Yöntem makalesi

LC-MS/MS kullanılarak A Vitamini Stabil İzotop İzleyicilerinin Analizi

677 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69558

⸱

30 Aralık 2025

 ,  ,  , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Newcastle University Centre for Cancer, 3Fera Science Ltd

Bu makalede

Özet

Burada, insan plazmasında hem izotopik olarak etiketlenmiş hem de doğal retinoidleri aynı anda nicel olarak nicele eden bir protokol sunuyoruz; LC-MS/MS kullanılarak, 6 fmol sütun içi tespit sınırları vardır. Bu yöntem, basit bir örnek çıkarma prosedürü ve kısa bir analitik çalışma süresi içererek yüksek bir numune verimliliği sağlar.

Özet

Retinol izotop seyreltme (RID) yöntemi, vücudun A vitamini havuzuyla stabil izotop seyreltilmesi yoluyla insanlarda toplam vücut A vitamini depolarını (TBS) tahmin eder. Bunun için, etiketlenmiş ve etiketlenmemiş retinolün plazma izotopik oranını kütle spektrometrisi ile doğru ve verimli şekilde belirlemek kritik öneme sahiptir. Hazırlıklı HPLC ve türevleşme gibi kapsamlı ve zaman alıcı çıkarma ve/veya arıtma prosedürlerinden kaçınmak için, LC-MS/MS etiketlenmiş ve etiketlenmemiş retinoidlerin hızlı, hassas ve eşzamanlı analizini yapmak için kullanılır. Yöntem iki seviyede tespit kullanır: (i) ana (öncü) iyonların başlangıçta kütle/yük (m/z) ayrımı, ardından (ii) parçalanmış kız (ürün) iyonların tespiti. Bu da yüksek hassasiyetle sonuçlanır ve retinol tespit sınırları kolon üzerinde 6 fmol kadar düşüktür. Tandem kütle spektrometrisinin avantajlarına rağmen, retinol ile retinil esterlerin ayrılması için sıvı kromatografik ayrım gereklidir çünkü terminal fonksiyonel gruplar iyonizasyon sırasında kaybolur ve benzer ebeveyn (m/z 269) ve kız iyon parçalanma desenleri oluşur. Makale, endogen ve etiketlenmiş (13C veya 2H) retinolün plazmadan çözücü ekstraksiyonu ile izole edilmesini, ardından LC-MS/MS ile atmosfer basıncı altında kimyasal iyonizasyon (APCI) pozitif iyon modunda nicelendirilmesini anlatır.

Giriş

A vitamini, insan sağlığı için gerekli olan yağda çözünürken birbesindir 1. A vitamini eksikliği, şiddetli bulaşıcı hastalık ve ölüm riskine yatkınlığı artırır ve küresel olarak %29 olarak yaygınlık olduğu tahmin edilmektedir; bu oranlar Sahra Altı Afrika (%48) ve Güney Asya'da (%44) daha yüksek görülmektedir. A vitamini takviyesi, özellikle Sahra altı Afrika gibi yüksek riskli bölgelerde aşırı çocuk ölümünü azaltmak için etkili birstratejidir. Ancak, genellikle farklı kamu ve özel kurumlar tarafından yönetilen yaygın yaygın A vitamini takviyesi ile birlikte temel gıda maddelerinin büyük ölçekli A vitamini takviyesi ve mikrobesin tozunun dağıtımı, bireyleri aşırı A vitaminialımına maruz bırakma potansiyeline sahiptir 4,5,6,7,8,9,10 . Bu nedenle, A vitamini biyobelirteçleri ideal olarak eksiklikten toksisiteye kadar tüm vitamin A spektrumunu kapsayabilmelidir. Retinol izotop seyreltme (RID) yöntemi, şu anda insanlarda toplam vitamin A vücut depolarını değerlendirmek için en doğru dolaylıyöntemdir ve karaciğer vitamin A konsantrasyonlarına karşı doğrulanmıştır; vitamin A durumu için en iyi biyokimyasalbelirteç olarak kabul edilir 14,15. Yöntem, stabil izotop etiketli A vitamininin oral iz dozunun değiştirilebilir vücut havuzlarında etiketlenmemiş A vitamini (tracee) ile karışması ilkesine dayanır. Belirli bir dozlama sonrası plazma retinol spesifik aktivitesinin ölçümü (yani, etiketlenmiş retinol izleyicisinin plazmadaki toplam retinole oranı (plazmada izleyici/iz)) RIDdenklemi 11,12,13 kullanılarak vitamin A durumunun tahmin edilmesine olanak tanır.

Plazmada hem retinol izleyici hem de iz konsantrasyonlarını doğru ve kesin belirlemek için, stabil izotop etiketli vitamin A'nın nicelendirilmesi için gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS), izotop oranı kütle spektrometrisi (IRMS) ve sıvı kromatografi tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) dahil olmak üzere çeşitli yöntemler uygulanmıştır. 23,24,25,26. Önemli olarak, LC-MS/MS yüksek hassasiyet, özgüllük ve operasyonel basitliği karmaşık matrislerde hem doğal hem de etiketlenmiş retinol ölçümünü doğrudan ölçebilme yeteneğiyle birleştirir. Bu nedenle, IRMS için hazırlıklı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) veya GC-MS için türevleme gibi zaman alıcı örnek hazırlamaktan kaçınmak için, bu yöntem basit bir çıkarma prosedürü, kararlı izotoplar için çok düşük tespit limitleri ve kısa çalışmasüreleri 7,18,19 içerdiği için ideal bir tercihtir. Burada, daha kısa çalışma süresi, basit iş akışları ile yüksek hassasiyet ve seçiciliğe sahip güncellenmiş bir LC-MS/MS yöntemini, büyük ölçekli insan müdahalesi ve gözlemsel çalışmalardan elde edilen örneklerin yüksek verimlilikli analizi için son derece uygun bir yöntem olarak sunuyoruz; bu yöntem, tüm vücut vitamin A depolarının belirlenmesi gereken yerlerde.

Protokol

Çalışma, Filipinler Üniversitesi Manila Araştırma Etik Kurulu (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), UC, Davis Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB ID: 903681-2) tarafından onaylanmış ve ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339) olarak kayıtlı olmuştur. Çalışma, Gana Sağlık Hizmetleri Etik İnceleme Komitesi (GHS-ERC 012/07/20) tarafından onaylandı ve çalışma https://clinicaltrials.gov tarihinde NCT04632771 olarak kaydedildi.

1. İç standartların hazırlanması

  1. İç standart stok çözeltisi: İç stok çözeltisi, %0,1 bütillenmiş hidroksitolüen (BHT; w/v) içeren etanol içinde 1 mg/mL retinil asetat konsantrasyonunda hazırlanır. Stok çözeltilerini aliquotlara ayırın ve -80 °C'de 3 aya kadar saklayın.
    NOT: İç standart için, etiketsiz retinyl-asetat veya etiketlenmiş retinil asetat kullanmak mümkündür. Etiketsiz bir retinil-asetat standardı kullanılırsa, retinil asetat ve retinol zirvelerinin temel çözünürlükünün elde edilmesi hayati öneme sahiptir ( bkz. Şekil 1).
  2. İç standart çalışma çözümü: Stok standardını (1 mg/mL) 1 μg/mL'ye seyreltileyerek dahili standart çalışma çözümü hazırlayın. İlk olarak, stok standardın 60 μL'sini 300 μL etanol ile seyreltirin, ardından bu çözeltinin 60 μL'sini 10.000 μL etanol içinde seyreltirin. Her örnek için, 20 ng retinil-asetat içeren 20 μL çalışan dahili standart çözelti eklenir.
    NOT: Dahili standart çalışma çözümleri -20 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.

2. Kalibrasyon standartlarının hazırlanması

  1. Kalibrasyon stok standardı: Hem iz hem de izleyici için %0,1 BHT (w/v) içeren etanol içinde 1 mg/mL retinol konsantrasyonunda kalibrasyon stok standart çözeltilerini hazırlayın. Aliquot çözeltilerini stoklayın ve -80 °C'de 3 aya kadar saklayın. Donma-çözülme döngülerini önlemek için her aliquotu sadece bir kez kullanın.
  2. Kalibrasyon standart çalışma çözümü: Kalibrasyon stok standart çözeltisinden 100 μL alın ve hacimsel bir şişede 10.000 μL etanol ile seyreltin. Bir spektrofotometrede 325 nm seviyesinde seyreltilmiş kalibrasyon stok çözeltinin konsantrasyonunu kuvars küvet kullanarak belirleyin (ayrıntılar için Tablo 1'e bakınız).
  3. Sulandırılmış kalibrasyon stok standardının bir aliquotunu alın ve konsantrasyonu iz için 8 μM, izleyici için ise %50 etanol ve %50 asetonitril/dH 2O (70:30 (v/v) kullanarak 2 μM'e ayarlayın.
  4. %50 etanol ve %50 asetonitril/dH2O (70:30 (v/v) kullanılarak yedi farklı konsantrasyonda tekrarlanan kalibrasyon standartları hazırla. 200 μL plazma çıkarılırsa, iz kalibrasyon standartları 6 μM ile 0,03 μM, izleyici kalibrasyon standartları ise 0,5 μM ile 0,004 μM arasında değişmelidir.
    NOT: Doğru nicel belirlemek için, plazmadaki izotopik olarak etiketlenmiş retinol ve retinil esterler, çoğaltılmış 7 noktalı kalibrasyoneğrileri 27 kullanılarak nicelendirilmiştir. Kalibrasyon eğrisinin en yüksek noktası (plazmadaki iz ve izleyicinin beklenen en yüksek konsantrasyonunun iki katı), orijinal plazma hacminden yeniden oluşturulmuş ekstraktın konsantrasyon faktörünü dikkate alır.

3. Plazmadan retinoidlerin çıkarılması

  1. -80 °C dondurucudan plazma örnekleri alın ve oda sıcaklığında (yaklaşık 30 dakika) çözülür.
  2. Çözüldükten sonra, her örneği girdabla döndürün ve kapakta plazma kalmadığından emin olmak için birkaç saniye döndürün. Sonrasında örnekleri buzun üzerine koyun.
  3. Soğutulmuş bir santrifüjü açın ve 4 °C'ye kadar soğumasına izin verin. Vida kapaklı 15 mL cam tüpleri (konunun kimliği ve zaman noktası) etiketleyin ve her örnek tüpüne 200 μL deionize su (dH 2O) pipet ekleyin.
  4. İç standart çalışma çözeltisinden, dahili standart karışımdan 20 μL pipet ile cam tüpe alın.
  5. Bir pipet kullanarak, dahili standart ve dH2Oiçeren tüpe 200 μL plazma dağıtılır.
  6. Her örnek tüpüne 400 μL etanol pipet yapın ve tüpü karıştırarak etanol plazmayla karıştırın. Protein kalıntılarının cam duvara yapışmasını önlemek için girdaba girme.
  7. İlk heksan çıkarımı için, her tüpe 2 mL heksan ekleyin ve tüp kapaklarını sıkıca bağlayın.
  8. Tüpleri yörünge sallayıcısına yerleştirin ve 15.000 rpm'de 30 dakika boyunca sallayın. Tüpleri soğutmalı santrifüja aktarın ve 1.800 x g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca döndürün.
  9. Cam Pasteur pipetleri kullanarak, süpernatantı temiz etiketli cam test tüplerine aktarın. Protein çökeltmesi veya su aktarmamaya dikkat edin.
  10. Kalan kalıntıya 2 mL heksan ekleyerek ikinci bir heksan çıkarımı yapın, tüp kapaklarını sıkıca bağlayın ve tüpleri orbital sallayıcıya yerleştirip 15.000 rpm'de 15 dakika boyunca sallayın.
  11. Tüpleri soğutmalı santrifüja aktarın ve 1.800 x g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca döndürün. Cam Pasteur pipetleri kullanılarak, süpernatantı sırasıyla her örnek için ilk heksan ekstraksiyonunun süpernatantını (adım 3.9) içeren cam test tüpüne aktarın.
  12. Kombine heksan ekstraksiyon çözücüsünü (her örnek için birinci ve ikinci ekstraksiyon süpernatantı) hafifçe bir N2 akışı altında koyu bir duman kapüşonunda yaklaşık 30 dakika buharlaştırın. Isıtma bloğunu 35 °C'ye ayarlayın.
  13. Kurumuş kalıntıyı 50 μL etanolde yeniden askıya alın, kısa bir girdap yapın ve 50 μL mobil faz (70:30 asetonitril/dH 2O (v/v)) ekleyin ve tekrar girdabı oluşturun.
    NOT: Kurutulmuş kalıntının yeniden süspansiyonu, yalnızca retinil-esterleri nicelendirmek ise 100 μL etanol kullanılarak yapılmalıdır.
  14. Etiketli 0.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. 16.900 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  15. Yeniden oluşturulmuş kalıntının 80 μL'sini 300 μL insertlerle kehribar renkli HPLC şişelerine aktarın. Buharlaşma nedeniyle çözücü kaybını önlemek için şişeyi hemen kapatın.
  16. Cam şişeleri bir kriyoboxa aktarın, çalışma adı, çıkarma tarihi ve örnek kimlikleriyle etiketleyin ve analiz yapılana kadar -80 °C sıcaklığında dondurucuda saklayın.
    NOT: Depolanan örneklerin analizi 3-5 gün içinde tamamlanmalıdır. 200 μL plazma hacmı, etiketli vitamin A izleyicisini dozdan 90 gün sonra tespit etmek için normalde yeterlidir. Ancak, plazma/su/etanol oranları hacmle 1:1:2 olarak tutulursa plazma hacmi 400 μL'ye ayarlanabilir.

4. İç standart kontrol örneklerinin hazırlanması

  1. Etanol/mobil faz çözeltisini, 120 μL etanolünü mikrosantrifüj tüpüne pipetleyerek ve 200 μL (70:30) asetonitril/dH 2O (v/v) ekleyerek ve vorteksle hazırlayın.
  2. Üç ayrı 0.6 mL tüplere, dahili standart çalışma çözeltisi 20 μL pipetle.
  3. 80 μL etanol/mobil faz çözeltisi ve vortex eklenin. Üç dahili standart kontrol örneğini 300 μL insertlerle amber renkli HPLC şişelerine aktarın ve buharlaşma nedeniyle çözücü kaybını önlemek için şişeleri hemen kapatın.

5. Plazma evi standartları

  1. Ev standart örneklerini hazırlamak için, her analitik çalışma için en az üç örnek analizine olanak tanıyacak yeterli plazma hacmi elde edinin. Toplam gerekli plazma hacmi, analiz edilmesi gereken örnek sayısına göre belirlenir.
  2. Aliquot, standart plazmayı her analitik çalışma için gereken hacimlerde küçük kriyoviallere yerleştirir ve -80 °C'de depolar.
    NOT: Ev standardının bilinmeyen örneklerde kullanılan izotop etiketli retinol izleyiciyi içermesi kritik öneme sahiptir. Gönüllü örneklerin bir aliquot'ta toplanmasıyla yeterli materyal elde edilebilir.
  3. Her analitik çalışma için bilinmeyen plazma örnekleriyle aynı hacimde en az üç plazma evi standart örneği alın, bu da adımda 3. aşamada yapıldığı gibi.
  4. Plazma evi standartlarını, örnek rafına en az 10 bilinmeyen plazma örneği ile yerleştirin. Gün içi ve gün arası varyasyonları hesaplamak için plazma evi standartlarını kullanın.

6. Dış standart örnekler

  1. Sertifikalı harici standart örnekler alın ve -80 °C'de saklanın. Yaygın olarak kullanılan sertifikalı harici bir standart NIST Standart Referans Materyali SRM 968'dir.
  2. Her analiz başına bilinmeyen plazma örnekleriyle aynı hacimde en az dört plazma harici standart örneği çıkarma adımı 3. Elde edilen sonuçların doğruluğunu doğrulamak için harici standart örnekler kullanın.

7. Manuel bileşik optimizasyonu

  1. APCI Isıtılmış Nebulizer probunun MS kaynak gövdesine monte olduğundan emin olun. Her kararlı izotop izleyicisi için yaklaşık 1 μg/mL hızında infüzyon çözeltisi hazırlanır.
    NOT: Çözelti mobil faza benzer olmalı ve protonasyon için biraz asit içermelidir. Kullanılabilecek iyi bir çözücü, %0,1 formik asit (v/v) ile 1:1 asetonitril/dH 2O olur.
  2. 1 mL Luer-lock Hamilton şırıngasını infüzyon çözeltisi ile doldurun, ardından şırıngayı topraklama birleşiği ile PEEK borusuyla kaynağa bağlayın. İnfuzyon akış hızını 10 μL/s olarak ayarlayın.
  3. Manuel Akort seçeneğini seçin ve enstrümanın Ayarlanma ve Kalibrasyon Modunda olduğundan emin olun. Şırınga pompasını çalıştırın ve pozitif modda Q1 Tarama Tipini seçin.
  4. Hedef bileşiğin moleküler kütlesinden yaklaşık 100 Da üzerinde bir üst kütle aralığı 50 Da olarak ve üst kütle aralığı ayarlayın.
  5. Döngüleri 500'e ayarlayın, tarama hızı 200 Da/s. Başlat tuşuna tıklayın ve kütle spektrumları penceresinde sinyali gözlemleyin.
  6. Sinyalin stabilleşmesini bekleyin, sonra beklenen m/z zirvelerinin ortaya çıktığını kontrol edin. MS pozitif modda olduğu için [M+H]+ ve [M+2H]2+ zirvelerini ele alalım.
  7. Hedef zirve yüksekliği yaklaşık 1e6 civarında olmalı. Toplam iyon akımı (TIC) 1e7-1e9 olmalıdır. Sinyal stabil olana kadar infüzasyona devam edin, sonra Stop tuşuna tıklayın. İnfuzyon çözeltisinde bulunan bileşikten oluşan yüksek yoğunluklu belirgin bir zirve olmalıdır. Toplam iyon akımı (TIC) gösterilir; bu, tüm iyonların birleşik sinyalini gösterir.
    NOT: 12C Retinol'ün beklenen kütlesi 269 Da'dır, bu nedenle [M+H]+ ve [M+2H]2+ iyonları göstermek için 50-300 Da aralığı uygundur.

8. Ürün iyonu (MS2) taraması / CE spektrum kontrolü

  1. Başlangıç kütlesini daha düşük bir kütleye, örneğin 50 Da, Stop kütlesini ise Q1 kütlesinin hemen üstüne (örneğin, 12C Retinol için 269.1) ayarlayın. Döngüleri 5'e ayarlayın ve çarpışma enerjisini (CE) 10'a değiştirin. Öncü iyon olarak Q1 kütlesini kontrol edin. Daha küçük parçalar görünmüyorsa, CE'yi 20'ye çıkarın.
  2. CE arttıkça daha fazla ürün iyonu oluşur. CE'yi artırmaya devam edin, spektrumun sağındaki önsöz iyonu tamamen yok olana kadar. CE'yi daha da artırarak potansiyel ikincil parçalanma görebilirsiniz.

9. MRM taraması

  1. MS2 taramasından, daha fazla optimizasyon için en çok bulunan veya en uygun üç ürün iyonu seçilir.
  2. Her çarpım iyonu için, bulunan Q1 (öncü) kütlesi ve bulunan Q3 (çarpım) kütleleri girin. Dwell Time'ı 200 ms'ye ayarlayın. Her parçaya uygun şekilde adlandırın (örneğin, 12C_Frag_93).
  3. Çarpışma enerjisini seçin ve rampa özelliğini kullanarak optimal CE değerini belirleyin. CE sütununu her parça için optimize edilmiş CE değeriyle doldurun.
  4. İzobarik girişimleri en aza indirmek için CE optimize edildikten sonra Kümeleme Çıkarma Potansiyeli (DP) optimize edilir. Çarpışma Hücresi Çıkış Potansiyelini (CXP) bir seferde bir geçiş için optimize edin.

10. Kaynak/gaz optimizasyonu

  1. Bu parametreler otomatik olarak optimize edilemez. Sinyal yoğunluğunu artırmanız gerekiyorsa, manuel bir optimizasyon süreci yapın. Bir parametreyi birer değiştirin ve sinyalin artıp aynı kalıp kalmadığını veya azaldığını karşılaştırın.

11. Sıvı kromatografi koşulları

  1. Kromatografi için, dH2O (A) içinde %0,1 (v/v) formik asit ve asetonitril (B)'de %0,1 (v/v) formik asit içeren ikili mobil faz gradyanı kullanın.
  2. Uygulanan LC sistemine bağlı olarak, ya 4 mm x 2,1 mm (3 μm) ABZ PLUS kolonu (HPLC için) 4 mm x 2,1 mm C18 kartuşla donatılmış veya retinol analizi için RP18 FIT kolonuyla donatılmış 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) Premier BEH Shield kullanın. Kolonları sırasıyla 40 °C veya 50 °C sıcaklıkta tutun.
  3. Kolona 10 μL plazma ekstraktı enjekte edin. Elute analizleri 0,4 mL/dakika akış hızında kullanın. HPLC sistemleri için doğrusal gradyan şudur: 6,0 dakikada %60 B'den %95 B'ye; 6,1 dakikadan 13,0 dakikaya kadar %100 B; 13.1 ile 14.0 dakika arasında %100 B'den %60 B'ye kadar; ve 14.0 ile 17.0 dakika arasında %60 B. UPLC sistemleri için doğrusal gradyan araştırma sorusuna bağlıdır. Sadece retinol belirlenecekse, gradyan şöyledir: %40 B'den %60 B'ye 1,0 dakikada; 1,0 dakikadan 6,0 dakikaya %6,0 dakika arasında %60 B'den %95 B'ye kadar; 6,5 dakikadan 7,5 dakikaya kadar %100 B; 7,5 ila 7,6 dakika arasında %100 B'den %40 B'ye kadar; ve %40 B 7,6 ile 8,5 dakika arasında. Amaç retinolle birlikte retinyl-esterleri de analiz etmekse, doğrusal gradyan şudur: %60 B'den %95 B'ye 3,0 dakikada; 3,5 dakikadan 6,5 dakikaya kadar %100 B; 6,5 ile 7,0 dakika arasında %100 B'den %60 B'ye kadar; ve %60 B 7,0 ile 8,5 dakika arasında.

12. MS/MS koşulları

  1. Atmosfer basıncı altında kimyasal iyonizasyon (APCI) pozitif iyon modunda MS/MS analizi yap. APCI, elektrosprey iyonizasyonu yerine tercih edilir çünkü daha yüksek sinyal yoğunluğu, daha geniş bir doğrusal aralık sağlar ve daha düşük arka plangürültüsü 26 sunar.
  2. [12C]retinol, [13C10]retinol ve [2H 6]retinol ile ilgili eterler/asetat için ilgili kütle geçişleri için, API4000 ve QTRAP 5500 kütle spektrometresi için seçilmiş reaksiyon izleme (SRM) parametreleriyle birlikte Tablo 2, Tablo 3 ve Şekil 2'yi kontrol edin.
    NOT: Retinol, retinil esterler ve retinil asetat için seçilmiş iyon izlemesi, APCI niceliklendirmesi için aynı parça iyonuydu; çünkü bu iyon protonlanmış moleküllerden su, yağ asidi veya asetik asit kaybına karşılık gelir. LC-MS/MS retinol zirvelerini esterlerinden ayırabildiğinden, tek enjeksiyonla hem retinol hem de retinyl-ester fraksiyonlarında izotop zenginleşmesinin bir örnekte belirlenmesine olanak tanır.

13. Retinol'ün nicelendirilmesi

  1. [12C] retinol, [2H6] retinol ve [13C10] retinol numune konsantrasyonlarını ilgili kalibrasyon standartlarına göre nicelikle ölçün.
  2. Her örnek için dahili standart konsantrasyonların geri kazanımı ile dahili standart kontrol örneklerine karşı ekstraksiyon kayıplarını belirleyin.
  3. Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü (NIST) standart referans materyali (SRM) 968 kullanılarak plazma retinol konsantrasyonlarının doğrulanmasını gerçekleştirin.

Sonuçlar

Farklı kromatografik sistemlerde kararlı izotop etiketli retinolün analizindeki analitik yöntemin etkinliğini göstermek için, iki farklı çalışmanın sonuçlarını sunuyoruz.

Ön HPLC ile API4000 kullanıldığı için, 12-18 aylık 111 Filipinli çocuktan alınan plazma örnekleri, 0. günde 400 μg (1,17μmol) [13 C10] retinil asetat oral dozu aldıktan sonra 4 gün sonra 6 mL kan örneği alındıve 7,28 analiz edildi. Ortalama plazma toplam retinol konsantrasyonları 1,1 μmol/L ve ortalama [13C10] retinol 0,007 μmol/L idi. m/z 279 ile 100 geçişi içindeki arka plan gürültü seviyesinin ortalama zirve yüksekliği ~50 cps (Şekil 1) olduğundan, [13C10] retinol için tespit (LOD) ve nicelik (LOQ) seviyeleri sırasıyla 6 fmol ve 19 fmol kolonuna karşılık gelen 150 cps ve 500 cps olarak belirlenmiştir. [12C] retinol ile uygulanan dahili retinil-asetat standardı arasında iyi bir başlangıç çözünürlüğü elde edildiğinden, kararlı izotop etiketli retinyl-asetat kullanmaya gerek kalmamıştır.

UPLC ile QTRAP 5500 kombinasyonu kullanılarak, çalışma süreleri 10 dakikanın altında daha hızlı bir kromatografik ayrım sağlanabilir. Araştırma sorusuna bağlı olarak, iki farklı ayırma yöntemi uygulanabilir; (i) amaç, etiketsiz bir retinyl-asetat dahili standardı ile uygulanan doğal ve izotop etiketli retinol belirlemekse, retinol (4,37 dakika) ile retinyl-asetat (5,33 dakika) arasındaki tutma süreleri iyi bir başlangıç ayrımı sağlar (Şekil 3); (ii) amaç, doğal ve izotop etiketli retinolü ve etiketlenmiş retinyl-esterlerle birlikte ayırmak ise, 8,5 dakikalık bir sürede iyi bir ayrım sağlanabilir (Şekil 4). Ancak, retinol (2,10 dakika) ile retinil asetat (2,43 dakika) arasındaki yakın tutma süreleri nedeniyle, izotopik olarak etiketlenmiş retinil asetat ([2H4] retinil asetat) kullanılması tavsiye edilir. Bu örnekte, üreme çağındaki 80 Ganalı kadından serum örnekleri analiz edildi; bu kadınlara 2 mg retinol eşdeğer doz [2H6] retinil asetat verildi ve dozdan 21 gün sonra kan örneği alındı. Serumdaki ortalama toplam retinol konsantrasyonları 1,89 μmol/L olup, ortalama [2H 6] retinol 0,027 μmol/L ve ortalama [13C10] retinol 0,025 μmol/L idi.

Sunulan yöntem düşük bir tespit seviyesi (LOD = 6 fmol; LOQ = 19 fmol kolon), doğal retinol ile dahili standartlar arasında net bir başlangaz ayrımıyla stabil izotop etiketli retinol tespit etmekte yüksek hassasiyet ve özgüllük göstermektedir. Ayrıca, yöntem hem HPLC hem de UPLC kurulumlarında etkili çalıştı, tutma sürelerindeki farklılıklara rağmen. İzotopik olarak etiketlenmiş iç standartların ([2H4] retinil asetat) kullanımı, retinil esterler belirlenmesi gerekirse daha hızlı UPLC koşullarında doğru nicelik sağlanmasını sağladı. NIST sertifikalı referans standartlarına göre doğrulama doğruluğu doğruldu, gün içi ve gün arası varyasyon katsayıları (sırasıyla %2,3 ve %4,4) mükemmel hassasiyet ve tekrarlanabilirlik gösterdi. Farklı dozlama protokolleriyle iki farklı popülasyondan (Filipinli çocuklar ve Ganalı kadınlar) plazma/serum örneklerinin başarılı analizi, çeşitli beslenme çalışmalarında sağlamlık ve pratik fayda sağlamlığını göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: API4000 kütle spektrometresi kullanılarak LC-MS/MS kromatogramı. Serum retinolünün kromatogramı, 0,4 mg [13C10] retinil asetat ağızdan alındıktan 4 gün sonra alındı. M/z 269 ile 93 arasındaki seçilmiş reaksiyon izleme (SRM), [12C] retinol (RT = 5,06 dakika) ve [12C] retinil asetat (RT = 5,83 dakika) arasında iç standart (IS) ayrıldığını gösterir. [13C10] retinol sinyali m/z 279 ile 100 arasında hem tespit sınırını (LOD) hem de nicelik sınırını (LOQ) yeterince aşar. Kromatografik koşullar: (A) dH2O'da %0,1 (v/v) formik asit ve asetonitrildə %0,1 (v/v) formik asit içeren ikili mobil faz gradyanı ve (B) %0,1 (v/v) formik asit; 0,4 mL/dakika akış hızı, doğrusal gradyan: %60 B'den %95 B'ye 6,0 dakikada; 6,1 dakikadan 13,0 dakikaya kadar %100 B; 13.1 ile 14.0 dakika arasında %100 B'den %60 B'ye kadar; ve %60 B 14.0 ile 17.0 dakika arasında; 100 mm x 2.1 mm (3 μm) ABZ PLUS kolonu, 40 °C'de tutulan 4 mm x 2 mm C18 kartuşuyla donatılmış. Bu figürün daha büyük versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: APCI-MS/MS ürün iyon kütle spektrumları. Akış-enjeksiyonlu APCI-MS/MS iyonunun ürün iyonları (A) m/z 269 [12C] retinol, (B) m/z 273 [2H 4] retinol, (C) m/z 275 [2H 6] retinol ve (D) m/z 279 [13C10] retinol pozitif iyon modunda. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: QTRAP 5500 kütle spektrometresi kullanılarak LC-MS/MS kromatografisi. Plazma evi standardından alınan tipik bir ekstraktın LC-MS/MS kromatografisi, 1,0 mg [2H6] retinil asetat ağızdan alındıktan sonra 21 d ve 1,0 mg [13C10] retinil asetat ağızdan alındıktan sonra 90 d örneklenmiştir. m/z 269→93 için seçilmiş reaksiyon izleme (SRM), [12C] retinol zirvesini (RT = 4,37 dakika) ve retinil asetatı (RT = 5,33 dakika) dahili standart (IS) olarak gösterir; [2H 6] retinol (RT = 4,36 dakika) m/z 275→96; ve [13C10] retinol zirvesi (RT = 4.38) m/z 279→100 seviyesinde yer alır. Kromatografik koşullar: (A) dH2O içinde %0,1 (v/v) formik asit ikili mobil faz gradyanı ve asetonitrile %0,1 (v/v) formik asit; 0,4 ml/dakika akış hızı, doğrusal gradyanı %40 B'den %60 B'ye 1,0 dakikada; 1,0 dakikadan 6,0 dakikaya %6,0 dakika arasında %60 B'den %95 B'ye kadar; 6,5 dakikadan 7,5 dakikaya kadar %100 B; 7,5 ila 7,6 dakika arasında %100 B'den %40 B'ye kadar; ve %40 B 7,6 ila 8,5 dakika arasında; 100 mm x 2.1 mm (1.7 μm) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT kolonu, 50°C'de tutulmuştur. Bu figürün daha büyük versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: QTRAP 5500 kütle spektrometresi kullanılarak retinol ve retinil-esterlerin LC-MS/MS kromatografisi. Plazma evi standardından tipik bir ekstraktın LC-MS/MS kromatografisi, 1.0 mg [2H 6] retinil asetat ağızdan alındıktan 6 saat sonra ve 1.0 mg [13C10] retinil asetat ağızdan alındıktan sonra 90 d içinde örneklenmiştir. m/z 269→93 seçilmiş reaksiyon izlemesi (SRM) [12C]retinol zirvesini (RT = 2,10 dakika) gösterir; [2H 4]retinil asetat m/z 273→94 (RT = 2,43 dakika) dahili standart olarak (IS); [2H 6]retinol (RT = 2,09 dakika) ve [2H 6]retinil palmitat (RT = 5,11 dakika) ayrılması m/z 275→96'da zirve noktası; ve [13C10]retinol zirvesi (RT = 2.10) m/z 279→100 seviyesinde bulunur. Kromatografik koşullar: (A) dH2O içinde %0,1 (v/v) formik asit ikili mobil faz gradyanı ve asetonitrile %0,1 (v/v) formik asit; Akış hızı 0,4 ml/dakika ve doğrusal gradyan: %60 B'den %95 B'ye 3,0 dakikada; 3,5 dakikadan 6,5 dakikaya kadar %100 B; 6,5 ile 7,0 dakika arasında %100 B'den %60 B'ye kadar; ve %60 B 7,0 ile 8,5 dakika arasında; 100 mm x 2.1 mm (1.7 μm) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT kolonu, 50 °C'de tutulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Parametreler
Etanolde retinolün azı dişleri soğurması (ɛ):52.770 M-1 cm-1
Sulandırma faktörü:100 (10mL etanolde 100μL stok kalibrasyon standardı)
Ölçülen ortalama soğurma:0.575
Hesaplama
Etanoldeki [12C]retinol konsantrasyonu (mol):Konsantrasyon (mol) = Soğurma / ɛ x Küvetin uzunluğu
= 0.575 / 52770 M-1 cm-1 x 1 cm = 1.09 x 10-5 M
Sulandırma için düzeltme:1.09 x 10-5 M x 100 = 1.09 x 10-3 M veya 1.09 mM

Tablo 1: Kalibrasyon standardı retinol stok konsantrasyonunun belirlenmesi.

AnalizMRM geçişleri (m/z)Kümeleme çözme potansiyeli (V)Giriş potansiyeli (V)Çarpışma enerjisi (eV)Çarpışma çıkış potansiyeli (V)
[12C]-retinol/esterler269→935110276
[2H 4]retinil asetat273→945110276
[2H 6]retinol/esterler275→965110276
[13C10]-retinol/esterler279→1004110276

Tablo 2: Seçilmiş reaksiyon izleme (SRM) parametreleri. [12C] retinol, [13C10] retinol ve [2H6] retinol ile ilgili esterleri için parametreler API4000

AnalizMRM geçişleri (m/z)Kümeleme çözme potansiyeli (V)Giriş potansiyeli (V)Çarpışma enerjisi (eV)Çarpışma çıkış potansiyeli (V)
[12C]-retinol/esterler269→939410338
[2H 4]retinil asetat273→9454102011
[2H 6]retinol/esterler275→966910253
[13C10]-retinol/esterler279→10010210359

Tablo 3: Seçilmiş reaksiyon izleme (SRM) parametreleri. [12C] retinol, [13C10] retinol ve [2H6] retinol ile ilgili esterleri için QTRAP 5500 kullanılarak parametreler

Tartışma

Sunulan LC-MS/MS yöntemi, tespit sınırları 6 fmol/L kadar düşük olan son derece yüksek hassasiyet sunar; böylece araştırmacılar 100 - 200 μL kadar az plazma19 kullanabilir. Bu hedefe yönelik tandem MS yöntemi, hem niceleyici hem de niteleyici ürün iyonları kullanıldığında retinoid izotopolog kimliğinin doğrulanması için özellikle güçlüdür18. Ancak, izotop etiketli retinoidler, fizyolojik olarak etiketlenmemiş retinoidlere göre çok daha düşük konsantrasyonlarda bulunduğundan, etiketlenmiş retinol ve retinil esterler içeren plazma örnekleri ek bir konsantrasyon adımı gerektirebilir. Bu gereklilik, doz sonrası kan örneğinin zamanlaması, ağız izleyici konsantrasyonu ve LC-MS/MS sisteminin hassasiyeti gibi faktörlere bağlıdır. Tarihsel olarak, önceki kütle spektrometrelerinin düşük hassasiyetini aşmak için daha yüksek doz uygulamalar kullanılmıştı, ancak son gelişmeler daha düşük dozların kullanımınıkolaylaştırmıştır 13. Sunulan örneklerde, daha yüksek oral doz, stabil izotop etiketli retinol seviyesini daha sonraki zaman noktalarında bile artırır; yani 21 gün yerine 4 gün içinde.

Retinil esterlerin terminal fonksiyonel grupları iyonizasyon sırasında kaybolduğundan, hem retinol hem de retinil esterler için aynı ebeveyn m/z ve benzer kız iyon parçalanma desenleri gözlemlenir. Bu nedenle, kromatografik ayrım, ayrı konsantrasyonlarını belirlemek içinkritik öneme sahiptir 18. Ayrıca, endogen retinol izotopologlarında 13C stabil izotopların doğal bolluğu yüksek olduğundan, insan plazmasında doğal 13C zenginleşmesinin düzeltilmesi gerekmemesi için retinol izleyicisine üçten fazla 13C atomunun dahil edilmesiönerilir 29.

Plazma örnekleri, izotop analizinden önce iki aşamada işlem gerektirir. İlk olarak, plazma örnekleri deproteinize edilmeli, ardından polar olmayan bir çözücü kullanılarak retinol ve retinil esterlerin ekstraksiyonu yapılmalıdır; bu da iki fazlı birsistem oluşturur 18,19,20. Yukarıdaki protokol kullanılarak net bir faz ayrımı elde edilse de, bifazik sistemdeki ara fazın bozulmaması veya toplanmaması kritik öneme sahiptir; çünkü bu kuruma süresini artırır ve analizin doğruluğunu azaltır. Alternatif olarak, grubumuz retinoidler için tek fazlı ekstraksiyonprosedürünün uygulanmasını da araştırmıştır 20. Bunun için 200 μL plazma örnekleri 2 mL plastik mikro-santrifüj tüpüne pipet edilir ve retinoidler etanol ile etil asetat kombinasyonu kullanılarak çıkarılır. Bu ekstraksiyon protokolünün uygulanması, retinol ve retinoik asit izomerleri gibi daha polar retinoidlerin bifazik ekstraksiyona kıyasla eşdeğer geri kazanımı ile analiz edilmesine olanak tanır ve ayrıca Kane ve Napoli30'un tek aşamalı asetonitril ekstraksiyon yöntemiyle karşılaştırılabilir.

Retinoidlerin UV ışığı ve ısıya maruz kaldıklarında oksidasyon ve izomerizasyona karşı hassas olduğu göz önüne alındığında, analizin mümkün olan en kısa sürede yapılması çok önemlidir ve plazma30'un toplanması, işlenmesi ve depolanması sırasında genel önlemler alınmalıdır. Kararlı izotop etiketli retinoidlerin geleneksel analizi yöntemleri, zaman alıcı izolasyon ve/veya türevleştirme yöntemleri kullanır. GC-MS analizi, insan serumundan retinol fraksiyonunun yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) kullanılarak izole edilmesini ve ardından retinol22'nin türevlendirilmesini gerektirir. GC-C-IRMS için türevleşme gerekmese de, retinolün önceden iki ayrı HPLC arındırma adımıyla ayrılmasıönerilir 17,25,31 ve örnek popülasyonunda insan plazmasında retinolün doğal 13C zenginleşmesinin temel olarak belirlenmesi de gereklidir 17,32. Buna karşılık, sunulan LC-MS/MS yönteminin birkaç avantajı vardır. Kapsamlı ve zaman alıcı ekstraksiyon ve/veya arıtma prosedürlerinden kaçınır; böylece retinil esterler ile serbestretinol 16,18,26,32'nin hızlı, hassas ve eşzamanlı analizini mümkün kılar. Ayrıca, yöntem düşük değişkenlikle yüksek doğruluk sağladığı ve farklı LC-MS/MS sistemlerine uyarlanabilir olması nedeniyle etkilidir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışmaya destek Bill & Melinda Gates Vakfı (Proje Numarası: OPP1115464) ve Viyana'daki Uluslararası Atom Enerjisi Ajansı (IAEA) (Proje Numarası E4.30.30) tarafından sağlandı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
çözücüler
Mutlak etanol HPLC derecesiFisher10428671
Asetonitril HPLC sınıfıFisher10660131
HPLC sertifikalı HPLC için heksan %95 n-heksanFisherH/0406/17
İzopropanol HPLC derecesiVWR20880.32
İzopropanol HPLC derecesiVWR20880.32
Metanol %99 2,5 LTermo Bilimsel11367996
standartlar/izotoplar
Tamamen trans-retinolBioXtra95144
Retinil asetatSigmaPHR1236
Kararlı izotop etiketli retinol:ReseaChem/Buchem BV
Retinil asetat etiketli kararlı izotop:ReseaChem/Buchem BVYokRID yöntemi için çeşitli kararlı izotoplar kullanılabilir. Ticari olarak mevcut olan farklı izotopların listesi Tablo 1. 
Vitamin A  (19,19,19,20,20,20-D6)
Vitamin A  (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Vitamin A asetat (10,19,19,19-D4)
A Vitamini Asetat (19,19,19,20,20,20-D6)
A Vitamini Asetat (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Ekipman
5ml Ayarlanabilir çözücü dağıtıcıSigma-AldrichZ627607-1EA
ABI 4000 LC-MS/MS.AB Sciex
Analitik tartı terzileri Fisher13592970
Kapiler pistonlar (pipet uçları) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
6x96 CP250ST kapillyar pistonlarGilsonF148714
Duman dolabı
Microman E M100E Pipet (pozitif deplasman)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipet (pozitif deplasman)GilsonFD10005
Pipetman P100, 10-100ul, metal ejektörGilsonF114057M
Pipetman P1000, 100-1000ul, metal ejektörGilsonF114059M
Pipetman P20, 2-20ul, metal ejektörGilsonF144056M
QTRAP 5500 LC-MS/MSAB Sciex
Soğutmalı Santrifüj 5810 REppendorf
Sonikasyon su banyosuVWRUSC100T
SpektrofotometreThermo Fisher ScientificA51119600C
Techne numune konsantratörü ve ısı bloğu.VWR
Vibrax VXR Temel ShakerIKA0002819002
Vortex mikser; MS3 temel IKAFisherMPR-555-050L
VX2 test tüpü eklentisi - werke typ VX2IKA0000568900
tüketilebilir
1.5ml mikrosantrifüj tüpleriFisherFB74323
100 mm x 2.1 mm (1.7 μ m) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT kolonuSular186009498
100 mm x 2.1 mm (3 & mikro; m) Supelcosil ABZ PLUS kolonuSupelco57917
1000ul pipet uçlarıStarlabS1122-1830
100ml hacimsel şişelerFisher11323644Pyrex Borosilicate Cam Sınıf A Sertifikalı Hacimsel Şişe
200ul pipet uçlarıStarlabS1120-8810
4 mm x 2 mm SecurityGuard C18 kartuşuPhenomenexAJ0-4286
50ml hacimsel şişelerFisher11313644Pyrex Borosilicate Cam Sınıf A Sertifikalı Hacimsel Şişe
9mm kehribar cam şişeler ve iç kısımlarFisher11583680
9mm vida dişli kapaklarıFisher13206419
Karton kriyoboxStarlabA9623-8181
Hellma cuvette UV kuvarsSLSCEL1600
Azot gazı (en yüksek saflıkta ve oksijensiz)BOC
Pasteur PipetiFisher11546963
Pyrex kültür tüpleri 100x16mmCorningCLS9944916
Vida kapakları PTFE astar 16mmCorningCLS999815
Şişe cam amber 2ml PTFE kapaklarıFisher11573542
Vidal kapağı 9mm silikon beyazı/PTFE kırmızıThermo 13206419

Kaynaklar

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)-Vitamin A Review. J Nutr. 146 (9), 1816-1848 (2016).
  2. Stevens, G. A., et al. Trends and mortality effects of vitamin A deficiency in children in 138 low-income and middle-income countries between 1991 and 2013: a pooled analysis of population-based surveys. Lancet Global Health. 3 (9), E528-E536 (2015).
  3. Baye, K., et al. Estimates of child mortality reductions attributed to vitamin A supplementation in sub-Saharan Africa: scale up, scale back, or refocus. Am J Clin Nutr. 116 (2), 426-434 (2022).
  4. Bielderman, I., Vossenaar, M., Melse-Boonstra, A., Solomons, N. W. The potential double-burden of vitamin A malnutrition: under- and overconsumption of fortified table sugar in the Guatemalan highlands. Eur J Clin Nutr. 70 (8), 947-953 (2016).
  5. Brown, K. H., Engle-Stone, R., Kagin, J., Rettig, E., Vosti, S. A. Use of Optimization Modeling for Selecting National Micronutrient Intervention Strategies: An Example Based on Potential Programs for Control of Vitamin A Deficiency in Cameroon. Food Nutr Bull. 36 (3 Suppl), S141-S148 (2015).
  6. Bruins, M. J., et al. Maximizing the benefits and minimizing the risks of intervention programs to address micronutrient malnutrition: symposium report. Matern Child Nutr. 12 (4), 940-948 (2016).
  7. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  8. Engle-Stone, R., et al. Weighing the risks of high intakes of selected micronutrients compared with the risks of deficiencies. Ann New York Acad Sci. 1446 (1), 81-101 (2019).
  9. Raiten, D. J., et al. Perspective: Integration to Implementation (I-to-I) and the Micronutrient Forum-Addressing the Safety and Effectiveness of Vitamin A Supplementation. Adv Nutr. 11 (2), 185-199 (2020).
  10. van Stuijvenberg, M. E., et al. South African preschool children habitually consuming sheep liver and exposed to vitamin A supplementation and fortification have hypervitaminotic A liver stores: a cohort study. Am J Clinical Nutr. 110 (1), 91-101 (2019).
  11. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among Equations Used for Retinol Isotope Dilution in the Assessment of Total Body Stores and Total Liver Reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  12. Green, M. H., Green, J. B., Ford, J. L. Better Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method Are Possible with Deeper Understanding of the Mathematics and by Applying Compartmental Modeling. J Nutr. 150 (5), 989-993 (2020).
  13. Lietz, G., et al. Current Capabilities and Limitations of Stable Isotope Techniques and Applied Mathematical Equations in Determining Whole-Body Vitamin A Status. Food Nutr Bull. 37, S87-S103 (2016).
  14. Furr, H. C., et al. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  15. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).
  16. Fleshman, M. K., Riedl, K. M., Novotny, J. A., Schwartz, S. J., Harrison, E. H. An LC/MS method for d8-β-carotene and d4-retinyl esters: β-carotene absorption and its conversion to vitamin A in humans. J Lipid Res. 53 (4), 820-827 (2012).
  17. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  18. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of beta-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  19. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  20. Oxley, A., Lietz, G. Use of stable isotopes to study bioconversion and bioefficacy of provitamin A carotenoids. Meth Enzymol. 670, 399-422 (2022).
  21. Parker, R. S., et al. Study of beta-carotene metabolism in humans using 13C-beta-carotene and high precision isotope ratio mass spectrometry. Ann N Y Acad Sci. 691, 86-95 (1993).
  22. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
  23. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. G., Russell, R. M. Short-term (intestinal) and long-term (postintestinal) conversion of beta-carotene to retinol in adults as assessed by a stable-isotope reference method. Am J Clin Nutr. 78 (2), 259-266 (2003).
  24. Tang, G. W., Qin, J., Hao, L. Y., Yin, S. A., Russell, R. M. Use of a short-term isotope-dilution method for determining the vitamin A status of children. Am J Clin Nutr. 76 (2), 413-418 (2002).
  25. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats with C-13(4)-retinyl acetate and gas chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry. J Nutr. 130 (11), 2844-2849 (2000).
  26. van Breemen, R. B., et al. Development of a method for quantitation of retinol and retinyl palmitate in human serum using high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry. J Chromatogr A. 794 (1-2), 245-251 (1998).
  27. Fu, Y., Li, W., Flarakos, J. Recommendations and best practices for calibration curves in quantitative LC-MS bioanalysis. Bioanalysis. 11 (15), 1375-1377 (2019).
  28. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  29. van Lieshout, M., West, C. E., van Breemen, R. B. Isotopic tracer techniques for studying the bioavailability and bioefficacy of dietary carotenoids, particularly beta-carotene, in humans: a review. Am J Clinical Nutr. 77 (1), 12-28 (2003).
  30. Kane, M. A., Napoli, J. L. Quantification of endogenous retinoids. Methods Mol Biol. 652, 1-54 (2010).
  31. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84, 30-39 (2014).
  32. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Vitamin A zleyicileriRetinol zotop Dil syonuTandem K tle SpektrometrisiPlazma Retinol AnaliziRetinol KantifikasyonuSolvent EkstraksiyonuAtmosferik Bas n yonizasyonuRetinil Esterlerinin Ayr lmas
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.