir plakanın kuyularına aşılan. İstenilen zaman noktasına kadar 30 °C'de statik kuluçka yapın (3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 veya 21. günler).
   NOT: 96 kuyu plakaları kullanılırken, özellikle kuluçka makinesi nem kontrolü yoksa, sınır etkileri ve buharlaşma yaygındır. Bu etkileri en aza indirmek için, tüm çevresel kuyulara 200 μL steril damıtılmış su ekleyin. Ayrıca, su deposu içeren nemlendirilmiş bir kutuya plakalar yerleştirildi; bu kutu daha sonra buharlaşmayı azaltmak ve kuyular boyunca tutarlı nemi korumak için kuluçka içine yerleştirildi.
2. Her zaman noktasında, üç örnek türü hazırlanın:
   1. Tam süspansiyon - Biyofilmi içeren bir kuyunun tüm içeriğini, birkaç kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyerek homojenleştirin, böylece baloncuk oluşumunu önleyin. Bu fraksiyon, hem yapışmamış leptospireler hem de yarı-yapışkan biyofilm içindekiler dahil olmak üzere toplam bakteri popülasyonunu temsil eder. Bu homojenleştirme adımı, sonraki soğurma ölçümlerini engelleyebilecek hücre agregalarının dağılmasına yardımcı olur.
   2. Sıvı faz - İkinci bir kuyudan, biyofilm tabakasını rahatsız etmeden süpernatantın 180 μL'sini dikkatlice çıkarın. Boş bir kuyuya aktarın ve 20 μL taze EMJH ortamı ekleyin. Hücre agregalarını dağıtmak için birkaç kez yukarı ve aşağı nazikçe pipet yapın. Bu fraksiyon, sıvı fazda bulunan ve hem serbest asılı leptospirleri hem de ayrılmış biyofilm agregalarını içerebilir ve bağlanmamış hücreleri temsil eder.
   3. Biyofilm - Aynı kuyuda 2.2. adımda kullanılan, kalan biyofilmi 180 μL taze EMJH ortamı ekleyerek ve nazikçe birkaç kez yukarı aşağı pipetle yeniden askıya alın. Bu fraksiyon, biyofilm içindeki leptospirelere karşılık gelir.
3. Her süspansiyonun 405 nm soğurgunluğunu spektrofotometre ile ölçün, her kuyunun tamamen homojenleştirildiğinden emin olduktan sonra değerleri çizerek temsil eden bir grafik oluşturun (Şekil 4A).

7. Konak enfeksiyonu sırasında biyofilmin işlevsel rolünün araştırılması

1. Çalışan inokulumdan 200 μL (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ hücre/mL; bkz. Bölüm 1) 96 kuyuyla bir plakanın kuyularına aşılan. İstenilen gelişim aşamasına (21 güne kadar) ulaşılana kadar 30 °C'de statik kuluçka yapın.
2. Aşı konsantrasyonunu belirlemek için, sadece büyüme izleme için kullanılacak ve hayvan enjeksiyonu için kullanılmayacak özel "biyofilm kontrol" kuyuları ayırın. Biyofilm makroskopik olarak görünür hale geldiğinde, biyofilmi rahatsız etmeden bir kontrol kuyusundan 180 μL süpernatantı nazikçe çıkarın. 180 μL taze EMJH ortamı ile değiştirin, biyofilm agregalarını baloncuklar oluşturmadan dikkatlice yeniden askıya alın ve bakteri konsantrasyonunu tahmin etmek için_{OD 405'i} ölçün.
   NOT: Prensipte, nicelikten önce kuyuların yıkanması, yapışmayan hücrelerin çıkarılmasına yardımcı olabilir. Ancak, Leptospira biyofilmleri 96 kuyulu plakalarda zayıf yapışma gösterdiğinden, yıkama kontrolsüz biyofilm malzeme kaybına yol açar. Bu nedenle, yeniden süspansiyon adımı önceden yıkamadan yapıldı; böylece kuyular arasında tekrarlanabilirlik ve tutarlı bakteri konsantrasyonları sağlandı.
   Biyofilm kontrol kuyuları genellikle ~2 x 10⁸ leptospirler içerir ve bu leptospirler hamster enfeksiyonu deneyleri için standart aşı olarak seçilmiştir. Bu konsantrasyon ayrıca kontrol olarak kullanılan planktonik leptospirelerin hedef sayısını da belirler. Planktonik kontroller dahil edildiğinde, Leptospira EMJH ortamında 30 °C sıcaklıkta 5 güne kadar sarsıntı koşullarında taze alt kültüre alınarak hazırlanır; bu, benzer hücre yoğunluğu sağlayan orta ve geç üstel büyüme aşamasına karşılık gelir.
3. Hayvan aşısı için ayrı biyofilm kuyuları kullanın (kontrol kuyuları değil). Kuyulardan dikkatlice 180 μL süpernatan çıkararak çoğu sıvı faz leptospirleri ortadan kaldırın.
4. Kalan 20 μL biyofilm agregalarını 200 μL pipet ucu kullanarak toplayın; böylece yapının bozulmaması sağlanır.
   NOT: Biyofilm kırılgandır. Agregaların toplanmadan önce ve sonra görünür olduğundan emin olun. Tekrarlama gerekirse ekstra kuyular hazırlayın.
5. Agregaları 300 μL taze EMJH ortamıyla önceden doldurulmuş bir şırıngaya aktarın. Agregaların yerçekimiyle çökmesine izin verin.
6. 21 G'lik bir iğne takın ve fazla EMJH'yi nazikçe dışarı atarak son 200 μL hacme ulaşın. Hava kabarcıklarının kalmadığından ve biyofilm agregalarının görünür kaldığından emin olun.
   NOT: Agregaların çözülmesini beklemek, hacim ayarlaması sırasında kaybı en aza indirir. In vivo kullanımdan önce, agregaların 21 G'lik bir iğneden geçtikten sonra sağlam kaldığını doğrulayın (Şekil 4C, D).
7. 200 μL EMJH ortamında 2 x 10⁸ leptospirin intraperitoneal enjeksiyonu yapılacaktır.
   NOT: 7-8 haftalık altın Suriyeli hamsterları (her iki cinsiyet) kullanın, standart barınma koşullarında bakımı yapılsın. Negatif kontroller için sadece 200 μL EMJH ortamı enjekte edin (her çoğaltma başına bir hayvan).
8. Hayvanları leptospirozun klinik belirtileri (kabarcık tüy, secde etme ve uyarıya karşı azalmış yanıt) günde iki kez 21 güne kadar izleyin. Acı gözlemlenirse hemen karbondioksit soluma yoluyla ötenazi yapın ve ötenazi süresini ölüm zamanı olarak kaydedin.
9. 21. günde, hayatta kalan tüm hayvanları ötenazi yapın.
   NOT: Farklı tarihlerde hazırlanmış kültürlerle üç bağımsız biyolojik kopyalama yapın. Her çoğaltma her durum için iki hayvan ve bir negatif kontrol hayvanı içerir.

Results

Aşı doğru şekilde hazırlandığında, kültürler 3-5 gün içinde orta günlük faza girer ve karanlık alan mikroskopisi altında parlak, yüksek hareketli alanlarla (≥hücrelerin %90'ı hareketli) ve görünür kümeler olmadan ~ 0.2-0.4 OD₄₀₅ değerleri gösterir. Optimal olmayan preparatlar ise yavaş bakteriler ve alanda heterojen hareketlilik olarak görülür; Bu tür kültürler genellikle zayıf biyofilm üretir ve atılmalıdır. Pratikte, tohumlama öncesinde hareketlilik ve OD'nin yan yana doğrulanması, başarısız koşuları en aza indirir. Bu kalite kontrol kapılarını inokulum aşamasında kurmak, sonraki uygulamalarda başarının en iyi göstericisidir. Metodoloji, L. interrogans serovar Manilae L495 için optimize edilmiş olsa da, aynı prosedürler türler çapraz uygulanabilirliği göstermek için Leptospira biflexa Patoc suşuna da uygulanmıştır. L. biflexa genellikle L. interrogans'a kıyasla daha az uyumlu ve ince biyofilmler oluşturur, ancak karakteristik gelişimsel dizisi ve yapısal özellikler uygun parametre ayarlamalarıyla tespit edilebilir kalır. Her iki türün de dahil edilmesi, hem patojenik hem de saprofitik Leptospira'lara uyum sağlama yeteneğini vurgular.

Nemlendirilmiş bir odada 30 °C'de 21 gün statik kuluçka sonrası (veya kullanılan Leptospira türü için uygun süre), biyofilmler hem cam kapaklarda hem de hidrofilik polikarbonat membranlarda çıplak gözle görülebilir. Başarılı büyüme, 2-3 hafta sonra yüzeye bağlı nokta benzeri, dallanan veya retikülasyonlu ayak izleri gibi karakteristik CV desenleri üretir (Şekil 2A).

Tipik bir koşuda, vahşi tip L. interrogans Manilae L495 3. haftada ~%50 yüzey kapsamına ulaşırken, düşük biyofilm mutantlarının platosu yaklaşık %20 ve yüksek biyofilm fenotipleri ~%70-80 civarında olur, bu da tarama için pratik bir dinamik aralık oluşturur. Biyofilm oluşumunun kapsamı da Leptospira türüne ve suşuna bağlı olarak değişebilir; örneğin, L. biflexa Patoc suşu görünür biyofilmleri daha hızlı geliştirir; önceki çalışmalar, aşılamadan 120 saat sonra bile yapıların olgun biyofilmler olarak kabul^{edildiği görülür 35}.

Kristal menekşe boyama, biyofilm biyokütlesini nicelendirmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem sunar. İyi gelişmiş biyofilmlerde, boyama örtü veya membran alanında lokalize derin mor renk oluşur ve bu da yüksek miktarda birikmiş biyokütle olduğunu gösterir (Şekil 2A). Boyama ve çözümleme aşamalarındaki görsel ipuçları da protokol başarısının faydalı göstergeleri sağlar. Örneğin, dengesiz CV dağılımı veya soluk lekelenme, erken biyofilmlerin ayrılmasına neden olan düşük tohumlama, buharlaşma veya agresif yıkama nedeniyle olabilir.

570 nm'deki absorbans ölçümleri, tutulan leke miktarını ve dolayısıyla göreli biyofilm yoğunluğunu yansıtır (Şekil 2B). Temsilci deneylerde, optimal koşullarda yetiştirilen L. interrogans kültürleri, çoğaltmalar arasında tutarlı ve tekrarlanabilir OD₅₇₀ okumaları gösterir ve bu da kararlı biyofilm oluşumunu yansıtır. Buna karşılık, örnekler ortam değişimleri sırasında aşırı pipetlendiğinde kopyalar arasında büyük farklılıklar sıklıkla gözlemlenir; bu da zayıf yapışma veya kısmi biyofilm ayrılmasını gösterir. Bu tür değişkenlik teknik sorunların bir işareti olarak değerlendirilmeli, etkilenen örnekler dışlanmalı veya protokol dikkatlice incelenmelidir. Özellikle, L. biflexa Patoc benzer koşullarda hem cam kapak kapaklarında hem de polikarbonat membranlarda daha kapsamlı biyofilmler oluşturur; bu da daha yüksek CV emilimi değerlerinde yansımaktadır ve protokolün Leptospira türleri arasında uyarlanabilir ve etkili olduğunu gösterir.

Başarılı SEM hazırlığı, hücre dışı matris birikintilerini 3. günden itibaren ortaya çıkarabilir; olgun biyofilmlerde çarpıcı şekilde polarize bir mimari ortaya çıkar: gür, kanallı bazal yüz (genellikle > 5 μm kanallı) ve spiroketlerin yoğun matriksle iç içe geçmiş olduğu daha pürüzsüz bir apikal yüz (Şekil 2C, D, E, F). Yüksek büyütme alanları sıklıkla dallanan hücre dışı filamentleri ve ara sıra mantar benzeri çıkıntıları yakalar; zaman geçişiyle görülen birleşme dinamiklerine karşılık gelen özellikler (Ek video 1). Optimal olmayan preparatlarda, genellikle yetersiz fiksasyon, yetersiz iletken kaplama veya kötü kuruma nedeniyle çökmüş matrisler, şarj ve belirsiz hücre hatları gözlemlenebilir. Bazal-apikal polarite ve yaygın kanallar belirgin olduğunda, SEM okumaları kalınlık ve gözeneklilik konfokal tahminleriyle yakından örtüşür ve hem hazırlık hem de görüntülemenin başarılı bir şekilde uygulandığını doğrular.

Etkili zaman geçişli serilerde, izole noktalar 24-72 saat içinde ortaya çıkar ve mekân kısıtlamaları hareketlerini yavaşlatmadan önce yüzeyde süpürülen daha büyük agregalara kademeli olarak birleşir (Şekil 3A, B, C). Nicel segmentasyon, toplam kaplı alanda monoton bir artış sağlarken, toplam sayımları ~12 ile 216 saat arasında çarpışmalar ve birleşmeler hakim olarak artır, zirve yapar ve ardından azalır. Bu kinetikler (alan yukarı, agrega sayısı aşağı), basit sedimentasyon yerine aktif birikmeyi gösterir. Başarısız veya sınırda olan koşularda erken nokta yoktur, zaman içinde düz alan eğrileri gösterir veya dengesiz sıcaklık/nem nedeniyle odak kayması yaşar. %95 nemli stabilize 30 °C ortam ve her zaman noktasında otomatik odaklama kullanmak, mutantlar veya tedaviler karşılaştırmak için uygun net yörüngeleri geri getirir.

Olgun biyofilmlerden elde edilen temsil Z-yığınları, genellikle 50 μm kalınlığında köpük benzeri, çok katmanlı mimariye sahiptir; çoğu hücre canlı (SYTO 9-pozitif) ve zaman zaman merkezi boşluklar büyüme sırasında kolektif yeniden düzenlemelere işaret eder (Şekil 3D). Matris probları matris bileşimini araştırmak için kullanılabilir: WGA polisakkarit epitoplarını vurgular, BOBO-3 bol hücre dışı DNA'yı işaretler ve protein seçici boyalar hücre dışı sinyal çok az katkı sağlar (Şekil 3E). Optimal olmayan sonuçlar arasında, propidium iyodürün hakim olduğu ince veya kesintili yığınlar, güçlü foto ağartma veya tutarsız kazanç ayarları bulunur; bunların her biri nicel karşılaştırılabilirliği zayıflatır. Kalınlık, biyohacim ve canlı/ölü oranlarının birlikte yorumlanması (lazer gücü, dedektör kazancı ve iğne deliği koşullar arasında sabit tutarken) olgunlaşma durumunu doğrular ve SEM ultrastrukturu ile CV biyokütlesi ile doğrudan karşılaştırmaları destekler.

Leptospira'nın biyofilm oluşum süreci genellikle farklı aşamalar izler, ancak kesin zamanlamalar ve değerler türe veya suşa göre değişebilir. Referans olarak L. interrogans süzü Manilae L495 kullanıldığında, 21 gün boyunca beklenen ilerleme, bakterilerin çoğunlukla planktonik ve minimum biyofilm ile kaldığı bir başlangıç aşamasını (0-3. günler) içerir (Şekil 4A). Bunu, hem planktonik hem de biyofilm ilişkili bakterilerin arttığı, yaklaşık 9 x 10⁸ hücre/mL oranına ulaştığı üstel bir büyüme aşaması (3-7. günler) takip eder; bu süreçte biyofilm agregaları oluşup genişleme ile birlikte gerçekleşir. 7 ile 12. günler arasında planktonik bakteriler önemli ölçüde azalırken, biyofilm ile ilişkili hücreler zirveye ulaşır ve nüfusun yaklaşık %80'ini temsil eder. Son olarak, olgunlaşma aşamasında (12-21. günler), biyofilm bakteri sayısı planktonik hücrelerde artış olmadan azalır, ancak biyofilm boyutu ve karmaşıklığı büyümeye devam eder. Bu değişim dizisini gözlemlemek, protokolün Leptospira biyofilmlerinin dinamik gelişimini ve olgunlaşmasını etkili bir şekilde yakaladığını gösterir.

Doğru şekilde uygulandığında, enfeksiyon protokolü iyi tanımlanmış planktonik (5 günlük) veya biyofilm (21 günlük) kültürlerden hazırlanmış 200 μL EMJH içinde ~2 x 10⁸ leptospirler içeren inokula kullanır. Bu iki kültür tipi farklı fizyolojik durumları temsil etse de, bu fark kasıtlıdır; çünkü deney, azalmış metabolik aktivite ve yapısal farklılaşma ile karakterize edilen Leptospira biyofilmlerinin enfeksiyonu başlatma yeteneğini koruyup korumadığını belirlemeyi amaçlamaktadır. Bu zıtlık, planktonik ve biyofilm Leptospira^35,36 arasında gen ifadesinde önemli değişiklikler gösteren transkriptomik çalışmalarla desteklenmektedir. Biyofilm agregaları, enjeksiyondan önce doğrulandığı gibi yapılarını korumak ve 21 G'lik bir iğneden geçtikten sonra sağlam kalmak için dikkatlice hasat edilir (Şekil 4C, D). İntraperitoneal enjeksiyondan sonra, altın Suriye hamsterları genellikle 3 ila 5 gün içinde leptospirozun klinik belirtilerini gösterir (örneğin, halsizlik, kabarcık tüy, çökme). Sadece EMJH ortamı ile enjekte edilen negatif kontrol kontrollerinde hastalık belirtisi göstermemektedir. Klinik belirtilerin ilerlemesi ve şiddeti, ayrıca ötenazi süresi aşıya göre değişir: planktonik bakteriler genellikle daha erken ve daha akut semptomlara yol açarken, biyofilm kaynaklı agregalar gecikmeli ancak kalıcı enfeksiyona neden olabilir (Şekil 4B). Günde iki kez, 21 güne kadar izlemek, hastalığın tam seyrini yakalamayı sağlar.

Şekil 2. Leptospira biyofilmlerinin kristal mor boyama, nicelik ve ultrastruktural görüntüleme. (A) Farklı substratlarda yetiştirilen biyofilmlerin kristal menekşe (CV) boyaması. CV boyama, farklı türler ve substratlar için biyofilm mimarisi ve ilk yapışma desenlerinin görselleştirilmesini sağlar. i. L. polikarbonat filtre üzerine araştırmacılar; ii. L. biflexa polikarbonat filtre üzerinde; iii. L. cam kapak üzerine sorgulamalar; iv. L. biflexa, cam kapak üzerinde. (B) L. interrogans ve L. biflexa için zaman içinde CV emilimiyle (OD570 nm) değerlendirilen nicel biyofilm oluşumuna örnek. Bu kinetik okuma, hem erken yapışma hem de biyokütle birikim dinamiklerini yakalarak, patojenik ve saprofitik türler arasındaki biyofilm büyümesindeki farklılıkları vurgular. Bu rakam^27'den değiştirilmiştir. (C-E) L. interrogans biyofilmlerinin taramalı elektron mikroskopisi (SEM): (c) 3 günlük biyofilm, erken mikrokoloni oluşumunu ve ilk hücre dışı matriks birikimini gösteriyor; (d) olgun mimariyi geniş matris ve üç boyutlu organizasyona sahip 14 günlük biyofilm; (e-f) Uzun süreli kültür boyunca yapısal konsolidasyon ve matriks olgunlaşmasını gösteren 3 haftalık biyofilm. CV boyama, nicel OD ölçümleri ve SEM görüntülemenin bu kombinasyonu, erken yapışmadan olgun ultrastruktural organizasyona kadar biyofilm gelişimine kapsamlı bir bakış sunar ve türler ve kültür süreleri arasında doğrudan karşılaştırma imkanı sağlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Leptospira biyofilm oluşumunun görselleştirilmesi. BioStation ile alınan faz kontrast görüntüleri, (A) 48 saat, (B) 96 saat ve (C) 144 saat biyofilm gelişimini gösterir. (D) 3D görselleştirme için ortogonal dilimlerle toplam biyohacmi gösteren Leptospira biyofilminin CLSM rekonstrüksiyonu. (E) Olgun bir biyofilmin DAPI (yeşil) ve WGA (kırmızı) ile konfokal boyaması, bakteri hücreleri ve ekstrahücre matris bileşenlerini vurgulamak. Bu rakam^37'den değiştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. Planktonik ve Biyofilm Fraksiyonlarının Zaman Çözümlü Nicelleştirilmesi ve Leptospira biyofilmlerinin fonksiyonel değerlendirmesi. (A) 405 nm'de absorbansla ölçülen biyofilm oluşumunun kinetiği Her zaman noktası için, toplam kuyuyu, biyofilm fraksiyonu ve planktonik leptospireleri içeren süpernatanttan ölçümler alındı; böylece bağlı ve serbest yüzen bakteriler arasında ayrım yapıldı. (B) Biyofilm agregaları, planktonik leptospirler veya EMJH kontrolü ile enjekte edilen hamsterların hayatta kalma eğrilerine örnek örnekler. Biyofilm enjekte edilen hayvanlar azalmış virülans gösterir; bazıları 21 gün hayatta kalırken, planktonik leptospireler hızlı ölümlere neden olur. (C-D) Biyofilm bütünlüğünün ön doğruluğu: agregalar enjeksiyondan önce şırıngada görünür (C) ve 21 G'lik bir iğneden (D, beyaz oklar) geçtikten sonra sağlam kalır; bu da biyofilm yapısının işlem sırasında korunduğunu doğrular. Bu rakam^36'dan değiştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokol, Leptospira biyofilmlerinin incelenmesi için modüler ve bütünleyici bir iş akışı sunar; nicel biyokütle (kristal menekşe)^9,27, dinamik (zaman geçişli faz kontrastı), üç boyutlu bileşim (hedefli problarla konfokal lazer taramalı mikroskopi^), ultrayapı (taramalı elektron mikroskopisi) ve fonksiyonel değerlendirme (hamster enfeksiyonu) entegre edilir. Aynı kültür serileri modüller arasında kullanılarak, toplu etkiler en aza indirilir ve deney içi çapraz doğrulama etkinleştirilir; bu özellikle yavaş büyüyen, kırılgan spiroketler için önemlidir. Her modül diğerlerini tamamlıyor: CV "ne kadar" niceliklerini belirler, time-lapse "ne kadar hızlı" olduğunu gösterir, CLSM "içinde ne olduğunu gösterir", SEM "nasıl yapıldığını" çözer ve in vivo test "işlev kanıtı" sağlar. L. biflexa'nın dahil edilmesi, türler arasında uyum sağlama yeteneğini gösterir; daha hızlı ve yoğun biyofilm oluşumunu vurgular ve metodolojik esnekliği^vurgular.

Her modülün başarısı, aşı kalitesi ve fizyolojik duruma bağlıdır. Orta loglu planktonik kültürler (3-5 gün), yüksek hareketli ve agregalardan arındırılmış olanlar, tekrarlanabilir yapışma ve biyofilm gelişimi sağlar. Sağlam biyofilm oluşumu ve tekrarlanabilirliği sağlamak için yalnızca düşük geçişli izolatlar kullanılmalıdır.

CV testi, hızı, ölçeklenebilirliği ve^{verimliliği 9,27} üzerinden iş akışını sabitler. Mutantların, medyanın veya anti-biyofilm bileşiklerinin hızlı taramasını mümkün kılar. Ancak, Leptospira biyofilmleri kırılgan ve heterojen olduğundan, nazik manipülasyon ve çoğaltma doğrulaması gereklidir. CV, kompakt ve gözenekli mimarileri ayırt edemez veya matris bileşimini tespit edemez — bu nedenle daha derin yapısal analizler için bir tarama kapısı rolünü taşır.

Zaman geçişli görüntüleme, biyofilm kinetiklerini gerçek zamanlı olarak ortaya çıkararak bu boşluğu kapatıyor. Hareketli agregaların ortaya çıkışını, birleşmesini ve hareketsizleşmesini yakalarak, son testlerin gözden kaçırdığı geçici olayları ortaya çıkarır. Çevresel istikrar (sıcaklık, nem, otomatik odak) kritik öneme sahiptir. Bu kayıtlar, CV biyokütlesi stabil görünse bile dinamiklerin ayrılabileceğini göstermiştir — bu da daha derin tabakalarda yapısal yeniden düzenlemeler veya yaşamlılık kaybı anlamına gelir.

CLSM, dehidrasyon artefaktları olmadan hacimsel ve kimyasal içgörü^{sağlar 39}. Canlı/ölü boyama, biyofilm içindeki hücre canlılık gradyanlarını ortaya koymakta; bu da sınırlı oksijen difüzyonu ve metabolik tabakalaşma^{raporlarıyla uyumlu 6,40}. Lektinler ve nükleik asit boyaları, bol miktarda hücre dışı DNA ve spesifik glikan motiflerini ortaya çıkarır; bu da matriks^{bileşenlerinin nicelendirilmesine ve karakterizasyonuna olanak tanır 41,42}. CLSM verileri sıklıkla iç boşlukları ortaya koyuyor ve bu da zaman^{geçişi 38'de} görülen toplu yeniden düzenlemeleri yansıtıyor. Yine de, sınırlamalar arasında prob özgüllüğü, foto ağartma ve difraksiyonla sınırlı eksenel çözünürlük yer alır; Bu nedenle, mikroskop ayarları ve boya performansı, deneyler arasında güvenilir ve karşılaştırılabilir sonuçlar sağlamak için önceden standartlaştırılıp test edilmelidir.

SEM, tamamlayıcı ultrastruktural^{çözünürlük 43} sunar. Erken aşamalarda, yeni başlayan agregaları çözer; Olgunlukta (15-21 gün ≈), polarize bir mimariyi ortaya çıkarır: sabitleme ve değişim için kaba, kanallı bazal tabaka ve daha pürüzsüz, apikal matriks açısından zengin bir^{yüzey 37}. Dikkatli fiksasyon, HMDS kurutması ve konfokal verilerle korelasyon, dehidrasyon veya çökme nedeniyle oluşan artefaktları azaltır⁴⁴.

Bu dört modül birlikte iç çapraz doğrulamayı mümkün kılar: CV, CLSM ve SEM birleştiğinde sonuçlar sağlam olur; ayrıldıklarında, tutarsızlıklar bilgilendiricidir — örneğin, azalmış yaşama ile artan biyokkütle veya değişmemiş matriks bileşimiyle biyokkütle ortaya çıkar.

Birkaç içsel sınırlama hâlâ mevcuttur. Leptospira biyofilmleri heterojen ve hassastır, bu da onları ele geçirmeye ve susuzlaşmaya karşı hassas kılar. CV toplam biyokütleyi entegre eder ancak^{uygulanabilirliği değil 16}; CLSM, optik sınır^38'i aşamaz; SEM hazırlık artefaktlarını riske atıyor. Daha derin tabakalarda ölüm oranı oksijen^{gradyanları 6} nedeniyle beklenmektedir, ancak bu önyargı sistematik ve koşullar arasında karşılaştırılabilirdir. Biyofilm olgunlaşması, yaklaşık 15-21 gün içinde bir platoya ulaşır ve besin sınırlamasının transkripsiyonel^{imzalarıyla ilişkilidir 36}. Sonraki aşamalar ise kötü tanımlanmıştır.

In vivo testler fonksiyonel bağlam sağlar. Agregaların intraperitoneal enjekte edilmesi, biyofilm kaynaklı hücrelerin planktonik muadillerden virülans veya kalıcılık açısından farklı olup olmadığını test eder. İntraperitoneal aşılama doğal bir yol olmasa da, kontrollü karşılaştırmalı model³⁶ sunar. Toplam heterojenlik bazı varyans getirir, ancak tutarlı kullanım ve uyumlu inokulum boyutu bunu azaltır. Önemli olarak, biyofilm kalıcılığı özellikleri (örneğin, ECM aracılı stres toleransı) mutlaka gelişmiş akut virülansa dönüşmez; bu da biyofilm oluşumunun patojenik değil ekolojik rolünü^{vurgular. 24}.

Modüler tasarım, ölçeklenebilir kullanım sağlar. Hızlı tarama için CV ve zaman geçişi yeterli. Mekanik içgörü için CLSM ve SEM kompozisyonsal ve mimari çözünürlük ekler. Modüller, enzimatik veya kimyasal bozulmaları (DNaz, glikozidaz), glikanlar veya nükleik asitler için alternatif probları veya akış tepkilerini test etmek için mikrofluidik sistemleri entegre edebilir. Aynı aşı, transkriptomik veya proteomik analizler yapabilir ve biyofilm fenotipini doğrudan regülasyona (örneğin, c-di-GMP sinyalizasyonu, açlık tepkisi) bağlayabilir. Bu çerçeve ayrıca mutant tarama, çevresel bozulma testleri ve anti-biyofilm veya anti-virülans bileşik değerlendirmesini de kapsar.

Bu entegre iş akışı, izole gözlemleri Leptospira biyofilmlerinin tutarlı çok boyutlu bir anlayışına dönüştürür. Verimlilik (CV), dinamik (timelapse), kimya ve derinlik (CLSM) ile ultrastruktur (SEM) birleştirerek, yaklaşım Leptospira topluluklarının hareketli, gözenekli ve polarize doğasını sadık bir şekilde yakalar. Önceki^{çalışmaları} 17,35,36 genişleterek, koordine, modüler deneylerin tek yöntemli çalışmalarda görünmez olan fenomenleri ortaya çıkardığını göstermektedir — örneğin yaşama değerinin düşmesine rağmen artan biyokütle veya türler arasında farklı kinetik gibi. Sonuç olarak, bu yaklaşım türler, mutantlar ve koşullar arasında karşılaştırmalı, tekrarlanabilir ve işlevsel olarak ilgili analizleri destekler ve mekanik mikrobiyoloji, ekolojik dayanıklılık ve anti-biyofilm strateji tasarımı için bir temel sağlar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 & mikro; m steril hidrofilik polikarbonat membran	it4IP	1000M25/861N101/13
12 mm steril cam kapak slipi	SPL	330164
%16 paraformaldehit (PFA)	Termo Bilimsel	28908
21G iğne	BD Medical	304432
24 kuyu mikroplaka	NUNC	143982
35 mm cam tabanlı çanak	İbidi	81218-200
35 mm cam tabanlı Hi-Q4 çanak	İbidi	81156
96-kuyu mikroplakası	NEST	701001
Antifade montaj ortamı	Biorad	29410
Karbon kaplama	Leica Microsystem	Em ACE600
CFDA/SE izleyicisi	Biolegend	423801
İletken karbon yapıştırıcısı	Elektron Mikroskopi Bilimi	77816
Kristal menekşe (CV)	Sigma	C3886
Karanlık alan mikroskobu	Leica Microsystem	11888846	Leica DM4000 B, koyu bir fiel kondensörü ile donatılmış (cat n& grad; 11505142)
Etanol	VWR Kimyasalları	83813.36
FM4-64	Invitrogen	T3166
Buzul asetik asit	Supelco	1.00063
Glutaraldehit çözeltisi	Sigma-Aldrich	G5882
Hexamethyldisilazane	Acros Organics	120581000
Kuluçka makinesi	Memmert	IN30
Ters konfokal mikroskop	Leica Microsystem	Leica DMI6000 TCS SP8 X	Konfokal mikroskop SP8
Faz kontrast optikleriyle donatılmış ters mikroskop	Nikon	CELL-S2	BioStation IM-Q
Leptospira Orta Baz EMJH	Becton Dickinson	BD  279410	Leptospira için EMJH ortamı
Osmiyum tetrooksit (OsO4)	Sigma	BCCG9181
Propidium iyodid	Biyotyum	40017
Taramalı elektron mikroskobu	JEOL	JSM-IT300
Sodyum kakodilat tamponu	Termobilimsel Kimyasallar	15453149
Spektrofotometre Varioskan Lux	Termo Bilimsel	VLBL00GD0
Steril Fosfat-tamponlu Salin	Biosolve	0016232301BS
Şırınga (1 mL)	Chirana	CH03002L
SYTO9 yeşil floresan nüklein asit boyama	Invitrogen	S34854