Yöntem makalesi

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

DOI:

10.3791/69562

⸱

10 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücresi (hPSC) kaynaklı pankreas endokrin hücreleri, diyabet hücresi tedavisi ve hastalık modellemesi için umut vadeden bir kaynak oluşturur. Çeşitli farklılaşma protokolleri oluşturulmuş olmasına rağmen, in vivo implantasyon genellikle fizyolojik bağlamda olgunlaşma ve işlevi incelemek için gereklidir. Çoğu nakil yaklaşımı, böbrek kapsülü veya deri altı alanı gibi yerlere dayanır ve bu da teknik veya fizyolojik sınırlamalar oluşturabilir. Burada, immün eksikliği olan farelere hPSC kaynaklı pankreas SC-adacıklarının intrakas nakli için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu bölge, doğrudan cerrahi erişim, azaltılmış invazivlik ve sonraki analizler için güvenilir greft alımı sağlar. Bu işlem, kök hücre kaynaklı adacıqların kas içi implantasyonunu mümkün kılar ve ağızdan alınan glikoz sorunu sonrası insülin salgısının sonraki değerlendirmesi için iyileşmelerini destekler. Protokol, küme hazırlığı ve sıkıştırma, nakil cerrahisi, in vivo glukoz uyarılı insülin salgılanması (GSIS) ve greft toplama adımlarını içeren histolojik analiz için yer almakta olup, preklinik fare modellerinde intramusküler nakil için tekrarlanabilir bir çerçeve sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyabet, son otuz yılda yaygınlığı iki katına çıkan heterojen bir metabolik bozukluktur ve 2050 yılına kadar 1,3 milyar insanı etkilemesibeklenmektedir. 1. Diyet ve yaşam tarzı gibi çevresel faktörler tip 2 diyabetin (T2D) başlangıcında önemli rol oynasa da, genetik yatkınlık da patogenezi2'ye önemli ölçüde katkıda bulunur. Pankreas β hücreleri insülin sentezi ve salgılanmasından sorumludur ve diyabet patofizyolojisinde merkezi bir roloynar 3. Genetik riskin β-hücre işlev bozukluğuna nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için, insan kök hücresinden türetilen β hücreleri, üç boyutlu endokrin kümeler (bundan sonra SC-adaciği olarak adlandırılır) olarak organize edilmiş, son derece bilgilendirici ve ilgili bir model sistemisağlar 4,5. Son protokoller, pankreas gelişiminin temel aşamalarını özetleyerek insan kök hücrelerinin insülin üreten β hücrelerine ayırılmasını etkili bir şekilde yönlendiriyor ve belirli inhibitörler ve büyümefaktörleri 6,7 kullanılarak tekrarlanıyor.

Bu sistemler, gelişim dönüm noktalarını ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir bir şekilde güvenilir şekilde çoğaltarak, gelişimsel modellemeyi desteklemeyen ve tedarik kısıtlamalarına tabi olan bağışçı köklü adacıkların sınırlamalarını aşmaktadır. Fare modelleri pankreas gelişimi hakkında değerli bilgiler sağlamıştır, ancak insan hastalarda gözlemlenen fenotipik belirtileri genellikle tam olarak yenidenüretemezler 5. Sonuç olarak, kök hücre tabanlı bir sistemin kullanımı, insan pankreas gelişiminde ve β hücre işlev bozukluklarında rol alan genetik varyantların karakterizasyonunu mümkünkılar 8.

Bu gelişmelere rağmen, in vitro üretilen SC-adacikleri, yerli yetişkin β hücrelerine kıyasla transkriptomik ve fonksiyonel olarak olgunlaşmamış kalır. Glikozla uyarlanan insülin salgılanmasının optimal olmadığı ve MAFA ile G6PC2 9,10 gibi olgun β-hücre belirteçlerinin ekspresyonundan yoksundurlar. Bu boşluğu kapatmak için, immün eksikliği olan farelere nakil yoluyla in vivo olgunlaşma genellikle uygulanır; Bu genellikle hem insülin salgılanma dinamiklerini hem de gen ifade profilleriniiyileştirir 6.

Glikoz metabolizması sıkı bir şekilde düzenlenir ve sistemik ipuçlarının entegrasyonunu gerektirir. Nakledilen SC-adacikleri, birden fazla organdan gelen sinyalleri entegre edebilir ve insan β hücrelerindeki genetik varyasyonun fonksiyonel sonuçlarını değerlendirmek için kritik fizyolojik olarak daha önemli bir ortamsağlar 11.

Farelerde SC-isciği nakli farklı anatomik bölgelerde gerçekleştirilmiştir. Geleneksel bölge böbrek kapsülüdür; streptozotosin (STZ) ile tedavi edilen kemirgenlerde β hücre olgunlaşmasını teşvik etmek ve diyabetin tersine dönmesi için etkilidir12, ancak karmaşık bir invaziv cerrahi gerektirir ve bu da laboratuvarlarda uygulanmasınısınırlar. Ayrıca, bu yöntem tip 1 diyabetli hastaların tedavi için klinik ortamlara boyut ve damarlaşma sınırlamaları nedeniyle çevrilemez. Kas intuzi, deri altı ve yağ dokusu gibi alternatif nakil bölgeleri rapor edilmiştir; bunlar daha az invaziv ve klinik olarak daha uygulanabilir yollar sunmaktadır. Kas içi nakil, böbrekkapsülü 12 ile karşılaştırıldığında optimal β hücre olgunlaşması ve insülin salgılanmasını sağlama konusunda zorluklar yaratabilir, ancak yine de etkili insülin salgılanması ve glikoz homeostazının korunması sağlanabilir, aynı zamanda daha basit ve erişilebilir bir cerrahi yaklaşımsunabilir15,16.

Bu nedenle, bu protokolte, diğer nakil protokollerinin birkaç sınırlamasını ele alan bir kas içi nakil yaklaşımı sunuyoruz. Bu yöntem minimal invazivdir ve SC-adacıklarının olgunlaşması ve β hücre işlevsizliğiyle bağlantılı genetik varyantların araştırılması için güvenilir bir in vivo strateji sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pluripotent kök hücreler (hPSC) ve laboratuvar hayvanlarını içeren tüm deneyler, kurumsal, bölgesel ve ulusal etik komiteleri tarafından onaylandı. Burada kullanılan hPSC hatları, orijinal olarak kaynak kurumlarda uygun etik onaylar ve bilgilendirilmiş onay prosedürlerine uygun olarak türetilip dağıtılmıştır. Şekil 1 , hPSC bakımından yönlendirilmiş pankreas soyu farklılaşması ve olgunlaşmaya kadar genel iş akışını göstermektedir; nakil için uygun SC-adacıklara dönüşür.

1. hPSC'lerin pankreas öncüllerine ayırtılması

NOT: Bu protokol iki temel hazırlık adımına dayanır: 1) hPSC'lerin korunması ve genişletilmesi, 2) endokrin pankreas hattına yönelik yönlendirilmiş farklılaşmaları. Her iki adım daayrıntılı olarak 7,17 şeklinde tanımlanmıştır. hPSC'ler, Lyria-Leyte ve ark.17'nin önerilerine uygun olarak B8 ortamı kaplı plakalarda tutulur. HPSC'ler, üssel büyüme sırasında birleşmeden önce farklılaşmak için hasat edin. Önerilen tohumlama yoğunluğunda, ertesi gün %90-100 birleşime ulaşmalı, farklılaşmaya başlamaya hazır olmalıdır. Endokrin pankreas hattına doğru farklılaşma, Barsby ve ark.7 tarafından tanımlanan prosedüre göre gerçekleştirilir. Medyanın tam detayları Tablo 1'de bulunabilir.

  1. Farklılaşma plakalarını bazal membrandan türetilen ekstraselüler matriksle taze kaplayın.
  2. 0. günde 0,16-0,19 milyon hücre/cm2 tohum (6 kuyuyla bir plakadan bir kuyuda 1,7 milyon hücre). Besin tükenmesini önlemek için B8+CEPT'nin 1,5-2 katı hacmi kullanın (6 kuyu tabakta kuyuya 3-4 mL).
    NOT: hPSC'ler geçerken veya tohumlama farklılaşma deneyleri yapılırken, B8 ortamını geleneksel ROCK inhibitörü Y-27632 yerine CEPT ile tercihen destekliyoruz; çünkü bu madde hPSCsağkalımını artıra bildiği kanıtlanmış bir özellik nedeniyle. Buna rağmen, Y27632 bu protokol için geçerli bir alternatif olarak kalmaktadır.
  3. S1'den S4'e kadar olan farklılaştırıcı medyaları kullanarak medya değişikliklerini aşağıdaki programa göre yapın: S1 (1-4. günler), 2. (4-7. günler), 3. sezon (7-9. günler) ve 4. (9-11. günler).
    NOT: Tam medya besteleri için Tablo 1'e bakınız; ek prosedür detayları Barsby ve ark.7 tarafından açıklanmıştır.

2. 3B kümelerin oluşumu ve insülin üreten hücrelere farklılaşma

NOT: 11. günde, farklılaşmış hücreler pankreas öncüllerine dönüşmüş olmalı. Bu aşamada endokrin farklılaşmayı daha da teşvik etmek için hücreler planar kültürden 3D kültüre geçiş yapar.

  1. Ters piramidal mikrokuyular içeren (400 μm çapında) 24 kuyruklu mikrokuyu plakasının altını kapatmak için %5 (w/v) anti-yapışma çözeltisi eklenin (ayrıntılar için Tablo 1'e bakınız). Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.300 g santrifüj yapın.
    NOT: Anti-yapışma çözeltisi, hücrelerin plastiğe yapışmasını engelleyen ve eşit bir toplanması teşvik eden anti-yapışkan bir yüzey oluşturur.
  2. Mikro kuyrukları hava kabarcıkları için mikroskop altında inceleyin ve hapsolmuş havayı çıkarmak için gerektiğinde yeniden santrifüj yapın (Şekil 2A). Anti-yapışma çözeltisini aspire edin ve 2 kez 0,5 mL PBS ile yıka. Kuyular PBS ile kaplı bırakın ve kullanıma hazır olun.
  3. Hücreleri 1 mL PBS-0.5 mM EDTA ile yıkayın, PBS-EDTA'yı aspire edin ve kuyuları tripsinle (6 kuyuluğa sahip bir plaka için 1 mL) kaplayın. 37 ºC'de 8-12 dakika kuluçka yapın (tık atışı belirgin bir kopuşa yol açana kadar).
  4. Tripsini çıkarmayın; bunun yerine, 2x hacim DMEM-F12 veya PBS ile seyreldin ve pipetle nazikçe yeniden süzültür. Süspansiyonu konik bir tüpe yerleştirin ve hemen bir sonraki adıma geçin.
    NOT: Sert bir mekanik triturasyon yapmaktan daha iyi tripsin içinde kuluçka yapmak, daha iyidir.
  5. Süspansiyonu 200 g'de RT'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve pelleti önceden ısıtılmış S4 ortamında nazikçe tekrar askıya alın (24 kuyruklu mikrokuyunun her kuyusu için 1.25 mL).
  6. PBS'yi mikro kuyu çanaklarından aspire edin. Mikro kuyu plakasının her kuyusuna nazikçe 1,25 mL askıda kalmış hücreler ekleyin.
    NOT: 24 mikrokuyu plakasının her kuyusu, 1.200 mikro kuyu içerir. Uygun boyutta kümeler elde etmek için gereken tohumlama yoğunluğu, mikro kuyu başına 1.500 hücredir; bu da kuyu başına 1,8 milyon hücreye karşılık gelir. Alternatif olarak, hacim ve hücre sayısını ayarlayan 6-kuyruklu mikrokuyular kullanılabilir (5 mL Evre 4 ortamda yaklaşık 8,85 milyon hücre).
  7. Plakayı 100 g ile RT hızında 3 dakika boyunca santrifüjle ederek hücreleri mikro kuyruklarda eşit dağıtın. Mikro kuyu plakalarını dikkatlice nemlendirilmiş bir kuluçka makinesine aktarın.
  8. S5 (D14-D18), S6 (D18-D25) ve S7 (D25-D46) farklılaştırma ortamları kullanılarak medya değişiklikleri yapılabilir.
    NOT: Tam kompozisyon detayları Tablo 1'de sunulmakta, Barsby ve ark.7 tarafından tanımlanan ek prosedürel detaylar da bulunmaktadır.
    CEPT kokteyli, organoid oluşumu sırasında hücre hayatta kalma yeteneğini artırdığı kanıtlanmış olması nedeniyle ROCK inhibitörü Y-27632 yerine bu aşamada kullanılabilir. Başarılı bir toplaşma, 24-48 saat içinde kompakt, küresel kümelerin oluşmasıyla gösterilir ( bkz. Şekil 2B).

3. İmmmün eksikliği olan farelerin sıkı kaslarına SC-isiğinin nakli edilmesi

NOT: SC-adacıqları farklı farklılaşma aşamalarında (4. evreden 7. aşamaya kadar) nakil edilmiştir. Farklılaşmış S7 SC-adalarının nakli, glikozyanıtlılığını değerlendirmek için optimal strateji temsil ederken, erken evredeki öncüllerin (S4-S5) veya olgunlaşmamış SC-adacıqların (S6) nakli, in vitro olarak tanımlanmış kültür koşullarıyla gizlenen farklılaşma veya olgunlaşma farklılıklarını ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Ancak, daha az farklılaşmış aprogenitörlerin nakledilmesi, öncelikle kalıntı farklılaşmamış hücre popülasyonları nedeniyle teratoma oluşumu riskini artırır.

  1. Kümelerin sıkıştırılması
    1. Uygun küme miktarını 1,5 mL bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın (bkz. not).
      NOT: Hücre dozu deneysel hedefe bağlıdır. Histoloji için, güvenilir greft geri alımı için fare başına 0,5-1 milyon hücre yeterlidir; STZ ile tedavi edilen farelerde fonksiyonel testler veya diyabetin tersine çevrilmesi genellikle daha yüksek dozlar, 2-5 milyon hücreye kadar gerektirir. Sıkıştırmadan önce, SC-adacıqları ~150-250 μm (kabul edilebilir aralık: 100-300 μm) hedef çaplı bir küresel morfolojiye sahip olmalıdır. Bu boyut aralığı yaklaşık olarak ~10³-4 × küme başına 10³ hücreye karşılık gelir; büyük agregalar (>300-400 μm) daha hassas olmaları nedeniyle uzak durmalıdır. Küme büyüklüğü ve tekdüzelik, temsil kuyuların parlak alan veya stereomikroskop görüntülemesiyle sıkıştırmadan önce doğrulanır, ardından standart görüntü analiz yazılımı kullanılarak çap ölçümü yapılır.
    2. Şırıngayı iğne boru montajına bağlayın ve S7 ortamla doldurun.
    3. Kümeleri mikrosantrifüj tüpünden doğrudan boruya aspire edin. Boruyu ikiye katlayın ve katlanmış bölümü 200 μL pipet ucuna yerleştirin. Uç-boru iğnesi montajını 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve uçlarını bantla borunun kenarına sabitleyin.
    4. Tüpü 100 g'de 2 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlenerek kümeleri sıkıştırın. Tüpü hemen buz üzerine koyun.
  2. Kümelerin farelere nakil edilmesi
    NOT: Tüm cerrahi işlemler uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla ve kurumsal biyogüvenlik ve hayvan refahı düzenlemelerine uygun şekilde yapılmalıdır. Anestezik ve keskin maddeler, onaylanmış güvenlik prosedürlerine uygun şekilde ele alınmalı ve bertaraf edilmelidir.
    1. %3-5 isofluran kullanarak NOD-scid-gamma farelerinde anestezi indük edin.
    2. Sağ bacağın arka tarafını dizin altından tıraş edin ve %70 etanol ile dezenfekte edin.
    3. Boruyu pipet ucundan ayırın ve şırıngaya bağlayın. Boruyu sıkışmış kümelere yakın kesin ve iğnenin kör ucuna takın. Salini ilk küme iğnenin ucuna ulaşana kadar itin.
    4. Faresi yabu, sağa yaslanarak ve sağ bacağını uzat. İğneyi sağ uyluğun medial bölmesine, adduktör ve gracilis kasları arasındaki bölgeye 4-5 mm derinlikte yerleştirin.
    5. İğneyi ~3 mm geri çekerken kümeleri enjekte edin. Şırıngayı döndürün ve iğneyi çekin.
    6. Anesteziden tamamen iyileşene kadar fareyi izleyin.
      NOT: Fonksiyonel karakterizasyon için (yani in vivo GSIS, bölüm 4), fare başına tek bir genotipe sahip SC-adacıkları kullanılmalıdır; Tek bir nakil yeterlidir. Ancak, implantasyon sonrası olgunlaşmanın histolojik veya transkriptomik karakterizasyonu için her iki bacak da kullanılabilir (örneğin, bir bacak, hastalıkla ilişkili genetik varyant içeren hPSC'lerden türetilen SC-kümeleri taşıyor, diğer bacakta ise varyant düzeltilmiş halde). Doğru intramusküler doğum in vivo enjeksiyondan hemen sonra doğrulanamaz. Başarılı implantasyon, geri alınma sırasında greftin makroskopik tanımlanmasıyla geriye dönük olarak doğrulanır (Şekil 3) ve histolojik analizle (Şekil 4).

4. In vivo glikozla uyarlanan insülin salgısı (GSIS)

NOT: In vivo GSIS, oral glikoz mücadelesi yoluyla fonksiyonel insülin salgılanmasını fizyolojik bir uyarana yanıt olarak değerlendirir. Tüm prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım kılavuzlarına uymalıdır. Nakil edilen β hücrelerin fonksiyonel yanıtları in vivo olgunlaşmayla iyileşir: insan C-peptidi nakildən 2 hafta sonra tespit edilebilirken, güçlü glikoza duyarlı salgılanma genellikle 4 hafta içinde sağlanır. Bu zaman çizelgeleri, nakil sırasında SC-adacıklarının gelişim evresine bağlı olarak değişebilir

  1. Glikoz uygulamasından önce 4-6 saat hızlı fareler tutun, böylece suya erişimi garanti edin.
  2. Suda %20 (w/v) D-(+)-glikoz çözeltisi hazırlayın. 0.22 μm filtreden geçirip kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtarak sterilize edin.
  3. Her fareyi tartın ve gerekli glikoz dozunu 3 g/kg vücut ağırlığında hesaplayın.
  4. Uygun miktarda glikoz çözeltisini, 1 mL'lik bir şırıngaya bağlı 20 G'lik kavisli gavaj iğnesine yükleyin.
  5. Fareyi nazikçe tutun ve ağız dozu uygulayın; böylece trakeal aspirasyonu önlemek için gawage iğnesinin düzgün yerleştirilmesini sağlayın.
  6. Kan örnekleri başlangıçta (0 dakika) ve gavaj sonrası 15-30 dakika sonra, kapiller tüpler ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri kullanılarak submandibular veya kuyruk ven ponksiyonu ile alın. Kanın oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika pıhtılaşmasına izin verin, ardından tüpleri buzda saklayın.
  7. Örnekleri 1.000 g'de 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjle edin ve serumu yeni tüplere aktarın. ELISA analizine kadar −80 °C'de saklanın.
    NOT: Zaman noktaları deneysel modele bağlı olarak ayarlanabilir. Ksenotransplant modellerinde greft kaynaklı insülin salgılanmasını değerlendirmek için insan ve fare insülini veya C-peptidi ayırt edebilen bir test kullanmak kritik öneme sahiptir.

5. Aşılanmış kümelerin geri alınması

  1. Kurumsal hayvan etik kurallarına uygun olarak fareyi ötenazi yapın.
  2. Tüyle doku kontaminasyonunu en aza indirmek için, vücut üzerine %70 (v/v) etanol püskürtün.
  3. Deriyi çıkararak alt uzuv kaslarını açığa çıkarın ve aşılanmış kümeleri büyüteç ile konumlandırın. Gazlı dokuları makas ve pensis ile greft içeren dokuları alın.
  4. Dokuyu bir kez PBS ile durulayın ve buz üzerinde %4 (w/v) paraformaldehit (PFA) olarak geçirin. Dokuyu %4 PFA'da 4 °C'de nazikçe sallayarak 4 saat boyunca sabitleyin.
  5. Numuneyi PBS'de 1 saat boyunca hafifçe çalkalayarak yıka. Dokuyu PBS ile %30 (w/v) sakaroza aktarın ve gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın.
    NOT: Biyolojik dokular, kan örnekleri ve kimyasal atıklar (fiksatörler ve anestezik kalıntıları dahil) kurumsal biyogüvenlik ve kimyasal atık yönetimi yönergelerine uygun şekilde bertaraf edilmelidir.

6. Dışkıların boyalanması

  1. OCT gömü
    1. Dokuyu Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiğiyle doldurulmuş bir kalıba gömül.
    2. Kalıpı kuru buz-izopropanol banyosuna yerleştirerek numuneyi hızlı dondurabilirsiniz. -80 °C'de kriyoseksiyon yapılana kadar saklayın.
    3. Kriyostat kullanarak 5-7 μm kesitler kesin ve slaytları -80 °C'de sakla.
  2. İmmünboyama
    1. Yoğuşmayı önlemek için slaytları RT rejiminde 15 dakika boyunca bir kapta dengeleyin.
    2. Slaytları PBS ile 3 x 5 dakika durulayın.
    3. Her bölümü RT'de 30 dakika boyunca 100 μL bloklama/permeabilizasyon çözeltisi ile inkübe edin (PBS'de %0,1 noniyonik yüzeyaktif madde, ikincil antikorun çıkarıldığı türde %5 serum).
    4. Her bölümü 4 °C'de gece boyunca bloklayıcı/permeabilizasyon çözeltisinde seyreltilmiş 50 μL primer antikor ile inkübe edin.
    5. Slaytları PBS ile 3 x 5 dakika durulayın.
    6. Her bölümü RT'de 1 saat içinde bloklama/permeabilizasyon çözeltisiyle seyreltilmiş 50 μL ikincil antikor ile inkübe edin.
    7. Slaytları PBS ile 3 x 5 dakika durulayın.
    8. Sürgüleri DAPI ile 15 μL montaj çözümüyle monte edin ve bir örtü kaydırması uygulayın. Görüntülemeye kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gösterilen sonuçlar, Evre 7 SC-adaciklerinin bağışıklık eksikliği olan farelere kas içi nakli ve transplantasyondan 6 hafta sonra yapılan analizlere karşılık gelmektedir. Temsil etraf taşıyan sınırlı sayıda hayvan, prosedürün uygulanabilirliğini göstermek için analiz edildi. Bu çalışmada, başarılı bir sonuç, intrakas greftinin makroskopik olarak geri alınması ve ardından nakil edilen SC-adacıqlarının hayatta kalma ve endokrin kimliğinin histolojik olarak ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, SC-adacıqlarının kas içi naklini, işlevsel değerlendirme potansiyeline sahip in vivo olgunlaşma için basit, tekrarlanabilir ve minimal invaziv bir yaklaşım olarak tanımlıyoruz. Böbrek kapsülü altında nakil, kemirgenlerde adacığak veya SC-isiği nakleti için yaygın olarak "altın standart" olarak kabul edilse de, daha fazla teknik uzmanlık ve daha uzun cerrahi bir işlem gerektirir. Buna karşılık, kas içi bölge prosedürel sadelik ve hızlı uygulama sunar; 3Rs çerçevesi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan hPSC hatlarını cömertçe sağladığı için Dr. Danwei Huangfu'ya (Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi, New York, ABD) teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, İspanya Bilim, İnovasyon ve Üniversiteler Bakanlığı MICIU/AEI/10.13039/501100011033 ve Next GenerationEU/PRTR (A.B.) tarafından alınan PID2021-122284NA-I00 ve CNS2023-145179 hibeleri ile CIBER-Biyomedikal Araştırma Konsorsiyumu CB07/08/0029 ve PID2023-150719OB-I00 (M.V.), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) tarafından desteklendi. Diyabet ve İlgili Metabolik Bozukluklarda Biyomedikal Araştırma Merkezi (CIBERDEM), ISCIII'nin bir girişimidir ve kısmen Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (FEDER) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-Phospho-L-askorbik asit trisodyum tuzuSigma Aldrich49752
Activin AQkineQk001
AggreWell 400 24-kuyu (mikro kuyu plakası)Stemcell34415
BetasellülinGenScriptZ03102
Bovino Serum Albumini, Fraksiyon V, Yağ Asidi İçeriği YokGoldbioA-421
CHIR 99021LC labsC-6556 
Kroman-1Medchem ExpressHY-15392CEPT kokteyli
CMRL-1066Pan BiotechP04-84600
D-(+)-GlukozSigma AldrichG7021
Dibenzazepin (DBZ)SyncomÖzel ürünGamma-sekretaz inhibitörü
Dulbecco's Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı ve Ham’s F12 ortamı (DMEM/F12)Corning15383541
EGFQkineQk011
EmricasanMedchem ExpressHY-10396CEPT kokteyli
EtanolaminSigma AldrichE9508
FGF2-G3GenScriptÖzel ürün
FGF7GenScriptZ03047
HeparinSigma AldrichH3149
İnsülinGibco30284510
L-Alanil-L-GlutaminLinusX0551-100
L-Askorbik AsitSanta Cruzsc-202686
LDN-193189 Sigma AldrichSML0559
Lipid KonsantraGibco11548846
Matrigel (bazal membran türevi hücre dışı matris)Falcon354230
MCDB 131Corning15-100-CV
N-asetilsisteinThermo Scientific10521221
NaHCO3Fisher Scientific10553325
NikotinamidSigma AldrichN0636
NRG-1QkineQk045
Pluronic F-127 (yapışma önleyici çözelti)Sigma Aldrich82184%5 (w/v) olarak kullanılır
Poliamin Takviyesi (1000×)Sigma AldrichP8483CEPT kokteyli
RepSoxMedChemExpressHY-13012Alk5 İnhibitörü
Retinoik AsitSigma AldrichR2625
SANT-1SelleckchemS7092
Sobetirome (GC1)Sigma AldrichSML1900-5MGHücreye geçirgen T3 analogu
Sodyum PiruvatCorning25-000-CI
Sodyum SelenitSigma AldrichS5261
T3 (3,3′,5-Triodoi-L-tiironin sodyum tuzu)Sigma AldrichT6397
TGF-β1 QkineQk010
TPBTocris5343
Eser Elementler ACorning15333641
Eser Elementler BCorning15343641
Trans-ISRIBMedchem ExpressHY-12495CEPT kokteyli
TransferrinInVitria777TRF029
Triton X-100 (noniyonik yüzey aktif madde)Thermo Scientific11488696
TrypLEGibco11538856
Y-27632LC LaboratoriesY-5301ROCK inhibitörü
ZM-447439 MedChemExpressHY-10128
ZnSO4Sigma AldrichZ0251
Antikorlar
Rat anti-Human C-peptidi (insülin)DSHBGN-ID4-s150 ng/mL olarak kullanılır
Mouse anti-glukagonaProteintech67286-1-Ig1:2000
Rabbit anti-somatostatinMilliporeAB54941:500
Goat anti-rat AF488InvitrogenA-110061:500
Donkey anti-mouse AF488InvitrogenA-212021:500
Donkey anti-rabbit AF488InvitrogenA-212061:500

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, K. L., et al. regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. The Lancet. 402 (10397), 203-234 (2021).
  2. Ismail, L., Materwala, H., Al Kaabi, J. Association of risk factors with type 2 diabetes: A systematic review. Comput Struct Biotechnol J. 19, 1759-1785 (2021).
  3. Prasad, M. K., Mohandas, S., Ramkumar, K. M. Dysfunctions, molecular mechanisms, and therapeutic strategies of pancreatic β-cells in diabetes. Apoptosis. 28 (7-8), 958-976 (2023).
  4. Xue, D., et al. Functional interrogation of twenty type 2 diabetes-associated genes using isogenic human embryonic stem cell-derived β-like cells. Cell Metab. 35 (11), 1897-1914.e11 (2023).
  5. Bartolomé, A. Stem cell-derived β cells: A versatile research platform to interrogate the genetic basis of β cell dysfunction. Int J Mol Sci. 23 (1), 501(2022).
  6. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nat Biotechnol. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  7. Barsby, T., et al. Differentiating functional human islet-like aggregates from pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (4), 101711(2022).
  8. Shi, Z. -D., et al. Genome editing in hPSCs reveals GATA6 haploinsufficiency and a genetic interaction with GATA4 in human pancreatic development. Cell Stem Cell. 20 (5), 675-688.e6 (2017).
  9. Fantuzzi, F., et al. In depth functional characterization of human induced pluripotent stem cell-derived beta cells in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 10, e967765(2022).
  10. Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Single-cell transcriptome profiling reveals β cell maturation in stem cell-derived islets after transplantation. Cell Rep. 32 (8), 108850(2020).
  11. Lin, H., et al. Glucose metabolism and regulation in establishing human stem cell-derived β cell maturation. Cell Rep. 44 (7), 115892(2025).
  12. Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation. Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).
  13. Thévenet, J., Gmyr, V., Delalleau, N., Pattou, F., Kerr-Conte, J. Pancreatic islet transplantation under the kidney capsule of mice: Model of refinement for molecular and ex-vivo graft analysis. Lab Anim. 55 (5), 408-416 (2021).
  14. Scholl, V. G. S., et al. Assessing implantation sites for pancreatic islet cell transplantation: Implications for type 1 diabetes mellitus treatment. Bioengineering. 12 (5), 499(2025).
  15. Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), e141553(2021).
  16. Lithovius, V., et al. Non-invasive quantification of stem cell-derived islet graft size and composition. Diabetologia. 67 (9), 1912-1929 (2024).
  17. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  18. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  19. Wells, S. A., Ellis, G. J., Gunnells, J. C., Schneider, A. B., Sherwood, L. M. Parathyroid autotransplantation in primary parathyroid hyperplasia. N Engl J Med. 295 (2), 57-62 (1976).
  20. Kim, H. -I., Yu, J. E., Park, C. -G., Kim, S. -J. Comparison of four pancreatic islet implantation sites. J Korean Med Sci. 25 (2), 203(2010).
  21. Axen, K. V., Pi-Sunyer, F. X. Long-term reversal of streptozotocin-induced diabetes in rats by intramuscular islet implantation. Transplantation. 31 (6), 439-441 (1981).
  22. Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18 (1), 47-54 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Pl ripotent K k H crelerK k H cre Adac klarDiyabet H cre Tedavisimm n yetmezlikli FarelerGlukozla Stim le Edilmi ns lin Sal n mGreft Geri Kazan mK me Haz rlamaHistolojik Analiz

İlgili makaleler