Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Poliglutamin spinoserebellar ataksiyaların preklinik modeli olarak lentiviral indüksiyonlu striatal patoloji

418 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69550

⸱

13 Mart 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1ABC-RI, Algarve Biomedical Center Research Institute, 2Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 3ABC Collaborative Laboratory: Integrated Ageing and Rejuvenation Solutions (ABC CoLAB - Ageing Better)

Bu makalede

Özet

Poliglutamin spinoserebellar ataksiler, CAG genişlemelerinin agregasyona yatkın proteinler üretmesiyle oluşur. Bu protokol, vektör üretimi, stereotaksik teslimat ve inklüzyonlar ile nöronal belirteç kaybının analizini tanımlar; böylece nörodejeneratif hastalıklar için mekanizmaları araştırmak ve hedefe yönelik tedavileri değerlendirmek için kontrollü bir platform sağlar.

Özet

Poliglutamin spinoserebeller ataksiler, her neden olan genin kodlama bölgesindeki trinükleotid CAG traktındaki mutasyondan kaynaklanan altı nörodejeneratif hastalıktan oluşan bir gruptur. Bu mutasyon, proteinde anormal şekilde genişlemiş poliglutamin gerilmesine yol açar, bu da proteini agregasyona yatkın hale getirir ve bu hastalıkların ayırt edici özelliği olan nöron içi inklüzyonların oluşmasına yol açar. Bu hastalıkların patogenezinin altında yatan moleküler mekanizmalar karmaşıktır ve tam olarak anlaşılmamıştır. Şu ana kadar bu hastalıklar tedavi edilemez durumda. Hassas beyin bölgelerindeki moleküler mekanizmaları anlamak, terapötik gelişim için gereklidir. Mekanizmleri ve müdahaleleri hızlı test etmek için, birden fazla transjenik çizgi üretme zamanı ve maliyeti olmadan, seçici kırılganlığı ele almadan esnek, bölgeye özgü deneysel platformlara ihtiyaç vardır. Son yıllarda, biz ve diğerleri, beynin belirli bölgelerinde genişlemiş protein ekspresyonunun etkisini incelemek için birkaç lentiviral tabanlı model geliştirdik. Bu modeller, bazı hastalık özelliklerini taklit eden nöropatolojik ve davranışsal özellikleri göstererek, patogenezi anlamada ve yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesinde önemlerini vurgular. Bu makalede, SCA2'yi örnek olarak kullanarak striatal bir modelin geliştirilmesini anlatıyoruz. Lentiviral vektör gelişimi ve üretimini, ayrıca ataksin-2'nin (hastalık oluşturan protein) genişletilmiş formunu ifade eden vektörlerin stereotaksik enjeksiyonunu vurguluyoruz. Son olarak, iki ana nöropatolojik özelliği karakterize ediyoruz: inklüzyonların oluşumu ve nöronal belirteçlerin kaybı. Bu temel patolojik özellikleri tekrar eden kontrollü bir platform sunarak, bu model bölgeye özgü nörodejenerasyon mekanizmalarını incelemek ve hedefe yönelik terapötik müdahaleleri değerlendirmek için değerli bir araç sunar.

Giriş

Poliglutamin spinoserebeller ataksiler (polyQ SCA'lar), çeşitli neden olan genlerde CAG trinükleotid tekrar genleşmeleriyle oluşan altı otozomal dominant nörodejeneratif bozukluktan oluşan bir gruptur ve kodlanmış proteinler içinde toksik poliglutamin (polyQ) traktlarına yol açar.1. Bunlar arasında en sık görülen poliQ SCAlar SCA3/Machado-Joseph hastalığı ve SCA2'dir. Bu bozukluklar, öncelikle beyin beyin kökü ve beyin sapı gibi belirli beyin bölgelerindeki nöronal hücreleri, ayrıca striatum ve diğer bölgeleri etkiler. Sonuç olarak, ilerleyici motor koordinasyon bozuklukları, yürüyüş bozuklukları, şiddetli nörodejenerasyon ve erken ölüme nedenolurlar 3.

Çoklu hayvan modelleri poliQ SCA'ları incelemek ve terapötik yaklaşımları test etmek için geliştirilmiştir. Transgenik fareler, knock-in çizgileri ve koşullu ifade fare modelleri, hastalık ilerlemesinin moleküler temelini ve ilgili hücresel yolları aydınlatmak içinkullanılmıştır 4,5. Ancak, yeni bir hastalık hayvan modeli oluşturmak zaman alıcı ve maliyetlidir ve hastalık patogenezinde beyin bölgesel katılımını incelemek için genellikle uygundeğildir 6.

Lentiviral (LV) tabanlı fare modelleri, geleneksel modellere tamamlayıcı bir alternatif sunar; daha düşük maliyetle ve beynin belirli bölgelerini inceleme imkanısunar 7,8. Lentivirüs vektörleri, büyük transgenlerin (8 kb'ye kadar) taşınmasına izin verir; bu da germ hattı modifikasyonu olmadan tanımlanmış beyin bölgelerinde patolojinin hızlı bir şekilde indüklenmesine yol açar ve farklı yaş içindeki hayvanlarda kullanılabilirler. Lentiviral vektörlerin hedef beyin bölgesine doğrudan enjekte edilmesi, diğer viral vektörlere kıyasla daha düşük immünojenlikle patojenik veya terapötik genlerin bölgeye özgü ekspresyonu sağlayabilir4. Ayrıca, doğum sonrası doğum, insan başlangıcına daha çok benzeyen koşullarda hastalık mekanizmalarını incelemek için gelişimsel kompensasyondankaçınır 9. İfade seviyeleri, viral dozun ayarlanmasıyla titreyebilen kontrollü şiddette fenotipler üretilebilir ve hastalık ilerlemesinin kademeli modellenmesini kolaylaştırabilir. Ayrıca, bu yöntem, seçilen promotor 4,7'ye bağlı hücre tipine özgü ifadeye izin verir.

Birçok çalışma, LV tabanlı fare modellerinin poliQSCA'ları 10,11,12,13 modellemesinde pratikliğini ve faydalılığını göstermiştir. Biz ve diğerleri, SCA111, SCA212, SCA311,12 ve SCA714 için LV tabanlı modeller geliştirdik; bu modeller, hastalık genlerinin hızlı, bölgeye özgü ifadesi veya susturulması için platformlar oluştururken nöropatolojinin temel yönlerini yeniden üretmektedir.

Özetle, burada tanımlanan lentiviral yaklaşım, poliQ SCA'ların patogenezini modellemek için çok yönlü ve verimli bir araç sağlar. Mevcut hayvan modellerinin bazı büyük dezavantajlarını aşarak, bu yöntem kavram kanıtı çalışmalarını hızlandırır ve hastalığın başlangıcı, lokalizasyonu ve şiddeti üzerinde daha fazla kontrol sağlar - bu özellikler onu terapötik tarama ve moleküler mekanizmaların incelenmesi için son derece uygun kılar. Burada, erken patojenik olayların detaylı analizini ve aday tedavilerin değerlendirilmesini mümkün kılan poliglutamin spinoserebellar ataksisinin striatal lentiviral modelini oluşturmak ve karakterize etmek için tekrarlanabilir bir yöntem tanımlıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Hayvan Araştırmaları: In Vivo Deneylerin Raporlanması (ARRIVE) yönergeleri ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirildi. Mevcut çalışma, Direção-Geral da Alimentação e Veterinária (DGAV) tarafından onaylandı. Bu çalışmada C57BL/6J fareleri kullanıldı ve standart kafeslerde 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü altında grup olarak yerleştirildi; yiyecek ve su ile libitum olarak sağlandı.

NOT: Bu protokolde kullanılan materyaller, Materyaller Tablosu'nda daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

1. Lentiviral vektörlerin paketlenmesi

NOT: Lentiviral vektörlerle ilgili tüm işlemler, kurumun güvenlik yönergelerine uygun olarak BSL-2 laboratuvarında yapılmalıdır. Diğer lentiviral üreten sistemlere kıyasla daha yüksek biyogüvenlik nedeniyle 4-plazmid transfeksiyon sistemini kullandık (transfer plazmidi hakkında detaylar için Şekil 1'e bakınız).

  1. HEK 293T hücrelerini su banyosunda eritip Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile 2 mM L-glutamin, %10 FBS ve %1 Pen-Strep ile takviye edilmiş T75 şişesine tohumlayın. Bu tam DMEM ortamı protokolün tüm adımlarında kullanıldı. Yüksek viral titrerler ve tutarlı sonuçlar için ≤10 geçiş numarasında hücreler kullanın.
    NOT: Devam etmeden önce her zaman mycoplasma kontaminasyonunu kontrol edin.
  2. Hücreler %80-90 birleşimine ulaştığında, ilk kültürü 1:2 bölerek 2 T175 şişesine genişletin. Her tabak başına 3,8 x 106 hücre içeren 20 adet 100 mm kültür kabı tohumlayın (son hacim 10 mL) ve bunları %5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'de 24 saat kuluçka yapın. Hücreleri trypan blue hariç tutarak Neubauer hemositometresi kullanarak sayın.
    NOT: Hücre stresini azaltmak ve böylece hücre transfeksiyonunu maksimize etmek için Pen-Streptokok'u ortamdan çıkarmayı düşünün.
  3. Ertesi gün, Tablo 1'de açıklandığı şekilde transfeksiyon karışımını hazırlayın. Vortex ve kısa bir süre aşağı dönerek homojenleşme. Karışımı oda sıcaklığında 10–20 dakika kuluçka altına alın ki DNA: PEI kompleksleri oluşsun.
  4. DNA'dan sonra: PEI kompleksleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca oluşmasına izin verildi, karışımı tam DMEM ile 5 mL'ye ayarlayarak ayarlandı.
    Her kültür kabından 5 mL ortam (toplam hacmin yarısı) alın ve yerine 5 mL transfeksiyon karışımı verin. Bu, transfeksiyon sırasında nihai kültür hacminin 10 mL'de kalmasını sağlar.
  5. Hücreleri, üç paketleme plazmidi ve transfer plazmidi ile Tablo 1'de açıklandığı şekilde transfekte edin.
    NOT: Lentiviral üretiminde kullanılan tüm plazmidler endotoksin içermeyen arıtma kitleriyle hazırlanmalıdır. Ayrıca, plazmid bütünlüğü, transfeksiyondan önce LTR bölgelerinin ve transgen kasetinin doğruluğunu doğrulamak için krestriksiyon enzim analiziyle doğrulanmalıdır.
  6. Her plakaya 5 mL transfeksiyon karışımını damla olarak ekleyin ve 6 saat kuluçka yapın. Tüm ortamı aspire edin ve yerine 10 mL taze orta madde ekleyin. 48 saat kuluçka yapın.
    NOT: Viral titeri artırmak için, ortamı 48 saatte toplayın, her tabakaya 10 mL taze ortam ekleyin ve 24 saat sonra tekrar toplayın. Daha önce toplanan ortam, 4 °C'de 24 saate kadar saklanabilir. Bu, hacmin iki katı konsantrasyonu sağlar ve viral titreyi artırır.
  7. Lentiviral vektörleri içeren tüm koşullandırılmış ortamı 0.22 μm filtre ünitesi kullanarak filtreleyin.

2. Lentiviral vektörlerin arındırılması ve titrasyonu

  1. Filtrelenmiş süpernatantı uygun konik ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve örneğin sallanan kovalı rotor kullanarak 65.000 x g sıcaklıkta 1 saat 30 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
  2. Süpernatantı dikkatlice atın ve her pelleti 1x PBS ile seyreltilmiş 400 μL %1 BSA ile tekrar askıya alın, böylece baloncuk oluşumunu önleyin. En az 1 saat buzda kuluçka yapın.
  3. 1 saat kuluçkadan sonra, her tüpü nazikçe karıştırarak pelletlerin tamamen yeniden askılanmış ve homojen olduğundan emin olun, ardından tüm yeniden askılanan peletleri tek bir tüpte toplayın.
  4. Santrifüjasyon sırasında çöküşü önlemek için tüpü %1 BSA/PBS ile en az üçte ikisi dolacak kadar doldurun.
  5. Lentiviral vektörleri pelletlemek için tekrar 65.000 x g ile 1 saat 30 dakika 4 °C'de santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice atın ve tüpün kenarını steril kağıtla kurutun.
  6. Lentiviral vektörleri içeren pelleti 45 μL %1 BSA/PBS içinde yeniden askıya alın, böylece kabarcıklar oluşmamalıdır. Tüpü şeffaf filmle mühürleyin ve 4 °C'de 24 saat kuluçka yapın.
  7. Ertesi gün, lentiviral vektörlerden 10 μL aliquot hazırlanır. Titrasyon için 10 μL aliquot bulundurun: p24 ELISA kiti için 5 μL ve qPCR kiti için 2 μL. Lentiviral vektörleri üreticinin talimatlarına göre ELISA ve qPCR ile titrleyin.
    NOT: Titrasyon yönteminin seçimi, deneysel ihtiyaçlara bağlıdır; örneğin, enfeksîyon birimlerinin hızlı bir değerlendirmesi veya kesin nicelenmesi. p24 tabanlı ELISA, kapsid proteinini nicelikle ölçür ve böylece toplam fiziksel parçacıkları ölçür; Hızlıdır, diğer yöntemlere göre daha ucuzdur ve yüksek derecede tekrarlanabilir. Ancak, bulaşıcı ile enfeksüf olmayan parçacıkları ayırt etmez; bu da fonksiyonel titrenin aşırı tahmin edilmesine yol açabilir. qPCR tabanlı titrasyon, parçacıklara paketlenmiş viral genomların (vg) sayısını ölçür; genom içeren virionların daha doğru bir tahminini sağlar ve vektör preparatları arasında doğrudan karşılaştırma yapılmasına olanak tanır. Ancak, viral parçacıkların etkili enfektifliğini hâlâ değerlendiremiyor. Son olarak, floresan vektörler için akış sitometrisi veya antibiyotik dirençli koloni oluşumu gibi enfektiflik temelli testler, doğrudan fonksiyonel transdüksiyon birimlerini (TU/ml) ölçer ve biyolojik olarak en önemli olanlardır; ancak bunlar daha emek yoğun, hücre tipine bağımlı, zaman alıcı ve daha pahalıdır15,16.

3. Fare striatumunda iki taraflı lentiviral doğum için stereotaksik cerrahi

  1. Hayvan hazırlığı
    1. Hayvanı tartın ve gerekli anestezi dozunu hesaplayın. Hazır karışım çözeltisi kullanılarak vücut ağırlığında 10 μL/g dozda intraperitoneal anestezi uygulanır. Bu çözelti, 7,5 mL %0,9 NaCl, 500 μL medetomidin (1,0 mg/mL), 1,0 mL midazolam (5,0 mg/mL) ve 1,0 mL fentanil (0,05 mg/mL) birleştirilerek hazırlanır ve nihai hacim 10 mL olur. Tam anestezi indükasyonu için yaklaşık 10 dakika bekleyin.
    2. Anestezi derinliğini doğrulayın (örneğin, parmak sıkıştırma refleksi). Her iki göze de oftalmik merhem sür ve saç derisini tıraş et.
    3. Hayvanı stereotaksik çerçeveye bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin. Kulak barları ve ısırma çubuğu kullanarak başı konumlandırın.
      NOT: Enjekte edilecek hayvan sayısı ve zaman çizelgesi deneye bağlıdır ve belirli hipotezler ile beklenen etki boyutlarına dayanarak önceden istatistiksel güç analiziyle belirlenmelidir. Örneğin, önceki12. çalışmamızda, enjekte edilen beyinler enjeksiyondan 4, 8 ve 12 hafta sonra analiz edilerek nöropatolojik değişikliklerin ilerlemesini değerlendirdi.
  2. Şırınga hazırlığı ve viral yükleme
    1. Yükleme için standart Hamilton iğnesini, enjeksiyon için ise 26G kör uçlu iğne kullanın. Şırıngaya 2 μL lentiviral vektör çözeltisi yükleyin. Enjeksiyon bölgesi başına viral dozun 400 ng p24 antijen/mL veya 5 x 109 IU/mL 10,12,17 olduğundan emin olun.
    2. Şırıngayı otomatik mikroenjeksiyon pompasına (örneğin, Stoelting) takın. İğne ucunda bir damla sıvı belirene kadar şırıngayı infüzyon modunda hazır hale getirin. Eğimin öne baktığından emin olun.
    3. Pompa parametrelerini ayarlayın - hız: 0.25 μL/dakika, yarımküre başına hacm: 2 μL, şırınga tipi: kullanılan yönteme uygun.
      NOT: Enjeksiyon hacmi, kemirgen türüne ve dönüştürülecek hedef beyin bölgesine bağlıdır. 1 μL enjeksiyonlar odak ifadeye yol açarken, daha büyük toplam hacimler (10 μL'ye kadar) çok yavaş enjeksiyon hızları gerektirir ve doku bozulması veya reflü riski daha yüksektir.
  3. Striatal hedefleme ve enjeksiyon
    1. Saç derisini %70 etanol ile dezenfekte edin. Kulakların arasından gözlere steril bir bistüri bıçakla orta hat kesimi (~1–1,5 cm) yapın.
    2. Kafatasını açığa çıkarıp temizleyin, periostu pamuk çubuklarıyla çıkarın. Bregma'yı bulun ve stereotaksik sıfır noktasını (manuel veya dijital olarak) kaydedin.
    3. Bregma'ya göre enjeksiyon koordinatlarını belirleyin (yaklaşık 18-20 g ağırlığı olan 8-12 haftalık fare için): Antero-posterior (AP) +0,6 mm; Medio-lateral (ML) ±1,8 mm; Dorso-ventral (DV): –3,3 mm.
    4. Işaretlenmiş AP/ML koordinatlarında dikkatlice tatbikat yapın. Beyne girmemek için yavaş ilerleyin. Alternatif olarak, kemik yeterince inceltildiğinde dura mater'de kan damarlarının kafatası üzerinden görselleştirilmesiyle belirtilir. Dura mater'i küçük bir iğneyle dikkatlice delin.
    5. Enjeksiyon iğnesini aşağı indirerek deliğin doğru konumda olup olmadığını test edin. İğne tıkanmasını test edin, çözeltinin bir kısmını enjekte ederek bir damla net görünür hale getirile.
    6. Enjeksiyon iğnesini yavaşça DV koordinatına indirin. Her yarımküre 2 μL viral çözeltiyi 0,25 μL/dakika ile enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, reflüden kaçınmak için iğneyi yavaşça geri çekmeden önce 5 dakika bekleyin.
    7. Vahşi tip proteini (ATXN2WT veya ATXN3WT) kodlayan lentivirüs bir yarımküre, mutant/genişlemiş proteini (ATXN2MUT veya ATXN3MUT) kodlayan lentivirüs ise kontralateral tarafa (rastgele veya önceden tanımlanmış) enjekte edilir.12,13.
      NOT: Fare beyni atlası18 kullanılarak, korteks, hipokampus, substantia nigra ve beyincik dahil olmak üzere striatumun ötesinde neredeyse tüm beyin bölgeleri stereotaksik olarak hedeflenebilir. SCA'larda patolojinin birincil yeri olan beyincik, vektör teslimatı için özellikle önemli bir hedeftir. Bu serebellar SCA3 fare modelinin geliştirilmesinde, koordinatlar 1.6 mm rostral ile lambda, orta hatttan 0 mm ve kafatası yüzeyine 1 mm ventral olarak kullanıldı; ağız çubuğu −3.3 olarak ayarlandı, böylece serebellarkorteksin 12,15 hassas hedeflenmesini sağladık.
  4. Ameliyat sırasında izleme
    1. Bıyık hareketini ve reflekslerini takip edin. Hareket gözlemlenirse, başlangıç hacminin üçte biri kadar ek anestezi dozu uygulanır.
  5. Yara kapanması ve iyileşmesi
    1. Kesiyi 3–5 kesintili 5-0 naylon dikişlerle kapatın. İlk anesteziklerin etkilerini tersine çevirmek için 10 μL/g vücut ağırlığı dozda antigonistik ilaçların karışımını deri altına uygular. Bu çözelti, 1,5 mL %0,9 NaCl, 500 μL atipamezol (5,0 mg/mL), 5,0 mL flumazenil (0,1 mg/mL) ve 3,0 mL nalokson (0,4 mg/mL) birleştirilerek hazırlanır ve nihai hacim 10 mL olur.
    2. Hayvanı temiz bir iyileşme kafesine ısıtıcı pedin üzerine yerleştirin ve gece boyunca izleyin.
      NOT: İkne odası ideal olarak vektör kullanımı için biyolojik bir güvenlik kabini ile donatılmalıdır. Araştırmacılar, laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruma gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giymek zorundadır. Tüm atıklar (örneğin, iğneler, şırıngalar ve kirlenmiş malzemeler) kurumsal ve ulusal düzenlemelere uygun olarak biyolojik tehlike kaplarında bertaraf edilmelidir.

4. Doku toplama, hazırlanma ve işleme

  1. Hazırlık
    1. Fare ötenazi ve doku toplama için tüm diseksiyon aletlerini ve gerekli çözümleri hazırlamak (örneğin, anestezi, PBS'de %4 paraformaldehit [PFA]).
    2. %4 PFA önceden hazırlayın, dondurulmuş halde saklanın ve kullanımdan en fazla 24 saat önce eridin. Perfüzyon öncesi çözeltinin iyice soğutulduğundan emin olun.
      DIKKAT: PFA toksiktir. Sadece uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) ve eğitimle birlikte bir duman kapanağının içinde kullanın.
    3. Hayvanı anestezi etmek için ölümcül bir dozda pentobarbital (100–200 mg/kg, intraperitoneal) uygulanır. Derin anestezi, parmak sıkıştırma refleksinin olmaması ile doğrulan; Refleks devam ederse, ek bir doz verin.
  2. Transkardiyal perfüzyon
    1. Hayvanı diseksiyon cihazına yerleştirin ve sabitleyin. Penseps kullanarak karın derisini kaldırın ve makasla yükselen dikey bir kesi yapın (Şekil 2A, pembe ok).
    2. Yüzeysel fasyanı kaldırın ve karaciğer görünene kadar üst bir kesi yapın, böylece karın organlarına zarar vermekten kaçının.
    3. Diyaframı yatay olarak kesin, ardından kesiyi aksillaya doğru uzatın (Şekil 2A, beyaz ok). Göğüs duvarını yansıtın ve geriye sabitleyin.
    4. Sol ventrikülün zirvesine bir perfüzyon iğnesi sokarak ventriküler duvarı delmediğinden emin olun. Sağ atriyumda ince makasla küçük bir kesi yapın (Şekil 2B).
    5. Transkardiyal perfüzyona 50 mL buz gibi soğuk %4 paraformaldehit (PFA) ile 1-2 mL/dakika akış hızında başlatın.
      NOT: Genellikle soğuk çözelti kuyruk kıvrımı ve kas seğirmesine neden olur; bu da iyi perfüzyonun göstergesidir.
  3. Beyin diseksiyon
    1. Beyni tamamen batıracak kadar %4 PFA içeren bir tüp hazırlayın. Farenin kafasını büyük makasla kesin. Cesedi yakmak üzere kapalı bir biyolojik tehlike torbasına atın.
    2. Kafatasını açığa çıkarmak için saç derisini yansıtın. Foramen magnum'u belirleyin ve kafatasını ince makasla yan taraftan keserek beyne paralel kesin (Şekil 2C).
    3. Karşı tarafta tekrarlayın, sonra kafatasını koku soğanlarının üzerindeki gözlerin arasından kesin.
    4. Kafatasını beyincikten koku soğanlarına kaldırarak beyni açığa çıkar. Spatula kullanarak, beyni arkadan öne doğru dikkatlice çıkarın ve 4 °C'de en fazla 24 saat boyunca %4 PFA içine daldırın.
    5. Gömülü çözeltiyi PBS'de %20-30 sakaroz ile değiştirin ve infiltrasyon tamamlanana kadar 4 °C'de kuluçka yapın. Beyin başlangıçta yüzer ve tam sızdırıldığında genellikle 24 saat içinde batır. Eğer su üzerinde kalırsa, kuluçka süresini tüpün dibine kadar uzatın.
      NOT: Bu kriyokoruma adımı, doku su içeriğini azaltarak donma artefaktlarını en aza indirir.
      Beyin ve tüpü nazikçe kurutun, ardından -80 °C'de daha fazla kullanıma kadar saklayın.
  4. Kriyobölümleme ve serbest yüzen doku koleksiyonu
    1. Kesitlemeden önce, kriyostatı -20 °C ve istenen kalınlığa ayarlayın.
      NOT: Striatum için, 20-25 μm kalınlığındaki koronal kesitler yapısal koruma ile antikor nüfuzu arasında ideal bir uzlaşma sunar; böylece yüksek boyama kalitesi ve mekansal çözünürlüğü koruyarak kullanımı için yeterince sağlam kesitler üretir. Kriyoseksiyon koşulları diğer beyin bölgeleri için de belirtilmelidir, çünkü optimal kalınlık sitomimari ile değişebilir. Beyincik için genellikle 25–35 μm ölçüsünde sagital kesitler önerilir, çünkü bu kalınlık serebellar korteksin katmanlı organizasyonunu korur.
    2. Beyni kuru buz üzerinde taşıyın ve kriyostat içinde 5-10 dakika dengelenmesine izin verin. Bu adım, doku hasarını önlemek için önemlidir.
    3. Koku soğanlarını bir bistürle çıkarın; Yumuşak ve kolayca kesilebilen olmalılar. Numune diskine bezelye büyüklüğünde bir damla taze O.C.T. uygulayın ve beyincik temasına alın (Şekil 1D). Koronal kesitleme için beyni konumlandırın. Dondurulduktan sonra, tüm beyni yerleştirmek için ek O.C.T. ekleyin.
      NOT: O.C.T. oda sıcaklığında şeffaftır ve tamamen donduğunda opak beyaz olur; Parlak kalırsa, kriyostatta daha fazla donma süresi bekleyin.
    4. Numune diskini tutucuya monte edin ve striatum (her yarımkürede iki beyaz daire) görünene kadar kesin. Yarımküreler farklı tedaviler aldıysa, yönelimi korumak için bir yarımküre iğneyle delin. Bunu daha sonra analiz için kaydedin.
    5. Kesitleme moduna geçin ve serbest yüzen bölümleri ince bir fırça veya ateşte parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanarak 48 kuyruklu bir plakada toplayın.
      NOT: Serbest yüzme yöntemi antikor nüfuzunu artırır, arka planı azaltır, uzun süreli depolama sağlar ve tam striatal kapsama için eşit aralıklı kesitler sağlar.
    6. Kuyular %0,05 sodyum azid içeren PBS ile doldurun.
      DIKKAT: Sodyum azid zehirlidir - PPE ile ele alın ve atıkları uygun şekilde bertaraf edin.
    7. İlk bölümü A1 kuyusuna, ikinciyi A2'ye yerleştirin ve ardışık olarak devam edin. Plaka dolduğunda, ya yeni bir plakada devam edin ya da A1 kuyusuna dönüp tüm striatum kesitlenene kadar devam edin (~3 tam 48 delik plaka). Plakaları şeffaf filmle mühürleyin ve 4 °C'de kullanana kadar saklayın.
      NOT: Tam striatum analizi için, plakadan bir sütun seçildiğinde, tüm bölgeyi temsil eden eşit aralıklı kesitler elde edilir.

5. DAB boyama ile immünohistokimya

  1. Bölgeleri PBS'de 3 kez yıkayarak kalan sodyum azidi çıkarın. Fenilhidrazin çözeltisinde (PBS içinde 0,2 - 0,3 mg/mL) 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe yapın.
    DIKKAT: Fenilhidrazin kanserojendir - bu adımı duman davlumbazında yapın ve atıkları tehlikeli olarak bertaraf edin.
  2. PBS'de 3 kez 5 dakika, 10 dakika, 10 dakika ardışık olarak yıka. Dokuyu RT'de 1 saat boyunca PBS ile bloklayın; PBS %10 normal keçi serumu (NGS) ve %0,1 Triton X-100 içerir.
  3. Gece boyunca 4 °C'de, önerilen seyreltme içinde primer antikor (örneğin, fare anti-ataksin-2, bloklayıcı çözeltide 1:1000) hafif çalkalama altında inkübe yapın. PBS'de 3 kez 5 dakika, 10 dakika, 10 dakika ardışık olarak yıka.
  4. Biyotinillenmiş ikincil antikor (blok çözeltisinde 1:200) ile RT'de hafif çaltlama altında 2 saat kuluçka yapın. PBS'de 3 kez 5 dakika, 10 dakika, 10 dakika ardışık olarak yıka.
  5. ABC kompleksinde RT'de 30–40 dakika kuluçka yapın. PBS'de 3 kez 5 dakika, 10 dakika, 10 dakika ardışık olarak yıkayın.
  6. DAB çözelyesini taze hazırlayın: 2.5 mL ultrasaf su için, 1 damla tampon ve vortex ekleyin; 2 damla DAB ve vortex ekleyin; 1 damla H₂O₂ ekleyin ve tekrar vortex yapın.
    DIKKAT: DAB kanserojendir - buhar kapasonu içinde kullanın ve atıkları düzgünce atın.
  7. DAB çözeltisinde bölümleri bireysel olarak geliştirin, ta ki istenen boyama yoğunluğuna ulaşana kadar (genellikle 1–10 dakika). Tepkiyi hemen PBS'ye aktararak durdurun.
    NOT: DAB tepkisi zamanla azalır; verimli çalış. Aynı anda birden fazla bölüm kuyuda varsa, onların temas etmediğinden emin olun, çünkü bu lekelenme sürecini etkiler.
  8. PBS'de 3 kez 5 dakika, 10 dakika, 10 dakika ardışık olarak yıka. Bölümleri jelatin kaplı slaytlara monte edin ve tamamen kurumasına izin verin. Slaytları grafit kalemle etiketlemeyin, çünkü görüntülemeyi engelleyebilir.
  9. Susuz kurut, berrak ve örtülü sürüşme işlemi şu şekilde: 30 saniye damıtılmış suya batırın, etanol serileriyle kurutun: %75, %96, %100 (her biri 3 dakika). Ksilen ikamesi ile 5 dakika berrak yapın ve havada kurutulun. Coverslip'i hızlı sertleştiren montaj ortamı ile uygulayın ve görüntüleme veya saklamadan önce en az 24 saat duman kapağının içinde kürtülmesine izin verin.

6. FIJI kullanılarak fare striatumunda DARPP-32 azalmış hacmin nicelendirilmesi (ImageJ)

  1. Görüntü edinimi
    1. Tüm striatum boyunca koronal beyin kesitlerinin görüntülerini yakalayın (yaklaşık Bregma +1,0 ila –0,5 mm). Tutarlı aydınlatma, büyütme (örneğin, 10x) ve çözünürlük korun. Görüntüleri TIFF formatında ardışık dosya adlarıyla kaydedin (örneğin, Striatum_Bregma_+0.5.tif).
  2. FIJI'de görüntü hazırlığı
    1. FIJI'de her görseli açın. Piksel boyutunu kalibre edin: Analiz > Ölçeği Ayarlayın. Bir mikrometreden veya görüntü meta verilerinden bilinen bir ölçek kullanın (örneğin, 1 piksel = 1 μm).
    2. Görüntüleri 8-bit'e dönüştürün: Görüntü > Tip > 8-bit. Tükenmiş alanın en iyi görselleştirilmesi için gerekirse parlaklık/kontrast ayarlayın (bu adımda eşik yapmadan kaçının).
  3. Tükenmiş alanların ROI seçimi
    1. Polygon, Freehand veya Brush araçlarını kullanarak DARPP-32 ile azalmış bölgeyi (genellikle striatumda daha açık veya lekelenme olmayan) çizebilirsiniz. Alanıμm 2 cinsinden kaydetmek için Analyze > Measure sayfasına gidin.
    2. ROI Yöneticisine > Daha >Fazla Ekle > KaydEtme veya Toplu Analiz için Multi-Measure fonksiyonunu kullanarak ROI Yöneticisine giderek ROI'yi kaydedebilirsiniz.
    3. Tüm ilgili beyin bölümleri için tekrarlayın.
  4. Azalmış hacmin hesaplanması
    1. Her bölümdeki azalmış alanı, bölümler arasındaki mesafeyle çarpın (genellikle kesit kalınlığı ve aralığına bağlı olarak 120 – 240 μm).
      Kesit başına hacim (mm3) = Azalmış alan (mm2) × Kesit aralığı (mm)
    2. Tüm bölümler boyunca hacim toplam:
      Toplam azalmış hacim (mm3) = Σ (alan × aralığı)
    3. İsteğe bağlı: Görselleştirme için üst üste binme. Bölümler arasında tükenmiş bölgeleri görselleştirmek için Image > Overlay > From ROI kullanın. Figürler için özet bir görüntü veya animasyon dışa aktarın.
  5. Doğru rostro-kaudal eşleme için her zaman fare beyni atlası ile hizalanmayı kontrol edin. Her yarımküreyi ayrı ayrı analiz ederek tek taraflı etkileri ayırt edin (örneğin, WT ve mutant enjeksiyon).

7. Fare striatumunda protein agregalarının nicelendirilmesi

  1. FIJI kullanılarak manuel nicelik
    1. Görüntüyü yükleyin ve kalibre edin. FIJI'de görseli açın. Piksel boyutunu kalibre edin (meta veri içeren görüntüler kullanıyorsanız bu adımı atlayın).
    2. Analiz > Set Scale'e gidin, bilinen mesafeyi girin (örneğin, 1 piksel = 0,5 μm). FIJI'de Eklentiler > Hücre Sayacı > Hücre Sayacı > Analiz Et. Başlat'a tıklayın, ardından görseli seçin.
    3. Agregalar için bir işaretleyici tipi (örneğin, Tip 1) seçin. Her görünür agrega manuel olarak tıklayarak etiketleyin. Kayıt Verileri: FIJI, sayıyı Hücre Sayacı panelinde gösterecektir. Her görsel/bölüm için kayıt sayıları. Hesapları elle dışa aktarın veya sonuçları derlemek için bir makro kullanın.
  2. IHCAggreCount kullanılarak yarı otomatik nicelik
    1. Görüntüleri yükleyin ve işleyin. IHCAggreCount'u açın ve Upload Image'e tıklayın (Ek Şekil 1).
      NOT: IHCAggreCount uygulaması, laboratuvarımız tarafından mikroskopik görüntülerden hücre agregalarının nicelendirilmesini kolaylaştırmak ve standartlaştırmak amacıyla bağımsız bilimsel bir araç olarak geliştirilmiştir. Yazılım, görüntü işleme, işleme, seçim düzeltmeleri, ölçüm hesaplamaları ve diğerlerini ayıran modüler bir mimari kullanarak tamamen Python ile oluşturulmuştur. IHCAggreCount, Windows 10 ve Windows 11 ile birlikte macOS 13 Ventura ve macOS 14 Sonoma ile tam uyumludur ve her iki platformda da başarıyla test edilmiştir. Geleneksel manuel görüntü inceleme yöntemlerine kıyasla, yazılım önemli analitik avantajlar sağlar: kullanıcı öznelliğini azaltır, tekrarlayan manuel adımları ortadan kaldırır, görüntü işlemeyi hızlandırır, tekrarlanabilir ölçümler sağlar, tutarlı ilgi alanı çıkarımı sağlar ve birden fazla ortamın toplu işlemesini sağlar. Genel olarak, uygulama küresel tespit ve nicelik için geleneksel manuel yaklaşıma kıyasla daha hızlı, daha objektif ve daha sağlam bir iş akışı sunar. Başvuru, makul talep üzerine yazarlardan temin edilebilir.
    2. Görüntü, Orijinal Görüntü Ekranında görünecektir. İşleme sekmesine gidin. HiLo'yu kullanarak agregaları/arka plan kontrastını artırın (bkz. Ek Şekil 2). Arka plandan agregaları filtrelemek için bir parlaklık eşiği uygulanır (Ek Şekil 3). Küçük parçacıkları (gürültü) çıkarmak için Minimum Boyutlu Filtreyi kullanın (Ek Şekil 4). Isteğe bağlı olarak, toplamsal olmayan şekilleri hariç tutmak için Yuvarlaklık Eşiği uygulanabilir (Ek Şekil 5).
    3. IHC agregat tespiti için Genel sekmesine gidin ve Toplam Agregaları Hesapla ile Toplam Alanı Hesapla'yı tıklayın. Tespit edilen tüm agregalar Matrix Tablosu'nda vurgulanıp listelenmiştir (ID, alan, ortalama boyut; Ek Şekil 6).
  3. Manuel düzeltmeler (isteğe bağlı)
    1. Düzeltme sekmesine gidin, Smart Add ile seçilen bölgelerde agregaları otomatik olarak tespit edin (Ek Şekil 8). Agregaları manuel olarak etiketlemek için manuel ekleme kullanın. İstenmeyen etiketleri kaldırmak için Smart Delete kullanın. (Vurgulanmış agregalar görsel inceleme için gösterilir; Ek Şekil 7).
  4. Sonuçların ihracatı
    1. Mevcut görüntü verilerini dışa aktarmak için Export CSV'ye tıklayın. Birden fazla analiz edilen görselden toplu olarak aktarılan veriler için Hepsini Dışa Aktar'a tıklayın. IHCAggreCount'da deneysel gruplar arasında aynı parlaklık/kontrast ayarları ve diğer parametreler (örneğin, eşik noktası) altında görüntüleri her zaman analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışma, mevcut protokol kullanılarak ataksin-2 ve DARPP-32'nin ekspresyonunu başarıyla tanımlamıştır. C57BL/6J farelerinin striatumuna lentiviral vektörlerin stereotaksik enjekte edilmesinin ardından, 12 hafta sonra hem vahşi tip hem de mutant ataksin-2'nin sağlam ekspresyonu tespit edildi. Daha önce12'sine bu yapıların nöronlara özgü olduğunu göstermiştik ve ortalama 20.000 nöron birimi 3 üzerinden etkili şekilde aktardık. Deneysel koşulla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makale, polyQ SCA için striatal lentiviral fare modelinin oluşturulmasını açıklamaktadır. Ayrıca, neden olan proteinin vahşi tip ve genişlemiş formunu kodlayan yüksek titrli lentiviral vektörlerin üretimini ve stereotaksik cerrahiyle LV'lerin fare striatumuna iki taraflı enjekte edilmesini de tanımlar. Ayrıca, beyin toplama işlemini, histolojik işlemeyi ve hastalık özelliklerinin görüntü tabanlı nicelendirilmesini tanımlar. Bu yöntemler birlikte, striatumda protein agregasyon...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

Clévio Nóbrega'nın laboratuvarı, Cure CSB projesi, Slovenya'daki Viljem Julijan Nadir Hastalıklı Çocuklar Derneği ve Algarve Biyomedikal Merkezi Araştırma Enstitüsü (ABC-Ri) tarafından finanse edilmektedir. Bu makalenin bazı yazarları, Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) tarafından finanse edilen bir doktora bursuna sahiptir ve aşağıdaki referanslarla şunlardır: Tiago Moreira-Gomes (2022.11008.BD), Inês T Afonso (2022.10161.BD) ve Rafael G Costa (2022). 11973.BD).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.9% NaClYerel tedarikçi—Anestezi ve antagonist karışımlarının hazırlanmasında kullanılır
100 mm doku kültürü plakalarıSPL Life Sciences11090
ABC kiti (Avidin-Biyotin Kompleksi)VECTASTAIN Elite
Atipamezole (5.0 mg/mL)Yerel tedarikçi—Medetomidin antagonisti
Tezgah üstü santrifüj--
Sınıf II Biyogüvenlik kabini (BSL-2 uyumlu)--
Biyotinleştirilmiş ikincil antikor--
Bovin Serum Albumini (BSA)NZYTechMB47002
DARPP-32 için immünoboyanmış beyin kesitleri (örn., 30–40 µm koronal kesitler)--
Hücre Sayacı eklentisi (FIJI)Dahili / ImageJ—Manuel agrega sayımı için araç
CO2 inkübatörü (37 °C, 5% CO2, nemli)--
Bilgisayar iş istasyonuYerel tedarikçi—Görüntü işleme ve yazılım yürütme için kullanılır
Konik ultrasantrifüj tüpleriBeckman Coulter358126
Pamuk çubuklarYerel tedarikçi—Periostun çıkarılmasında kullanılır
Numune disk tutacağı olan kriyostate--
DAB (Diaminobenzidin)--
Dijital stereotaktik koordinat okuyucuStoelting/WPI51725Koordinat ölçümü için dijital ekran
Dulbecco'nun Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM, yüksek glikoz)Gibco/Thermo Fisher11-965-092
Etanol 70, 96 ve 100%--
Etanol, %70Yerel tedarikçi—Saç derisi dezenfeksiyonu için
Fentanil (0.05 mg/mL)Yerel tedarikçi—Anestezik bileşen
Fetal Bovin Serum (FBS), ısıl inaktiveGibco/Thermo Fisher10500064
FIJI (ImageJ dağıtımı)NIH / ImageJhttps://fiji.sc/Agregaların manuel kantifikasyonu için açık kaynaklı yazılım
İnce forseps (parmak sıkıştırma için)Yerel tedarikçi—Anestezi derinliği izleme için
Flumazenil (0.1 mg/mL)Yerel tedarikçi—Midazolam antagonisti
Forseps ve skalpelYerel tedarikçi—Periostun çıkarılması ve kafatası açılması için
Hamilton 700/1700 Serisi Mikrolitre/Gastight ŞırıngalarHamilton / Fisher Sci.7653-01/10550203Viral çözelti yüklemesi için
Hamilton Küçük Göbek Çıkarılabilir İğneler (26G)Hamilton / Fisher Sci.7804-03/ 10698205Viral teslimat için
Isıtma yastığı (kemirgenler için)Kent Scientific / SOMNIör. 04-777-177Vücut ısısının korunması için
HEK 293T hücreleri (≤ geçiş 10, mikoplazmasız)ATCC veya eşdeğeriCRL-3216
Hidrojen peroksit--
IHCAggreCount yazılımıTalep üzerine sağlanırN/AYarı otomatik agrega tespiti ve kantifikasyonu için tescilli şirket içi yazılım
Çevirmeli mikroskop (hücre yoğunluğu için)--
Laboratuvar vortex karıştırıcısı--
Lentiviral vektörler (WT ve mutant)Şirket içi / Temel tesisN/AEnjeksiyon için viral çözelti
L-glutamin (200 mM)Gibco/Thermo Fisher25030081
Kameralı ışık mikroskop (brightfield)--
Medetomidin (1.0 mg/mL)Yerel tedarikçi—Anestezik bileşen
Mikro delici (stereotaktik uyumlu)Stoelting / Yerel tedarikçi—Kraniotomi için
Mikroenjeksiyon pompası (örn., Stoelting)Stoelting/WPI53210Viral enjeksiyonlar için otomatik infüzyon pompası
Mikropipet (P1000, P200, P10) ve uçlar--
Mikroskop görüntüleri (IHC kesitleri)Şirket içi üretilirN/AAnaliz edilecek immünohistokimya görüntüleri
Mikrotom bıçakları (düşük profil, tek kullanımlık)--
Midazolam (5.0 mg/mL)Yerel tedarikçi—Anestezik bileşen
Montaj ortamı--
Nalokson (0.4 mg/mL)Yerel tedarikçi—Fentanil antagonisti
İğne tutucu ve ince diseksiyon iğneleri--
Normal Keçi Serumu (NGS)--
O.C.T. bileşiğiTissue-Tek
Oftalmik merhem (Bepanthen Göz ve Burun Merhemi, %5 Dekspantenol)Bayer11568-0053Ameliyat sırasında kornea kurumasını önler
Orbital karıştırıcı--
p24 ELISA kitiZ

Kaynaklar

  1. Afonso-Reis, R., Afonso, I. T., Nóbrega, C. Current Status of Gene Therapy Research in Polyglutamine Spinocerebellar Ataxias. Int J Mol Sci. 22 (8), 4249(2021).
  2. Durr, A. Autosomal dominant cerebellar ataxias: polyglutamine expansions and beyond. Lancet Neurol. 9 (9), 885-894 (2010).
  3. McIntosh, C. S., Li, D., Wilton, S. D., Aung-Htut, M. T. Polyglutamine Ataxias: Our Current Molecular Understanding and What the Future Holds for Antisense Therapies. Biomedicines. 9 (11), 1499(2021).
  4. Henriques, C., et al. Viral-based animal models in polyglutamine disorders. Brain. 147 (4), 1166-1189 (2024).
  5. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The Construction of Transgenic and Gene Knockout/Knockin Mouse Models of Human Disease. Transg Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  6. Tello, J. A., Williams, H. E., Eppler, R. M., Steinhilb, M. L., Khanna, M. Animal Models of Neurodegenerative Disease: Recent Advances in Fly Highlight Innovative Approaches to Drug Discovery. Front Mol Neurosci. 15, 883358(2022).
  7. Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. Development of a gene therapy with lentiviral vectors for spinocerebellar ataxias. Methods Mol Biol. 2974, 215-225 (2026).
  8. Parr-Brownlie, L. C., et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 8, 14(2015).
  9. Zwi-Dantsis, L., Mohamed, S., Massaro, G., Moeendarbary, E. Adeno-Associated Virus Vectors: Principles, Practices, and Prospects in Gene Therapy. Viruses. 17 (2), 239(2025).
  10. Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. From the disruption of RNA metabolism to the targeting of RNA-binding proteins: The case of polyglutamine spinocerebellar ataxias. J Neurochem. 168 (8), 1442-1459 (2024).
  11. Matsuzaki, Y., Oue, M., Hirai, H. Generation of a neurodegenerative disease mouse model using lentiviral vectors carrying an enhanced synapsin I promoter. J Neurosci Meth. 223, 133-143 (2014).
  12. Marcelo, A., et al. Autophagy in Spinocerebellar ataxia type 2, a dysregulated pathway, and a target for therapy. Cell Death Dis. 12 (12), 1117(2021).
  13. Alves, S., et al. Striatal and nigral pathology in a lentiviral rat model of Machado-Joseph disease. Human Mol Genet. 17 (14), 2071-2083 (2008).
  14. Alves, S., et al. Lentiviral vector-mediated overexpression of mutant ataxin-7 recapitulates SCA7 pathology and promotes accumulation of the FUS/TLS and MBNL1 RNA-binding proteins. Mol Neurodegenerat. 11 (1), 58(2016).
  15. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6 (1), 34(2006).
  16. Arrasate, A., et al. Establishment and Characterization of a Stable Producer Cell Line Generation Platform for the Manufacturing of Clinical-Grade Lentiviral Vectors. Biomedicines. 12 (10), 2265(2024).
  17. Nóbrega, C., et al. Overexpression of Mutant Ataxin-3 in Mouse Cerebellum Induces Ataxia and Cerebellar Neuropathology. Cerebellum. 12 (4), 441-455 (2013).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Compact Second Edition, Gulf Professional Publishing. (2004).
  19. Bateup, H. S., et al. Distinct subclasses of medium spiny neurons differentially regulate striatal motor behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14845-14850 (2010).
  20. Nóbrega, C., et al. Molecular hallmarks of neurodegeneration in polyglutamine spinocerebellar ataxias. Cell Death Dis. 16 (1), 826(2025).
  21. Murakami, Y., et al. AAV-based gene therapy ameliorated CNS-specific GPI defect in mouse models. Mol Ther Meth Clin Dev. 32 (1), 101176(2024).
  22. Wada, H., et al. AAV-based gene therapy ameliorates neurological deficits in a mouse model of childhood-onset neurodegeneration with cerebellar atrophy. Mol Ther J Am Soc Gene Ther. 33 (11), 5829-5839 (2025).
  23. Konno, A., Shinohara, Y., Hirai, H. Production of Spinocerebellar Ataxia Type 3 Model Mice by Intravenous Injection of AAV-PHP.B Vectors. Int J Mol Sci. 25 (13), 7205(2024).
  24. Jansen-West, K., et al. Plasma PolyQ-ATXN3 Levels Associate With Cerebellar Degeneration and Behavioral Abnormalities in a New AAV-Based SCA3 Mouse Model. Front Cell Dev Biol. 10, 863089(2022).
  25. Nóbrega, C., Mendonça, L., Matos, C. A. A Handbook of Gene and Cell Therapy. , Springer International Publishing. Cham. (2020).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Ther. 24 (2), 132-142 (2013).
  28. de Almeida, L. P., Ross, C. A., Zala, D., Aebischer, P., Déglon, N. Lentiviral-Mediated Delivery of Mutant Huntingtin in the Striatum of Rats Induces a Selective Neuropathology Modulated by Polyglutamine Repeat Size, Huntingtin Expression Levels, and Protein Length. J Neurosci. 22 (9), 3473-3483 (2002).
  29. Fisher, E. M. C., Bannerman, D. M. Mouse models of neurodegeneration: Know your question, know your mouse. Sci Transl Med. 11 (493), eaaq1818(2019).
  30. Bii, V. M., Collins, C. P., Hocum, J. D., Trobridge, G. D. Replication-incompetent gammaretroviral and lentiviral vector-based insertional mutagenesis screens identify prostate cancer progression genes. Oncotarget. 9 (21), 15451-15463 (2018).
  31. Alves-Cruzeiro, J. M. D. C., Mendonça, L., Pereira de Almeida, L., Nóbrega, C. Motor Dysfunctions and Neuropathology in Mouse Models of Spinocerebellar Ataxia Type 2: A Comprehensive Review. Front Neurosci. 10, 572(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Poliglutamin AtaksileriLentiviral ModelStereotaksik EnjeksiyonAtaksin 2 EkspresyonuN ronal nkl zyonlarN rodejenerasyon MekanizmalarTerap tik M dahalelerN ronal Mark r KaybB lgeye zg Modeller
Poliglutamin spinoserebellar ataksiyaların preklinik modeli olarak lentiviral indüksiyonlu striatal patoloji
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.