Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

CRISPR/Cas9 Aracılı Ent2*/CyO Drosophila melanogaster Suşunun Üretimi ve Karakterizasyonu

62 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69546

⸱

7 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

Bu makalede

Özet

Dengeleyici nükleozid taşıyıcı 2 (ENT2), nükleozid taşınımı ve hücresel metabolizmada yer alan korunan bir transmembran proteindir. Bu çalışmada, Drosophila melanogaster'da Ent2 hedefli bir allel oluşturmak için CRISPR/Cas9 tabanlı bir genom düzenleme iş akışı oluşturuldu. Dengeleyici kromozom stratejisi kullanılarak stabil bir Ent2*/CyO heterozigot çizgisi inşa edildi ve korundu. Bu çalışma, mutant hattın tasarımını, üretimini ve moleküler doğrulamasını ile farklı sıcaklık koşullarında fenotipik karakterizasyonunu açıklar. Yerleşik iş akışı ve mutant suş, homozigot ölümcül fenotiplere sahip genlerin incelenmesi ve Drosophila'da sıcaklıkla ilişkili fenotipik varyasyonun araştırılması için pratik bir çerçeve sağlar.

Özet

Bu çalışmada, Drosophila melanogaster'deki dengeleyici nükleozid taşıyıcı 2 (Ent2) geninde mutasyonları tanıtmak için CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenleme yaklaşımı kullanıldı. Ent2'nin kodlama bölgesini hedefleyen rehber RNA'lar, Cas9 mRNA ile birlikte w 1118 embriyolarına enjekte edilmiş. Mutant alleller Sanger dizileme ile tanımlanmış ve dengeleyici kromozom kullanılarak stabil bir Ent2*/CyO heterozigot çizgisi olarak korunmuştur. Daha sonra, meyve sineklerinde vücut ağırlığı, tırmanma yeteneği, hayatta kalma oranı ve süperoksit dismutaz (SOD) ile katalaza (CAT) aktivitelerini sırasıyla 22 °C ve 25 °C sıcaklıklarda değerlendirdik. Sonuçlar, hem 22 °C hem de 25 °C sıcaklıklarında, Ent2*/CyO meyve sineklerinin vücut uzunluğu ve ağırlığının w1118'e kıyasla önemli ölçüde azaldığını ve gelişimlerinin geciktiğini göstermektedir. 22 °C'de Ent2*/CyO sineklerinin genel ömrü w1118'den biraz daha uzundu, oysa 25 °C'de anlamlı bir fark gözlemlenmedi. Lokomotor kabiliyeti açısından, heterozigot sineklerin tırmanma performansı, her iki sıcaklıkta daw1118'den anlamlı derecede düşüktü ve erkekler daha ciddi şekilde etkilendi. Ayrıca, Ent2*/CyO meyve sineklerinde CAT ve SOD'nin antioksidan enzim aktiviteleri önemli ölçüde azalmış, bu da antioksidan kapasitesinin belirgin bir şekilde bozulduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, CRISPR tarafından oluşturulan bir Ent2 mutant hattının fenotipik profilini tanımlıyor ve Drosophila'da genom düzenleme ile dengeleyici kromozom stratejilerini birleştirmenin mümkünlüğünü göstermektedir. Bu çalışma, metabolizma ve çevresel tepkilerle ilişkili genlerin gelecekteki araştırmaları için metodolojik bir çerçeve ve genetik kaynak sağlar.

Giriş

Drosophila melanogaster, genetik ve gelişim biyolojisi için en yaygın kullanılan modelorganizmalardan biri olmaya devam etmektedir 1. Kısa yaşam döngüsü, hızlı üreme, yerleşik genetik manipülasyon araçları ve tam açıklamalıgenom 2,3 ile karakterize edilir. Bu tür, gen fonksiyonu, metabolik düzenleme ve çevresel uyum sağlama çalışmalarında kapsamlı şekildeuygulanmaktadır 4,5. Nukleozidler ve ATP gibi türevleri, Drosophila'da hücresel enerji üretimi, nüklein asit sentezi ve sinyal iletiminde merkezi rol oynar ve metazoanlar arasında korunan metabolik düzenlemeyiyansıtır. Drosophila'daki hücre dışı adenosin ve nükleozid taşıma mekanizmalarına bağlı olan purinerjik sinyal yolları, enerji ve sinyal iletim yanıtlarının koordinasyonunda nükleozid hareketinin zarlar boyunca işlevsel rolünüvurgular. Bu süreçler arasında, sitoplazmik zar boyunca nukleozidlerin taşınması öncelikle dengeleyici nükleozid taşıyıcı (ENT) ailesi aracılığıyla sağlanır ve DmENT2 Drosophila8'de fonksiyonel taşıma aktivitesi sergiler.

KBB ailesi, ENT2 de kapsamlı şekilde incelenmiş bir transmembran nükleozidtaşıyıcısı 9 olmak üzere birden fazla alt tipten oluşur. Çeşitli pürin ve pirimidinnükleozitlerinin 10,11 enerjiden bağımsız transmembran taşınımını kolaylaştırır. Memelilerde ENT2, pürin ve pirimidin nükleozidleri ile nükleobazların hücresel alımını kolaylaştıran yaygın olarak ifade edilen çift yönlü bir taşıyıcıdır. Bu taşıma aktivitesi, nukleotid kurtarılmasına katkıda bulunur ve hücresel metabolik homeostazın12 korunmasına yardımcı olur. ENT2 ayrıca çeşitli nukleozid kaynaklı ilaçların taşınışına aracılık eder; işlevsel önemini endogen nükleozid hareketinin ötesine genişletir ve daha geniş fizyolojik ve klinik önemini vurgular. Ayrıca, ENT2'nin insanlarda nörolojikbozukluklarda 14, tümörmetabolizmasında 15, damar işlevbozukluğunda 16 ve hücresel enerji metabolizmasında roloynadığı belirtilmiştir. Ancak, Drosophila'da Ent2'nin organizma düzeyindeki rollerini ele alan çalışmalar sınırlı kalır.

ENT2'nin büyüme ve gelişim, enerji metabolizması, lokomotor performansı ve değişken sıcaklık koşullarında antioksidan kapasitedeki rolleri tam olarak incelenmemiştir18. Drosophila'da sıcaklık, bazal metabolik hızı ve yaşam süresini güçlü şekilde etkiler; daha yüksek yetiştirme sıcaklıkları genellikle metabolik aktiviteyi artırır ve ömrü azaltır19. Bu sıcaklığa bağlı gen ifadesi değişiklikleri, fizyolojik yolları etkileyebilir ve böylece belirli gen mutasyonlarının fenotipik etkilerinideğiştirebilir.

Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar/CRISPR ile ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9), Drosophila'da siteye özgü yok etme, silinme, değiştirme ve etiket girişi gibi çeşitli genomik modifikasyon işlemlerinde yaygın olarak uygulanmış olup, etkinliğini ve güvenilirliğinigöstermiştir 21,22,23. Son gelişmeler, CRISPR kaynaklı baz editörlerin Drosophila'da daha ince siteye özgü baz modifikasyonları için de kullanılabileceğini göstererek nokta mutasyonları ve hassas fenotipikkontrol 24 için yeni bir araç sağlamaktadır. Kimyasal ve radyasyon mutagenezi ile transpozon aracılı ekranlar dahil geleneksel mutagenez yöntemleri genetik mutasyonlarüretebilir 25. Bu yaklaşımlar genellikle düşük verimlilik ve yüksek rastgelelik nedeniyle mutasyon olaylarında sınırlıdır. Sonuç olarak, araştırmacılar ilgi çekici belirli allelleri izole etmek için çok sayıda bireyitaramak zorundadır 26. CRISPR/Cas9, belirli DNA dizilerinde programlanmış rehber RNA (gRNA) yönlendirilmiş bölünmeyi mümkün kılar. Ortaya çıkan çift iplikli kırılmalar, homolog olmayan uç birleştirme veya homoloji yönlendirilmeli onarım yoluyla onarılır; bu da tanımlanmış, kalıtsal mutasyonlar oluşturur ve fenotipik analizi karıştırabilecek arka plan mutasyonlarını önemli ölçüde azaltır27,28. CRISPR/Cas9 ile üretilen mutant alleller, Curly O (CyO)29 gibi dengeleyici kromozomlarla bağlanarak heterozigot bir durumda tutulabilir. Bu stratejinin, Drosophila genetiğinde ölümcül allellerin homozigot formda kaybını etkili bir şekilde önlediği gösterilmiştir. Sonuç olarak, değişken sıcaklıklar veya çevresel koşullar altında fonksiyonel çalışmalar dahil olmak üzere uzun vadeli ve sistematik fenotipikdeğerlendirmeyi destekler 29,30. CRISPR/Cas9'un basit tasarımı ve yüksek verimliliği, suş yapım döngüsünü önemli ölçüde kısaltmış ve genetik arka planın kararlılığını artırmıştır. Bu özellikle, sıcaklık tepkisi ve gelişimsel homeostaz gibi uzun vadeli çevresel faktörlerin incelenmesi için önemlidir.

Bu temel üzerine inşa edilerek, Drosophila melanogaster'deki Ent2 geni CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak yok edilmiş ve kalıcı bir kalıtsal Ent2*/CyO heterozigot mutant suş kurulmuştur. Antioksidan enzimler SOD ve CAT gelişim döngüsü, vücut ağırlığı, hareket kabiliyeti ve aktiviteleri sistematik olarak değerlendirildi. W1118'in çok boyutlu fenotipleri ve mutant sinekleri değişken sıcaklık koşullarında karşılaştırarak, bu çalışma CRISPR'den türetilen mutant çizgilerin üretilmesi ve korunması için tekrarlanabilir bir strateji sunmayı ve ortaya çıkan fenotiplerin tanımlayıcı bir karakterizasyonunu sunmayı amaçlamaktadır. Bu çalışma, metabolizma ve çevresel tepkilerde rol alan genleri inceleyen gelecekteki çalışmalar için metodolojik bir çerçeve ve faydalı bir genetik kaynak sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Ent2 geni için CRISPR/Cas9 hedeflerinin tasarımı

  1. CHOPCHOP (v3)31 ve CCTop (v1.0)32 kullanarak Ent2'nin ekzon 2 ve 5'inde (FlyBase ID: FBgn0263916) aday CRISPR sitelerini seçin.
  2. Referans genom, Drosophila melanogaster Sürüm 6 (dm6) olarak tanımlanmıştır (RefSeq montaj erişimi: GCF_000001215.4). Daha sonra, aday gRNA siteleri belirlendi. Son olarak, belirlenen bölgeler optimal gRNA'lar elde edilmek için filtrelendi.
  3. MIT Özgüllük Skoru ≥ 80 (CHOPCHOP), CFD puanı ≤ 0.1 (CCTop), GC içeriği %40–%60 ve minimum PAM mesafesi ile hedefleri filtreleyin.
  4. Hedefleri ağırlıklı bir puanla sıralayın (verimlilik %50, özgüllük %30%, genel analiz optimizasyonu %20) ve iki gRNA seçin.
  5. T7 promotör gereksinimini karşılamak için her gRNA'nın 5′ ucuna bir "G" ekleyin. PCR ile tam boy sgRNA transkripsiyon şablonunu oluşturmak için aşağıdaki gRNA-spesifik ileri oligonukleotidleri kullanın:
    Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTGTTTAGAGCTAGAAATAGC
    Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGTTTAGAGCTAGAAATAGC
  6. Kalan sgRNA iskelet dizisi, PCR sırasında evrensel ters oligonukleotid tarafından sağlanır.

2. sgRNA transkripsiyon şablonlarının hazırlanması

  1. sgRNA transkripsiyon şablonlarının hazırlanması
    1. Üreticinin talimatlarına göre çift oligonukleotid tavlama–PCRyöntemi 33 ile 60 μL PCR reaksiyon karışımı oluşturulur. gRNA-spesifik ileri oligonukleotidi (Ent2-sg1-F veya Ent2-sg2-F) sgRNA iskeletini kodlayan evrensel ters oligonukleotid ile birleştirerek in vitro transkripsiyon için tam boy dsDNA şablonu elde edilir.
    2. Termosiklleri programla: 95 °C 3 dakika; 35 döngü: 95 °C 30 saniye, 55 °C 30 saniye, 72 °C 20 saniye; ardından 72 °C 10 dakika; 12 °C'de bekleyin.
  2. Transkripsiyon şablonunu arındırın
    1. 60 μL PCR ürününe 100 μL amonyum asetat (bkz. Malzeme Tablosu) ekleyin; karıştırın. 400 μL susuz etanol ekleyin; karıştırmak için ters yapın ve -20 °C'de 20 dakika kuluçka yapın.
    2. 4 °C'de santrifüj, 20.000 x g 15 dakika boyunca kullanıldı; Üstten atıl.
    3. Tüpü açık halde pelleti 10 dakika boyunca hava ile kurut. Pelleti 10 μL nükleazsız ddH₂O içinde yeniden askıya alın.
  3. gRNA'nın In vitro transkripsiyonu
    1. Kit talimatlarına uygun olarak 10 μL T7 in vitro transkripsiyon reaksiyonu kurun ( bkz. Materyal Tablosu).
    2. 37 °C'de 35 dakika kuluçka yapın. Transkripsiyon kitinde sağlanan 0,5 μL DNaz I ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
  4. GRNA'yı Saflaştır
    1. Transkripsiyon karışımını nukleazsız ddH₂O ile 60 μL'ye seyreltin. 60 μL suya doygun fenol/kloroform ekleyin (bkz. Materyal Tablosu); kısa bir girdap ve 4 °C, 16.000 x g sıcaklıkta 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    2. Sulu fazın 45 μL'sini yeni 1,5 mL RNazsız bir tüpe aktarın. 5 μL sodyum asetat ekleyin; karışım.
    3. 125 μL önceden soğutulmuş susuz etanol ekleyin; karıştırıp -20 °C'de 20–30 dakika kuluçka yapın. 4 °C'de santrifüj, 20.000 x g 15 dakika boyunca kullanıldı; Üstten atıl.
    4. Pelleti 200 μL %70 etanol (RNase içermeden) ile yıkayın; 4 °C'de santrifüj, 20.000 x g 5 dakika boyunca kullanıldı; Süpernatantı çıkarın.
    5. Pelleti 37 °C'de kurutarak etanol tamamen buharlaşana kadar kullanın. 20 μL ddH₂O ile yeniden süzülür; aliquot ve -80 °C'de sakla.
    6. NanoDrop spektrofotometre kullanarak gRNA konsantrasyonunu ölçün ve enjeksiyon için konsantrasyonu 250 ng/μL'ye ayarlayın. GRNA'nın saflığını yaklaşık 2.0 A260/A280 oranıyla güvence altına alın.
      NOT: RNase koruması için tüm süreç boyunca eldivenlerin giyilmesi gerektiğini vurguluyoruz. Tüm tüketim malzemeleri, önceden soğutmalı RNase-serbest santrifüj tüpleri ve pipet uçları dahil, işlem sırasında tutarlı şekilde kullanılmalıdır. İşlem sırasında oluşan organik reaktif atıkları, türüne göre belirlenmiş atık konteynerlerinde ayrı ayrı toplanmalı ve uygun şekilde işlemek için sertifikalı tehlikeli atık bertaraf tesisine düzenli olarak taşınmalıdır.

3. Cas9 mRNA'nın hazırlanması

  1. Transkripsiyon Şablonunun Hazırlanması
    NOT: RNA ile ilgili adımlar boyunca RNase içermeyen uçlar ve tüpler kullanın.
    1. Cas9 ifade plazmidini MLM3613 ( bkz. Malzemeler Tablosu) buz üzerinde eritin. RNase-içermeyen bir tüpte, 20 μg plazmid DNA, 7.5 μL 10x krestriksiyon tamponu, 1 μL PmeI (10.000 U/mL) ve nükleazsız ddH₂O ile 75 μL ile birleştirin.
    2. 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın. Tam doğrulayıcı olmayı 120 V'da %1 agaroz jeline 30 dakika boyunca 5 μL yükleyerek doğrulayın.
  2. Transkripsiyon Şablonlarının Arındırılması
    1. 70 μL sindirime 23 μL %2 sodyum dodesil sülfat (SDS, detaylar için Malzeme Tablosu'na bakınız) ve 0,5 μL proteinaz K (ayrıntılar için Materyaller Tablosu'na bakınız) eklenin; 50 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
    2. 45 μL kloroform ve 45 μL Tris-doygun fenol ekleyin; kısa bir süreliğine vortex; Santrifüj 13.800 x G, 5 dakika.
    3. 90 μL sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. 10 μL sodyum asetat (kit tarafından sağlanan) ve 200 μL önceden soğutulan susuz etanol ekleyin; mix; kuluçka −20 °C, 30 dakika.
    4. Santrifüj 20.000 x g, 4 °C, 15 dakika; Üstten atıl. Pelleti 100 μL %70 etanol ile iki kez yıkay; santrifüj 20.000 x g, her biri 2 dakika; Havada kurutuldu.
    5. DNA'yı 20 μL nükleazsız ddH₂O içinde çöz; >500 ng/μL doğrula.
  3. In vitro transkripsiyon ve co-capping
    1. Reaksiyonu, üreticinin talimatlarına göre kapalı bir T7 in vitro transkripsiyon kiti (bkz. Malzemeler Tablosu) kullanarak kurun.
    2. 37 °C'de 2 saat kuluçka yapın ve kapalı Cas9 mRNA üretilir.
    3. Transkripsiyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra, 1 μL DNAZ'ı (kitte sağlanan, konsantrasyon 2 U/μL) ekleyin, iyice karıştırın ve 37°C'de 15 dakika kuluçka geçirerek DNA şablonu parçalanın.
  4. Bir poli(A) kuyruk ekleyin
    1. RNA'yı 14 μL ddH₂O'ya getirin.
    2. 2 μL 10x E. coli Poly(A) Polimeraz tamponu, 2 μL ATP (10 mM), 1 μL RNaz inhibitörü ve 1 μL Poli(A) polimeraz ekleyin.
    3. 37 °C'de 45 dakika kuluçka yapın.
  5. mRNA'yı arındırın
    1. Reaksiyonu spin-kolonlu toplam RNA kitine uygulayın (bkz. Malzemeler Tablosu). Örneği 2 mL silika membran spin kolonuna yükleyin; santrifüj 8.000 x g, 15 saniye; Akışı atmak.
    2. RNeasy kolonuna 500 μL RPE tamponu ekleyin, 8000 x g hassasiyetinde 15 saniye santrifüj yapın ve kalan sıvıyı atın. Bu adımı bir kez tekrarlayın, ardından 2 dakika santrifüj yapın ve kalan sıvıyı atın.
    3. RNeasy kolonunu yeni bir 1.5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. RNA'yı üütlemek için 30 μL RNase-free ddH₂O ekleyin, 8000 x g boyunca 1 dakika boyunca santrifüj yapın. Enjeksiyon için mRNA konsantrasyonunu 500 ng/μL'ye ayarlayın. Elutlenmiş RNA'yı -80 °C'de sakla.

4. Drosophila embriyolarının mikroenjeksiyonu

  1. Enjeksiyon Örneklerinin Hazırlanması
    1. 15 μg Cas9 mRNA'yı 7,5 μg çift zincirli gRNA ile 2:1 hacim oranında karıştırın.
    2. DEPC ile işlenmiş RNase içermeyen suyla 30 μL'ye ayarlayın; Buzda kal.
  2. Drosophila yetiştiriciliği
    1. Enjeksiyonlu Drosophila suşunu w1118 büyük besin tüplerine amplifikasyon için aktarın. W1118 sinekleri, dengeleyici ile ilişkili etkiler olmadan temel fizyolojik durumu temsil etmek için referans kontrol olarak kullanıldı.
    2. Sinekler, %60–70 nem ile %60–70 arasında ayarlanmış yapay iklim odasında ve 14 gün boyunca 12:12 ışık-karanlık döngüsünde tutulur.
    3. 14 günlük yetiştirme döneminden sonraki gün saat 17:00'de (15. gün), zamanlanmış embriyo yumurtlama senkronizasyonu için yetişkin sinekleri toplayın. Bu özel toplama süresi, enjeksiyon için kullanılan embriyoların tutarlı bir gelişim aşamasında olmasını sağlar. Günün saatinin kontrollenmesi, embriyo gelişimi ve üreme davranışı üzerindeki sirkadiyen ritim etkilerini en aza indirmek için önemlidir; böylece deneysel tekrarlanabilirlik sağlanır ve partiler arasındaki fizyolojik değişkenliği azaltır.
  3. Drosophila'nın mikroenjeksiyonu
    1. Yetişkin sinekleri sinek kafeslerine enjekte etmek için topla, her kafes başına yaklaşık 400 yetişkin olur. Embriyoları maya kaplı agar plakalarında toplayın; Embriyoları yumurta bıraktıktan sonraki 60 dakika içinde topla ve örtü kapaklarında durulayım. Enjeksiyondan önce dekoryonasyon yapılmadı.
    2. Embriyoları, arka kutupları dışa bakacak şekilde, yukarıdan aşağıya düzenli bir şekilde dizilmiş şekilde örtü sliplerinde hizala. Enjeksiyon iğnesinin arka kutbu uygun derinliğe (embriyo uzunluğunun yaklaşık beşte biri) nüfuz ettiğinden emin olun, böylece tutarlı sitoplazmik teslimat sağlanır. Bu çalışmada toplam 300 embriyo kullanıldı.
    3. Stereomikroskop altında, iğne ucu ve embriyoyu aynı düzlemde odaklayın.
    4. Enjeksiyon aleti kullanılarak arka kutbu delin ve her embriyoya 0.001 μL karışım enjekte edilsin.
    5. Enjekte edilen embriyoları gıda şişelerine aktarmak; 25 °C'de, ~%70 göreli nemde (RH) kuluçka yapın ve P₀ üretimi (enjekte edilen yetişkinler, yavrular üreten ve hayatta kalan) elde edilir.

5. Drosophila'da kararlı ifade suşlarının inşası

  1. Bc/CyO sinekleriyle çapraz kapatılmış P₀.
    1. İlgi konusu geni hedefleyen gRNA karışımını ve Cas9 proteinini w1118 Drosophila suşunun 300 embriyosuna mikroenjekte et. Enjeksiyondan sonra toplam 30 canlı ve verimli P0 yetişkini elde edinin. Her bir P0 yetişkinini (mozaik) w1118 suşundan sineklerle ayrı ayrı çaprazlayarak 16 tek çiftli çaprazlama elde edilir (8 şişe, P0 erkek bakire dişilere çaprazlanmış ve 8 dişi dişi ile erkeklere çaprazlanmıştır). Tüm çaprazları sabit kültür koşullarında 25 °C'de tutun.
    2. F1 larvaları ortaya çıktıktan sonra, P0 ebeveyn sinekleri çıkarılır. F1 yavrudan genomik DNA çıkarıp PCR analizine tabi tutularak F1 yetişkin genotiplerini (Ent2/+) belirleyin.
    3. Bc/CyO sinekleri arasında tek çaprazlamalarla F2 yakurları üretin. Bireysel F2 yetişkinlerini seçip genotipi belirleyerek Ent2/CyO genotipine sahip sinekleri tanımlayın.
    4. Homozigot mutantların varlığını değerlendirmek için çapraz F3 (Ent2/CyO) uçuruyor. Eğer homozigot sinek bulunamazsa, homozigot genotipin ölümcül olup olmadığını daha iyi belirlemek için bir nesil daha fazladan çapraz Ent2/CyO sinekleri kullanabilirsiniz.
  2. Drosophila genomik DNA çıkarımı
    1. Bir veya iki yetişkin sineği 1.5 mL EP tüpüne toplayın ve 110 μL Bitki DNA Ekstraksiyon Tamponu PA ekleyin.
    2. Örnekleri en az 3 dakika boyunca doku öğütücüyle iyice homojenleştirin.
    3. Homojenatları 65 °C'lik metal banyoda en az 30 dakika kuluçka edin.
    4. 100 μL kloroform ekleyin, karışımı nazikçe ters çevirip 10 saniye girdabla yapın. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 14.000 rpm'de santrifüjlendirin.
    5. Yaklaşık 65 μL (veya daha fazlası) süpernatantı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın, iki hacim önceden soğutulmuş mutlak etanol ekleyin (en az 10 dakika 4 °C'de önceden kuluçka içinde), nazikçe ters çevirin ve en az 15 dakika -20 °C'de kuluçka yapın.
    6. Santrifüj örnekleri 14.000 rpm'de 4 °C'de 10 dakika boyunca alın ve süpernatantı dikkatlice atarak atabilirsiniz.
    7. DNA pelletini oda sıcaklığında veya kuluçka makinesinde tamamen kuruyana kadar hava ile kurutun, ardından uygun hacimde PB tamponu ile tekrar süzülür. Kadın (f) örnekler için 50 μL PB tamponu ekleyin, erkek (m) örnekler için ise 15 μL ekleyin.
  3. PCR amplifikasyonu ve Sanger dizileme
    1. GRNA hedef sitesinin yukarı ve aşağı bölgelerini yanlarından tutacak özel primerlerle PCR amplifikasyonu yapılacaktır.
    2. PCR ürünlerini arındırın ve Sanger dizileme testine tabi tutuyorsunuz. Dizileme kromatografilerini SnapGeneyazılımı 34 kullanarak analiz edin ve karşılaştırmalı analiz için vahşi tip referans dizisiyle hizalanın.
    3. gRNA hedef bölgesine yakın zirve grafiklerini, indel mutasyonlarına işaret eden örtüşen zirveler için inceleyin. Karışık sinyalleri çözmek ve mutasyon türünü doğrulamak için hedef bölgedeki yerleştirme veya silinmeleri de dahil olmak üzere tepe bölme işlemi gerçekleştirin.
    4. 4 nesil boyunca Bc/CyO erkeklerine geri çaprazlayarak Ent2/CyO kurun.
      Not: Ent2*/Ent2* ve CyO/CyO'nun erken gelişim aşamalarında ölümcül olduğu gözlemlenmiştir; bu nedenle, Ent2*/CyO heterozigotları korunur.
  4. Ent2*/CyO heterozigotları belirlendikten sonra, aynı Ent2*/CyO heterozigot partisinden stereomikroskop altında örnekler toplayın.
  5. Rastgele 20 yetişkin sineği seçin ve 0.001 g çözünürlüklü hassas bir denge ile tartın. Örnekleri fotoğraflayarak fenotipik özellikleri belgeleyin.

6. Betimleyici fenotipik karakterizasyon

  1. Arka 120 erkek ve 120 dişi (her grup için üç şişe test edildi, her şişede 20 sinek bulunuyordu) Ent2*/CyO ve w1118 22 °C ile 25 °C sıcaklıklarda bulundu.
  2. Haftalık ölüm sayısını kaydedin ve hayatta kalma eğrilerini çizin.
  3. Her grup için 30 rastgele çift oluştur; 24 saat çiftleşmeye izin ver;
  4. Yetişkinleri yeni tüplere aktarın; arka yavru.
  5. Eklozyondan 7 gün sonra, tırmanış başarısını (≥30 saniye içinde 8 cm) her grup başına altı kopya ile değerlendirin.
  6. Tüm gözlemler, mutant hattın tanımlayıcı özellikleri olarak kaydedildi ve gen fonksiyonunu çıkarmak için kullanılmadı.

7. Antioksidan enzim aktivitelerini ölçmek

  1. Fizyolojik olgunluk ve karşılaştırılabilir yaş sağlamak için eklozyondan 5 gün sonra 300 erkek ve 300 dişi yetişkin (her grup için üç şişe test edildi, her şişede 100 sinek bulunuyor) Ent2*/CyO ve w1118 kontrol sinekleri toplayın.
  2. Sinekleri yemsiz boş tüplere aktarın ve biyokimyasal testlerden önce metabolik durumu standartlaştırmak için 2 saat aç bırakın.
  3. Bir çelik boncuk/boru ekleyin; 60 Hz'de homojeniz, 2 dakika.
  4. Santrifüj 4 °C, 161 x g, 10 dakika; Süpernatantı topla.
  5. Toplam süperoksit dismutazını (SOD, detaylar için Materyal Tablosu'na bakınız) ve katalaz (CAT, detaylar için Materyal Tablosu'na bakınız) kit talimatlarına göre ölçün.

8. Veri istatistikleri ve analizi

  1. Tüm verileri ortalama ± ortalama standart hata (figure-protocol-1± SEM) olarak ifade edin.
  2. Enzim aktivite verilerini karşılaştırmak için tek yönlü ANOVA kullanın; vücut ağırlığı, tırmanma yeteneği ve vücut uzunluğu için üçlü ANOVA (faktörler: genotip, sıcaklık, cinsiyet) uygulayın. Uygun olduğunda Tukey'nin HSD sonrası testiniyapmak 35.
  3. Tüm istatistiksel testler için anlamlılığı P < 0.05 olarak tanımlayın.
  4. Yaşam verisini hayatta kalma eğrileri kullanılarak analiz edin ve deneysel36 gruplar arasında hayatta kalma yörüngelerinde önemli farklar olup olmadığını değerlendiren log-rank (Mantel-Cox) testini gerçekleştirin.
  5. Tüm analizleri ve grafikleri GraphPad Prism 9.5.0 yazılımında yazılımyönergelerine uygun olarak yürütmek 37.
  6. Tüm istatistiksel analizler yalnızca betimleyici karşılaştırma için yapıldı ve nedensel ilişkiler kurmak için yapılmadı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ent2 gen hedefleme alanlarının tasarım ve etkinlik doğrulama analizi
Ent2 geni için aday hedef siteler CHOPCHOP ve CCTop platformları kullanılarak tasarlandı (Şekil 1). Ekzon 2 ve ekzon 5 bölgelerini hedefleyen iki gRNA, özgüllük ve verimlilik kriterlerine göre seçildi. Başarılı genom düzenlemesini doğrulamak için, yerleşik Ent2*/CyO hattından rastgele seçilmiş bireylerden genomik DNA amplifikasyon yapıldı ve Sanger dizilenmesine tabi tutuld...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

KB, birden fazla biyolojik süreci etkileyen evrimsel olarak korunmuş birproteindir 38. Xenopus laevis oositlerinde ifade edildiğinde, Ent2 nükleozid taşımaaktivitesi gösterir 8. Çalışmalar, Ent2'nin homozigot mutantının geç larva veya erken pupaevre 10'da ölümcül olduğunu göstermiştir. Mevcut çalışmada, Drosophila melanogaster'da Ent2 hedefli alleller oluşturmak i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarların çıkar çatışması belirtmesi gerekmiyor.

Teşekkürler

Jilin Eyaleti Bilim ve Teknoloji Geliştirme Programı (Proje No. 20230505044ZP) tarafından yapılan bu araştırmayı desteklemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ammonium acetateSigma A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (Visible Light Method) (Ammonium Molybdate Method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Dodecyl sulfateSigmaL3771
Injection deviceEppendorf FemtoJet 4i
Linearized plasmid: MLM3613Addgene42251
MicroscopeOLYMPUS CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kitThermo FisherAM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitThermo FisherAM1344
PmeI restriction enzymeNEB R0560S
Poly(A) polymeraseNEBM0276S
Protease KThermo FisherEO0491
RNeasy Mini KitQIAGEN74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production SystemPromega P1320
T7 RiboMAX KitPromega P1320
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) assay kit (Hydroxylamine method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-1
w1118 Drosophila Fangjing Biology
Water-saturated phenol/chloroformSigmaP2069

Kaynaklar

  1. Tolwinski, N. S. Introduction: Drosophila-A Model System for Developmental Biology. J Dev Biol. 5 (3), (2017).
  2. Ogienko, A. A., et al. Drosophila as a Model Organism to Study Basic Mechanisms of Longevity. Int J Mol Sci. 23 (19), (2022).
  3. Lu, T. C., et al. Aging Fly Cell Atlas identifies exhaustive aging features at cellular resolution. Science. 380 (6650), eadg0934(2023).
  4. Koyama, T., Texada, M. J., Halberg, K. A., Rewitz, K. Metabolism and growth adaptation to environmental conditions in Drosophila. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4523-4551 (2020).
  5. Moraes, K. C. M., Montagne, J. Drosophila melanogaster: A Powerful Tiny Animal Model for the Study of Metabolic Hepatic Diseases. Frontiers in Physiology. 12, 2021(2021).
  6. Chatterjee, N., Perrimon, N. What fuels the fly: Energy metabolism in Drosophila and its application to the study of obesity and diabetes. Sci Adv. 7 (24), (2021).
  7. Volonté, C., Alberti, F., Vitale, G., Liguori, F. Delineating Purinergic Signaling in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 15196(2022).
  8. Machado, J., Abdulla, P., Hanna, W. J., Hilliker, A. J., Coe, I. R. Genomic analysis of nucleoside transporters in Diptera and functional characterization of DmENT2, a Drosophila equilibrative nucleoside transporter. Physiol Genomics. 28 (3), 337-347 (2007).
  9. Ho, H. T., Xia, L., Wang, J. Residue Ile89 in human plasma membrane monoamine transporter influences its organic cation transport activity and sensitivity to inhibition by dilazep. Biochem Pharmacol. 84 (3), 383-390 (2012).
  10. Knight, D., et al. Equilibrative nucleoside transporter 2 regulates associative learning and synaptic function in Drosophila. J Neurosci. 30 (14), 5047-5057 (2010).
  11. Sidorov, R., Kucerova, L., Kiss, I., Zurovec, M. Mutation in the Drosophila melanogaster adenosine receptor gene selectively decreases the mosaic hyperplastic epithelial outgrowth rates in wts or dco heterozygous flies. Purinergic Signal. 11 (1), 95-105 (2015).
  12. Naes, S. M., Ab-Rahim, S., Mazlan, M., Abdul Rahman, A. Equilibrative Nucleoside Transporter 2: Properties and Physiological Roles. Biomed Res Int. 2020, 5197626(2020).
  13. Boswell-Casteel, R. C., Hays, F. A. Equilibrative nucleoside transporters-A review. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 36 (1), 7-30 (2017).
  14. Wu, K. C., Lee, C. Y., Chou, F. Y., Chern, Y., Lin, C. J. Deletion of equilibrative nucleoside transporter-2 protects against lipopolysaccharide-induced neuroinflammation and blood-brain barrier dysfunction in mice. Brain Behav Immun. 84, 59-71 (2020).
  15. Rattray, Z., et al. ENT2 facilitates brain endothelial cell penetration and blood-brain barrier transport by a tumor-targeting anti-DNA autoantibody. JCI Insight. 6 (14), (2021).
  16. Chiang, H. L., et al. The Critical Role of Equilibrative Nucleoside Transporter-2 in Modulating Cerebral Damage and Vascular Dysfunction in Mice with Brain Ischemia-Reperfusion. Pharm Res. 40 (11), 2541-2554 (2023).
  17. Chen, M., et al. SLC29A1 and SLC29A2 are human nicotinamide cell membrane transporters. Nat Commun. 16 (1), 1181(2025).
  18. Bajgar, A., et al. Extracellular adenosine mediates a systemic metabolic switch during immune response. PLoS Biol. 13 (4), e1002135(2015).
  19. Mołoń, M., et al. Effects of Temperature on Lifespan of Drosophila melanogaster from Different Genetic Backgrounds: Links between Metabolic Rate and Longevity. Insects. 11 (8), (2020).
  20. Chen, J., Nolte, V., Schlötterer, C. Temperature-Related Reaction Norms of Gene Expression: Regulatory Architecture and Functional Implications. Mol Biol Evol. 32 (9), 2393-2402 (2015).
  21. Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Curr Protoc Mol Biol. 111, 31.32.31-31.32.20 (2015).
  22. Bassett, A., Liu, J. L. CRISPR/Cas9 mediated genome engineering in Drosophila. Methods. 69 (2), 128-136 (2014).
  23. Port, F., Muschalik, N., Bullock, S. L. Systematic Evaluation of Drosophila CRISPR Tools Reveals Safe and Robust Alternatives to Autonomous Gene Drives in Basic Research. G3 Genes|Genomes|Genetics. 5 (7), 1493-1502 (2015).
  24. Clark, M., et al. Expanding the CRISPR base editing toolbox in Drosophila melanogaster. Communications Biology. 7 (1), 1126(2024).
  25. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  26. Port, F., Boutros, M. Drosophila: Methods and Protocols. Dahmann, C. , Springer US. 157-176 (2022).
  27. Liao, H., Wu, J., VanDusen, N. J., Li, Y., Zheng, Y. CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair for precise gene editing. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (4), 102344(2024).
  28. Shumega, A. R., et al. CRISPR/Cas9 as a Mutagenic Factor. International Journal of Molecular Sciences. 25, 823(2024).
  29. Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. PLoS Genet. 15 (11), e1008421(2019).
  30. Muron, S., Kucera, S., Oliver, B., Benner, L. Creation of a new Drosophila melanogaster X chromosome balancer, First Multiple 8 ( FM8 ), using the CRISPR/Cas9 gene-editing system. MicroPubl Biol. 2022, (2022).
  31. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  32. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).
  33. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  34. Wang, H., Zheng, S., Yu, X., Wu, K., Zhao, M. Clinical characteristics and genotypes of patients with Congenital fibrinogen disorders. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 42 (3), 264-273 (2025).
  35. Chotcomwongse, P., et al. The Impact of Various Surface Treatments on Adhesion Between Co-Cr Alloy and Acrylic Teeth. Int J Dent. 2026, 2199689(2026).
  36. Prakash, S., Havard, M., Hodges, E., Agrawal, A., Ahuja, S. In the artificial intelligence age, is Oswestry spinal risk index still useful? an external validation of Oswestry spinal risk index applied to radiotherapy patients and its relevance. Br J Neurosurg. , 1-9 (2026).
  37. Anaya-Ayala, J. E., et al. Analysis of Inflammatory and Angiogenic Activities in Patients with Abdominal Aortic Aneurysms with the Radiotracers (99m)Tc-HYNIC-CCR2-L and (99m)Tc-RGD with Single-Photon Emission Computed Tomography. Ann Vasc Surg. 124, 312-317 (2026).
  38. Rose, J. B., Coe, I. R. Physiology of nucleoside transporters: back to the future. Physiology (Bethesda). 23, 41-48 (2008).
  39. Niveditha, S., Deepashree, S., Ramesh, S. R., Shivanandappa, T. Sex differences in oxidative stress resistance in relation to longevity in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology B. 187 (7), 899-909 (2017).
  40. Carvalho, G. B., et al. The 4E-BP growth pathway regulates the effect of ambient temperature on Drosophila metabolism and lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9737-9742 (2017).
  41. Martelli, F., Alves, A. N., Yang, Y. T., Batterham, P., Wedell, N. Genotype and sex affect the combined impact of temperature and low-dose insecticide exposure on insect survival. Insect Sci. , (2024).
  42. Goh, G. H., Blache, D., Mark, P. J., Kennington, W. J., Maloney, S. K. Daily temperature cycles prolong lifespan and have sex-specific effects on peripheral clock gene expression in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 224 (10), (2021).
  43. Robillard, K. R., Bone, D. B. J., Hammond, J. R. Hypoxanthine uptake and release by equilibrative nucleoside transporter 2 (ENT2) of rat microvascular endothelial cells. Microvasc Res. 75 (3), 351-357 (2008).
  44. Kropotov, A., et al. Equilibrative Nucleoside Transporters Mediate the Import of Nicotinamide Riboside and Nicotinic Acid Riboside into Human Cells. Int J Mol Sci. 22 (3), (2021).
  45. Katsyuba, E., et al. De novo NAD(+) synthesis enhances mitochondrial function and improves health. Nature. 563 (7731), 354-359 (2018).
  46. Suman, R., et al. Deregulation of mitochondrial reverse electron transport alters the metabolism of reactive oxygen species and NAD+/NADH and presents a therapeutic target in Alzheimer's disease. Ageing Neur Dis. 4 (1), 4(2024).
  47. Pérez, S. E., Gooz, M., Maldonado, E. N. Mitochondrial Dysfunction and Metabolic Disturbances Induced by Viral Infections. Cells. 13 (21), (2024).
  48. Ballard, J. W., Melvin, R. G., Miller, J. T., Katewa, S. D. Sex differences in survival and mitochondrial bioenergetics during aging in Drosophila. Aging Cell. 6 (5), 699-708 (2007).
  49. Yi, Y., Xu, W., Fan, Y., Wang, H. X. Drosophila as an emerging model organism for studies of food-derived antioxidants. Food Res Int. 143, 110307(2021).
  50. Tiberi, J., et al. Sex differences in antioxidant defence and the regulation of redox homeostasis in physiology and pathology. Mechanisms of Ageing and Development. 211, 111802(2023).
  51. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  52. Yan, Y., Schetelig, M. F. Protocol for genetic engineering in Drosophila suzukii using microinjection. STAR Protocols. 5 (3), 103248(2024).
  53. Aguilar, G., et al. Seamless knockins in Drosophila via CRISPR-triggered single-strand annealing. Developmental Cell. 59 (19), 2672-2686.e5 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

GenetikSay 234Say 234Bo De erSayoksidatif stres
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.