Method Article

Trombus Profilleme Testi: Biyomekanik Trombogenezin Kapsamlı Karakterizasyonu İçin Mikrofluidik Tabanlı Bir Platform

DOI:

10.3791/69555

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Department of Pathology, University of Texas Medical Branch

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, kanda trombus oluşumunu tetiklemek için kesme stresi kullanan ve trombü birden fazla boyutlu okuma ile karakterize eden bir mikrofluidik testi tanımlar. Bu test, kan örneklerinin protrombotik eğilimini ölçebilir ve bu nedenle hastalık teşhisi, ilaç keşfi ve trombozla ilgili temel mekanik çalışmalarda faydalıdır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tromboz, bir kan damarında trombositlerin ve pıhtı faktörlerinin anormal şekilde birikmesini belirten patolojik bir durumdur. Birçok çalışma, trombozun temel mekanizması olarak çözünür agonistlerin trombosit aktivasyonuna odaklansa da, kan akışının trombus oluşumunu da kolaylaştırdığı sıklıkla göz ardı edilmiştir. Özellikle arterlerde tromboz genellikle arterial stenozla ilişkilidir; bu da kan akışındaki kesme stresini artırır ve biyomekanik trombogenez olarak adlandırılan trombogenez sürecini kolaylaştırır. Uzun süre boyunca, biyomekanik trombogenez sürecine dair kapsamlı ve ayrıntılı bilgiler sunacak bir biyoanaliz mevcut değildi. Bunu çözmek için, mikrofluidikler ile çok renkli floresan görüntüleme birleştirilerek bir trombus profilleme testi geliştirilmiştir; bu test, trombüsün boyutu ve bileşimi ile trombosit aktivasyon seviyesini kapsayan yedi okuma ile biyomekanik trombogenezin kapsamlı karakterizasyonunu sağlar. Bu trombos profilleme testi, insanlardaki protrombotik eğilimi ve anti-trombotik ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir ve arterial trombozun altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması için de faydalıdır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tromboz, her yıl dünya çapında milyonlarca ölümden sorumlu olan kardiyovasküler hastalıkların başlıcanedenidir. 1. Şu anda, tromboz risklerinin değerlendirilmesi için standart klinik ortamlarda biyoanaliz mevcut değildir. Ticarileştirilmiş laboratuvar ve tedavi noktası hematolojik fonksiyon testleri arasında, geleneksel koagulasyon testleri ve agregometri, tromboz veya büyük yan kardiyovasküler olayları tahmin etmede güvenilir olmadığıkanıtlanmış 2,3,4. Küresel tromboztesti 5, PFA-100/2006 ve küresel koagülasyontestleri 7,8,9,10,11 de performanslarını destekleyen sınırlı verilere sahiptir.

Mevcut anlayışa göre, trombogenez sürecine esas olarak üç mekanizma katkı sağlamaktadır. Geleneksel olarak kabul edilen iki mekanizmanın yanı sıra, biyokimyasal trombosit agregasyonu ve pıhtılaşmanın yanı sıra, az incelenen ve sıklıkla az tahmin edilen üçüncü bir mekanizm ise kesme kaynaklı trombosit agregasyonudur; bu mekanizma aynı zamanda "biyomekanik trombosit agregasyonu" olarak da adlandırılmıştır. Biyomekanik trombosit agregasyonunda, yüksek kesme gerilimi ve kesme gradyan, GPIbα-von Willebrand faktörü (VWF), integrin αIIbβ3-VWF ve integrin αIIbβ3-fibrinojen etkileşimleri aracılığıyla trombosit çapraz bağlanmanın ana sürücüsü olarak hizmet eder. Arteriyel trombozda, biyomekanik trombosit agregasyonu muhtemelen en temel mekanizma olarak hizmet eder; çünkü arterial stenozun neden olduğu yüksek kayma akışıyla büyük ölçüde güçlendirilmiştir. Bu nedenle, biyomekanik trombosit agregasyonuyla yönlendirilen trombogeneze 'biyomekanik trombogenez'12,14 denmiştir.

Önceki çalışmalarda, biyomekanik trombosit agregasyonunu deneysel olarak gözlemlemek için yaygın bir yöntem, şiddetli stenozun düz bir kanala gömüldüğü mikrofluidik stenoz testidir. Kan, kanal üzerinden fizyolojik bir duvar kesme stresi altında perfüzye edildiğinde, stenotik bölge etrafında patolojik olarak yüksek kayma stresi oluşur ve bu da trombositlerin birikmesini tetikleyerek bir trombus oluşturur. Ancak önceki çalışmalarda yalnızca bir (trombositler için, tromb boyutunu yansıtan) 15,16,17,18,19 veya en fazla iki (biri trombositler için, diğeri başka bir biyobelirteç için) 13,20 gösterisi kullanılmıştır; bu da trombüsün kapsamlı karakterizasyonunu sağlayamıyor.

Mikrofluidik stenoz testinde çok renkli floresan görüntülemeyi içeren ve 7 biyobelirtecin (trombositler, fibrinojen seviyesi, von Willebrand faktör seviyesi, P-selektin ekspresyon seviyesi, fosfatidilserin maruziyeti seviyesi, genişletilmiş integrin α IIbβ3 ekspresyon seviyesi, tam aktif integrin αIIb β 3) gerçek zamanlı takibi elde edilen bir trombus profilleme testi geliştirilmiştir bir trombusta ifade seviyesi) ile tanımlanır; bu da biyomekaniktrombogenezin 21'i kapsamlı şekilde karakterize edilmesinin temelini oluşturur. Bu çalışmada, trombus profilleme testinin hazırlanması ve performansı ile ilgili veri analizi hakkında ayrıntılı protokoller sunulmaktadır. Analiz için gereken donanım, ters çok renkli floresan mikroskop ve mikrofluidik sistem içerir. Test, nispeten az miktarda insan tam kanı (2 mL'den az) kullanır, yüksek maliyet etkinliğine sahiptir (örnek başına ~$12) ve sonuçları 30 dakika içinde elde eder. Test, bireylerin çok boyutlu protrombotik anormalliklerini doğru şekilde tespit edebilir ve anti-trombotik ajanların trombüsün boyutunu, bileşimini ve trombosit aktivasyon durumunu değiştirmedeki etkilerini değerlendirebilir; böylece gelecekte hem araştırma hem de klinik amaçlar için geniş çapta uygulanmasınıdestekliyor 21. Testin taze toplanan heparinli kan kullanılması dikkat çekicidir. Kanı 4 °C'de veya 6 saatten fazla saklamak veya heparin dışında antikoagülantlar kullanmak trombüsün oluşmasını engeller veya yanlış sonuçlar verebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi İnsan Araştırmaları Etik Komitesi'nin yönergelerini takip etmekte ve onaylanmıştır. Deneysel donanım sistemi, mikrofluidik cihaz, perfüzyon bileşenleri (konnektörler, borular, şırınge ve şırınge pompası) ve parlak alan ile çok renkli floresans görüntüleme imkanı sağlayan optik bileşenlere sahip ters bir mikroskoptan oluşur. Mikroskopta, 4 floresan kanalı en az karşılıklı kanama ile ayırmak için çok LED ışık ve çoklu geçişli filtre küpü kullanılır: uyarılma: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31 ve emisyon: 435/30, 519/25, 594/32, 695/58. Tüm deneysel işlemler için eldiven, göz koruma ve laboratuvar ceketi dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giyin. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Mikrofluidik cihaz hazırlığı

  1. %80 ışık daralması alanı içeren dikdörtgen kanallar (200 μm genişliğinde × 50 μm yüksekliğinde) bir ana kalıp tasarlayın. Her kanalın boru bağlantıları için özel giriş ve çıkışları vardır (Şekil 1; orijinal tasarım dosyası için Ek Dosya 1'e bakınız).
  2. Tasarıma dayanarak , standart fotolitografi ile SU-8 fotorezist ana kalıbı üretmek için silikon wafer kullanılır. Kalıpı 15 cm'lik bir Petri kabının dibine bantlayın (Şekil 2A).
  3. PDMS karışımını, silikon elastomer kitinde prepolimer baz ve kürleme maddesini 10:1 ağırlık oranında karıştırarak hazırlayın. Karışımı ana kalıbın üzerine dökün (Şekil 2B).
  4. PDMS karışımını içeren plakayı gaz çıkarmak ve hapsolan hava kabarcıklarını temizlemek için vakum kurutucuya yerleştirin.
    NOT: Plakayı kabarcıklar tamamen temizlenene kadar en az 2 saat vakum altında tutun.
  5. PDMS karışımını 75 °C'de 2 saat kuluçka geçirerek termal olarak kürleyin.
  6. Ana kalıptan (Şekil 2C,D) kürlenmiş PDMS'yi dikkatlice kesin ve ayrı çip birimlerine ayırın.
  7. Giriş ve çıkışı, belirlenen yerlerde bir prob iğnesi kullanarak delikler açarak oluşturun (Şekil 2E).
    NOT: Delikli deliklerden kalan kalıntıları temizlemek için bir basınçlı hava tozlayıcı kullanın. Yüzey kirliliğini en aza indirmek için, PDMS cihazlarını yapıştırmadan önce yapıştırıcı kapatma bandı ile temizleyin.
  8. Kimyasal bir başlıkta, bir görev mendiline %75 etanol püskürtün ve ıslak görev mendiliyle cam sürgüleri silip temizleyin. Cam sürgüleri kurumaya bırakın.
  9. Kimyasal bir başlıkta, cam kaydırakları ve PDMS çiplerini sırasıyla 30 saniye ve 20 saniye yüksek frekanslı jeneratörle işlendirin ve ardından her çipi cam sürgü ile hizalamalısınız. Çipi cam kaydırma yüzeyine nazikçe bastırarak bağlanabilir.
    NOT: Bu adım, yüksek frekanslı jeneratör kullanım sırasında ozon üretir ve bu da sağlığa zararlıdır, kimyasal bir başlıkta yapılmalıdır.
  10. Cihazları 150 °C'de 15 dakika boyunca kuluçka geçirerek termal olarak bağlayın. Soğuduktan sonra cihazlar kullanıma hazır olur (Şekil 2F).
  11. Cihazları oda sıcaklığında, tozsuz koşullarda sakla.
  12. Prob iğnelerinin plastik kısmını çıkarmak için bir pençe kullanın ve metal tüpleri 90°'ye doğru bükürün. Bu bükülmüş tüpler mikrofluidik cihazlar için konnektör olarak kullanılacak.

2. Floresan sensör hazırlığı

NOT: Deney toplamda 7 floresan sensör kullanır: SZ22-FITC, fibrinogen-Alexa Fluor 405, 2.2.9-Alexa Fluor 555, AK4-Alexa Fluor 647, Annexin V-Pacific Blue, MBC 370.2-Alexa Fluor 555, PAC-1-Alexa Fluor 647. Bunlar arasında fibrinojen, 2.2.9 ve MBC 370.2 yalnızca ticari olarak konjuge olmayan formda bulunabilir ve laboratuvarda floresan konjuge edilmesi gerekir.

  1. Fibrinogenin Alexa Fluor 405 ile konjugasyonu yapmak için:
    1. Taze bir 0.1 M sodyum bikarbonat tamponu yap, pH 8.5.
    2. Fibrinojen stokunu fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla 1 mg/mL'ye seyreldin (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO 4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4).
    3. Fibrinojen çözeltisine 1/10 hacim sodyum bikarbonat tamponu ekleyin.
    4. 1 mL fibrinojeni 1 mg Alexa Fluor 405 NHS-ester ile karıştırın ve oda sıcaklığında rotator üzerinde 1 saat kuluçka yapın. Işıktan korun.
    5. Depolama tamponunu bir arıtma kolonundan çıkararak kolonu 1.100 × g ile 2 dakika boyunca santrifüj edin ve akış kısmını atabilirsiniz. Reaksiyon çözeltisini kolona yükleyin, kolonu uyumlu bir toplama şişesine monte edin ve 1.100 × g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın, böylece fibrinojen-Alexa Fluor 405 hasat edilir.
    6. 280 nm (A280; protein sinyali) ve 405 nm (A 405; boya sinyali) dalga boyunda absorbansı ölçmek için spektrofotometre kullanın. Protein konsantrasyonu ve F/P oranını hesaplayın (floresans: protein mollar oranı).
      NOT: F/P oranı 8-10 aralığında olmalıdır.
    7. Fibrinogen-Alexa Fluor 405'i karanlıkta 4 °C'de sakla.
  2. 2.2.9 ve MBC 370.2 antikorlarını Alexa Fluor 555 ile birleştirmek için:
    1. Taze bir 0.1 M sodyum bikarbonat tamponu yap, pH 8.5.
    2. Antikor stokunu amin içermeyen tamponda 1 mg/mL'ye seyreltin.
    3. Antikor çözeltisine 1/10 hacim sodyum bikarbonat tamponu ekleyin.
    4. 100 μL antikoru 1 şişe (100 μg) Alexa Fluor 555 NHS-ester ile karıştırın ve rotator üzerinde oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın. Işıktan korun.
    5. Depolama tamponunu bir arıtma kolonundan çıkarın, kolonu 1.100 × g ile 2 dakika boyunca santrifüjle yapın ve akış atar. Reaksiyon çözeltisini kolona yükleyin, kolonu uyumlu bir toplama şişesine monte edin ve 1.100 × g sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın, böylece 2.2.9- veya MBC 370.2-Alexa Fluor 555 hasat edilir.
    6. 280 nm (A280; protein sinyali) ve 555 nm (A555; boya sinyali) dalga boyunda absorbansı ölçmek için spektrofotometre kullanın. Antikor konsantrasyonu ve F/P oranını hesaplayın (floresans: antikor molar oranı).
      NOT: F/P oranı 1-1.5 aralığında olmalıdır.
    7. 2.2.9- ve MBC 370.2-Alexa Fluor 555'i karanlıkta 4 °C'de depolayın.
      NOT: Aşırı etiketlemeden kaçının - yüksek F/P oranı biyolojik işlevi bozabilir.

3. İnsan deneklerden kan toplama

NOT: Bu işlem, nitelikli tıbbi personel (örneğin, lisanslı hemşireler, sertifikalı flebotomistler) tarafından yapılmalıdır. Ayrıca, çalışmaya katılan kişilerden yazılı bilgilendirilmiş onay alın.

  1. Şırınga, toplanacak 10 mL kanda 0,32 U/mL heparin içeren 500 μL Tyrode tamponu (12 mMNaHCO 3, 10 mM Hepes, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 5,5 mM D-Glikoz, %0,5 sığır serum albümini, pH 7,4) aspirasyon yoluyla hazırlanır.
  2. Venipunktur yoluyla kan toplayın. İlk 2 ml kanı atmak için boş bir şırınga kullanın. Sonra, kan örneği almak için heparin içeren şırıngaya geçin. Trombosit aktivasyonunu en aza indirmek için şırıngayı yavaşça çekin.
  3. Toplanan kanı 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve sıcaklığı 37 °C'nin altında tutun.
    NOT: Kan örnekleri, toplandıktan sonra 6 saat içinde deneyler için kullanılmalıdır.

4. Trombus profilleme testi

NOT: Deney uzmanında kan dökülmesinin önlenmesi için mümkün olduğunca biyogüvenlik dolabında kan işleme işlemlerinin yapılması önerilir. Eğer bu mümkün değilse, tezgah üstü bir sıçrama kalkanı kullanın.

  1. VWF monomerini PBS'de 2 μg/mL'ye kadar seyreltin. Mikrofluidik cihazları VWF monomeriyle önceden kaplamak ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçka için.
  2. Kan örneğini floresan sensör Set 1 veya 2 ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kuluçka yapın:
    1. Set 1: SZ22-FITC (0.5 μg/mL), fibrinogen-Alexa Fluor 405 (60 μg/mL), 2.2.9-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), AK4-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL).
    2. Set 2: SZ22-FITC (0.5 μg/mL), Annexin V-Pacific Blue (1 μg/mL), MBC 370.2-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), PAC-1-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL).
      NOT: İki sensör seti ayrı ayrı kullanılmak gerektiğinden, her kan örneği en az iki kez (bir kez sensör Seti 1 ile, bir kez sensör Seti 2 ile) test edilmek için tam bir veri seti elde edilmelidir.
  3. Giriş ve çıkış konnektörleri ile boru ile mikrofluidik cihazı bağlayın. Giriş konnektörünün diğer ucunu PBS içeren bir tüple, çıkış konnektörünün diğer ucunu ise bir şırıngala ile bağlayın. Şırıngayı bir şırınga pompasına takın. Mikrofluidik cihazı ters bir mikroskopa monte edin ve stepi manuel olarak yönlendirerek mikroskop altında stenoz yerini bulabilir (Şekil 3A).
  4. Mikrofluidik kanal ve boru şırınga pompası ile PBS ile 0,5 mL/dakika akış hızında doldurun. Stenoz bölgesinde hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
  5. Giriş borusunu kan örneğiyle bağlayın ve kan örneğini şırınga pompası ile mikrofluidik kanaldan 0,018 mL/dakika akış hızında perfüze edin (Şekil 3A).
  6. Her floresan kanalının pozlama süresini ve kazancını ayarlayın. Dört kanal arasında dönüşümlü olarak gerçek zamanlı çok renkli floresans görüntüleme yapın ve her bir florofor türü birer heyecanlandırın. Bu arada, trombüsün odak düzlemini bulun ve stenoz bölgesinde, genellikle 15-30 dakika süren sinyalleri kaydedin (Şekil 4).
    NOT: Her kanalın pozlama süresi, floresan sinyalin kolayca ayırt edilebilmesi ve doygunluğun önlenmesi için ayarlanmalıdır (Şekil 4). Mevcut sistemde, sağlıklı bireylerin kan örnekleri genellikle oluşan trombus içinde aşağıdaki sinyal yoğunluk aralığını gösterir: SZ22-FITC, 70-110; fibrinogen-Alexa Fluor 405, 60-100; 2.2.9-Alexa Fluor 555, 70-110; AK4-Alexa Fluor 647, 45-75; Annexin V-Pacific Blue, 35-65; MBC 370.2-Alexa Fluor 555, 45-85; PAC-1-Alexa Fluor 647, 10-30. Ancak dikkat çekici olan, sağlıklı katılımcıların küçük bir kısmı alışılmadık bir okuma veriyordu. Bu nedenle, her kanal için maruziyet süresinin doğru seçildiğinden emin olmak amacıyla en az 5 sağlıklı deneğin kan örneği test edilmesi önerilir.

5. Veri analizi

  1. Veri dosyasını ImageJ 1.53 ile açın (Fiji, Ulusal Sağlık Enstitüleri).
    NOT: Her dosyada 4 farklı kanaldan toplam 4 video bulunmalıdır. Aşağıdaki prosedür genellikle kullanıcının analiz etmek istediği herhangi bir zaman noktası için geçerlidir.
  2. Trombüsün konturunu belirlemek için SZ22-FITC kanalını kullanın ve trombüsün alanını yaklaşık olarak belirlemek için 'Çokgen seçimleri' kullanın (Şekil 5A,B).
  3. Her kanal için, arka planı ortadan kaldırmak için Image -> Adjust -> Threshold (Şekil 5C) kullanın, ardından trombus içindeki sinyalin alanını ve ortalama yoğunluğunu ölçmek için Analyze -> Measure kullanın.
    NOT: SZ22-FITC trombositleri boyalar ve böylece tromb boyutunu yansıtır. Set 1'de, fibrinogen-Alexa Fluor 405 fibrinojen zenginleştirme seviyesini, 2.2.9-Alexa Fluor 555 von Willebrand faktörü (VWF) zenginleştirme seviyesini ve AK4-Alexa Fluor 647 P-seçim ekspresyonunu yansıtır. Set 2'de, Annexin V-Pacific Mavisi fosfatidilserin (PS) maruziyetini yansıtır, MBC 370.2-Alexa Fluor 555 integrin αIIbβ3 aktivasyonunu genişletilmiş konformasyona (E+ αIIbβ3) yansıtır ve PAC-1-Alexa Fluor 647 integrin αIIbβ3 tam aktivasyonunu yansıtır (Act. αIIbβ3)21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombus profilleme testi, kanı stenotik kanaldan perfüze ederek kesme kaynaklı trombus oluşumunu sağlar ve oluşan trombus hakkında çok boyutlu bilgi toplamak için gerçek zamanlı çok renkli floresan görüntüleme yapar. Hem Set 1 hem de Set 2 sensörleri kullanılarak yapılan deneyler, trombü boyut, çapraz bağlama proteinlerinin zenginlenmesi (von Willebrand faktörü, fibrinogen) ve trombosit aktivasyon seviyesi (P-seçilme ekspresyonu, PS maruziyeti ve integrin αIIbβ3 akt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrofluidik stenoz testini çok renkli floresan görüntüleme ile birleştirerek, trombus profilleme testi biyomekanik trombogenez ve trombosit mekanobiyolojisini incelemek için kullanışlı ve güçlü bir yaklaşım sunar. Bu arada, test çok çeşitli uygulamalarda faydalıdır. Örneğin, moleküler hedef ve etki mekanizmasının etki barkodu21'den çıkarılabildiği biyomekanik trombosit toplanması özellikle inhibe eden anti-trombotik ajanların ekranında kullanılabilir. Ayrıca, bel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makaleyle ilgili araştırmalar ve Chen laboratuvarında trombus profilleme testinin geliştirilmesi, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibe R00HL153678 (Y.C.), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü, Claude D. Pepper Yaşlı Amerikalılar Bağımsızlık Merkezi Ödülü #P30-AG024832 (Y.C.), UTMB Takım Bilim Pilot Araştırma Ödülü (Y.C.), Amerikan Kalp Derneği Doktora Sonrası Bursu 20POST35080023 (Y.C.) tarafından desteklendi, ve Amerikan Kalp Derneği Dönüşüm Projesi Ödülü 25TPA1471420 (Y.C.). Bu çalışma, kısmen Ulusal Bilim Vakfı (Grant ECCS-2025752) tarafından desteklenen Ulusal Nanoteknoloji Koordineli Altyapısı'nın bir üyesi olan UCSD'nin San Diego Nanoteknoloji Altyapısı'nda (SDNI) gerçekleştirilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL ŞırıngalarHenke Sasss Kurt5100-X00V0Kan örneği toplama
15 mL şahin tüpleriGenesee Scientific28-101Kan örneği depolama
1 mL gaz geçirmez cam şırıngaHamilton81331Donanım montajı
2.2.9MERU VasImmuneTromb boyama
20 X1/2 Prob İğneleriMcMaster-CarrM919PDMS cihazlarının üretimi
20-mL ŞırıngalarHenke Sasss Kurt5200-X00V0Kan örneği toplama
%70 etanolSigma-AldrichEX0281-1Gaz geçirmez şırıngaların dezenfekte edilmesi ve cam sürgülerin temizlenmesi
AK4-Alexa Fluor 647BioLegend304918Tromb boyama
Alexa Fluor 405 NHS EsterInvitrogenA30000Fibrinojen etiketleme
Alexa fluor 555 antikor etiketleme kitiInvitrogenA88065MBC 370.2 ve 2.2.9 etiketleme
Annexin V-Pacific BlueInvitrogen501121505Tromb boyama
Temizlik TozuOfis Deposu911245PDMS cihazlarının üretimi
Ahşap Kutulu El Işi Hobi Bıçağı SetiExcel Blades44282PDMS cihazlarının üretimi
Deionize su ThermoFisher Scientific 751-628Gaz geçirmez şırıngaların yıkanması
KurutucuBel ArtF420270000PDMS'nin Gazı Parçalanması
Tek Kullanımlık Çok Amaçlı Laboratuvar SpatulasıLevGo17211Silikon elastomer baz ve kürleme maddesini karıştırıyor 
Boya ve Biotin Çıkarma Spin KolonuZebaA44296SFibrinojen etiketleme
FibrinogenYenilikçi AraştırmaIHUFBG25MGTromb boyama
Fusion 200-X şırınga pompasıChemyx Inc.0720XDonanım montajı
Heparin Sigma-AldrichH3149Kan örneği antikoagülasyonu
Yüksek Frekanslı JeneratörElectro-technic product Inc.BD-20PDMS cihazlarının üretimi
İnsan VWF monomeriSino Biyolojik A.Ş.10973-H08CMikrofuidik cihaz kaplaması
Image J v1.53 yazılımıFiji, Ulusal Sağlık EnstitüsüVeri analizi
Ters mikroskopLeicaDM IL LIDERLIK ETTI; filtre küpü: Leica DFT51010; Deniz feneri: LED5Donanım montajı
KimwipeKimberly- Clark Profesyonel34120Cam slaytların temizlenmesi
Luer kilit kapaklarıUluslararası Tıp Endüstrileri, Inc.57100BKan örneği toplama
MBC 370.2KerafastEBW104Tromb boyama
Mikroskop kapak gözlükleriPaul Marienfeld GmbH & Şirket KGES0107222PDMS cihazlarının üretimi
Mini Jilet Bıçak KazıyıcıStanley28-100PDMS cihazlarının üretimi
NanoDrop 2000 UV-Vis SpektrofotometresiTermo BilimselND-2000Protein konsantrasyonu ve F/P oranı ölçümü
FırınLaboratuvar Hattı Aletleri3512PDMS cihazlarının üretimi
PAC-1-Alexa Fluor 647BioLegend362806Tromb boyama
Plastik bardakThermoFisher Scientific S04589Silikon elastomer baz ve kürleme maddesini karıştırıyor 
SU-8 fotorezist master  KalıpUC San Diego Nano3 Nanofabrika Temiz Odası TesisiPDMS cihazlarının üretimi
Sylgard 184 Silikon Elastomer KitiKrayden DowDC4019862PDMS
SZ22-FITC Beckman CoulterIM 1756UTromb boyama
Boru SistemiCole - Palmer Enstrüman Şirketi.06422-01Donanım montajı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lindstrom, M., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risks collaboration, 1990-2021. J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2372-2425 (2022).
  2. Lim, H. Y., O'malley, C., Donnan, G., Nandurkar, H., Ho, P. A review of global coagulation assays - is there a role in thrombosis risk prediction. Thromb Res. 179, 45-55 (2019).
  3. Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. Platelet function tests: A comparative review. Vasc Health Risk Manag. 11, 133-148 (2015).
  4. Zhang, Y., Jiang, F., Chen, Y., Ju, L. A. Platelet mechanobiology inspired microdevices: From hematological function tests to disease and drug screening. Front Pharmacol. 12, 779753(2021).
  5. Gorog, D. A., et al. First direct comparison of platelet reactivity and thrombolytic status between Japanese and Western volunteers: Possible relationship to the "Japanese paradox". Int J Cardiol. 152 (1), 43-48 (2011).
  6. Gorog, D. A., Becker, R. C. Point-of-care platelet function tests: Relevance to arterial thrombosis and opportunities for improvement. J Thromb Thrombolysis. 51 (1), 1-11 (2021).
  7. Lopez-Jaime, F. J., et al. Clot stiffness measured by seer sonorheometry as a marker of poor prognosis in hospitalized COVID-19 patients. Clin Appl Thromb Hemost. 28, 10760296221112085(2022).
  8. Bochsen, L., Wiinberg, B., Kjelgaard-Hansen, M., Steinbruchel, D. A., Johansson, P. I. Evaluation of the TEG platelet mapping assay in blood donors. Thromb J. 5, 3(2007).
  9. Lipets, E. N., Ataullakhanov, F. I. Global assays of hemostasis in the diagnostics of hypercoagulation and evaluation of thrombosis risk. Thromb J. 13 (1), 4(2015).
  10. Thromboelastography loinc code 67790-6. , LOINC Committee. (2022).
  11. Volod, O., Viola, F. The quantra system: System description and protocols for measurements. Methods Mol Biol. 2663, 743-761 (2023).
  12. Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nature Medicine. 15 (6), 665-673 (2009).
  13. Chen, Y., et al. An integrin alphaiibbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nat Mater. 18 (7), 760-769 (2019).
  14. Li, M., Hotaling, N. A., Ku, D. N., Forest, C. R. Microfluidic thrombosis under multiple shear rates and antiplatelet therapy doses. PLoS One. 9 (1), e82493(2014).
  15. Colace, T. V., Diamond, S. L. Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).
  16. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  17. Brazilek, R. J., et al. Application of a strain rate gradient microfluidic device to von Willebrand's disease screening. Lab Chip. 17 (15), 2595-2608 (2017).
  18. Tovar-Lopez, F. J., et al. A microfluidics device to monitor platelet aggregation dynamics in response to strain rate micro-gradients in flowing blood. Lab Chip. 10 (3), 291-302 (2010).
  19. Kim, D. A., Ku, D. N. Structure of shear-induced platelet aggregated clot formed in an in vitro arterial thrombosis model. Blood Adv. 6 (9), 2872-2883 (2022).
  20. Receveur, N., et al. Shear rate gradients promote a bi-phasic thrombus formation on weak adhesive proteins, such as fibrinogen, in a vwf-dependent manner. Haematologica. 105 (10), 2471-2483 (2020).
  21. Din, M., et al. Multi-parametric thrombus profiling microfluidics detects intensified biomechanical thrombogenesis associated with hypertension and aging. Nat Commun. 15, 9067(2024).
  22. Stein, P. D., Sabbah, H. N. Measured turbulence and its effect on thrombus formation. Circ Res. 35 (4), 608-614 (1974).
  23. Mahalingam, A., et al. Numerical analysis of the effect of turbulence transition on the hemodynamic parameters in human coronary arteries. Cardiovasc Diagn Ther. 6 (3), 208-220 (2016).
  24. Thomson, E. E., et al. Gigapixel imaging with a novel multi-camera array microscope. Elife. 11, e74988(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Thrombus ProfilingBiomechanical ThrombogenesisMicrofluidic DevicesPlatelet ActivationFluorescence ImagingArterial ThrombosisVon Willebrand FactorProthrombotic TendencySyringe PumpImageJ Analysis

Related Articles