CRISPR/Cas9 Aracılı Ent2*/CyO Drosophila melanogaster Suşunun Üretimi ve Karakterizasyonu

Özet

Dengeleyici nükleozid taşıyıcı 2 (ENT2), nükleozid taşınımı ve hücresel metabolizmada yer alan korunan bir transmembran proteindir. Bu çalışmada, Drosophila melanogaster'da Ent2 hedefli bir allel oluşturmak için CRISPR/Cas9 tabanlı bir genom düzenleme iş akışı oluşturuldu. Dengeleyici kromozom stratejisi kullanılarak stabil bir Ent2*/CyO heterozigot çizgisi inşa edildi ve korundu. Bu çalışma, mutant hattın tasarımını, üretimini ve moleküler doğrulamasını ile farklı sıcaklık koşullarında fenotipik karakterizasyonunu açıklar. Yerleşik iş akışı ve mutant suş, homozigot ölümcül fenotiplere sahip genlerin incelenmesi ve Drosophila'da sıcaklıkla ilişkili fenotipik varyasyonun araştırılması için pratik bir çerçeve sağlar.

Özet

Bu çalışmada, Drosophila melanogaster'deki dengeleyici nükleozid taşıyıcı 2 (Ent2) geninde mutasyonları tanıtmak için CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenleme yaklaşımı kullanıldı. Ent2'nin kodlama bölgesini hedefleyen rehber RNA'lar, Cas9 mRNA ile birlikte ^{w 1118} embriyolarına enjekte edilmiş. Mutant alleller Sanger dizileme ile tanımlanmış ve dengeleyici kromozom kullanılarak stabil bir Ent2*/CyO heterozigot çizgisi olarak korunmuştur. Daha sonra, meyve sineklerinde vücut ağırlığı, tırmanma yeteneği, hayatta kalma oranı ve süperoksit dismutaz (SOD) ile katalaza (CAT) aktivitelerini sırasıyla 22 °C ve 25 °C sıcaklıklarda değerlendirdik. Sonuçlar, hem 22 °C hem de 25 °C sıcaklıklarında, Ent2*/CyO meyve sineklerinin vücut uzunluğu ve ağırlığının w^1118'e kıyasla önemli ölçüde azaldığını ve gelişimlerinin geciktiğini göstermektedir. 22 °C'de Ent2*/CyO sineklerinin genel ömrü w^1118'den biraz daha uzundu, oysa 25 °C'de anlamlı bir fark gözlemlenmedi. Lokomotor kabiliyeti açısından, heterozigot sineklerin tırmanma performansı, her iki sıcaklıkta da^w1118'den anlamlı derecede düşüktü ve erkekler daha ciddi şekilde etkilendi. Ayrıca, Ent2*/CyO meyve sineklerinde CAT ve SOD'nin antioksidan enzim aktiviteleri önemli ölçüde azalmış, bu da antioksidan kapasitesinin belirgin bir şekilde bozulduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, CRISPR tarafından oluşturulan bir Ent2 mutant hattının fenotipik profilini tanımlıyor ve Drosophila'da genom düzenleme ile dengeleyici kromozom stratejilerini birleştirmenin mümkünlüğünü göstermektedir. Bu çalışma, metabolizma ve çevresel tepkilerle ilişkili genlerin gelecekteki araştırmaları için metodolojik bir çerçeve ve genetik kaynak sağlar.

Giriş

Drosophila melanogaster, genetik ve gelişim biyolojisi için en yaygın kullanılan model^{organizmalardan biri olmaya devam etmektedir 1}. Kısa yaşam döngüsü, hızlı üreme, yerleşik genetik manipülasyon araçları ve tam açıklamalı^{genom 2,3} ile karakterize edilir. Bu tür, gen fonksiyonu, metabolik düzenleme ve çevresel uyum sağlama çalışmalarında kapsamlı şekilde^{uygulanmaktadır 4,5}. Nukleozidler ve ATP gibi türevleri, Drosophila'da hücresel enerji üretimi, nüklein asit sentezi ve sinyal iletiminde merkezi rol oynar ve metazoanlar arasında korunan metabolik düzenlemeyi^yansıtır. Drosophila'daki hücre dışı adenosin ve nükleozid taşıma mekanizmalarına bağlı olan purinerjik sinyal yolları, enerji ve sinyal iletim yanıtlarının koordinasyonunda nükleozid hareketinin zarlar boyunca işlevsel rolünü^vurgular. Bu süreçler arasında, sitoplazmik zar boyunca nukleozidlerin taşınması öncelikle dengeleyici nükleozid taşıyıcı (ENT) ailesi aracılığıyla sağlanır ve DmENT2 Drosophila^8'de fonksiyonel taşıma aktivitesi sergiler.

KBB ailesi, ENT2 de kapsamlı şekilde incelenmiş bir transmembran nükleozid^{taşıyıcısı 9} olmak üzere birden fazla alt tipten oluşur. Çeşitli pürin ve pirimidin^{nükleozitlerinin 10,11} enerjiden bağımsız transmembran taşınımını kolaylaştırır. Memelilerde ENT2, pürin ve pirimidin nükleozidleri ile nükleobazların hücresel alımını kolaylaştıran yaygın olarak ifade edilen çift yönlü bir taşıyıcıdır. Bu taşıma aktivitesi, nukleotid kurtarılmasına katkıda bulunur ve hücresel metabolik homeostazın¹² korunmasına yardımcı olur. ENT2 ayrıca çeşitli nukleozid kaynaklı ilaçların taşınışına aracılık eder; işlevsel önemini endogen nükleozid hareketinin ötesine genişletir ve daha geniş fizyolojik ve klinik önemini vurgular^. Ayrıca, ENT2'nin insanlarda nörolojik^{bozukluklarda 14}, tümör^{metabolizmasında 15}, damar işlev^{bozukluğunda 16} ve hücresel enerji metabolizmasında rol^{oynadığı belirtilmiştir.} Ancak, Drosophila'da Ent2'nin organizma düzeyindeki rollerini ele alan çalışmalar sınırlı kalır.

ENT2'nin büyüme ve gelişim, enerji metabolizması, lokomotor performansı ve değişken sıcaklık koşullarında antioksidan kapasitedeki rolleri tam olarak incelenmemiştir¹⁸. Drosophila'da sıcaklık, bazal metabolik hızı ve yaşam süresini güçlü şekilde etkiler; daha yüksek yetiştirme sıcaklıkları genellikle metabolik aktiviteyi artırır ve ömrü azaltır¹⁹. Bu sıcaklığa bağlı gen ifadesi değişiklikleri, fizyolojik yolları etkileyebilir ve böylece belirli gen mutasyonlarının fenotipik etkilerini^{değiştirebilir.}

Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar/CRISPR ile ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9), Drosophila'da siteye özgü yok etme, silinme, değiştirme ve etiket girişi gibi çeşitli genomik modifikasyon işlemlerinde yaygın olarak uygulanmış olup, etkinliğini ve güvenilirliğini^{göstermiştir} 21,22,23. Son gelişmeler, CRISPR kaynaklı baz editörlerin Drosophila'da daha ince siteye özgü baz modifikasyonları için de kullanılabileceğini göstererek nokta mutasyonları ve hassas fenotipik^{kontrol 24} için yeni bir araç sağlamaktadır. Kimyasal ve radyasyon mutagenezi ile transpozon aracılı ekranlar dahil geleneksel mutagenez yöntemleri genetik mutasyonlar^{üretebilir 25}. Bu yaklaşımlar genellikle düşük verimlilik ve yüksek rastgelelik nedeniyle mutasyon olaylarında sınırlıdır. Sonuç olarak, araştırmacılar ilgi çekici belirli allelleri izole etmek için çok sayıda bireyi^{taramak zorundadır 26}. CRISPR/Cas9, belirli DNA dizilerinde programlanmış rehber RNA (gRNA) yönlendirilmiş bölünmeyi mümkün kılar. Ortaya çıkan çift iplikli kırılmalar, homolog olmayan uç birleştirme veya homoloji yönlendirilmeli onarım yoluyla onarılır; bu da tanımlanmış, kalıtsal mutasyonlar oluşturur ve fenotipik analizi karıştırabilecek arka plan mutasyonlarını önemli ölçüde azaltır^27,28. CRISPR/Cas9 ile üretilen mutant alleller, Curly O (CyO)²⁹ gibi dengeleyici kromozomlarla bağlanarak heterozigot bir durumda tutulabilir. Bu stratejinin, Drosophila genetiğinde ölümcül allellerin homozigot formda kaybını etkili bir şekilde önlediği gösterilmiştir. Sonuç olarak, değişken sıcaklıklar veya çevresel koşullar altında fonksiyonel çalışmalar dahil olmak üzere uzun vadeli ve sistematik fenotipik^{değerlendirmeyi destekler 29,30}. CRISPR/Cas9'un basit tasarımı ve yüksek verimliliği, suş yapım döngüsünü önemli ölçüde kısaltmış ve genetik arka planın kararlılığını artırmıştır. Bu özellikle, sıcaklık tepkisi ve gelişimsel homeostaz gibi uzun vadeli çevresel faktörlerin incelenmesi için önemlidir.

Bu temel üzerine inşa edilerek, Drosophila melanogaster'deki Ent2 geni CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak yok edilmiş ve kalıcı bir kalıtsal Ent2*/CyO heterozigot mutant suş kurulmuştur. Antioksidan enzimler SOD ve CAT gelişim döngüsü, vücut ağırlığı, hareket kabiliyeti ve aktiviteleri sistematik olarak değerlendirildi. W^1118'in çok boyutlu fenotipleri ve mutant sinekleri değişken sıcaklık koşullarında karşılaştırarak, bu çalışma CRISPR'den türetilen mutant çizgilerin üretilmesi ve korunması için tekrarlanabilir bir strateji sunmayı ve ortaya çıkan fenotiplerin tanımlayıcı bir karakterizasyonunu sunmayı amaçlamaktadır. Bu çalışma, metabolizma ve çevresel tepkilerde rol alan genleri inceleyen gelecekteki çalışmalar için metodolojik bir çerçeve ve faydalı bir genetik kaynak sunmaktadır.

Protokol

1. Ent2 geni için CRISPR/Cas9 hedeflerinin tasarımı

1. CHOPCHOP (v3)³¹ ve CCTop (v1.0)³² kullanarak Ent2'nin ekzon 2 ve 5'inde (FlyBase ID: FBgn0263916) aday CRISPR sitelerini seçin.
2. Referans genom, Drosophila melanogaster Sürüm 6 (dm6) olarak tanımlanmıştır (RefSeq montaj erişimi: GCF_000001215.4). Daha sonra, aday gRNA siteleri belirlendi. Son olarak, belirlenen bölgeler optimal gRNA'lar elde edilmek için filtrelendi.
3. MIT Özgüllük Skoru ≥ 80 (CHOPCHOP), CFD puanı ≤ 0.1 (CCTop), GC içeriği %40–%60 ve minimum PAM mesafesi ile hedefleri filtreleyin.
4. Hedefleri ağırlıklı bir puanla sıralayın (verimlilik %50, özgüllük %30%, genel analiz optimizasyonu %20) ve iki gRNA seçin.
5. T7 promotör gereksinimini karşılamak için her gRNA'nın 5′ ucuna bir "G" ekleyin. PCR ile tam boy sgRNA transkripsiyon şablonunu oluşturmak için aşağıdaki gRNA-spesifik ileri oligonukleotidleri kullanın:
   Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT
   AGGTGACGTTAAATCCATCGTGTTTAGAGCTAGAAATAGC
   Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
   TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGTTTAGAGCTAGAAATAGC
6. Kalan sgRNA iskelet dizisi, PCR sırasında evrensel ters oligonukleotid tarafından sağlanır.

2. sgRNA transkripsiyon şablonlarının hazırlanması

1. sgRNA transkripsiyon şablonlarının hazırlanması
   1. Üreticinin talimatlarına göre çift oligonukleotid tavlama–PCR^{yöntemi 33} ile 60 μL PCR reaksiyon karışımı oluşturulur. gRNA-spesifik ileri oligonukleotidi (Ent2-sg1-F veya Ent2-sg2-F) sgRNA iskeletini kodlayan evrensel ters oligonukleotid ile birleştirerek in vitro transkripsiyon için tam boy dsDNA şablonu elde edilir.
   2. Termosiklleri programla: 95 °C 3 dakika; 35 döngü: 95 °C 30 saniye, 55 °C 30 saniye, 72 °C 20 saniye; ardından 72 °C 10 dakika; 12 °C'de bekleyin.
2. Transkripsiyon şablonunu arındırın
   1. 60 μL PCR ürününe 100 μL amonyum asetat (bkz. Malzeme Tablosu) ekleyin; karıştırın. 400 μL susuz etanol ekleyin; karıştırmak için ters yapın ve -20 °C'de 20 dakika kuluçka yapın.
   2. 4 °C'de santrifüj, 20.000 x g 15 dakika boyunca kullanıldı; Üstten atıl.
   3. Tüpü açık halde pelleti 10 dakika boyunca hava ile kurut. Pelleti 10 μL nükleazsız ddH₂O içinde yeniden askıya alın.
3. gRNA'nın In vitro transkripsiyonu
   1. Kit talimatlarına uygun olarak 10 μL T7 in vitro transkripsiyon reaksiyonu kurun ( bkz. Materyal Tablosu).
   2. 37 °C'de 35 dakika kuluçka yapın. Transkripsiyon kitinde sağlanan 0,5 μL DNaz I ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
4. GRNA'yı Saflaştır
   1. Transkripsiyon karışımını nukleazsız ddH₂O ile 60 μL'ye seyreltin. 60 μL suya doygun fenol/kloroform ekleyin (bkz. Materyal Tablosu); kısa bir girdap ve 4 °C, 16.000 x g sıcaklıkta 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   2. Sulu fazın 45 μL'sini yeni 1,5 mL RNazsız bir tüpe aktarın. 5 μL sodyum asetat ekleyin; karışım.
   3. 125 μL önceden soğutulmuş susuz etanol ekleyin; karıştırıp -20 °C'de 20–30 dakika kuluçka yapın. 4 °C'de santrifüj, 20.000 x g 15 dakika boyunca kullanıldı; Üstten atıl.
   4. Pelleti 200 μL %70 etanol (RNase içermeden) ile yıkayın; 4 °C'de santrifüj, 20.000 x g 5 dakika boyunca kullanıldı; Süpernatantı çıkarın.
   5. Pelleti 37 °C'de kurutarak etanol tamamen buharlaşana kadar kullanın. 20 μL ddH₂O ile yeniden süzülür; aliquot ve -80 °C'de sakla.
   6. NanoDrop spektrofotometre kullanarak gRNA konsantrasyonunu ölçün ve enjeksiyon için konsantrasyonu 250 ng/μL'ye ayarlayın. GRNA'nın saflığını yaklaşık 2.0 A260/A280 oranıyla güvence altına alın.
      NOT: RNase koruması için tüm süreç boyunca eldivenlerin giyilmesi gerektiğini vurguluyoruz. Tüm tüketim malzemeleri, önceden soğutmalı RNase-serbest santrifüj tüpleri ve pipet uçları dahil, işlem sırasında tutarlı şekilde kullanılmalıdır. İşlem sırasında oluşan organik reaktif atıkları, türüne göre belirlenmiş atık konteynerlerinde ayrı ayrı toplanmalı ve uygun şekilde işlemek için sertifikalı tehlikeli atık bertaraf tesisine düzenli olarak taşınmalıdır.

3. Cas9 mRNA'nın hazırlanması

1. Transkripsiyon Şablonunun Hazırlanması
   NOT: RNA ile ilgili adımlar boyunca RNase içermeyen uçlar ve tüpler kullanın.
   1. Cas9 ifade plazmidini MLM3613 ( bkz. Malzemeler Tablosu) buz üzerinde eritin. RNase-içermeyen bir tüpte, 20 μg plazmid DNA, 7.5 μL 10x krestriksiyon tamponu, 1 μL PmeI (10.000 U/mL) ve nükleazsız ddH₂O ile 75 μL ile birleştirin.
   2. 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın. Tam doğrulayıcı olmayı 120 V'da %1 agaroz jeline 30 dakika boyunca 5 μL yükleyerek doğrulayın.
2. Transkripsiyon Şablonlarının Arındırılması
   1. 70 μL sindirime 23 μL %2 sodyum dodesil sülfat (SDS, detaylar için Malzeme Tablosu'na bakınız) ve 0,5 μL proteinaz K (ayrıntılar için Materyaller Tablosu'na bakınız) eklenin; 50 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
   2. 45 μL kloroform ve 45 μL Tris-doygun fenol ekleyin; kısa bir süreliğine vortex; Santrifüj 13.800 x G, 5 dakika.
   3. 90 μL sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. 10 μL sodyum asetat (kit tarafından sağlanan) ve 200 μL önceden soğutulan susuz etanol ekleyin; mix; kuluçka −20 °C, 30 dakika.
   4. Santrifüj 20.000 x g, 4 °C, 15 dakika; Üstten atıl. Pelleti 100 μL %70 etanol ile iki kez yıkay; santrifüj 20.000 x g, her biri 2 dakika; Havada kurutuldu.
   5. DNA'yı 20 μL nükleazsız ddH₂O içinde çöz; >500 ng/μL doğrula.
3. In vitro transkripsiyon ve co-capping
   1. Reaksiyonu, üreticinin talimatlarına göre kapalı bir T7 in vitro transkripsiyon kiti (bkz. Malzemeler Tablosu) kullanarak kurun.
   2. 37 °C'de 2 saat kuluçka yapın ve kapalı Cas9 mRNA üretilir.
   3. Transkripsiyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra, 1 μL DNAZ'ı (kitte sağlanan, konsantrasyon 2 U/μL) ekleyin, iyice karıştırın ve 37°C'de 15 dakika kuluçka geçirerek DNA şablonu parçalanın.
4. Bir poli(A) kuyruk ekleyin
   1. RNA'yı 14 μL ddH₂O'ya getirin.
   2. 2 μL 10x E. coli Poly(A) Polimeraz tamponu, 2 μL ATP (10 mM), 1 μL RNaz inhibitörü ve 1 μL Poli(A) polimeraz ekleyin.
   3. 37 °C'de 45 dakika kuluçka yapın.
5. mRNA'yı arındırın
   1. Reaksiyonu spin-kolonlu toplam RNA kitine uygulayın (bkz. Malzemeler Tablosu). Örneği 2 mL silika membran spin kolonuna yükleyin; santrifüj 8.000 x g, 15 saniye; Akışı atmak.
   2. RNeasy kolonuna 500 μL RPE tamponu ekleyin, 8000 x g hassasiyetinde 15 saniye santrifüj yapın ve kalan sıvıyı atın. Bu adımı bir kez tekrarlayın, ardından 2 dakika santrifüj yapın ve kalan sıvıyı atın.
   3. RNeasy kolonunu yeni bir 1.5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. RNA'yı üütlemek için 30 μL RNase-free ddH₂O ekleyin, 8000 x g boyunca 1 dakika boyunca santrifüj yapın. Enjeksiyon için mRNA konsantrasyonunu 500 ng/μL'ye ayarlayın. Elutlenmiş RNA'yı -80 °C'de sakla.

4. Drosophila embriyolarının mikroenjeksiyonu

1. Enjeksiyon Örneklerinin Hazırlanması
   1. 15 μg Cas9 mRNA'yı 7,5 μg çift zincirli gRNA ile 2:1 hacim oranında karıştırın.
   2. DEPC ile işlenmiş RNase içermeyen suyla 30 μL'ye ayarlayın; Buzda kal.
2. Drosophila yetiştiriciliği
   1. Enjeksiyonlu Drosophila suşunu w¹¹¹⁸ büyük besin tüplerine amplifikasyon için aktarın. W¹¹¹⁸ sinekleri, dengeleyici ile ilişkili etkiler olmadan temel fizyolojik durumu temsil etmek için referans kontrol olarak kullanıldı.
   2. Sinekler, %60–70 nem ile %60–70 arasında ayarlanmış yapay iklim odasında ve 14 gün boyunca 12:12 ışık-karanlık döngüsünde tutulur.
   3. 14 günlük yetiştirme döneminden sonraki gün saat 17:00'de (15. gün), zamanlanmış embriyo yumurtlama senkronizasyonu için yetişkin sinekleri toplayın. Bu özel toplama süresi, enjeksiyon için kullanılan embriyoların tutarlı bir gelişim aşamasında olmasını sağlar. Günün saatinin kontrollenmesi, embriyo gelişimi ve üreme davranışı üzerindeki sirkadiyen ritim etkilerini en aza indirmek için önemlidir; böylece deneysel tekrarlanabilirlik sağlanır ve partiler arasındaki fizyolojik değişkenliği azaltır.
3. Drosophila'nın mikroenjeksiyonu
   1. Yetişkin sinekleri sinek kafeslerine enjekte etmek için topla, her kafes başına yaklaşık 400 yetişkin olur. Embriyoları maya kaplı agar plakalarında toplayın; Embriyoları yumurta bıraktıktan sonraki 60 dakika içinde topla ve örtü kapaklarında durulayım. Enjeksiyondan önce dekoryonasyon yapılmadı.
   2. Embriyoları, arka kutupları dışa bakacak şekilde, yukarıdan aşağıya düzenli bir şekilde dizilmiş şekilde örtü sliplerinde hizala. Enjeksiyon iğnesinin arka kutbu uygun derinliğe (embriyo uzunluğunun yaklaşık beşte biri) nüfuz ettiğinden emin olun, böylece tutarlı sitoplazmik teslimat sağlanır. Bu çalışmada toplam 300 embriyo kullanıldı.
   3. Stereomikroskop altında, iğne ucu ve embriyoyu aynı düzlemde odaklayın.
   4. Enjeksiyon aleti kullanılarak arka kutbu delin ve her embriyoya 0.001 μL karışım enjekte edilsin.
   5. Enjekte edilen embriyoları gıda şişelerine aktarmak; 25 °C'de, ~%70 göreli nemde (RH) kuluçka yapın ve P₀ üretimi (enjekte edilen yetişkinler, yavrular üreten ve hayatta kalan) elde edilir.

5. Drosophila'da kararlı ifade suşlarının inşası

1. Bc/CyO sinekleriyle çapraz kapatılmış P₀.
   1. İlgi konusu geni hedefleyen gRNA karışımını ve Cas9 proteinini w1118 Drosophila suşunun 300 embriyosuna mikroenjekte et. Enjeksiyondan sonra toplam 30 canlı ve verimli P0 yetişkini elde edinin. Her bir P0 yetişkinini (mozaik) w1118 suşundan sineklerle ayrı ayrı çaprazlayarak 16 tek çiftli çaprazlama elde edilir (8 şişe, P0 erkek bakire dişilere çaprazlanmış ve 8 dişi dişi ile erkeklere çaprazlanmıştır). Tüm çaprazları sabit kültür koşullarında 25 °C'de tutun.
   2. F1 larvaları ortaya çıktıktan sonra, P0 ebeveyn sinekleri çıkarılır. F1 yavrudan genomik DNA çıkarıp PCR analizine tabi tutularak F1 yetişkin genotiplerini (Ent2/+) belirleyin.
   3. Bc/CyO sinekleri arasında tek çaprazlamalarla F2 yakurları üretin. Bireysel F2 yetişkinlerini seçip genotipi belirleyerek Ent2/CyO genotipine sahip sinekleri tanımlayın.
   4. Homozigot mutantların varlığını değerlendirmek için çapraz F3 (Ent2/CyO) uçuruyor. Eğer homozigot sinek bulunamazsa, homozigot genotipin ölümcül olup olmadığını daha iyi belirlemek için bir nesil daha fazladan çapraz Ent2/CyO sinekleri kullanabilirsiniz.
2. Drosophila genomik DNA çıkarımı
   1. Bir veya iki yetişkin sineği 1.5 mL EP tüpüne toplayın ve 110 μL Bitki DNA Ekstraksiyon Tamponu PA ekleyin.
   2. Örnekleri en az 3 dakika boyunca doku öğütücüyle iyice homojenleştirin.
   3. Homojenatları 65 °C'lik metal banyoda en az 30 dakika kuluçka edin.
   4. 100 μL kloroform ekleyin, karışımı nazikçe ters çevirip 10 saniye girdabla yapın. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 14.000 rpm'de santrifüjlendirin.
   5. Yaklaşık 65 μL (veya daha fazlası) süpernatantı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın, iki hacim önceden soğutulmuş mutlak etanol ekleyin (en az 10 dakika 4 °C'de önceden kuluçka içinde), nazikçe ters çevirin ve en az 15 dakika -20 °C'de kuluçka yapın.
   6. Santrifüj örnekleri 14.000 rpm'de 4 °C'de 10 dakika boyunca alın ve süpernatantı dikkatlice atarak atabilirsiniz.
   7. DNA pelletini oda sıcaklığında veya kuluçka makinesinde tamamen kuruyana kadar hava ile kurutun, ardından uygun hacimde PB tamponu ile tekrar süzülür. Kadın (f) örnekler için 50 μL PB tamponu ekleyin, erkek (m) örnekler için ise 15 μL ekleyin.
3. PCR amplifikasyonu ve Sanger dizileme
   1. GRNA hedef sitesinin yukarı ve aşağı bölgelerini yanlarından tutacak özel primerlerle PCR amplifikasyonu yapılacaktır.
   2. PCR ürünlerini arındırın ve Sanger dizileme testine tabi tutuyorsunuz. Dizileme kromatografilerini SnapGene^{yazılımı 34} kullanarak analiz edin ve karşılaştırmalı analiz için vahşi tip referans dizisiyle hizalanın.
   3. gRNA hedef bölgesine yakın zirve grafiklerini, indel mutasyonlarına işaret eden örtüşen zirveler için inceleyin. Karışık sinyalleri çözmek ve mutasyon türünü doğrulamak için hedef bölgedeki yerleştirme veya silinmeleri de dahil olmak üzere tepe bölme işlemi gerçekleştirin.
   4. 4 nesil boyunca Bc/CyO erkeklerine geri çaprazlayarak Ent2/CyO kurun.
      Not: Ent2*/Ent2* ve CyO/CyO'nun erken gelişim aşamalarında ölümcül olduğu gözlemlenmiştir; bu nedenle, Ent2*/CyO heterozigotları korunur.
4. Ent2*/CyO heterozigotları belirlendikten sonra, aynı Ent2*/CyO heterozigot partisinden stereomikroskop altında örnekler toplayın.
5. Rastgele 20 yetişkin sineği seçin ve 0.001 g çözünürlüklü hassas bir denge ile tartın. Örnekleri fotoğraflayarak fenotipik özellikleri belgeleyin.

6. Betimleyici fenotipik karakterizasyon

1. Arka 120 erkek ve 120 dişi (her grup için üç şişe test edildi, her şişede 20 sinek bulunuyordu) Ent2*/CyO ve w¹¹¹⁸ 22 °C ile 25 °C sıcaklıklarda bulundu.
2. Haftalık ölüm sayısını kaydedin ve hayatta kalma eğrilerini çizin.
3. Her grup için 30 rastgele çift oluştur; 24 saat çiftleşmeye izin ver;
4. Yetişkinleri yeni tüplere aktarın; arka yavru.
5. Eklozyondan 7 gün sonra, tırmanış başarısını (≥30 saniye içinde 8 cm) her grup başına altı kopya ile değerlendirin.
6. Tüm gözlemler, mutant hattın tanımlayıcı özellikleri olarak kaydedildi ve gen fonksiyonunu çıkarmak için kullanılmadı.

7. Antioksidan enzim aktivitelerini ölçmek

1. Fizyolojik olgunluk ve karşılaştırılabilir yaş sağlamak için eklozyondan 5 gün sonra 300 erkek ve 300 dişi yetişkin (her grup için üç şişe test edildi, her şişede 100 sinek bulunuyor) Ent2*/CyO ve w¹¹¹⁸ kontrol sinekleri toplayın.
2. Sinekleri yemsiz boş tüplere aktarın ve biyokimyasal testlerden önce metabolik durumu standartlaştırmak için 2 saat aç bırakın.
3. Bir çelik boncuk/boru ekleyin; 60 Hz'de homojeniz, 2 dakika.
4. Santrifüj 4 °C, 161 x g, 10 dakika; Süpernatantı topla.
5. Toplam süperoksit dismutazını (SOD, detaylar için Materyal Tablosu'na bakınız) ve katalaz (CAT, detaylar için Materyal Tablosu'na bakınız) kit talimatlarına göre ölçün.

8. Veri istatistikleri ve analizi

1. Tüm verileri ortalama ± ortalama standart hata (± SEM) olarak ifade edin.
2. Enzim aktivite verilerini karşılaştırmak için tek yönlü ANOVA kullanın; vücut ağırlığı, tırmanma yeteneği ve vücut uzunluğu için üçlü ANOVA (faktörler: genotip, sıcaklık, cinsiyet) uygulayın. Uygun olduğunda Tukey'nin HSD sonrası testini^{yapmak 35}.
3. Tüm istatistiksel testler için anlamlılığı P < 0.05 olarak tanımlayın.
4. Yaşam verisini hayatta kalma eğrileri kullanılarak analiz edin ve deneysel³⁶ gruplar arasında hayatta kalma yörüngelerinde önemli farklar olup olmadığını değerlendiren log-rank (Mantel-Cox) testini gerçekleştirin.
5. Tüm analizleri ve grafikleri GraphPad Prism 9.5.0 yazılımında yazılım^{yönergelerine uygun olarak yürütmek 37}.
6. Tüm istatistiksel analizler yalnızca betimleyici karşılaştırma için yapıldı ve nedensel ilişkiler kurmak için yapılmadı.

Sonuçlar

Ent2 gen hedefleme alanlarının tasarım ve etkinlik doğrulama analizi
Ent2 geni için aday hedef siteler CHOPCHOP ve CCTop platformları kullanılarak tasarlandı (Şekil 1). Ekzon 2 ve ekzon 5 bölgelerini hedefleyen iki gRNA, özgüllük ve verimlilik kriterlerine göre seçildi. Başarılı genom düzenlemesini doğrulamak için, yerleşik Ent2*/CyO hattından rastgele seçilmiş bireylerden genomik DNA amplifikasyon yapıldı ve Sanger dizilenmesine tabi tutuldu. Dizileme kromatografileri, hedef bölgeye yakın başlayan üst üste düşen zirveleri gösterdi ve bu, yerleştirme/silinme (indel) mutasyonlarıyla uyumludur. Daha fazla dizilik analizi, erken durma kodonlarına yol açan çerçeve kayması mutasyonlarını ortaya koydu (Şekil 2). Bu sonuçlar, CRISPR/Cas9 sisteminin hedeflenen Ent2 lokusunda mutasyonları başarıyla başlattığını doğrulamaktadır ve genom düzenleme iş akışının uygulanabilirliğini göstermektedir.

Şekil 1. Ent2 geninin nakatlanma noktasının şematik diyagramı ve genomdaki tespit primerinin konumu. Bu şematik, Ent2 lokusunun genomik yapısını göstermekte, CDS (yeşil), başlatma ve durdurma kodonları (kırmızı), gRNA PAM motifi (gri), gRNA hedef dizisi (mavi) ve gRNA amplifikasyon primer dizisi (sarı) vurgulanmaktadır. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Stabil hattın kendi akraba evreli Ent2*/CyO'nun Drosophila yavrularının dizileme sonuçlarının zirve grafigi. Stabil Ent2*/CyO heterozigot çizgisini kendiliğinden çaprazlayarak elde edilen genotipi doğrulayan kronogram dizileme. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ent2/CyO hattının betimleyici morfolojik gözlemleri
22 °C ve 25 °C koşullarında meyve sineklerinin iki genotipi arasındaki vücut şekli farklılıklarını stereomikroskop kullanarak gözlemledik (Şekil 3). Her iki sıcaklık koşullarında, hem erkek hem dişi meyve sinekleri tipik bir "uzun iğne" vücut şekli sergilerdi. Dişi karınlar geniş ve iğne şeklindeydi; kanat uçları karın ucunun biraz ötesine uzanıyordu. Erkeklerde göğüs-karın birleşimi net bir şekilde belirginleşmişti ve erkeklerde ayırt edici bir özellik olan karın ucundaki koyumuş pigmentasyon görünürdü. W ¹¹¹⁸ sineklerinin kanatları şeffaf ve net tanımlanmış damarlara sahipti ve kanat kenarlarında eğrilik veya damar kırılması gözlemlenmedi. Buna karşılık, Ent2*/CyO heterozigotları belirgin şekilde kanat tabanı bükülmesi ve kanat kenarı eğriliği sergilemiştir. 22 °C'de, cinsiyetten bağımsız olarak, meyve sineklerinin vücut uzunluğu, aynı genotipin 25 °C'deki vücut uzunluğuna göre önemli ölçüde daha fazlaydı. Ayrıca, aynı sıcaklıktaki kadın vücut uzunluğu erkeklerden önemli ölçüde daha fazlaydı. Ayrıca, hem 22 °C hem de 25 °C sıcaklıklarında, Ent2*/CyO heterozigotlarının vücut boyutu, ilgili w¹¹¹⁸ sineklerinin vücut boyutuna göre daha küçüktü. Morfolojik temeli incelemek için, sineklerin vücut uzunluğunu eşzamanlı olarak ölçtük (Şekil 3E, Tablo 1). Üç yönlü ANOVA genotipte (F(1,16)=230.1, P<0.0001), sıcaklık (F(1,16)=19.50, P=0.0004) ve cinsiyette (F(1,16)=166.9, P<0.0001) önemli ana etkiler ortaya koydu. Anlamlı genotip x cinsiyet etkileşimi (F(1,16)=14.96, P=0.0014) ve anlamlı genotip x sıcaklık x cinsiyet üçlü etkileşim (F(1,16)=6.231, P=0.0239) gözlemlendi.

Şekil 3. w¹¹¹⁸ ve Ent2*/CyO yetişkinlerinin kontrol morfolojisi. Dişi (A, C) ve erkek (B, D) Drosophila'nın duruş özelliklerini 22 °C ve 25 °C ile 25 °C ile birlikte vücut uzunluğunun (E) nicel karşılaştırmasını gösteren temsil görüntüler. ** P < 0.01. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Farklı sıcaklık koşullarında hayatta kalma analizi
Ent2*/CyO heterozigotları ve w¹¹¹⁸ sineklerinin 22 °C ve 25 °C sıcaklıklarda hayatta kalma eğrilerini istatistiksel olarak analiz ettik (Şekil 4). Sonuçlar, Ent2*/CyO heterozigot dişilerin hayatta kalma eğrisinin en yüksek olduğunu ve 14. haftada iki bireyin hayatta olduğunu gösterdi. 14. haftada tüm ¹¹¹⁸ kadın öldü. Tüm Ent2*/CyO heterozigot erkekler 12. haftada ölürken, ¹¹¹⁸ erkek herkes 11. haftada öldü. Bu bulgular, 22 °C'de dişilerin genel yaşam süresinin erkeklerden daha uzun olduğunu ve aynı cinsiyette Ent2*/CyO heterozigotların hayatta kalma yeteneğinin w¹¹¹⁸ tipine göre biraz daha güçlü olduğunu göstermektedir.

25 °C koşullarında genel hayatta kalma süresi önemli ölçüde kısalmıştır. w¹¹¹⁸ dişi ve Ent2*/CyO heterozigot erkeklerin hayatta kalma eğrileri 10. haftada sıfıra düştü. Ent2*/CyO heterozigot dişilerin ve w¹¹¹⁸ erkeklerin hayatta kalma eğrileri 8. haftada 1–2 bireye düştü ve 9. haftada sıfıra ulaştı. Mutant ile w¹¹¹⁸ arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (P > 0.05). Bu gözlemler, mutant hattın farklı çevresel koşullarda hayatta kalma özelliklerini tanımlar.

Şekil 4. Drosophila'nın farklı sıcaklık koşullarında hayatta kalma eğrileri. Ent2*/CyO ve w¹¹¹⁸ sineklerinin ömrünü 22 °C ile 25 °C'de karşılaştıran hayatta kalma analizi. n=3. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Lokomotor aktivite değerlendirmesi
w¹¹¹⁸ ve Ent2*/CyO meyve sineklerinin tırmanma yetenekleri iki sıcaklık koşulunda karşılaştırıldı: 22 °C ve 25 °C (Şekil 5, Tablo 2). Sonuçlar, 22 °C'de (Şekil 5A), w¹¹¹⁸ dişilerinin %98,15'inin 30 saniye içinde 8 cm'den fazla tırmandığını gösterirken, Ent2*/CyO heterozigot dişilerde bu oranın %89,74'e düştüğünü göstermektedir (P < 0,05). W ¹¹¹⁸ erkeklerinin hepsi 8 cm'den fazla tırmanabildi, Ent2*/CyO heterozigot erkeklerde tırmanma başarı oranı %98,14 idi (P < 0,05). 25 °C'de (Şekil 5B), ^w1118 dişi (%100) 30 saniye içinde 8 cm'den fazla tırmanmış, ancak bu oran Ent2*/CyO heterozigot dişilerde %91,31'e düşmüştür (P < 0,05). w¹¹¹⁸ erkek arasında %77,28'i 8 cm'den fazla (P < 0,01) başarıyla tırmanmışken, Ent2*/CyO heterozigot erkeklerin yalnızca %63,57'si bunu başarmıştır (P < 0,01). Lokomotor performansını daha iyi değerlendirmek için, 15 cm'nin üzerine tırmanan sineklerin oranı analiz edildi (Şekil 5C). Üç yönlü ANOVA, cinsiyet (F(1,16) = 201.7, P < 0.0001) ve yetişme sıcaklığının (F(1,16) = 72.60, P < 0.0001) tırmanış performansı üzerindeki son derece önemli ana etkilerini ortaya koydu. Ancak genotipin ana etkisi anlamlı değildi (F(1,16) = 0.59, P = 0.4545). Bu sonuçlar, lokomotor performansın deneysel koşullara bağlı olarak değiştiğini ve gruplar arasında bağlam asılı olarak farklılık gösterebileceğini göstermektedir.

Şekil 5. Drosophila'nın farklı sıcaklıklarda tırmanma yeteneğinin karşılaştırılması. 22 °C (A) ve 25 °C (B) sıcaklıklarda tırmanış performansının nicelenmesi ve tırmanış mesafesi 15 cm (C) > bireyler için istatistikler. ** P < 0.01. n=3. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Vücut ağırlığı ölçümü
Vücut ağırlığı w¹¹¹⁸ ve Ent2*/CyO heterozigot meyve sineklerinde 22 °C ile 25 °C arasında ölçüldü (Şekil 6). Sonuçlarımız, w¹¹¹⁸ sinekleriyle karşılaştırıldığında, Ent2*/CyO heterozigotlarının ağırlığının hem 22 °C hem de 25 °C'de (P < 0.05 veya P < 0.01) anlamlı şekilde azaldığını göstermektedir. ¹¹¹⁸ sinekler arasında erkek sineklerin ağırlığının, ¹¹¹⁸ sinekler arasında dişi sineklerin ağırlığından anlamlı şekilde daha düşük olduğunu gözlemledik (P < 0.01). Benzer şekilde, erkek Ent2*/CyO heterozigotlarının ağırlığı, kadın Ent2*/CyO heterozigotlarından anlamlı şekilde daha düşüktü (P < 0.01). Drosophila'da genotip, büyüme sıcaklığı ve cinsiyetin vücut ağırlığı üzerindeki bağımsız ve etkileşimli etkilerini değerlendirmek için üç yönlü bir ANOVA gerçekleştirdik. Analiz, genotipin (F(1,16) = 32,38, P < 0,0001), sıcaklık (F(1,16) = 23,31, P = 0,0002) ve cinsiyet (F(1,16) = 25,52, P = 0,0001) bakımında önemli ana etkileri gösterdi (Şekil 6; Tablo 3). Ayrıca, sıcaklık ile cinsiyet arasında önemli bir iki yönlü etkileşim vardı (F(1,16) = 24.76, P = 0.0001), bu da sıcaklığın vücut ağırlığı üzerindeki etkisinin cinsiyete göre değiştiğini gösteriyordu. Ancak, genotip ile sıcaklık (F(1,16) = 0.40, P = 0.538), genotip ve cinsiyet (F(1,16) = 1.31, P = 0.269) veya üçlü etkileşim (genotip x sıcaklık x cinsiyet: F(1,16) = 0.48, P = 0.497) arasında anlamlı bir etkileşim bulunmamıştır; bu da Ent2*/CyO mutantlarının sıcaklık ve cinsiyete verdiği yanıtın vahşi tipe benzer olduğunu göstermektedir.

Cinsiyet etkileşiminin önemli sıcaklığı × göz önüne alındığında, spesifik desenini netleştirmek için basit etki analizi yaptık. Sonuçlar, dişi sineklerde 22 °C'de yetiştirilen bireylerin 25 °C'de yetiştirilenlere göre anlamlı şekilde daha yüksek vücut ağırlığına sahip olduğunu gösterdi (P = 0.0012); ancak erkeklerde vücut ağırlığında iki sıcaklık arasında anlamlı bir fark yoktu (P > 0.9999). Bu, sıcaklığın 25–22 °C arasında düşürülmesinin özellikle dişi sineklerde vücut ağırlığını artırdığını, erkekler üzerinde ise önemli bir etkisi olmadığını gösterir.

Genotip ile diğer faktörler arasında anlamlı etkileşimler olmamasına rağmen, genotipin güçlü ana etkisi, Ent2*/CyO mutantlarının vahşi tipe kıyasla tüm koşullarda genellikle daha düşük vücut ağırlığına sahip olduğunu gösterdi. Sonradan yapılan karşılaştırmalar ise 22 °C'de vahşi tip dişilerin (w¹¹¹⁸:22 °C Dişiler) tüm mutant gruplara göre (P < 0.0001) anlamlı şekilde daha yüksek vücut ağırlığına sahip olduğunu ve aynı sıcaklıkta her iki genotipin de belirgin cinsel dimorfizm gösterdiğini (dişiler > erkekler, P < 0.01) gösterdi. 25 °C'de, vahşi tip ile mutantlar arasındaki vücut ağırlığı farkı benzer bir eğilim gösterdi ancak istatistiksel anlamlılığa ulaşmadı. Bu bulgular, mutant hattın vücut ağırlığı özelliklerini farklı çevresel ve biyolojik koşullar altında tanımlar.

Şekil 6. Drosophila'da farklı sıcaklıklarda vücut ağırlığının karşılaştırılması. Vücut ağırlığı ölçümleri 22 °C ve 25 °C. ^ns P > 0.05, * P < 0.05, ** P < 0.01. n=3. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Antioksidan enzim aktivitesi
w¹¹¹⁸ ve Ent2*/CyO heterozigot Drosophila'nın antioksidan enzim aktiviteleri 25 °C'de karşılaştırıldı (Şekil 7). Sonuçlarımız, w¹¹¹⁸ sineklerine kıyasla hem erkek hem de dişi Ent2*/CyO heterozigotlarının katalaz (CAT) ve süperoksit dismutaz (SOD) aktivitelerinde anlamlı şekilde azaldığını gösterdi (P < 0.01). Ayrıca, w¹¹¹⁸ erkek sineklerdeki CAT ve SOD aktivitelerinin, w¹¹¹⁸ dişilere göre anlamlı şekilde daha yüksek olduğunu bulduk (P < 0,05 veya P < 0,01). Benzer şekilde, Ent2*/CyO heterozigot erkeklerde antioksidan enzim aktiviteleri, Ent2*/CyO heterozigot kadınlardakilere göre anlamlı derecede yüksekti (P < 0.01).

Şekil 7. Drosophila'nın optimal beslenme sıcaklığında antioksidan kapasitesinin karşılaştırılması. Ent2/CyO sineklerinde w¹¹¹⁸ sinekleriyle karşılaştırıldığında CAT (A) ve SOD (B) aktivitesini gösteren enzimatik aktivite testleri. * P < 0.05, ** P < 0.01. n=3. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	P değeri
Genotip	0.8026	1	0.8026	F (1, 16) = 230.1	P<0.0001
Sıcaklık	0.06803	1	0.06803	F (1, 16) = 19.50	P=0.0004
Cinsiyet	0.5822	1	0.5822	F (1, 16) = 166.9	P<0.0001
Genotip x Sıcaklığı	0.005798	1	0.005798	F (1, 16) = 1.662	P=0.2156
Genotip x Cinsiyet	0.05218	1	0.05218	F (1, 16) = 14.96	P=0.0014
Sıcaklık x Cinsiyet	0.01323	1	0.01323	F (1, 16) = 3.793	P=0.0692
Genotip x Sıcaklık x Cinsiyet	0.02173	1	0.02173	F (1, 16) = 6.231	P=0.0239
Kalıntı	0.05581	16	0.003488

Tablo 1: Drosophila'da vücut uzunluğu ölçümlerinin varyans analizi.

ANOVA tablosu	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	P değeri
Cinsiyet	0.1483	1	0.1483	F (1, 16) = 201.7	P<0.0001
Genotip	0.0004319	1	0.0004319	F (1, 16) = 0.5877	P=0.4545
Sıcaklık	0.05336	1	0.05336	F (1, 16) = 72.60	P<0.0001
Cinsiyet x Genotip	0.01418	1	0.01418	F (1, 16) = 19.30	P=0.0005
Cinsiyet x Sıcaklık	0.007134	1	0.007134	F (1, 16) = 9.708	P=0.0067
Genotip x Sıcaklığı	0.0135	1	0.0135	F (1, 16) = 18.37	P=0.0006
Cinsiyet x Genotip x Sıcaklık	0.005903	1	0.005903	F (1, 16) = 8.032	P=0.0120
Kalıntı	0.01176	16	0.0007349

Tablo 2: Drosophila'da Tırmanma Yeteneğinin (> 15 cm) varyans analizi.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	P değeri
Genotip	4.363E-07	1	4.363E-07	F (1, 16) = 32.38	P<0.0001
Sıcaklık	3.141E-07	1	3.141E-07	F (1, 16) = 23.31	P=0.0002
Cinsiyet	3.439E-07	1	3.439E-07	F (1, 16) = 25,52	P=0.0001
Genotip x Sıcaklığı	5.333E-09	1	5.333E-09	F (1, 16) = 0.3958	P=0.5381
Genotip x Cinsiyet	1.765E-08	1	1.765E-08	F (1, 16) = 1.310	P=0.2692
Sıcaklık x Cinsiyet	3.336E-07	1	3.336E-07	F (1, 16) = 24.76	P=0.0001
Genotip x Sıcaklık x Cinsiyet	6.513E-09	1	6.513E-09	F (1, 16) = 0.4834	P=0.4968
Kalıntı	2.156E-07	16	1.347E-08

Tablo 3: Drosophila'da Vücut Ağırlığı Ölçümlerinin Varyans Analizi.

Tartışma

KB, birden fazla biyolojik süreci etkileyen evrimsel olarak korunmuş bir^{proteindir 38}. Xenopus laevis oositlerinde ifade edildiğinde, Ent2 nükleozid taşıma^{aktivitesi gösterir 8}. Çalışmalar, Ent2'nin homozigot mutantının geç larva veya erken pupa^{evre 10'da} ölümcül olduğunu göstermiştir. Mevcut çalışmada, Drosophila melanogaster'da Ent2 hedefli alleller oluşturmak için CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenleme iş akışı oluşturulmuştur. Suş oluşumu sırasında gözlemlenen homozigot mutantların ölümcüllüğü, önceki raporlarla tutarlıdır ve genom düzenleme stratejisinin geçerliliğini destekler. Bu çerçevede, bu çalışmada oluşturulan Ent2*/CyO heterozigot çizgisi, Ent2'nin kısmi kaybıyla ilişkili fenotipik özelliklerin belgelenmesi için bir model sunar. Test edilen deneysel koşullarda, Ent2*/CyO ile w¹¹¹⁸ sinekler arasında vücut büyüklüğü, vücut ağırlığı, hareket aktivitesi ve antioksidan enzim seviyelerinde farklılıklar gözlemlendi. Bu gözlemler, yerleşik mutant hattın fenotipik profilini tanımlar.

Gelişim ve vücut büyüklüğü açısından, Ent2*/CyO heterozigot bireyler, hem 22 °C hem de 25 °C sıcaklıklarda w¹¹¹⁸ sineklerinden önemli ölçüde daha küçüktü. Bu fark, Ent2 geninin yokluğundan kaynaklanan nukleozid taşıma verimliliğinin azalmasına bağlanabilir; bu da enerji metabolizmasının kararlılığını ve ekdison düzenlemesini etkiler. Ayrıca, olumsuz etkiler 25 °C'de daha belirgin hale geldi. Araştırmalar, hayvan ömrünün metabolik hızdan etkilendiğini göstermiştir; bu kavram metabolik hız^{teorisi olarak bilinir 19}. Bu çalışmanın bulguları, meyve sineklerinin yüksek sıcaklıklarda yüksek metabolik hızının zayıflamış nukleozid metabolizmasından kaynaklanan beslenme eksiklikleri ve gelişim gecikmeleriyle yakından ilişkili olabileceğini göstermektedir. Ancak, tek bir CRISPR kaynaklı allel kullanıldığı için, bu bulgular gen fonksiyonunun doğrudan kanıtı değil, tanımlayıcı gözlemler olarak yorumlanmalıdır.

Sıcaklığa bağlı varyasyon, birden fazla fenotipik okumada da belirgin olmuştur. Mutant, özellikle kadınlarda 22 °C ile mütevazı bir yaşam süresi uzantısı sergilemektedir; bu bulgu önceki çalışmalarla^{örtüşüyor (39,40}). Buna karşılık, 25 °C'de yaşam farkı azalır ya da kaybolur. Poikilotermik organizmalar olarak, meyve sinekleri daha yüksek metabolik hız gösterir ve bu nedenle^41,42 yüksek sıcaklıklarda daha kısa ömür sürerler; bu da bu çalışmanın bulgularıyla örtüşmektedir. Bu bağlamda, gözlemlenen desenler genel fizyolojik sıcaklık tepkilerini yansıtabilir.

Lokomotor performans ve antioksidan enzim aktiviteleri de genotipler, cinsiyetler ve sıcaklık koşulları arasında değişiklik göstermektedir. Belirli koşullar altında Ent2/CyO sineklerinde tırmanma performansının azalması ve SOD ile CAT aktivitelerinin azalması gözlemlendi. Önceki çalışmalar, nükleozid taşıyıcılarını NAD⁺ metabolizması, mitokondriyal fonksiyon ve oksidatif stres^{düzenlemesi ile ilişkilendirmiştir} 17,43,44,45,46,47. Bu raporlar olası bir biyolojik bağlam sunsa da, mevcut veriler fenotipik karakterizasyonla sınırlıdır ve Ent2 ile bu yollar arasında mekanik bağlantılar kurmaz.

Sonuçlarımız ayrıca, aynı koşullar altında erkek meyve sineklerinin genellikle dişi meyve sineklerine göre daha yüksek antioksidan enzim aktivitesi^{sergilediğini göstermektedir (39,48}). Bu, cinsiyetle ilgili faktörlerin antioksidan yanıtını farklı sinyal yolları aracılığıyla düzenleyebileceği anlamına gelir. Antioksidan yanıtlarıyla ilgili transkripsiyon faktörleri, örneğin Nrf2/CncC ve onların sonraki hedef genleri, farklı cinsiyetler arasında ifade farklılıkları gösterir ve böylece genel antioksidan^{kapasitesini 49} etkiler. Bu gözlem, Drosophila'da oksidatif stres direnci ve antioksidan savunmalarında cinsiyet farklılıkları raporlarıyla tutarlıdır; burada kadınlar genellikle erkeklere göre daha düşük ROS seviyeleri ve daha yüksek başlangıç antioksidan enzim aktiviteleri korur; bu da cinsiyetler arasında stres direnci ve uzun ömür farklılıklarına katkıda bulunabilir⁵⁰. Bu gözlemler, mutant fenotipleri karakterize ederken cinsiyet gibi biyolojik değişkenlerin dikkate alınmasının önemini daha da vurgulamaktadır.

Metodolojik açıdan, bu çalışma Drosophila'da CRISPR/Cas9 aracılı mutasyonların üretilmesi ve doğrulanması için tekrarlanabilir bir iş akışını ortaya koymaktadır. GRNA'nın hassas tasarımı ve seçimi gereklidir; çünkü etkili gRNA'lar, Cas9 tarafından hedeflenen bölünme etkinliğini belirler ve istenmeyen değişiklikleri en aza^{indirir 21,51}. Cas9 ve gRNA bileşenlerinin embriyolara yüksek hassasiyetli mikroenjeksiyonu da çok önemlidir, çünkü verimsiz enjeksiyonlar düşük düzenleme oranlarına veya mozaikliğe^{yol açabilir 52}. Dizileme yoluyla kapsamlı genotip doğrulaması, amaçlanan düzenlemelerin mevcut olmasını sağlar ve hedeften sapan veya eksik düzenlemeleri hariç tutar; böylece model^{bütünlüğü 53} güçlendirilir. Özellikle, homozigot mutantların ölümcüllüğü nedeniyle CyO dengeleyici kromozomunun kullanılması, Ent2 mutant allelini korumak için hayati önem taşıyordu. Bu yaklaşım, zararlı mutasyonları korumak ve sonraki analizleri mümkün kılmak için Drosophila genetiğinde yaygın olarak kullanılır. Bu çalışma, bu stratejinin CRISPR/Cas9 düzenleme çerçevesinde pratik uygulamasını göstermektedir.

Birkaç sınırlama kabul edilmelidir. İlk olarak, fenotipik analizler tek bir CRISPR teşreli mutant çizgi kullanılarak yapıldı. CRISPR/Cas9 düzenlemesinin heterojen alleller oluşturabileceği iyi bilinmektedir ve genetik sonuçları güçlendirmek için genellikle birden fazla bağımsız çizginin analizi önerilir. Bu nedenle, burada bildirilen bulgular bir mutant allelin ön karakterizasyonu olarak yorumlanmalıdır. Gelecekteki çalışmalar, bağımsız olarak üretilen ek Ent2 allellerini içeren çalışmalar, sonuçların sağlamlığını artırmak için gerekli olacaktır. İkinci olarak, mutant çizgi CyO dengeleyici kromozom kullanılarak korundu, oysa kontrol grubu (w¹¹¹⁸) dengeleyici kromozom taşımaz. Dengeleyici kromozomların kendileri gelişimsel ve fizyolojik özellikleri etkileyebildiği için, dengeleyici uyumlu kontrolün olmaması potansiyel bir kafa karıştırma kaynağıdır. Bu sınırlama, genotipler arasındaki fenotipik farklılıkları yorumlarken dikkate alınmalıdır. Üçüncüsü, nem, ışık döngüsü ve diyet gibi çevresel koşullar standart laboratuvar ortamlarında korundu ancak sistematik olarak değiştirilmedi. Bu faktörler metabolizma ve stres yanıtlarını etkileyebildiğinden, kontrollü çevresel gradyanları içeren gelecekteki çalışmalar, fenotip-çevre etkileşimlerinin daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlayacaktır.

Özetle, bu çalışma Drosophila melanogaster'de Ent2 mutant allellerinin üretimi ve sürdürülmesi için CRISPR/Cas9 tabanlı bir iş akışı oluşturur ve farklı çevresel koşullarda ortaya çıkan heterozigot hattın tanımlayıcı bir karakterizasyonunu sunar. Sonuçlar, bu yaklaşımın ölümcül fenotiplere sahip genleri incelemek için uygulanabilirliğini vurguluyor ve genetik arka plan, dengeleyici kromozomlar ve çevresel değişkenler gibi deneysel tasarım hususlarının önemini vurgulamaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ammonium acetate	Sigma	A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (Visible Light Method) (Ammonium Molybdate Method)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1
Dodecyl sulfate	Sigma	L3771
Injection device	Eppendorf FemtoJet	4i
Linearized plasmid: MLM3613	Addgene	42251
Microscope	OLYMPUS	CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kit	Thermo Fisher	AM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1344
PmeI restriction enzyme	NEB	R0560S
Poly(A) polymerase	NEB	M0276S
Protease K	Thermo Fisher	EO0491
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
T7 RiboMAX Kit	Promega	P1320
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) assay kit (Hydroxylamine method)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-1
w1118 Drosophila	Fangjing Biology
Water-saturated phenol/chloroform	Sigma	P2069