Yöntem makalesi

Optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal üzerinde DNA-PAINT ile tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme

1.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69531

⸱

6 Ocak 2026

 ,  ,  , 
1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

Bu makalede

Özet

Bu protokol, optik foton yeniden atamalı olan dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak derin, tam hücre tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) uygulanma prosedürünü özetler; böylece özel optik veya karmaşık aydınlatmaya ihtiyaç olmadan DNA-PAINT görüntüleme mümkün olur.

Özet

Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM), hücresel yapıların nano ölçekli görüntülemesini mümkün kılar, ancak genellikle tam iç yansıtma floresansı (TIRF) ve yüksek eğimli ve optik tabaka (HILO) aydınlatmasının sınırlamaları nedeniyle örtü kılıfı yakınında görüntüleme ile sınırlıdır. Burada, optik foton yeniden ataması (SDC-OPR) ile donatılmış dönen disk konfokal mikroskopu kullanarak tüm hücrelerde SMLM gerçekleştiren bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, nano ölçekli topografyada (DNA-PAINT) görüntüleme için DNA noktaları birikimi kullanılarak tam hücre hacmi boyunca yüksek hassasiyetli tek moleküllü görüntüleme imkanı sağlar; özel optiklere veya karmaşık aydınlatma şemalarına gerek kalmadan. Protokol, ticari olarak mevcut bir dönen disk mikroskobunun (örneğin, CSU-W1 SoRA) SMLM görüntülemesi için ayarlanmasına adım adım rehberlik sağlar ve derin görüntüleme için optimize edilmiş satın alma parametreleri de dahildir. DNA-PAINT görüntüleme yapmak için hücre içi hedeflerin etiketlenmesi için örnek hazırlama adımları, DNA-PAINT görüntüleme yapmak üzere DNA-PAINT görüntüleme stratejileri de dahil olmak üzere belirlenmiştir. Görüntü edinimi, standart yazılım paketleriyle tek molekül lokalizasyonu ve yeniden yapılandırma ile takip edilir. Arka planı en aşağı indirme, yan çözünürlük optimize etmek ve tam hücre derinliği boyunca görüntüleme kalitesinin sağlanması için kritik hususlar da tartışılır. Bu erişilebilir protokol, araştırmacıların standart konfokal ekipman kullanarak derin, tüm hücre SMLM'leri yapmasına olanak tanır ve tek moleküllü görüntülemeyle ele alınabilecek biyolojik soruların yelpazesini membrana yakın bölgelerin ötesine genişletir.

Giriş

Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM)1, bireysel floroforların emisyonunu zamanında ayırarak nano ölçekli çözünürlüğe ulaşan bir süper çözünürlüklü teknikler ailesidir ve onları yüksek hassasiyetle lokalize eder. Başarılı SMLM, tek moleküllü olayları tespit etmek için yüksek sinyal-gürültü oranı (SNR) gerektirir; bu da geleneksel olarak yoğun ve yerel uyarılma sağlayan optik kurulumlarla sınırlı olmuştur. En yaygın konfigürasyonlar toplam iç yansıtma floresansı (TIRF)2 mikroskopisi ve yüksek eğimli lamine optik tabaka (HILO)aydınlatmasıdır. TIRF, örtü kayışından birkaç nanometre içinde floroforları seçici olarak uyaran bir alan oluşturarak arka plan floresansını azaltır ve böylece odak dışı aydınlatmayı bastırır. Ancak bu kısıtlama, TIRF'yi, ekstrasellüler alanına uzanan organeller gibi daha derin biyolojik yapıların görüntülenmesi için uygun kılmaz. HILO mikroskobu daha fazla penetrasyon derinliği sağlar ve cam alt tabakanın birkaç yüz nanometre üzerinde görüntüleme imkanı sağlar. Bu, görüş alanının (FOV)4 azalması ve giderek daha yüksek düzlemlerle düzensiz aydınlatma maliyetiyle gerçekleşir; bu da daha büyük hücresel yapılar için uygulanabilirliğini sınırlar. Daha yakın zamanda, kafes ışıklevhası 5,6,7 ve tek hedefli tek düzlem aydınlatma mikroskobu (soSPIM)8 gibi ışık tabakası mikroskopisi (LSM) teknikleri, SMLM'yi hacimsel ve doku ölçeğinde görüntülemeye genişletmiştir. Uyarılma ışınını ince, yapılandırılmış ışık tabakalarına şekillendirerek, LSM arka plan ve fototoksisiteyi azaltarak optik kesitleme sağlar. SoSPIM, tek bir pozlamada tespit eksenine dik odak düzlemlerini yakalarak ve neredeyse izotropik çözünürlüklü hızlı hacimsel görüntüleme imkanı sağlar. soSPIM uygulaması, tüm hücrelerde ve küçük organellerde (>20 μm derinlik) 40 nm'e kadar izotropik çözünürlükle ve minimum odak dışı arka plan ile 3D SMLMgöstermiştir 9. Güçlü yönlerine rağmen, bu yöntemler genellikle şeffaf örnekler, özel optik ve karmaşık hizalama gerektirir ve kalın örneklerde optik sapmalara ve saçılmaya karşı duyarlıdır.

Konfokal mikroskopi, dedektörün önündeki bir iğne deliği kullanarak odak dışı ışığı reddederek ve ışın taramaaynaları 10 ile birleştirerek alternatif sunar. Bu optik kesitleme yeteneği, yüksek SNR ile derin hacimsel görüntülemeyi mümkün kılar. Özellikle, dönen disk konfokal (SDC) mikroskobi, geleneksel görüntülemenin hızını ve geniş alan algılamasını, nokta tarama sistemlerinin kesitleme kapasitesiyle birleştirir. Bu, geleneksel SDC'de, genellikle hizalanmış mikrolens dizisi ile paralel iğne delikleriyle desenlenmiş döner bir diskin dahil edilmesiyle sağlanır. Mikrolensler, yayılan floresansın önemli bir kısmını toplar ve onu iğne deliklerinden odaklar, bu da arka plan sinyalini azaltır. Bu yapılandırma, özel optik veya ek örnek montaj hazırlığı gerektirmeden hızlı optik kesitleme sağlar; bu da onu derin hacimsel SMLM görüntü alımı için kolayca uygulanabilir ve optimize edilebilir sağlam bir seçimyapar 11.

Bu çalışmada, optik foton yeniden ataması (SDC-OPR) ile donatılmış CSU-W1 dönen disk konfokal tarayıcı ünitesi kullanılmıştır. Standart SDC'nin aksine, SDC-OPR yayılan fotonları tamamlayıcı bir iğne deliğidesenine 12 yansıtan ikinci bir mikrolens dizisi sunar; böylece saçılmayı azaltır ve aksi takdirde atılacak fotonları geri kazanır. Bu foton yeniden atama, nokta yayılım fonksiyonunu (PSF) etkili bir şekilde keskinleştirir, yanal çözünürlüğü geleneksel SDC'nin ötesinde artırırken odak dışıışığı 13 reddeder. Özellikle, SDC-OPR mikrolens dizisi, eksen dışı fotonları en yakın köken noktalarına yönlendirerek tespit edilen floresan parlaklığını standart SDC'ye kıyasla etkili şekilde artırır. Ayrıca, SDC-OPR'nin çözünürlük avantajları görüntü dekonvolüsasyonu yoluyla da güçlendirilebilir. Yinelemeli dekonvolüsyon algoritmaları, PSF'yi hesaplamalı olarak iyileştirir, arka planı azaltır ve sinyal-arka plan oranını optik yapılandırmada değişiklik gerektirmeden iyileştirir. Bu birleşik yaklaşım, tek moleküllü lokalizasyon deneylerinde standart SDC'ye kıyasla lokalizasyon hassasiyeti açısından önemli bir avantajsağlar 14.

Burada, optik foton yeniden atama (SDC-OPR) ile donatılmış dönen disk konfokal mikroskop kullanılarak tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşım, DNA-PAINT'in nano ölçekli hassasiyetini dönen disk görüntülemenin hızı, FOV'u ve derinlik nüfuzuyla birleştirir. DNA-PAINT, nano ölçekli topografi (PAINT)15 görüntüleme için nokta birikiminin adaptasyonu olup, floresan olarak işaretlenmiş "görüntüleyici" zincirlerinin moleküler hedeflere sabitlenmiş tamamlayıcı "kenetlenen" zincirlerle geçici hibritizasyonuna dayanır. Bu geri dönebilir bağlanma olayları, hassas şekilde lokalize edilebilen stokastik floresans sinyalleri üretir ve hücresel ultrastrukturun yüksek çözünürlüklü yeniden yapılandırılmasını sağlar. DNA-PAINT, yüksek fotostabil floroforların kullanımını sağlar, görüntüleme koşullarının hassas kontrolü için ayarlanabilir bağlayıcı kinetik sağlar ve floresan görüntüleme zincirlerinin sürekli yenilenmesiyle fotobeyazmayıazaltır 16.

Tekrarlanabilirlik ve özgüllüğü sağlamak için, yaklaşım, kenetlenme zincirlerini ikincil antikorlara bağlayan özel DNA-antikor konjugatlarına dayanır. Antikor-DNA konjugasyonu dahil olmak üzere ayrıntılı örnek hazırlama adımları, sağlam deneysel sonuçları desteklemek için sunulmaktadır. Protokol, sabit örneklerdeki nükleer gözenek kompleksleri (NPC)17 ve mikrotubullar gibi iyi karakterize edilmiş hücresel yapılar üzerinde doğrulanmıştır ve yeniden yapılandırma doğruluğunu tahmin etmekte referans noktası sağlar. Çözüm değişimleri, lokalizasyon hassasiyetiyle vekil olarak nicelleştirilir ve FOV ve görüntüleme derinliğine bağlı olarak daha fazla değerlendirilir.

Ayrıca, çoklu görüntüleme için bu iş akışının verimliliği, aynı boya ve DNA-PAINT tabanlı tek bir lazer kaynağına sahip birden fazla hedefin ardışık görselleştirilmesini sağlayan Exchange-PAINT18 ile gösterilmiştir. Exchange-PAINT iş akışı, aynı örnek içindeki mitokondriler, mikrotübullar ve NPC'lerin çok renkli süper çözünürlüklü görüntülemesine uygulanır.

Bu protokol birlikte, antikor-DNA konjugasyonu, örnek hazırlığı, görüntüleme koşulları ve veri analizi üzerine kapsamlı rehberlik ve temel uyarlanabilirlik notları sunar; böylece araştırmacılar SDC-OPR üzerinde tekrarlanabilir DNA-PAINT görüntüleme yapabilmektedir. Yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi TIRF tabanlı yaklaşımların derinlik ve FOV sınırlamalarının ötesine taşıyarak, bu yöntem SMLM'nin geniş biyolojik bağlamlara uygulanabilirliğini genişletir.

Protokol

Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Tamponların hazırlanması

  1. Sitoskelet tamponu (CB) hazırlanması:
    1. 10 mM MES (pH 6.1) ile 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5 mM D-glikoz ve 5 mM MgCl2 ile 1x filtrelenmiş fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile hazırlanın.
    2. Kullanmadan önce 4 °C'de sakla ve filtre ile filtre al.
  2. 40x protocatechuic acid (PCA) stok hazırlığı:
    1. 154 mg PCA'yı 10 mL damıtılmış, filtrelenmiş suda çözürün.
    2. NaOH ile pH'ı 9.0'a ayarlayın.
    3. Aliquot ile -20°C'de en fazla 6 ay boyunca sakla.
      NOT: Herhangi bir aliquot kahverengi görünüyorsa, onu atın, çünkü bu oksidasyonu gösterir.
  3. 100x protocatechuate-3,4-dioksijenaz (PCD) stok hazırlığı:
    1. %50 gliserol çözeltisi hazırlayın, 50 mM KCl, 1 mM EDTA ve 100 mM Tris tampon ekleyin.
    2. 2.2 mg PCD'yi 3.4 mL gliserol çözeltisinde çöz.
    3. Aliquot ve -20 °C'de en fazla 6 ay boyunca sakla.
  4. 100x Trolox stok hazırlığı:
    1. 50 mg Troloksu (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkrom-2-karboksilik asit) 215 μL metanolde çözelti, uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) ile kimyasal bir buhar davlumbazında yeşile dönene kadar çözebilirsiniz.
    2. 1.6 mL damıtılmış, filtrelenmiş su ekleyin. Çözeltinin beyaza dönmesine izin verin ve katılaşmaya başlayın.
    3. 175 μL 1M NaOH 1M ekleyin. Çözeltinin tekrar sıvıya dönmeye başlamasına izin verin.
    4. 10 μL hacimde, çözelti tamamen berraklaşana kadar (yaklaşık 40 μL) 1 M NaOH eklemeye devam edin.
    5. Aliquot ve -20 °C'de en fazla 6 ay boyunca sakla. Son çözelti sarımsı görünüyor.
      NOT: Son 100x çözeltinin pH değeri 11, ancak 1x'e seyreltildiğinde pH 7-8 olur.
  5. C+ tamponu
    1. 1 mM EDTA, 500 mM NaCl ve %0,02 Tween-20 çözeltisi 1x PBS'de hazırlayın.
    2. Gerektiğinde HCl ve/veya NaOH ile pH 7.4'e ayarlayın.
    3. Isteğe bağlı Trolox takviyesi: 1x seyreltme elde etmek için gerekli hacimlerde PCA (40x), PCD (100x) ve Trolox (100x) stokları ekleyin, çözmeyi oda sıcaklığında (23 °C) 1 saat dengede bırakın ve sonra kullanın.
      NOT: Haftalık taze hazırlayın. Trolox kullanıyorsan, karıştırdıktan sonra 4 saat içinde kullan.
  6. İmmünboya tamponları (paraformaldehit PFA, glisin ve triton):
    1. 10 mL 16% PFA ampülünden %4 PFA hazırlığı için:
      1. Kimyasal bir duman başlığı içinde, ampülü dikkatlice açın.
      2. 10 mL %16 PFA dekantasyonu 50 mL konik santrifüj tüpüne alın.
      3. %4 PFA elde etmek için 1x PBS'de 1:4 seyreltme yapın, dekant %16 PFA'ya dikkatlice ~30 mL 1x filtrelenmiş PBS ekleyin, böylece nihai hacim ~40 mL olur.
      4. Aliquot 1 mL mikrosantrifüj tüplerine alın ve gerektiğine kadar -20 °C sıcaklıkta saklanın.
    2. PBS preparatında 60 mM glisin için:
      1. 225 mg glisin 50 mL'lik konik santrifüj tüpe alın.
      2. 50 mL 1x filtrelenmiş PBS ekleyin.
      3. Vortex tamamen karıştırıp filtreleyin.
      4. Gerekirse 4 °C'de saklanın.
    3. %0,1 Triton X-100 hazırlığı için:
      1. İlk olarak, %100 Triton X-100 ile 100% 100 Triton X-100 karışımını 9 mL filtrelenmiş PBS (son hacim = 10 mL) içine seyreltirerek pipet yapın ve aşırı köpüklenmeyi önlemek için yavaşça karıştırın. Gerekirse 4 °C'de saklanın.
      2. %10 çalışan stoktan, %0,1 ml 10 Triton X-100'e 9,9 mL 1x filtrelenmiş PBS ekleyin, böylece %0,1 nihai stok yine yavaş karıştırın. Gerekirse 4 °C'de saklanın.

2. Antikor-DNA konjugasyonu

  1. Antikoru 100 kDa ultrafiltrasyon santrifüj filtre ünitesi kullanarak konsantre edin:
    1. 100 kDa ultrafiltrasyon santrifüj filtre ünitesini, 100 μL 1x filtrelenmiş PBS ile 30 dakika boyunca 14.000 x g, 4 °C sıcaklıkta yıkayın.
    2. Daha önce yıkanmış 100 kDa ultrafiltrasyon santrifüj filtre ünitesine 100 μL antikor ve 200 μL 1x filtrelenmiş PBS ekleyin, 14.000 x g, 4°C sıcaklıkta 30 dakika boyunca spin yapın. Ultrafiltrasyon santrifüj filtre ile konsantrasyon sonrası antikor konsantrasyonunun 1,5 mg/mL'den yüksek olduğundan emin olun. Bu yöntemle, ultrafiltrasyon santrifüj filtresi genellikle antikoru ~3 kat yoğunlaştırır.
    3. 100 kDa ultrafiltrasyon santrifüj filtre ünitesini temiz bir tüp haline çevirin, 1000 x g, 4 °C sıcaklıkta 6 dakika boyunca döndürün. Bu, PBS'deki yoğunlaştırılmış antikordur.
    4. Yeni konsantrasyonu hesaplamak için yoğunlaştırılmış antikor hacmini (1 veya 2 μL) ölçün ve mikrohacimli UV-Vis spektrofotometre ile UV-Vis soğurma spektrumunu çalıştırın. Arka planı 1x PBS olarak ayarlayın ve spektrumu kaydedin.
  2. Tiolasyonlu DNA kenetlenme zincirini azaltın:
    1. 7,7 mg önceden tartılmış DTT'yi 100 μL filtrelenmiş suda çözüp taze bir tüpe aktarın.
    2. Orijinal DTT tüpüne, girdaba 1x PBS'de 100 μL 3 mM EDTA eklenir ve 2.2.1. adımda aynı tüpten aktarılır; böylece 1 adet PBS'de 1.5 mM EDTA'da 200 μL 250 mM DTT elde edilir.
    3. Tiollenmiş DNA kenetleme zincirini 1x filtrelenmiş PBS'ye çözerek nihai konsantrasyon 1 mM olur. DNA kenetlenme ipliği çözeltisinin UV-Vis spektrumunu (1x PBS'de 10 μM'e seyreltmiş) kaydedin ve mikrohacimli UV-Vis spektrofotometre kullanarak kaydedin.
    4. 13 μL tiollenmiş DNA (1 mM) ile 30 μL DTT (250 mM) karıştırın, oda sıcaklığında (23 °C) 2 saat çalkalayın.
      NOT: Kalan kullanılmayan DNA kenetleme zincirlerini gelecekteki reaksiyonlar için -20 °C sıcaklıkta 13 μL aliquotlarda depolayın.
  3. Çapraz bağlayıcıya karşı antikor konjugasyonu:
    1. Maleimid-PEG2-sukcinimidil ester çapraz bağlayıcıyı DMSO'da 10 mg/mL (23,5 mM) olarak çözür. Gerekirse -20 °C sıcaklıkta 10 μL aliquot içinde saklanın.
    2. 2.1. adımdan gelen konsantre antikoru çapraz bağlayıcının 20x molar fazlalığı ile karıştırın. 90 dakika boyunca sarsıntı ile 4 °C'de kuluçka yapın.
  4. Antikor-çapraz bağlayıcı filtrelemesini, boyut dışlama reçinesi içeren 7.0 KDa spin tuz çözme kolonu ile arındırın (7 kDa molekül ağırlığı kesinti):
    1. 7.0 kDa spin tuz giderme kolonunun alt kapaağını çıkarın ve kapağı gevşedin. Onu protein, düşük bağlı mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. 1500 x g, 4 °C sıcaklıkta 1 dakika santrifüj yapın.
      NOT: İlk dönmeden sonra reçineyin eğimli kısmını işaretleyin. Kolonun sonraki tüm kullanımlarında, eğim doğrudan dışarıya bakacak şekilde santrifüjün üzerine yerleştirilin. Numuneler ve yıkamaları merkeze uygulayın ve reçine yatağıyla temas etmeyin.
    2. 7.0 kDa spin tuz çözme kolon filtresine 300 μL 1x filtrelenmiş PBS ekleyin, gevşet kapağı, 1500 x g, 4 °C'de 1 dakika santrifüj yapın. İki kez daha tekrarlayın.
      NOT: Antikor-çapraz bağlayıcı reaksiyonu hazır olana kadar 300 μL 1x PBS ile 7.0 KDa spin tuz çözme kolonunu bırakın; Sütün kurumasına izin vermeyin.
    3. Son 300 μL PBS yıkamasını 1 dakika boyunca 1500 x g, 4 °C sıcaklıkta tekrar santrifüj yaparak çıkarın.
    4. Antikor-çapraz bağlayıcı çözeltisini reçine yatağının ortasına, damla olarak uygulayın. 7.0 kDa spin tuz arındırma kolonunu temiz bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, 1500 x g, 4 °C sıcaklıkta 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Antikor-çapraz bağlayıcı ürünü şu anda mikrosantrifüj tüpünde; 4 °C'de veya buzda tutulur.
  5. DNA-DTT karışımını, Sephadex G-25 (DNA arıtması için boyut dışlama reçinesi) ile tuzdan arındırıcı spin kolonlarıyla arındırın:
    1. Tuzdan arındırıcı spin sütunlarını girdablandırın (DNA saflaştırması), böylece reçine eşit şekilde dağılsın. Alt kapağı çıkarın, kapağı gevşedin ve temiz bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
    2. Depolama tamponu çıkarmak için 735 x g hassasiyetinde spin kolonları (DNA arıtma) 1 dakika boyunca santrifüj tuzundan arındırılır.
    3. Tuzdan arındırıcı spin kolonlarını (DNA arıtma) taze bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve DNA/DTT karışımını reçinenin merkezine yavaşça ekleyin. 735 x g ile 2 dakika boyunca santrifüj. Arındırılmış, indirgenmiş DNA artık mikrosantrifüj tüpünde olacak.
  6. DNA ve antikor-çapraz bağlayıcı ürünlerini birleştirin:
    1. İndirgenmiş DNA'yı, antikor-çapraz bağlayıcı ürününe 10x molar fazla DNA:antikor ile ekleyin. Arıtma sonrası hemen arıtılmış DNA'yı antikor-çapraz bağlayıcı ürünle karıştırın. Bu, DNA'nın yeniden bağlanmasını engeller.
    2. Gece boyunca sarsarak, 4 °C'de kuluçka yapın.
      NOT: DNA ve antikoru öğleden sonra geç saatlerde karıştırın ve ertesi sabah hemen arındırın. DNA ve antikorların uzun süreli kuluçka edilmesi, yüksek DNA:antikor oranlarına yol açabilir.
  7. Ertesi sabah 100 kDa ultrafiltrasyon santrifüj filtre ünitesiyle fazla DNA çıkarın:
    1. 100 kDa ultrafiltrasyon santrifüj filtre ünitesini 300 μL 1x filtrelenmiş PBS ile 30 dakika boyunca 14.000 x g, 4 °C sıcaklıkta yıkayın.
    2. DNA-antikor karışımını 300 μL 1x filtrelenmiş PBS ile 100 kDa ultrafiltrasyon santrifüj filtre ünitesine ekleyin ve 14.000 x g, 4 °C sıcaklıkta 30 dakika boyunca spin yapın.
    3. Ultrafiltrasyon santrifüj filtre ünitesini temiz bir tüp haline çevirin, 1000 x g, 4 °C'de 6 dakika boyunca döndürün. Bu, PBS'deki konsantre üründür.
    4. Ürünü 1x filtrelenmiş PBS'de 100 μL'ye kadar seyreltin.
    5. Ürünün UV-Vis spektrometresini (1 veya 2 μL) mikrohacimli UV-Vis spektrofotometre ile 1x PBS arka planıyla kaydedin ve spektrumları kaydedin.
    6. Spektrumlardan nihai konsantrasyon ve DNA:antikor oranını ölçün. DNA'dan gelen ekstra emilim nedeniyle antikorun emilim zirvesi 280 nm'den 260 nm'ye kayıyor. Konsantrasyonu ve DNA:antikor oranını belirlemek için adım 2.8'i kullanın.
    7. Ürün, kullanılan antikorun orijinal depolama koşullarında saklanır. Donursa, donma-erime döngülerinden kaçının.
  8. UV-Vis spektrumlarından DNA:antikor oranı hesaplayın:
    1. Saf DNA spektrumlarından (1x PBS'de 10 μM), 260 nm (Denklem 1) ve 280 nm (Denklem 2) soğurma değerlerini ölçün. Bunları DNA konsantrasyonuna (10 μM) bölerek DNA'nın molyar emilim katsayılarını (Denklem 3 ve Denklem 4) bulun.
    2. Antikorun ve Denklem 6bulması Denklem 5 için tekrarlayın, spektrum için kullanılan antikor konsantrasyonuna bölmeyi unutmayın.
    3. Ürün spektrumlarından, 260 nm ve 280 nm soğurma hem DNA'dan hem de antikordan gelen emilime bağlıdır:
      Denklem 7
      Denklem 8
      Burada cDNA ve cAb, son ürün içindeki sırasıyla DNA ve antikor konsantrasyonlarıdır. Bu denklemleri aynı anda çözerek üründeki hem DNA hem de antikorun molar konsantrasyonunu bulursunuz. Bu konsantrasyonları kullanarak DNA:antikor oranını hesaplayın.
      NOT: İlk spektrum için antikor konsantrasyonu, ultrafiltrasyon santrifüj filtre ünitesi 100 kDa filtreleme ile filtreleme sonrası kalan antikor hacmi ölçülüp kullanılan orijinal antikor hacmiyle (bilinen konsantrasyonla) karşılaştırılarak hesaplanabilir.

3. Hücre kültürü

  1. HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 hücreleri.
    1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 Penisillin/Streptomisin (P/S) ile takviye edilen Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) hücre kültür ortamı stokunu hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. Malzemeyi kullanımdan 30 dakika önce 37 °C su banyosunda önceden ısıtın. Çalışma koşullarına bağlı olarak, kirlenmeyi önlemek için gerekli miktarda alikotasyon ve filtre edilmesi önerilir.
    2. Tohum hücreleri, T25 flakonlarında 7 mL önceden ısıtılmış takviyeli DMEM ortamında 2 x 105 hücre/mL olarak yerleştirilir. Hücre termoslarını uygun bir kuluçka makinesine 37 °C ve %5CO2 ortamında yerleştirin.
    3. Aşırı kalabalıklığı önlemek için her 48-72 saatte bir geçişi garanti edin.
      1. Kültürün birleştiği T25 şişesini ve şampeden aspirasyon ortamını al.
      2. Pipett 1 mL Tripsin EDTA (TE), termosunu hafifçe eğileyerek tam örtü sağlar. Hücrelerin şişeden ayrılması için 7 dakika boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
      3. 2 ml takviyeli DMEM ortamı ekleyin ve tritürat.
      4. Hücre süspansiyonu, ek olarak 7 mL takviye edilmiş DMEM ortamı ile 15 mL'lik konik santrifüj tüpüne aktarın.
      5. Santrifüjle 400 x g 5 dakika boyunca kullanın. Tüpün altındaki pellet oluşumunu dikkatle kontrol edin ve onu rahatsız etmeyin.
      6. Aspirasyon ortamı ve hücre pelletini takviyeli DMEM ortamında yeniden süzülür.
      7. 7 mL önceden ısıtılmış ortam içeren yeni bir T25 şişesine 2 x 105 hücre/mL tohum ekin. 37 °C ve %5CO2 sıcaklıkta kuluçka yapın.
        NOT: Hücre yoğunluğundan emin değilseniz, hücre sayısını belirlemek için hemositometre kullanılabilir. Saymadan önce 1 mL pelet yeniden süspansiyonu ile başlamak önerilir.
  2. U2OS CRISPR mEGFP-Nup96 hücreleri
    1. McCoy's 5A medyasını %10 FBS ve %1 P/S destekli bir madde hazırlayın, adım 3.1.1'e göre.
    2. 7 mL içinde 2 x 105 hücre/mL tohum hücreleri, T25 termoslarındaki McCoy's 5A ortamını takviye etti. 37 °C ve %5CO2 sıcaklıkta kuluçka yapın.
    3. Kültür büyümesini %80 birleşimin altında tutmak için her 48 saatte bir geçiş yapın:
      1. Termostan aspirasyon ortamı yapın ve yapışkan kültürü 2 mL filtrelenmiş önceden ısıtılmış (37 °C) 1x PBS ile nazikçe yıkayın.
      2. PBS aspirasyonu yapın ve 2 mL Accutase ekleyin, termosu yavaşça eğip tam örtü sağlanır, ardından 37 °C'de 7 dakika kuluçka yapın.
      3. 2 ml McCoy's 5A madde takviyesi ekleyin ve tritürat.
      4. Hücre süspansiyonuna 7 mL madde ekleyin ve santrifüj için 15 mL veya 50 mL konik santrifüj boruya aktarın. 400 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve tüpün dibinde pellet oluşumunu kontrol edin.
      5. Hücre pelletini McCoy'un 5A maddesi takviyesinde yeniden askıya alın.
      6. Yeni bir T25 şişesinde 7 mL önceden ısıtılmış bir ortamda 2 x 105 hücre /mL tohum ekin. 37 °C ve %5CO2 sıcaklıkta kuluçka yapın.
        NOT: Hücrelere eklenen tüm çözeltileri su veya boncuk banyosu içinde 37 °C'ye ısıtın. Accutase için, bozulmayı önlemek için sadece 2 mL aliquot'u 5 dakikadan fazla ısıtmak zorunda kalın.

4. Nup96, mitokondriler ve mikrotübulların immünbojenlenmesi

  1. U2OS mEGFP-Nup96 hücrelerinin hazırlanması
    1. 3.2. adımda belirtilen adımları takip ederek, T25 şişesinden aspirasyon ortamı alın ve yapışan hücreleri 2 mL 1x filtrelenmiş PBS ile nazikçe yıkayın.
    2. PBS aspirasyonu yapın ve 2 mL Accutase ekleyin, matayı yavaşça yukarı aşağı eğin ve hücre ayrılmasını sağlamak için 37 °C'de 7 dakika kuluçka yapın.
    3. 2 ml McCoy's 5A madde takviyesi ekleyin ve tritürat.
    4. 7 mL McCoy's 5A ortamını takviye eden üst hücre süspansiyonu ile 15 mL veya 50 mL konik santrifüj borusuna aktardıktan sonra 400 x g ile 5 dakika santrifüj yapıldı. Yine, tüpün dibinde pellet oluşumunu kontrol edin.
    5. Hücre pelletini McCoy'un 5A maddesi takviyesinde yeniden askıya alın.
    6. Tohum hücreleri 1 x 105 hücre/mL hassasiyetinde 8 delikli mikroslaytlarda kalınır ve hücre kuluçkasında (37 °C, %5CO2) gece boyunca kuluçka yapılır.
      NOT: Tohum hücreleri, fiksasyon ve immünboyama işlemlerinden 24 saat önce, yapışma sağlanması için.
  2. Nup96 görüntülemesi için U2OS mEGFP-Nup96 hücrelerinin immünboze edilmesi
    1. Gece boyunca kuluçka sonrası McCoy's 5A medyasını 8 delikli mikroslaytlarda 1x filtreli PBS ile değiştirin. Hızlı bir şekilde ardışık olarak PBS aspirasyonu alın ve önceden ısıtılmış (37 °C) %4 PFA fiksasyon çözeltisini kimyasal bir duman davlumbazına ekleyin.
    2. Hücrelerin oda sıcaklığında (23 °C) 30 dakika boyunca, tercihen kimyasal duman davlumbazında sabitlenmesine izin verin, ardından PFA yıkanıp atık atılır. Artık tüm adımlar oda sıcaklığında yapılabilir, aksi belirtilmedikçe.
    3. %4 PFA fiksasyon çözeltisini çıkarın ve slaytı 1x PBS ile 3x 3 dakika yıkayın.
      DIKKAT: PFA kullanarak uygun PPE giyerek kimyasal bir davlumboz kullanın.
    4. Fiksasyondan sonra, hücre zarını 1x PBS çözeltisine %0,1 Triton X-100 ekleyerek geçirimlileştirin. 5 dakika bekletin, ardından 3 x 3 dakika boyunca 60 mM glisinle 1x PBS içinde yıkayarak kalan PFA'nın otofloresansını söndürürsün.
      NOT: Triton geçirimliliği çözeltisi son derece zaman açısından hassastır ve çok uzun süre bekletilirse hücre yapısının bütünlüğünü değiştirebilir.
    5. Hücreleri bloklamak için karanlıkta 1 saat boyunca %5 BSA ekleyin; böylece bağışıklık boyama işlemi yapılmadan önce hücreleri bloklayacaksınız.
    6. DNA ile konjuge edilmiş anti-GFP nanobody 20 nM bloklama çözeltisinde (%5 BSA 1x PBS) hazırlayarak spesifik olmayan bağlanma bloklamasını önleyin. Slaytı nanogövde karışımıyla oda sıcaklığında (23 °C) 1 saat kuluçka edin, ardından bağlanmamış DNA zincirlerini 1x filtrelenmiş PBS ile 3 x 3 dakika boyunca yıkayın.
      NOT: Duraklama noktası: Fiksasyon, blokaj ve antikor eklendikten sonra örnekler gece boyunca 4 °C'de saklanabilir. Bu duraklama noktası, protokolün katı bir zorunluluğu olmaktan çok, örnek hazırlama için gereken zaman nedeniyle dahil edilmiştir. Görüntüleme bu adımların hemen ardından tercih edilirse devam edebilir.
  3. Mitokondri ve mikrotübul görüntüleme için U2OS mEGFP-Nup96 hücrelerinin immünbojenlenmesi
    1. Gece kuluçkasından sonra, 8 kuyruklu mikroslaytlardaki DMEM ortamını aynı anda 200 μL %0,3 glutaraldehit ve %0,25 Triton X-100 ile sitoskelet tamponunda (CB) değiştirin ve önceden fiksasyon için 2 dakika bekletin.
    2. Ön fiksasyon çözeltisini, %2 glutaraldehit takviyesi içeren sitoskelet tamponu (CB) ile değiştirin. Hücreleri sabitlemek için 10 dakika bekletin, sonra slaytı 3 x 3 dakika boyunca 60 mM glisin ile PBS'de yıka, örneğin 4.2.4. adımda olduğu gibi.
      DIKKAT: Uygun PPE giyerken glutaraldehidi kimyasal bir duman kapastonunda kullanın.
    3. Bağışıklık boyamadan önce hücreleri engellemek için %3 BSA içinde 1x PBS'de 1 saat boyunca kırılmış somon sperm DNA'sı ekleyin.
    4. Mikrotubul görüntüleme için 5 μg/mL DNA ile konjuge edilmiş anti-tubulin (yukarıda açıklandığı gibi konjuge olmuş) ve/veya mitokondri görüntüleme için %2 BSA ile oda sıcaklığında (23 °C) 2 saat boyunca 1:200 TOM20 antikor ekleyin. 1x PBS ile 3 x 3 dakika yıka.
    5. 25 nM DNA ile konjuge edilmiş sdAb anti-Tavşan IgG ekleyin ve oda sıcaklığında (23 °C) 1 saat kuluçka yapın. 1x PBS ile 3 x 3 dakika yıka.
      NOT: Duraklama noktası: Fiksasyon, blokaj ve antikor eklendikten sonra örnekler gece boyunca 4 °C'de saklanabilir. Bu duraklama noktası, protokolün katı bir zorunluluğu olmaktan çok, örnek hazırlama için gereken zaman nedeniyle dahil edilmiştir. Görüntüleme bu adımların hemen ardından tercih edilirse devam edebilir.
  4. HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 hücrelerinin hazırlanması
    1. HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 hücrelerinin T25 şişesindeki ortamı aspire edin ve şişeyi 2 mL 1x filtrelenmiş PBS ile nazikçe yıkayın.
    2. PBS aspirasyonu yapın ve 2 mL Tripsin EDTA (TE) ekleyin, ardından matayı yavaşça yukarı aşağı eğin, 37 °C'de 7 dakika kuluçka yapın.
    3. 2 ml takviyeli DMEM ortamı ekleyin ve tritürat.
    4. Hücre çözeltisi 15 mL konik santrifüj tüpüne ek olarak 7 mL takviyeli DMEM ortamı ve 400 x g sıcaklıkta 5 dakika boyunca santrifüj ekleyin. Tüpün dibinde pelet oluşumunu kontrol edin.
    5. Hücre pelletini takviye edilmiş DMEM ortamında yeniden süzülür.
    6. Tohum hücreleri, 8 delikli mikroslaytlarda 1 x 105 hücre/mL oranında.
      NOT: Tohum hücreleri görüntülemeden 24 saat önce.
  5. HeLa Kyoto mEGFP-Nup107'nin mikrotübüller için immünbojenlenmesi
    1. Gece kuluçkasından sonra, 8 kuyruklu mikroslaytlardaki DMEM ortamını aynı anda 200 μL %0,3 glutaraldehit ve %0,25 Triton X-100 ile sitoskelet tamponunda (CB) değiştirin ve önceden fiksasyon için 2 dakika bekletin.
    2. Ön fiksasyon çözeltisini CB'de %2 glutaraldehit ile değiştirin ve hücre fiksasyonu için 10 dakika bekleyin. 3 x 3 dakika boyunca 60 mM glisinle 1x PBS ile yıkayın.
      DIKKAT: Uygun PPE giyerken kimyasal bir duman kapüşonunda glutaraldehit kullanın.
    3. Hücreleri bloklamak için karanlıkta 1 saat boyunca %5 BSA ekleyin; böylece bağışıklık boyama işlemi yapılmadan önce hücreleri bloklayacaksınız.
    4. 5 μg/mL DNA ile konjuge edilmiş anti-tubulin (yukarıda anlatıldığı gibi konjuge edilmiş) ekleyin; mikrotubul görüntüleme için %5 BSA içinde 1x PBS ile oda sıcaklığında (23 °C) 2 saat boyunca kullanın. 1x PBS ile 3 x 3 dakika yıka.
      NOT: Duraklama noktası: Fiksasyon, blokaj ve antikor eklendikten sonra örnekler gece boyunca 4 °C'de saklanabilir. Bu duraklama noktası, protokolün katı bir zorunluluğu olmaktan çok, örnek hazırlama için gereken zaman nedeniyle dahil edilmiştir. Görüntüleme bu adımların hemen ardından tercih edilirse devam edebilir.
    5. NOT: Alternatif antikorlar veya hücre hatlarıyla çalışırken, üreticinin önerilerine göre DNA bağlantılı antikor veya nanobody için seyrelme faktörlerini ayarlayın.
  6. Görüntüleme hazırlığı
    NOT: Bu adım tüm immünboyama protokollerinde ortaktır.
    1. Her kuyuyu, tam kuyu hacmi kullanılarak doğrudan deyonize suda 1:2 oranında seyreltilmiş 90 nm altın nanopartikülleri ekleyin. Görüntüleme sırasında gelecekteki sürüklenme düzeltmesi için 5 dakika kuluçka yapın. 1x PBS ile 3 kez kuyuyu yıka.
    2. Nup96 görüntüleme için, istenen görüntüleyici zincirini 1 nM'de C+ tamponunda ekle, 1x Trolox, 1x PCA ve 1x PCD ile takviye edin.
    3. Mitokondri ve/veya mikrotübulların Exchange-PAINT işleminde, sadece C+ tamponunda 1 nM mesafede ilk istenen görüntüleyici zincirini ekleyin. İlk turdan sonra numuneyi iyice ama dikkatlice yıkayarak tüm kalan görüntüleyici ipliklerini örnek hareket ettirmeden çıkarabilirsiniz. Genellikle, 5 yıkama ve aralarında 30 saniye bekleme süresi yeterli olur. Sonra ikinci görüntüleme turu için C+ tamponunda 1 nM olan ikinci görüntüleyici zincirini ekleyin.

5. Görüntüleme kurulumu ve parametreleri: Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi

NOT: Bu protokolde gösterilen görüntüler, Birleşik Krallık'taki University College London'daki LMCB süper çözünürlüklü mikroskopi tesisinde, ticari olarak mevcut bir döner disk konfokal mikroskobu kullanılarak, sCMOS kamera ile donatılmış ve NIS-Elements yazılımı ile alınmıştır.

  1. Çok odaklı uyarımlı dönen disk konfokal sistemi ve sCMOS kamera kullanın.
  2. Sistemi görüntülemeden 30 dakika önce çalıştırın: mikroskobu, kamerayı ve lazerleri açın, sonra bilgisayarı çalıştırın. NIS-Elements yazılımının tam olarak yüklenmesini bekleyin.
  3. Satın alma parametrelerini ayarlamadan önce NIS-Elements'te uygun görüntüleme modunu seçin: standart dönen disk konfokal veya SDC-OPR SoRA süper çözünürlük.
  4. SDC veya SDC-OPR görüntüleme için 60× Apo NA 1.49 yağ battırma objektîfini seçin; böylece tek moleküllü olayların en iyi tespitini ve daha iyi işlem sonrası çalışmayı mümkün kılar.
  5. Hedef, kamera ayarları ve incelenecek örnek temelinde uygun büyütmeyi (1×, 2.8× veya 4×) seçin. Kamera binlemesini buna göre ayarlayın: 1× binning için 1× büyütme, 2× binning için 2.8× ve 4× binning için 4×. Bu kurulumda, 1× için 108 nm (binleme yok) veya 4× (4× binning) ve 2.8× (2× binning) için 78 nm etkili piksel boyutlarına karşılık gelir. SMLM'ye uygun piksel boyutlarını elde etmek için binning gereklidir; bu boyutlar yaklaşık olarak PSF standart sapmasına (genellikle 100-150 nm) eşdeğerdir19,20.
    NOT: Daha yüksek büyütmeler (2,8× veya 4×) lazer güç yoğunluğunu artırır ve aydınlatma düzenliliğini artırır. Bu durum FOV'u azaltır, bu nedenle piksel boyutunu korumak için binning orantılı olarak ayarlanmalıdır (örneğin, 2.8× büyütme için 2× binning; 4× binning 4× büyütme).
  6. DNA-PAINT alımı için pozlama süresini ayarlayın ve bunu dönen disk dönüş hızıyla senkronize edin (CSU-W1 padinden ayarlanabilir). Dönüş hızının pozlama süresinin katı olduğundan emin olun veya en yakın uyumlu devir hızını otomatik olarak eşleştirmek için Sync düğmesine basın. Ekranda çizgileme artefaktları olup olmadığını kontrol et, çünkü bu senkronize edilmemiş ayarları gösteriyor. Burada sunulan deneyler için 300 ms pozlama süresi kullanılmıştır.
    NOT: SDC ünitesinin dönme ve senkronize mikrolens ile güçlendirilmiş SoRa disklerinin dönüş hızı, ışın uyarılma profilini etkiler ve aydınlatılan alan üzerindeki ortalama güç yoğunluğu dağılımını etkiler. Bu nedenle, TIRF kurulumlarına göre daha yüksek pozlama süreleri gerekebilir.
  7. Lazer dalga boyunu, gücü ve filtre çarkını yapılandırın (NIS-Elements uygun bir filtre önerecektir). Lazer dalga boyu, görüntüleyici boyasının spektrumu tarafından belirlenir.
    NOT: Bu çalışmada, 561 nm lazer ile en iyi şekilde uyarlanan Cy3B kullanılmıştır. Cy3B, DNA-PAINT için en iyi sinyal-arka plan oranını sağlar ve bu uygulama için tercih edilen tercih haline gelir.
  8. Lazer pediyle lazer gücünü ayarlayın (%0-%100). DNA-PAINT görüntüleme için lazeri maksimum güce (%100) ayarlayın. Bu sistem için bu, 4× büyütme hedefinden sonra ölçülen 1.75 mW (≈ 65 W/cm 2), 2× için 3 mW (≈ 50 W/cm 2) ve 1× için 5 mW (≈ 15 W/cm 2) ile karşılık gelir.
    1. Hedeften sonra gücü kaydetmek için, kalibre edilmiş bir lazer güç ölçeri kullanın ve sensörü mikroskop aşamasına mümkün olduğunca numune düzleminin olması gereken yere yakın konumlandırın. Objektif lensle temas etmemeye dikkat edin. Kullanılan her konfigürasyon için gücü kaydedin.
  9. Temiz 60× AP NA 1.49 yağ hedefine bir damla daldırma yağı uygulayın.
  10. Hazırlanan örneği (4.2-4.5. adımlardan) bir aşama adaptörü ile sahneye sabitleyin. Bu, görüntü alımı sırasında kaymayı en aza indirmek ve özellikle çok renkli deneylerde tampon değişimi sırasında hareketi önlemek için önemlidir.
  11. Seçilen görüntüleme yönteminde parlak alan moduna geçin ve nanopartikülleri referans olarak kullanarak cam düzlemine odaklanın. Mükemmel Odak Sistemini (PFS) etkinleştirin. Tüm alım süresi boyunca odağı koruyacak PFS veya benzeri bir sistem çok önemlidir çünkü eksenel yöndeki kayma sonradan işlem ile düzeltilemez.
    NOT: Nikon PFS, sabit referans düzlemi ile örnekin odak düzlemi arasındaki mesafeyi sürekli izleyip ayarlayarak bir ofset lens ve line-CCD dedektörü kullanarak örneği keskin odakta tutar. Görüntü alınmadan bağımsız çalışarak, sistem odak kaymasını gerçek zamanlı (~milisaniyeler) düzeltir.
  12. PFS aktifken, ilgilendiğiniz görüntüleme düzlemini seçin. U2OS mEGFP-Nup96 hücreleri veya HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 hücreleri için, GFP etiketli NPC'lerden gelen 488 GFP sinyalini kullanarak en düz hücreyi belirleyin ve optimal odak düzlemini belirleyin. Bu adımda düşük lazer gücü (maksimum lazer gücünün ~%10'u) kullanarak fotobeyazmayı önleyin.
  13. Deneyin adını ve kayıt yolunu tanımlayın. Zaman kutusunu işaretleyerek aralığı, süreyi ve döngü sayısını ayarlayın. Sürekli elde etme için, aralığı Gecikmesiz olarak ayarlayın ve sadece toplam kare sayısına karşılık gelen döngü sayısını girin.
    NOT: Alttaki PFS kutusunun seçildiğinden emin olun, sonra Çalıştır'a basın. Yazılım otomatik olarak tahmini deney süresi sunar ve tamamlandığında verileri kaydeder. Deney bitmeden durdurmak için, mevcut ilerlemeyi kaydetmek için Bitir tuşuna basın veya kaydetmeden deneyi bitirmek için Yarımçıq Bırakın.
  14. İlk protein için, 300 ms entegrasyon süresiyle 17.000-20.000 kare elde edinin.
    NOT: Bu aşamada görüntüleyici zincirinin konsantrasyonu, tek molekül sinyallerinin örtüşmemesini sağlamak ve yine de rekonstrüksiyon için yeterli lokalizasyon sağlamak için optimize edilmelidir. Bu süreç, görüntüleyici konsantrasyonunun yeniden yapılandırma için yeterli sayıda olay elde edilecek şekilde ayarlandığı tipik SMLM alımına benzer; üstelik örtüşmeler en aza indirilir. Optimal konsantrasyon, görüntülenen yapıya bağlıdır. Örneğin, mikrotübüler gibi yüksek etiketli yapılar genellikle daha düşük görüntüleyici konsantrasyonları (1 nM'den az) gerektirir.
  15. Bir pipet kullanarak bir sonraki protein için görüntüleme tamponunu nazikçe çıkarın, örneği rahatsız etmemeye özen gösterin. Mikroskop kamerasıyla örneği izlerken, ilk boyayı yıkamak için görüntüleyici olmadan dikkatlice 200 μL C+ tampon ekleyin.
  16. Bu adımı, ilk DNA görüntüleyici çözeltisinden (genellikle 5 yıkama) floresan sinyali tespit edilemeyene kadar tekrarlayın.
  17. İkinci bir görüntüleyici çözeltisi ekleyin ve tek moleküllü olayların tekrar tespit edildiğini kontrol edin.
  18. İkinci protein için 300 ms entegrasyon süresiyle 17.000-20.000 kare elde edin.
  19. Her ek protein için 5.14-5.18 adımlarını tekrarlayın.
  20. 3D görüntüleme için, tam hücre yüksekliği boyunca 0.5-1 μm aralıklı z-stack'leri alın. Bu, satın alma yazılımı (NIS öğeleri) için tasarlanmış özel bir JOBprotokolü 21 ile yapıldı; bu protokol, belirli z konumlarında önceden tanımlanmış sayıda kare videosunu alır ve PSF'yi tüm satın alma süresi boyunca korur.
    NOT: Yazılım paketi ve ayrıntılı kullanıcı talimatları, JOBprotokolü 21 içinde sağlanmıştır. İŞİNİN tam bir tanımı da dahil edilmiştir. "MultiZ_DNAPaint.bin" adlı yazılım, yayının Malzemeler sekmesinden indirilebilir. JOB'u çalıştırmak için, bu Dosyayı indirin ve verilen adım adım talimatları takip ederek NIS-Elements JOBS Explorer'a aktarın.

6. Görüntü İşleme ve Analiz

NOT: Görüntüler önce uyumlu bir yazılım kullanılarak dekonvolüsyonla işlendi, ardından Jungmannlaboratuvarı 16 tarafından geliştirilen Picasso yazılımı kullanılarak tek moleküllü lokalizasyon analizi yapıldı.

  1. NDIS-Elements AR yazılımında ND2 görüntü yığınlarını açın.
  2. 2D görüntüler için 2D Dekonvolütion'u seçin. 3D görüntüler için, bu prosedür her bir z-yığını için tekrarlanın.
  3. Kör dekonvolüsyonu seçin, etkili bir iğne deliği 0.01 ve gürültü seviyesini Gürültülü olarak ayarlayın. Sonra, lazer uyarılma ve emisyon oranlarını girin, burada sırasıyla 560 nm ve 571 nm. Diğer parametreler, kaynak görüntü nokta yayılım fonksiyonunun (PSF) kaba bir tahminini sağlamak için ND2 meta verilerinden otomatik olarak elde edilir.
  4. Yineleme sayısını belirtin (burada 12), Create New Document'i seçin ve Deconvolve'a basın. İşlem sonrası ortaya çıkan Dosyayı kaydet.
    NOT: Algoritma, PSF'yi birleştiren veya belirtilen yineleme sayısına ulaşana kadar konvolüsyoner işlemler yaparak görüntü kalitesini yinelemeli olarak iyileştirir. Dekonvolved görüntünün görsel olarak incelenmesi önerilir. Yineleme sayısının ayarlanması, hesaplama kısıtlamaları ve görüntü kalitesine bağlı olarak gereklidir.
  5. Çözülmüş görüntü yığınını Picasso Localize modülüne yükleyin.
  6. Menü çubuğundan Analyze → Parametreleri seçin ve üreticinin spesifikasyonlarına göre kameraya özgü parametreleri girin. Bu çalışmada kullanılan sCMOS kamera için (Hamamatsu ORCA-Fusion BT): EM kazancı: 1, Başlangıç: 100, Hassasiyet: 0.23 (dönüşüm faktörü, elektronlar/sayılar), Kuantum verimliliği: 0.95 (kullanılan uyarılma dalga boyuna bağlı olarak).
    NOT: Kuantum Verimliliği Picasso sürüm 0.6.0'dan beri kullanılmamakta ve sadece geriye dönük uyumluluk için saklanmıştır.
  7. Kutu kenarı uzunluğunu 7'ye ayarlayın. Kutu uzunluğu, [6 × σPSF + 1] formülü kullanılarak belirlenir; buradaσ PSF , PSF'nin standart sapmasıdır. Bu optimizasyon, yerelleştirme hassasiyetini artırır ve yeniden oluşturulan görüntünün çözünürlüğünü artırır.
  8. Görüntü yapılandırması için uygun piksel boyutunu seçin, bölüm 5.5'e göre.
  9. Sonra, uygun bir Min. Net Gradient seçin (örneğin, örnekleme bağlı olarak ~1000) ve tespit edilen yerelleştirmeleri görselleştirmek için Önizlemeyi etkinleştirin. Sonuçları inceleyin ve arka plan tespitlerini en aza indirmek ve doğru lokalizasyonu sağlamak için gradyan eşiğini gerektiğinde ayarlayın.
  10. Menü çubuğundan Analyze → Localize (Identify & fit) seçeneğini seçerek tüm film karelerini nokta tanımlamaya ve yerleştirmeye başlayın. Yarışmadan sonra, bu süreç otomatik olarak .hdf5 ve .yaml dosyalarını kaydeder.
    NOT: .hdf5 dosyası, her gauss uyumunun yerelleştirme konumunu ve daha fazla parametreyi saklar. .yaml dosyası, video ve analiz prosedürü hakkında bilgi kaydeder ve metin düzenleyici kullanılarak incelenebilir.
  11. Picasso Render modülündeki .hdf5 dosyasını yükleyerek yeniden oluşturulan lokalizasyon haritasını görselleştirin ve kayma düzeltmesini gerçekleştirin.
  12. Picasso Render'da Postprocess → Undrift by RCC'yi seçin. 1000'den başlayarak segmentasyon değeri girin. Tamamlandığında, hesaplanan xy sürüklenme grafiki görünecektir. Süreç, daha düşük segmentasyon değerleriyle (örneğin, 500, ardından 250) ardışık olarak tekrarlanarak, zamansal kaykınlıkta kademeli iyileşmeler gözlemlenir.
    NOT: Kayma düzeltmesi, nanopartiküller fiducial belirteç olarak kullanılarak da yapılabilir; ancak yükseltilmiş düzlemler görüntülendiğinde, nanoparçacık sinyali görünür olmayabilir. Bu durumlarda yalnızca gereksiz çapraz korelasyon (RCC) sürüklenme düzeltmesi uygulanır.
  13. Picasso Render penceresini kapatmadan önce Kayd→ Kayd Yerelleştirmeleri seçerek kayma düzeltilmiş Dosyayı kaydettiğinden emin olun.
  14. 6.13. adımdan sapma düzeltilmiş Dosyayı Picasso Filtre modülüne yükleyin; ek post-işlem adımları için, tek molekül lokalizasyonunun kalite metriklerine eşik değerler koyarak örneğin: (i) Lokalizasyon hassasiyeti (lpx, lpy); (ii) PSF genişlikleri (sx, sy); (iii) Foton sayıları; ve (iv) gürültü, istisna noktalar veya kötü çözülmüş noktaları kaldırmak için ek kriterler.
    NOT: lpx ve lpy (x ve y içinde lokalizasyon hassasiyeti), x ve y eksenleri boyunca lokalize nokta konumundaki belirsizliği tahmin eder ve Cramér-Rao alt sınırına (CRLB) dayanarak hesaplanır.
  15. Bir özelliği filtrelemek için, tablonun başlığındaki ilgili sütunu seçin ve menüden Plot → Histogram'ı seçin.
    NOT: İki sütun seçildiğinde 2D histogram çizilir.
  16. Belirli bir özellik aralığına göre filtrelemek için, 1D veya 2D histogram içinde istenen bölge boyunca tıklayın ve sürükleyin. Seçilen bölge yeşil renkte gölgelenmiş olarak görünür ve bu aralığın dışında değerlere sahip yerelleştirme olayları anında yerelleştirme listesinden çıkarılacaktır.
  17. Verileri fotonlar, sx, sy, lpx ve lpy ile filtreleyin; her parametrin dağılımının sadece merkezi kısmı korunarak en güvenilir lokalizasyonların korunmasını sağlar.
    NOT: PSF genişlik dağılımının merkezi kısmı genellikle 0.4 ile 1.2 piksel × arasındadır. Genellikle örtüşen sinyaller veya kötü çözülen noktalar nedeniyle oluşan ikincil dağılımlar hariç tutulur.
  18. Filtrelenen verileri menüden Dosya → Kaydet ' seçeneğini seçerek kaydedebilirsiniz.
  19. Her görüntüleyici çözümü için çekilen tüm videolar için 6.1-6.18 adımları arasındaki işlemi tekrarlayın.
  20. Picasso Render modülündeki filtrelenmiş Dosyayı açın. Bu süper çözünürlüklü görüntüdeki yoğunluk, lokalizasyon sayısını temsil eder. Kontrast, View → Display Settings seçeneğini seçerek ve Max. yoğunluk değerini değiştirerek değiştirilebilir.
  21. Tek bir kanalın süper çözünürlüklü görüntüsünü kaydetmek için, Blur bölümünden "Bireysel Lokalizasyon hassasiyeti" seçeneğini seçin. Ölçek çubuğu bölümünden bir ölçek çubuğu da eklenebilir.
  22. Tüm kanalların süper çözünürlüklü görüntüsünü kaydetmek için, işlenmiş tüm .hdf5 dosyalarını açın. Her kanalın rengi, menüden Dosyaları Gör → seçeneği ile değiştirilebilir.
  23. Tüm kanalları hizalayın, post-processing → Align kanallarını seçin.
  24. File → Export Complete Image seçeneğini seçerek .png bir görüntüyü kaydedin veya File → File Export Current View için belirli bir yakınlaştırma için.
    NOT: Tekrarlanabilirlik için tutarlı dosya isimlendirme ve dokümantasyon uygulamaları kullanın. Picasso yazılımı, her kaydedilen dosyaya otomatik olarak bir ek ekler. Cramer Rao Alt Sınırı ve en yakın komşu tabanlı analiz (NeNA)22 metrikleri, menüden Bilgiyi Göster → Göster seçeneğini seçerek çıkarılabilir. NeNA, yerel floroforların mekansal dağılımını, komşu lokalizasyonlar arasındaki Öklid mesafesini değerlendirerek niceliklerini sağlar. CRLB, foton istatistikleri ve arka plan gürültüsü temelinde yerelleştirme hassasiyeti için teorik bir alt sınır sağlarken, NeNA doğrudan veri setinden elde edilen yerelleştirme hassasiyetinin deneysel bir tahminini sunar. Bu nedenle, NeNA, SMLM'de CRLB'ye tamamlayıcı bir ölçüt olarak yaygın olarak kullanılır; çünkü sadece teorik sınırları değil, aynı zamanda sürüklenme düzeltmesi, uyum hataları ve deneysel değişkenlik gibi pratik etkileri de yakalar. NeNA metriği, Picasso Render modülünden çıkarılmıştır. Tek moleküllü uyumun CRLB'si, bilgilendirilen yerlileştirme hassasiyet değerlerini belirlemek için kullanılır (σSMLM). Bildirilen değer, tüm lokalizasyonlar için σx ile σy arasındaki ortalamadır; bunlar sırasıyla x ve y cinslerinde lokalizasyon hassasiyetinin dağılımının mod değeridir.

Sonuçlar

SDC-OPR sisteminin süper çözünürlüklü görüntüleme yeteneklerini göstermek için (Şekil 1A), düzlem içindeki çözünürlüğü, biyolojik referans yapısı olan nükleer gözenek kompleksleri (NPC'ler) üzerinde DNA-PAINT görüntüleme deneyleri (Şekil 1B) yapılarakdeğerlendirildi 17. Şekil 1C, U2OS hücrelerinde monomerik güçlendirilmiş yeşil floresan protein (mEGFP) ile etiketlenmiş ve DNA ile konjuge edilmiş anti-GFP nanokorlarıyla etiketlenmiş nukleoporin 96 (Nup96)'nın temsilci DNA-PAINT SDC-OPR görüntüsünü göstermektedir. Yakınlaştırılmış paneller NUP alt yapısını ortaya koymakta olup, Şekil 1D, oklarla gösterilen, nükleer gözeneklerin beklenen 8 katlı simetrisiyle uyumlu eşleşmiş Nup96 proteinlerini gösterir. Şekil 1E'de, Nup96 çiftleri arasındaki Öklid mesafesi, bunların hizalanmasıyla ve toplanan görüntünün kesitsel histogramı çizilerek ölçüldü (n = 16 çift). Analiz, EM modelleri ile HILO ve TIRgörüntüleme 23 sonuçları ile uyumlu olarak (13 ± 2) nm (Şekil 1E) bir tepeden tepeye ayrılma göstermiştir. Her zirve uyumu 4 nm standart sapma gösterdi ve SDC-OPR üzerinde DNA-PAINT kullanılarak elde edilen yüksek lokalizasyon hassasiyetini (σSMLM = 3.3 nm, NeNA = 4.4 nm) doğruladı. Dikkat çekici olarak, bu hassasiyet tüm 53 × 53 μm² FOV boyunca korunmuştur ki bu, konfokal tabanlı sistemler için olağanüstü bir özelliktir.

Çok renkli görüntüleme yeteneğini göstermek amacıyla, U2OS hücrelerindeki Nup96, mitokondriler ve mikrotübullar, Exchange-PAINT18 kullanılarak alınmak üzere DNA etiketiyle belirlendi. Bu teknik, tek bir florofora konjuge edilmiş ortogonal DNA görüntüleme zincirleri kullanır ve tüm hedeflerin aynı lazer kaynağıyla uyarılmasını sağlar (Şekil 2A). Sinyalleri aynı anda almak yerine, bunları ardışık görüntüleme turları arasında ayırarak ticari SDC-OPR sistemine doğrudan entegrasyonu kolaylaştırır. Şekil 2B, anti-GFP nanobody ile mavi etiketlenmiş Nup96, ikincil anti-TOM20 antikorlu kırmızı mitokondriler ve birincil anti-α-tubulin antikoru ile yeşil mikrotübullar gösterilmiştir. Özellikle, tek renkli Nup96 görüntülemesi için elde edilen olağanüstü tek moleküllü lokalizasyon hassasiyeti, çoklu hedefli deneyde tüm hedeflerde korunmuş ve NPC için 3,9 nm, α-tubulin için 4,0 nm ve mitokondriler için 3,3 nm lokalizasyon hassasiyeti değerleri elde edilmiştir (Şekil 2B panelleri 1, 2 ve 3).

Büyük FOV görüntüleme için, HeLa hücrelerindeki mikrotübullar, SDC-OPR sisteminde bulunan çeşitli büyütmeler ve farklı kamera binleme ayarlarıyla görüntülenerek piksel boyutlarını 78 nm ile 108 nm arasında tuttu (Şekil 3). Şekil 3A, 10 HeLa hücresinin mikrotübul sitoskeletini gösterir ve renkler lokalizasyon hassasiyetini temsil eder. 1× büyütmede, ortalama lokalizasyon hassasiyeti daha yüksek büyütmelere (Şekil 3B-D) kıyasla belirgin şekilde daha kötüdür ve daha fazla değişkenlik gözlemlenir. Bu, Gauss aydınlatma profilinin belirgin olduğu ve FOV'un kenarlarına doğru hassasiyetin azaldığı büyük FOV üzerindeki lazer güç yoğunluğunun azalmasından kaynaklanır. Buna rağmen, geniş 211 × 211 μm² FOV boyunca ortalama 9,5 nm lokalizasyon hassasiyeti elde etmek, konfokal tabanlı sistemler için etkileyicidir ve biyolojik heterojenliğin yüksek çözünürlüklü araştırılmasını mümkün kılar.

Son olarak, sistemin en yüksek büyütme (4×, 53 × 53 μm² FOV) kullanılarak sabit HeLa hücrelerinde mikrotubul ağının DNA-PAINT görüntüleri alınarak ~500 nm kalınlığında konfokal hacmde ve 1 μm z-adım elde edilerek tüm hücrelerin görüntülenme olasılığı gösterilmiştir. Şekil 4A, her z-düzlemi için tek moleküllü yeniden yapılandırma görüntülerini, ilgili lokalizasyon hassasiyeti ve NeNA değerleriyle birlikte sunar. Ayrıca, HeLa hücresindeki mikrotübul ağının 3D renkli görselleştirmesi Şekil 4C'de sunulmaktadır. Derinlik arttıkça, saçılma ve optik aberrasyonlar nedeniyle tespit edilen foton sayısı azalır; bu da hem Cramér-Rao Alt Sınırı (CRLB) (Şekil 4A, sağda) türetilen lokalizasyon hassasiyetleri hem de NeNA metriğiyle hesaplananlar için lokalizasyon hassasiyetinin azalmasına yol açar. Yine de, SDC-OPR sisteminin mümkün olan yüksek foton toplama seviyesi, dar dağılımlarla 9 μm'ye kadar görüntüleme derinliğinde 10 nm σSMLM ≤ olanak tanır. Gerçekten de, çift duvarlı filamentli mikrotübul yapıları çeşitli derinliklerde açıkça çözülmüştür: örtü-slip hücre arayüzüne yakın, ara eksenel pozisyonlarda ve hücrenin üst kısmında, tepeden tepeye mesafe 30 nm ile 40 nm arasında (Şekil 4C), bildirilendeğerler 24 ile tutarlıdır. Bu sonuçlar, SDC-OPR'nin büyük FOV'lar ve tüm hücre yüksekliği boyunca yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlama yeteneğini ortaya koymaktadır.

Şekil 1
Şekil 1: Farklı hücre örneklerinin düzlem içi tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi ve çok renkli süper çözünürlüklü görüntüleme. (A) Optik Foton Yeniden Ataması (SDC-OPR) sistemiyle dönen disk konfokalının şeması, foton toplama kapasitesini maksimize etmek için tasarlanmış mikrolens dizisi içerir. (B) DNA-BOYA'nın şeması: Floresan olarak işaretlenmiş DNA zincirleri, görüntüleyici zincirleri olarak bilinen, ilgilenilen proteini hedefleyen antikor/nanokora sabitlenen tamamlayıcı DNA dizileriyle (kenetlenen zincirler) geçici olarak hibritleşir. Bu kısa ömürlü bağlanma olayları, stokastik yanıp sönme şeklinde görünen floresans sinyalleri oluşturur. (C) U2OS hücrelerinin NPC'sinin 4× büyütülmesiyle SDC-OPR sisteminde temsil DNA-PAINT görüntüsü. Yüksek çözünürlük yeteneği, bireysel NPC'lerin net şekilde çözüldüğü inset bölümünde gösterilir. (D) SDC-OPR ile geliştirilmiş DNA-PAINT, beyaz okların gözenek mimarisindeki karakteristik Nup96 protein çiftlerini vurguladığı tek NPC'lerin görselleştirilmesini sağlar. (E) Nup96 dimerler (n=16 çift) arasındaki mesafe ölçümlerinin tek NPC simetri birimleri içinde dağılımı. Bu şekil, Zaza ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. 

Şekil 2
Şekil 2: SDC-OPR mikroskobu kullanarak çok renkli görüntüleme için Exchange-PAINT. (A) Üç hedefin Exchange-PAINT şeması sıralı olarak görüntülendi. Üç protein hedefi DNA fonksiyonel antikorlar, Fab parçaları veya nanobody ile etiketlendi. Cy3B görüntüleyici iplikleri, görüntüleme turları arasında yıkama adımları ile iplik tipine göre sıralı olarak görüntülendi. (B) U2OS hücrelerinin SDC-OPR mikroskopisi ile 4× büyütme ile üç renkli Exchange-PAINT görüntülemesi, mikrotubullar (kırmızı; DNA ile bağlanmış anti-α-tubulin ile etiketlenmiş), mitokondriler (yeşil; TOM20 hedefleyen DNA-nanobody) ve NPC (mavi; mEGFP etiketli Nup96, anti-GFP DNA-nanobody ile). Ölçek çubuğu: 5 μm. Yakınlaştırılmış bölge, SDC-OPR sisteminde elde edilen gelişmiş çözünürlüğü vurgular; (1) mitokondriler, (2) mikrotübullar ve (3) NUP'a odaklanır. Ölçek çubukları = 1 μm. Bu şekil, Zaza ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3
Şekil 3: SDC-OPR mikroskobunda büyük FOV'larda DNA-PAINT görüntüleme. Mikrotubul DNA-PAINT görüntüleri (anti-α-tubulin etiketleme) çoklu büyütmelerde elde edildi: (A) 1× büyütme ve 1 binleme (FOV 211 × 211 μm²), (B) 2.8× ve 2 binning (FOV 76 × 76 μm²), (C) 4× büyütme ve 4 binleme (FOV 53 × 53 μm²). Renk, 1x büyütme durumunda 0-16 nm arasındaki lokalizasyon hassasiyetini, diğerlerinde ise 0-4 nm arasındaki konumlandırma hassasiyetini temsil eder. (D) Farklı mesafelerde (μm cinsinden) 1× (kırmızı), 2,8× (sarı) ve 4× (yeşil) büyütmeler için lokalizasyon hassasiyeti ölçülür. Bu şekil, Zaza ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4
Şekil 4: Tüm hücre DNA-PAINT görüntülemesi. (A) Sol. SDC-OPR ile elde edilen DNA-PAINT ile HeLa hücrelerinde hacimsel mikrotubul görüntüleme, 4× büyütme ile z = 0 ile 9 μm (1 μm adım) arasında eksenel kesitler gösterilmiştir. Her düzlem z konumu, lokalizasyon hassasiyeti ve NeNA metriklerini gösterir. Ölçek çubukları: 5 μm (xy). Doğru. Tüm uçaklar için yerelleştirme hassasiyeti ve nüfuz derinliği arasındaki fark. (B) (A)'daki aynı HeLa hücresinde mikrotübul ağının 3D render edilmesi. Renk, 0 ile 9 μm arasındaki nüfuz derinliğini temsil eder. (C) (A)'da belirtilen her penetrasyon derinliğinden vurgulanmış küçük bölgelerin yakınlaştırılmış görüntüleri. Bu şekil, Zaza ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Süper çözünürlüklü floresan mikroskopisi, kırınım bariyerini aşarak mekansal çözünürlüğü dramatik şekilde artırmıştır. Ancak, biyolojik araştırmalarda yaygın olarak benimsenmesi devam eden zorluklarla karşı karşıyadır. Özellikle, FOV, çözünürlük ve penetrasyon derinliği arasındaki dengeler, bu üç faktörün hepsini aynı anda optimize etmeyi zorlaştırır. Bu zorluklar, optik foton yeniden ataması (SDC-OPR) ile geliştirilen SMLM ve dönen disk konfokal mikroskopisinin birleşik yeteneklerinin kullanılmasıyla ele alındı. Ticari SDC-OPR sistemi tarafından mümkün kılınan mikrolens dizilerinin standart SDC konfigürasyonuna entegre edilmesiyle, foton toplanımı artırılırken etkili iğne deliği boyutu azaltılmış ve bu da önemli çözünürlük iyileştirmelerine yol açmıştır. Standart SDC ile karşılaştırıldığında, SDC-OPR sistemi çözünürlük gücünde belirgin bir gelişme göstermiş, odak düzleminde 10 nm14 ile ayrılmış özellikleri başarıyla ayırt etmişken, standart SDC yalnızca 20 nm11'den büyük mesafeleri çözebiliyordu. Bu gelişmiş çözümleme kapasitesi, foton yeniden atamasının moleküler ölçekli ayrımların elde edilmesinde faydasını vurgular. Özellikle, odak düzleminde (z = 0 μm) 2 nm'in altında yan lokalizasyon hassasiyeti sağlandı; yan hassasiyet 9 μm'e kadar derinliklerde 10 nm'nin altında kaldı ve 53 × 53 μm² veya 76 × 76 μm² arasında oldukça uyarlanabilir bir FOV ile birleşti. 211 × 211 μm² gibi büyük bir FOV olmasına rağmen, sistem etkileyici bir ortalama 9,5 nm düzlem içi lokalizasyon hassasiyeti sağladı. Bu sonuçlar, sistemin tüm hücreler boyunca yüksek çözünürlüklü görüntüleme kapasitesini vurguluyor.

Kullanılan farklı antikorlar için bağlanma reaksiyonları konusunda, optimal antikor-DNA oranı sağlanmak için protokol dikkatlice takip edilmelidir. Bu oranın aşılması, lokalizasyon hassasiyetini azaltabilir ve qPAINT25'te yapılan nicel ölçümleri olumsuz etkileyebilir. Bu nedenle, oranın mikrohacimli UV-Vis spektrofotometre kullanılarak doğrulanması kritik öneme sahiptir; böylece DNA ile antikor arasında nihai 1:1 oranı sağlanır.

Mikrotübulların yüksek kaliteli süper çözünürlüklü görüntülerini elde etmenin kritik bir adımı doğru fiksasyondur. Yalnızca yüksek PFA konsantrasyonlarına dayanan geleneksel fiksasyon yöntemleri genellikle mikrotubul yapılarını bozar. Bunun yerine, glutaraldehitin (GA) tek başına veya PFA ile kombinasyon halinde kullanılması yapısal korumayı önemli ölçüdeiyileştirir 26,27.

Optimal görüntüleme için, tek moleküllü olay başına foton toplamayı maksimize etmek için yüksek sayısal açıklık (NA) hedefi gereklidir. Ticari SDC-OPR sisteminde, lazer gücü, örnek fotoağartmasını en aza indirmek için SMLM için kullanılan geleneksel TIRF mikroskoplarına göre kasıtlı olarak daha düşüktür. DNA-PAINT fotobeyazlama endişelerini ortadan kaldırır ve teorik olarak daha yüksek lazer gücü kullanabilir, ancak mevcut ticari sistemler sınırlamalar getirir ve TIRF aydınlatmasına kıyasla daha uzun pozlama süreleri gerektirir. Ayrıca, SDC-OPR'deki aydınlatma konfokal olduğundan, maruz kalma sırasında moleküller sürekli uyarılmaz. Sonuç olarak, sürekli TIRF aydınlatmasına göre daha uzun pozlama süreleri gereklidir; Bu çalışmada 300 ms maruz kalma süresi kullanılmıştır. Ancak, belirli bir deneyin çözünürlük gereksinimlerine bağlı olarak, daha kısa entegrasyon süreleri (örneğin 150-200 ms) minimum çözünürlükkaybı ile kullanılabilir.

Görüntüleyici zincirinin konsantrasyonunu optimize etmek, tek moleküllü sinyallerin iyi ayrılmış kalmasını sağlamak ve doğru yeniden yapılandırma için yeterli lokalizasyonlar oluşturmak için kritik bir adımdır. Bu ayarlama, olay yoğunluğu ile sinyal örtüşmesi arasındaki dengenin dikkatlice kontrol edildiği standart SMLM edinimlerine benzer. Optimum görüntüleyici konsantrasyonu her farklı hedef için ayarlanmalıdır. Örneğin, mikrotübüller için, başlangıçta görüntüleyici ipliği konsantrasyonu 1 nM'den az olması ve gerektiğinde ayarlamalar yapılması önerilir.

Uzun süreli edinimler sırasında sabit odak tutmak kritik öneme sahiptir, çünkü eksenel (z) kayması işlem sonrası düzeltilemez. Lateral (xy) kayma , RCC veya fiducial belirteçlerle telafi edilebilir. Bu kurulumda, mikroskobun Mükemmel Odak Sistemi (PFS), saatlerce süren görüntüleme boyunca odak kararlılığını sağlar.

Özetle, SMLM'nin SDC-OPR ile entegrasyonu, tüm hücrelerin derinliklerinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme için güçlü bir platform sağlar ve çözünürlük, derinlik ve FOV arasındaki geleneksel tavizleri aşmaktadır. Ancak, sistemin yeteneklerini tam olarak gerçekleştirmek için, antikor konjugasyonu ve fiksasyonundan edinim ayarları ve veri işlemeye kadar deneysel koşullara titizlikle dikkat etmek gereklidir. Örnek hazırlığından sürüklenme düzeltmesine kadar her adım, güvenilir, yüksek hassasiyetli veri elde etmede kritik bir rol oynar. Dikkatli protokol optimizasyonuyla, bu yaklaşım karmaşık biyolojik örneklerde nicel ve nano ölçekli görüntüleme için sağlam ve çok yönlü bir çözüm sunar. Bu protokolün, topluluğun tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisini benimsemesine ve geleneksel TIRF veya HILO aydınlatmasıyla ulaşılması zor örnek düzlemlerinden süper çözünürlüklü görüntüler elde etmesine yardımcı olması beklenmektedir. Her iki hedef, genellikle dünya çapında mikroskopi tesislerinde bulunan ticari olarak mevcut mikroskoplar kullanılarak gerçekleştirilmektedir.

Diğer ve gelecekteki uygulamalar açısından, yöntem tüm hücre örnekleri ve daha yüksek görüntüleme derinliklerinde daha karmaşık doku örnekleri için uygulanabilir; önceki çalışmalarda gösterildiğigibi 14. Fiziksel kesitleme gerektiren yaklaşımların aksine, bu teknik sağlam dokuların hacimsel görüntülenmesini sağlar, doğal mimariyi korur ve fiziksel kesitlemenin ortaya çıkardığı eserleri en aza indirir. Nanobedenler gibi daha küçük affinite problarının kullanımı, tam boy antikorlara kıyasla doku nüfuzunu daha da artırır ve kalın örneklerde daha eşit etiketleme sağlar. Bu yaklaşım, hücresel organizasyonu ve moleküler dağılımları yerinde daha yüksek isabetle incelemeye kapı açıyor. Bu uygulamaların ötesinde, strateji nanoyapıların ve biyomoleküler montajların yüksek verimli taramasına da olanak tanır ve yapısal heterojenlik ile fonksiyonun sistematik olarak incelenmesini mümkün kılar. Buna ek olarak, DNA-PAINT'teki son gelişmeler, boya söndürücü veya boya-boya etkileşimlerine(29,30,31) dayalı kendiliğinden söndüren görüntüleyici problar ortaya çıkarmıştır; bu problar arka plan sinyallerini etkili bir şekilde düşürür, floresans yoğunluğunu artırır ve mekansal çözünürlüğü artırır, böylece daha hızlı alım oranları sağlanır. Bu florojenik probların SDC-OPR çerçevesine entegre edilmesi, görüntüleme hızını ve çözünürlüğünü daha da artırma potansiyeline sahiptir. Bu gelişmeleri SDC-OPR sisteminin güçlü yönleriyle birleştirmek, daha karmaşık biyolojik örneklere uygulanabilirliğini genişletebilir ve platformu çok çeşitli dokularda hücresel ve moleküler yapıların ayrıntılı haritalanması için esnek bir araç haline getirebilir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, İnsan Sınırı Bilim Programı Organizasyonu (HFSP) tarafından, CZ (LT0025/2023-C) ve Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi'ne disiplinlerarası doktora sonrası bursu ile finanse edilmiştir; bu burs M.T. (EP/R513143/1 ve EP/W524335/1) ile O.P.L.D (EP/R513143/1 ve EP/T517793/1) desteklenmiştir. S.S ayrıca Dorothy Hodgkin bursu (DHF\R1\191019 ve DHF\R\251006) aracılığıyla Kraliyet Derneği'ni takdir etmektedir. Bu çalışma, Chan Zuckerberg Girişimi (2023-321188) ve BBSCR (BB/Y513064/1) hibeleriyle de desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(±)-6-Hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilik asitMerck 238813-5GTrolox
3,4-Dihidroksibenzoik asit Merck 37580-25G-FPCA
60& Times; Apo NA 1.49 objektif lensNikon
7.0 KDA spin tuz çözme kolonu boyut dışlama reçinesi içerir Fisher Scientific Ltd89882Zeba Spin Desalting Columns for step 2.4
Accutase - Enzim Hücre Ayrılma OrtamıPromo CellC-41310
Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP ve özel DNA (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')Büyük FotonikÖzel ürünDrosophila için anti-GFP nanobody
Alpaka sdAb (1H1) anti-GFP ve DNA kombinasyonuBüyük FotonikMASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3NUP için anti-GFP nanobody
Anti-alfa tubulin (YL1/2)Thermo Fisher ScientificMA1-80017
Anti-tavşan IgGBüyük FotonikMassive-sdAB-FAST 2-Plex, İkincil sdAB F2
Anti-TCRζ (6B10.2)BioLegend644102
Sığır serum albüminiMerck A4503-10GBSA
Konik santrifüj tüp 15 mLFisher Scientific Ltd17705004
Konik santrifüj boru 50 mLVWR International734-0448
CSU-W1 SoRaNikonSDC-OPR mikroskobu
Spin kolonlarının Sephadex G-25 ile tuzdan arındırılması (DNA arıtması için boyut dışlama reçinesi) Fisher Scientific Ltd11743309Marka: Cytiva. 2.5. adım için G-25 sütunları
D-glukozMerck G8270-1KG
DMEM medyasıThermo Fisher Scientific11965092
DMSO, AnsusuzThermo Fisher ScientificD12345
DTT  (Ditiothreitol)Thermo Fisher Scientific15976082
EDTAThermo Fisher Scientific15575020
EGTAMarck324626
Fetal Sığır SerumuThermo Fisher ScientificA5256701
GlutaraldehitServa2311402
GliserolMerck G5516-500ML 
GlisinMP Biyomedikal219482580
Maleimide-PEG2-succinimidyl Merck 746223-50MG
McCoy'un 5A medyasıFisher Scientific Ltd16600082
MES (2-(N-morfolino)etansülfonik asit)MerckM3671-50G
MetanolFisher Scientific Ltd32213-25L
MgCl2Fisher Scientific Ltd10418464
Mikrosantrifüj tüpleri 0.5 mLFisher Scientific Ltd11508232
Mikrosantrifüj tüpleri 1.5 mLEppendorf10509691 
Mikrohacimli UV-Vis SpektrofotometreThermo Fisher ScientificND-ONE-WNanodrop
NaCl2Sigma-AldrichS6546-1L 
Nanopartiküller 90 nm -AltınSitodiagnostikG-90-100
Orca Fusion-BT cmos kameraHamamatsu
Penisillin-StreptomisinThermo Fisher Scientific15070063Notlar
Fosfatla tamponlanmış tuzlu (1x çözelti)Fisher Scientific Ltd11530546PBS
Pierce 16% formaldehit (w/v), metanolsüzFisher Scientific Ltd11586711PFA
Potasyum Klorür Merck   P9541-500G
Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz  Merck P8279-25UN PCD
Sodyum  hidroksitFisher Scientific Ltd12963614
TOM20 antikorAbcamAb186735
Tris tamponuVWR InternationalA4577.1000
Triton  X-100   VWR International1086031000
Tween-20Merck P9416-50ML
Ultrafiltrasyon santrifüj filtre ünitesi, 100 kDa MWCOMerck UFC510024Üretici: Amicon Ultra
μ-Slide 8 Kuyu Yüksek Cam TabanİbidiIB-80807
μ-Slide VI 0.5 Cam TabanİbidiIB-80607

Kaynaklar

  1. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  2. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  3. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  4. Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms. Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).
  5. Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
  6. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  7. Wäldchen, F., et al. Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM. Nat Commun. 11 (1), 887(2020).
  8. Zagato, E., et al. Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM). Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).
  9. Galland, R., et al. 3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
  10. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. 236, Springer Science & Business Media. (2006).
  11. Schueder, F., et al. Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).
  12. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  13. York, A. G., et al. Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing. Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).
  14. Zaza, C., et al. Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment. Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).
  15. Jungmann, R., et al. Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).
  16. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  17. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy. Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  18. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  19. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  20. Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. Localization accuracy in single-molecule microscopy. Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).
  21. Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes. , (2025).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).
  23. Schlichthaerle, T., et al. Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT. Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).
  24. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).
  25. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  26. Whelan, D. R., Bell, T. D. M. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).
  27. Xie, Z., et al. Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy. Cytoskeleton. , (2025).
  28. Steen, P. R., et al. The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes. Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).
  29. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy. J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).
  30. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy. Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).
  31. Chung, K. K. H., et al. Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

DNA PAINT G r nt lemeTek Molek l LokalizasyonuT m H cre G r nt lemeok Renkli G r nt lemeH cre i EtiketlemeDerin H cre G r nt lemeG r nt Rekonstr ksiyonu
Optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal üzerinde DNA-PAINT ile tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.