HER2-pozitif meme kanserinde drenaj ve metastatik lenf düğümlerinin RNA-seq profillenmesi, POSTN'yi prognostik bir belirteç olarak tanımlıyor

Özet

HER2-pozitif meme kanserinde lenf düğüm yayılımının temelini oluşturan ekstrasellüler matriks ve PI3K-AKT merkezli bir programı ortaya koyuyoruz ve POSTN'yi, risk tabakasını ve yol yönlendirilmiş terapötik stratejileri destekleyen kötü prognoz belirteci olarak tanımlıyoruz.

Özet

HER2-pozitif meme kanseri klinik olarak agresiftir ve sık sık bölgesel lenf düğümlerine yayılır, ancak nodal yayılımla ilişkili transkriptomik programlar henüz tam olarak tanımlanmamıştır. Burada, HER2-pozitif meme kanseri olan altı hastadan RNA dizileme (RNA-seq) kullanarak eşleşen tümör drenajı lenf düğümleri (TDLN) ve metastatik tümörle ilgili lenf düğümleri (TMLN) profilini oluşturduk. Diferansiyel ifade analizi, Benjamini-Hochberg düzeltmesi (FDR < 0.05) ve mutlak log2 katlama eşiği (|log2FC| ≥ 1) uygulanarak DESeq2 ile gerçekleştirildi. TMLN ve TDLN'de 237 farklı şekilde ifade edilen gen tespit ettik (182 yukarı regülasyonlu ve 55 aşağı regulasyonlu gen). Fonksiyonel zenginleştirme analizleri, metastatik lenf düğümleriyle ilişkili önde gelen yollar olarak ekstraselüler matriks (ECM)-reseptör etkileşimi, PI3K-AKT sinyalizasyonu, odak yapışma ve kolesterol metabolizmasını öne çıkardı; bu da nodal yayılım sırasında koordineli ECM yeniden modellenmesi ve sinyal aktivasyonunu önerdi. En çok regülasyonlu genler arasında POSTN önemli bir aday olarak ortaya çıktı ve olumsuz klinikopatologik özelliklerle de ilişkilendirildi. Bağımsız bir doğrulama kohortunda (n = 120), daha yüksek POSTN ifadesi düşük hastalıksız hayatta kalma ile ilişkilendirildi. Bu sonuçlar topluca, POSTN'u potansiyel prognostik biyobelirteç olarak göstermekte ve HER2-pozitif meme kanserinde lenf düğümü metastazının uygulanabilir biyolojik özellikleri olarak ECM merkezli ve PI3K-AKT ile ilgili mekanizmaları desteklemektedir.

Giriş

Meme kanseri (BC), kadınlarda en sık teşhis edilen kanser olup, dünya çapında kanser ölümünün önde gelen nedenlerinden biridir; Çin'de önemli ve artan bir yük^{vardır 1}. BC'lerin yaklaşık %15-%20'si HER2-pozitiftir (HER2+), ERBB2 amplifikasyonu/aşırı ekspresyonu ve daha yüksek nyöleme ve ölüm riski olan agresif^{fenotiple karakterize edilir 2,3}. Anti-HER2 sistemik tedavi sonuçları belirgin şekilde iyileştirmiş olsa da, hastaların önemli bir kısmı hâlâ nüks veya metastaz geliştiriyor; bu da biyolojik olarak bilinçli risk tabakalaşması ve yeni tedavi seçeneklerine olan ihtiyacı^{vurgulamaktadır 4}.

Lenf düğümü metastazı (LNM), BC'de aşamalandırma, adjuvan tedavi seçimi ve prognozda kritik belirleyicidir; Aksiller tutulma, alt hayatta kalma habercisidir ve uzak organlara daha fazla yayılmayı^{kolaylaştırır 5,6}. Ancak HER2+ hastalığında nodal yayılımın biyolojisini yakalayan sağlam biyobelirteçler sınırlı kalıyor ve mevcut klinopatolojik faktörler sonuç heterojenliğini yalnızca kısmen^{açıklıyor 7}.

RNA-siq'taki gelişmeler, transkriptom genelinde, yüksek dinamik aralıklı profilleme imkanı sağlar ve günümüzde translasyonel onkolojide yaygın olarak^{benimsenmektedir 8}. Ancak, HER2+ BC'deki çoğu ekspresyon çalışması primer tümörler veya eşleşmemiş kohortlar üzerine odaklanırken, eşleşen tümör drenaj lenf düğümleri (TDLN) ve tümör-metastatik lenf düğümlerinin (TMLN) karşılaştırmalı profillenmesi seyrektir ve bu da nodal kolonizasyon ve ilerlemeyi oluşturan moleküler programlara dair bilgiyi^sınırlar.

Lenf düğümü metastazının klinik önemi ve metastatik tohumlama^10'da hücre dışı matriks (ECM) yeniden modellemesi ile PI3K-AKT aktivasyonunu ilişkilendiren önceki kanıtlara dayanarak, aynı hastada tümör-metastatik lenf düğümlerinin (TMLN) eşleşen tümör drenaj lenf düğümlerine (TDLN) kıyasla belirgin bir transkriptomik program sergileyeceğini ve sürekli olarak yükseltilmiş ECM ile ilişkili genlerin bir alt kümesinin olumsuz klinikopatolojik özelliklerle ilişkilendirileceğini ve Tekrarlanma riski. Bu hipotezi test etmek için, altı HER2 pozitif hastadan eşleştirilmiş TDLN ve TMLN profilini alarak nodal yayılımla ilişkili farklı ekspresyoner genleri (DEG) ve yolları tespit ettik. Daha sonra POSTN'i önceliklendirdik ve bağımsız bir kohortta prognostik önemini değerlendirdik; ECM yeniden yapılandırması ve PI3K-AKT sinyalini HER2+ meme kanserinde klinik olarak faydalı risk stratifikasyonu ile ilişkilendirdik. HER2 değerlendirmesi (çağdaş ASCO-CAP kriterlerine göre), dizileme kalite kontrolü, DESeq2 ile DEG çağrısı ve Benjamini-Hochberg FDR kontrolü ile doğrulama prosedürlerinin detayları burada^{verilmiştir 11,12}.

Protokol

Bu çalışma, kurumsal etik komitesi tarafından onaylanmış ve Helsinki Bildirgesi ile insan biyonumunelerinin kullanımını düzenleyen yerel düzenlemelere uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışma, Zhongshan Boai Hastanesi etik komitesi tarafından onaylandı (KY-2020-012-124). Herhangi bir çalışmaya özel prosedürden önce tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.

Çalışma kohortları ve örnekleri
Keşif kohortu, HER2-pozitif meme kanseri olan 6 hastadan ameliyat sırasında toplanan çift tümör drenaj lenf düğümü (TDLN) ve metastatik lenf düğümü (TMLN) dokularından oluşuyordu. Her hasta için eşleşen TDLN, metastaz için histolojik kanıtı olmayan drenaj lenf düğümü olarak tanımlandı ve hasta içi kontrol karşılaştırıcısı olarak hizmet verirken, TMLN patoloji tarafından doğrulanmış metastatik doku olarak kullanıldı. Taze dokular soğuk fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla (PBS) kısa süreliğine durulandı, kurutuldu, eksizyondan sonra 30 dakika içinde sıvı azotta donduruldu ve ekstraksiyona kadar -80 °C sıcaklıkta saklandı. Dahil etme kriterleri patolojik olarak doğrulanmış invaziv meme karsinomu, ASCO/CAP başına HER2-pozitif durum, çift düğümlerin bulunabilirliği ve neoadjuvan tedavi olmamasıydı. Dışlama kriterleri yetersiz doku veya RNA bütünlük numarası (RIN) < 7.0'dı. Başlangıçta taranan bir örnek, RIN < 7.0 nedeniyle kalite kontrol başarısız olmuş ve hariç tutulmuştur, bu nedenle tüm keşif analizleri tutarlı şekilde n = 6 kullanır. Bağımsız doğrulama kohortu, klinik takibi olan 120 arşivli FFPE lenf notu örneğinden oluşuyordu ve qRT-PCR ile sonuç analizleri için kullanıldı. Prognostik modelleme için, hastalar POSTN ifade gruplarına göre karşılaştırıldı (Yüksek ve Düşük, kesim noktası X-tile ile belirlendi), Düşük grup referans karşılaştırıcı olarak hizmet verdi. Takip eksikliği veya eksik kovaryatları olan vakalar prognostik modellemede hariç tutuldu.

Örnek boyutu gerekçesi (Keşif ve doğrulama)
Keşif aşaması, hasta içi kontrastı maksimize etmek ve bireyler arası varyansı azaltmak için eşleştirilmiş TDLN-TMLN tasarımı kullandı; FDR = 0.05 çokluğu kontrol etti. Doğrulama kohortu (n = 120) için, POSTN ifadesi X-tile ile belirlenen kesim noktasında bölünmüştür (Yüksek/Düşük = 40/80). 48 hastalıksız sağlıkta (DFS) olay ve α = 0.05 olduğunda, Schoenfeld yaklaşımı eşit dağılım altında yaklaşık HR 2.3 ≥ klinik olarak ilgili risk oranlarını tespit etme için %80 güç ≥ gösterir; bu, gözlemlenen etki boyutuyla tutarlıdır (HR = 2.31, %95 GA 1.41-3.77).

HER2 pozitifliğinin tanımı
HER2 pozitifliği, çağdaş ASCO/CAP ^{kriterleri 13'ü} takip etti: immünohistokimya (IHC) 3+, tümör hücrelerinin >%10'unda uniform yoğun membran boyama olarak tanımlanır veya HER2/CEP17 oranı ≥2.0 olarak tanımlanan in situ hibritizasyon (ISH) ile amplifikasyon ile HER2/CEP17 oranı 2.0 ile tanımlanır ve hücre başına ortalama HER2 kopya sayısı ≥4.0 sinyal elde edilir. IHC 2+ sonuçları, amplifikasyon durumunu doğrulamak için ≥20 invaziv tümör hücresinin kör sayımı ile refleks ISH geçirdi.

Doku işleme ve RNA izolasyonu
Tüm işlemler, belirtilmedikçe buz üzerinde, RNase içermeyen tüketim malzemeleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her ≤ 100 mg doku içeren her örnek için, 1 mL asit guanidinyum tiosiyanat-fenol-kloroform reaktifi (AGPC) içinde homojenizasyon yapıldı, ardından 15 saniye sert karıştırma ve 2-3 dakika oda sıcaklığında kuluçka ile 200 μL kloroform eklendi. Faz ayrımı, 12.000 x g ile 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjle sağlanmıştır. Sulu tabaka daha sonra yeni bir tüpe aktarıldı ve RNA, oda sıcaklığında 10 dakikalık kuluçkadan sonra 500 μL izopropanol ile çökeldi. Pelletleme işlemi 12.000 x g ile 10 dakika boyunca 4 °C'de tamamlandı. Pellet, 1 mL %75 etanol ile yıkanmış, 7.500 x g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika santrifüjlenmiş, 5-10 dakika hava kurutulmuş ve RNase içermeyen suda çözünmüştür. Genomik DNA aktarma şüphesi olduğunda sütun içi DNaz I sindirimi kullanıldı. Görsel kontrol noktaları arasında kloroform ekstraksiyonundan sonra net faz ayrımı ve izopropanol çökelmesinden sonra sağlam bir saydam pelet vardı. Sorun giderme çalışmaları arasında düşük A260/230 oranlarında etanol yıkamanın tekrarlanması ve yağışın uzatılması veya düşük verim için peletleme sırasında soğutma sağlanması yer alıyordu.

RNA kalite kontrolü
Nicel belirleme, A260/280 ve A260/230'u 1.8-2.1 civarında hedeflerle izlemek için spektrofotometri kullandı ve doğruluk için florometrik ölçümle tamamlandı. Bütünlük, mikrofluidik elektroforez sisteminde değerlendirildi ve RIN ≥ 7.0 gerektirdi. Kabul kriterleri olarak belirgin 18S/28S rRNA zirveleri ve genomik DNA smear'ının olmaması kullanıldı; eşikleri geçmeyen örnekler yeniden çıkarıldı veya dışlandı.

Kütüphane hazırlığı
Zincirlenmiş mRNA kütüphaneleri, sağlam RNA için poly(A) seçimi ile inşa edildi, kısmen bozunmuş girdiler için rRNA tükenmesine izin verildi. Tipik girdi≥ her kütüphane için toplam 1 μg RNA idi. Parçalanma işlemi 8 dakika boyunca 94 °C civarında gerçekleştirildi; 50 dakika boyunca 50 °C'de birinci zincir cDNA sentezi; ikinci iplik sentezi 16 °C'de 60 dakika boyunca; 20 °C'de 15 dakika boyunca adaptör ligasyonu; PCR amplifikasyonu ise aşırı amplifikasyonu önlemek için ayarlanmış 10-12 döngü kullanıldı. Temizliklerde boncuk oranları yaklaşık 0.8x-1.0x civarında kullanıldı ve beklenen kütüphane boyutu dağılımı adaptörler dahil 300 bp idi. Kütüphane kalitesi mikrofluidik elektroforez ile doğrulandı; Adaptör-dimer kirlenmesi daha sıkı bir temizlik gerektirdi ve aşırı geniş boyut dağılımları, parçalanmanın biraz kısaltılmasıyla düzeltildi.

Dizileme
İndekslenen kütüphaneler, eşli uçlu 150 bp (PE150) modunda sıralandı ve her kütüphane için 30 milyon okunma çifti hedeflendi. Çalışma seviyesi kalitesi için Q30 ≥% 90 ve stabil küme yoğunlukları ile minimum şerit önyargısı gerekiyordu. Kütüphaneler, toplu etkileri azaltmak için şeritler arasında rastgele ayrıldı ve çapraz kirlemeyi izlemek için kullanılan nöbetçi kontrolleri belgeleyen şerit atamalarını kaydetti.

Hesaplamalı analiz ve diferansiyel ifade
Analizler R (v4.3.2) ile Linux üzerinden yapıldı. Ham okuma kalitesi FastQC (v0.11.9) ile değerlendirildi. Adaptör ve kaliteli kırpma, fastp (v0.23.4) ile otomatik adaptör algılama, kaydırmalı pencere kesme (pencere boyutu 4 bp; ortalama Phred Q ≥ 20), minimum okuma süresi 50 bp ve ilgili kimyalar tespit edildiğinde poli-G kırpma ile gerçekleştirildi. Okumalar, kütüphanelere uygun ipliklilik parametreleri ve bilinen splice-site indeksleriyle HISAT2 (v2.2.1) kullanılarak GRCh37/hg19 referans genomuna hizalanmıştır. Gen seviyesi sayımları, eşleştirilmiş uç sayımı, chimerik okuma işleme, çoklu haritalayıcı farkında ayarlar ve doğru ipliklilik bayrağı kullanılarak GENCODE v19'a karşı featureCounts (Subread v2.0.3) ile oluşturuldu. Düşük sayıya sahip genler, en az üç örnekte 10 ≥ sayım gerektirerek filtrelendi. Diferansiyel ifade (DE) analizi, TMLN ile TDLN'yi karşılaştırmak için DESeq2 (v1.40.2) kullanılarak eşleştirilmiş bir tasarım (tasarım = ~ çift + koşul) kullanılarak yapıldı; varsayılan boyut faktörü normalizasyonu ve log2 katlama değişimi apeglm ile karşılaştırıldı. Olası istisnalar Cook'un mesafesi kullanılarak değerlendirildi. Transkriptom genelinde çokluluk Benjamini-Hochberg yanlış keşf oranı (FDR) kullanılarak kontrol edildi. Anlamlılık FDR < 0.05 ve mutlak log2 katlama değişim eşiği (|log2FC|) ≥ 1 olarak tanımlanmıştır. DESeq2'nin negatif-binomial çerçevesi, sayım verileri için uygun ortalama-varyans modellemesi sağlar ve küçük-orta ölçekli kohortlarda katlanma değişim tahminlerini stabilize eder. Duyarlılık analizleri olarak, aynı filtreleme kriterleri ve FDR eşikleriyle edgeR ve limma-voom kullanılarak DE testlerini yeniden yaptık; bu da ana analiz seçeneklerinin sağlamlığını destekleyen uyumlu, en üst sıralı sinyaller elde etti.

Fonksiyonel zenginleştirme (GO ve KEGG)
Fonksiyonel açıklama, clusterProfiler (v4.8.3) kullanılarak R'de gerçekleştirilmiştir. Yukarı ve aşağı düzenlenen DEG'ler ayrı ayrı analiz edildi. Gen tanımlayıcıları, zenginleştirmeden önce Entrez Gen ID'lerine (organizma: Homo sapiens) eşlendi. Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirmesi, enrichGO (OrgDb: org. Hs.eg.db; ont = BP/CC/MF; pAdjustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0.05; qvalueCutoff = 0.05) ve KEGG yol zenginleştirmesi enrichKEGG kullanılarak gerçekleştirildi (organizma = "var"; pAdjustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0.05; qvalueCutoff = 0.05). Arka plan evreni, DE analizinde düşük sayılı filtreleme sonrası korunan tüm ekspres genler olarak tanımlandı. Zenginleştirilmiş terimler ayrıca 10-500 açıklamalı gen setlerini korumak için filtrelenmiştir (minGSSize = 10; maxGSSize = 500). Görselleştirmeler, gen oranı ve -log10 (ayarlanmış P) değerlerinin nokta grafikleri dahil olmak üzere ggplot2 (v3.5.1) ve ComplexHeatmap (v2.16.1) kullanılarak oluşturuldu; "Bağışıklık yanıt yolları" terimi, antijen işleme ve sunum, interferon sinyal iletimi ve lenfosit aktivasyonunu kapsayan özenli GO modüllerini ifade eder.

Dış veritabanı sorgusu
Aday genler, ortogonal bağlam sağlamak için dış kaynaklarda sorgulandı. Tümör ve normal mRNA ekspresyonu, GEPIA2 (v2.0) kullanılarak TCGA meme invaziv karsinom (TCGA-BRCA) tümör örnekleri kullanılarak normal meme dokularıyla karşılaştırıldı (mevcut GTEx/TCGA normalleri). GEPIA2 tarafından bildirilen ifade değerleri (log2[TPM+1]) ve grup karşılaştırmaları için varsayılan istatistiksel test çerçevesi, her sorgulanan gen için kutu grafikleri ve P değerleri oluşturmak için kullanıldı. Protein düzeyinde lokalizasyon, İnsan Protein Atlası (HPA) kullanılarak meme dokusu/kanser için Tissue Atlas ve Patoloji Atlas'tan immünohistokimyasal görüntüler ve notasyonlar incelenerek ve bildirilen boyama yoğunluğu ile hücresel bölmenin (örneğin, stromal vs epitelyal) kaydedilmesiyle değerlendirildi.

qRT-PCR doğrulaması
Bağımsız lenf düğümü dokuları yukarıda belirtildiği gibi işlenmiş ve toplam RNA çıkarılmış ve cDNA, 20 μL ters transkripsiyon reaksiyonlarında 1 μg RNA'dan sentezlenmiştir. SYBR tabanlı kimya kullanılarak nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirildi; her reaksiyonda 1x master karışım ve her primerden 0,2-0,4 μM bulundu. Astar özgüllüğü, tek zirveli erime eğrisi profilleriyle doğrulandı ve amplifikasyon verimliliği seyreltme serisi standart eğriler kullanılarak değerlendirildi; kabul edilebilir verimlilikler %90-%110 olarak tanımlandı. Her örnek teknik üçlü olarak analiz edildi; tekrarların döngü eşiği (Ct) SD ≤ 0.3'ü karşılaması gerekiyordu. Gen ifadesi GAPDH'ye (veya uygun olduğunda başka bir doğrulanmış referans gene) normalize edildi ve göreli ifade 2^-ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı. Normallik Shapiro-Wilk testleriyle değerlendirildi; gruplar arası karşılaştırmalarda yaklaşık normal veriler için iki taraflı t-testleri veya aksi takdirde Mann-Whitney U testleri kullanıldı.

Doğrulama kohortunda prognostik analiz
Hastalıksız sağlık, birincil son nokta olup, ameliyat tarihinden ilk belgelenmiş nyölenme olayına veya son takipine (sansürlü) kadar hesaplandı. Birincil analizde, POSTN ifadesi X-tile ile belirlenen kesim noktasında ikilileştirildi (Yüksek vs Düşük = 40/80); Duyarlılık analizlerinde tertiller gibi alternatif kesim noktaları kullanıldı. Tek değişkenli karşılaştırmalar için Kaplan-Meier eğrileri ve log-rank testleri kullanıldı. Çok değişkenli Cox orantılı riskli modeller, yaş, tümör boyutu, nodal durum, histolojik derece ve reseptör durumu için önceden ayarlanarak risk oranlarını (HR) ve %95 güven aralıklarını tahmin etmeye uygundu. Orantılı riskler varsayımı Schoenfeld kalıntıları kullanılarak değerlendirildi, kollineerlik varyans-enflasyon faktörleriyle incelendi ve etkili gözlemler dfbetalarla değerlendirildi. Tam vaka analizleri, yukarıda açıklandığı gibi eksik takip veya eksik kovaryatların olduğu vakalar hariç tutulduktan sonra yapılmıştır.

Genel istatistikler ve raporlama
Aksi belirtilmedikçe, veriler ortalama SD veya medyan (IQR) ± olarak özetlenir, iki taraflı testler kullanılır ve p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir. Transkriptom çapında analizler ve zenginleştirme için, çokluk BH-FDR ile kontrol edilir ve etki büyüklükleri mümkün olduğunda %95 güven aralıklarıyla desteklenir.

Güvenlik ve atık bertarafı
Fenol-guanidinyum reaktifleri ve organik çözücüler, laboratuvar önlükleri, nitril eldivenleri ve sıçrama koruması ile sertifikalı bir duman davlumonunda işlendi. Organik ve halojenlenmiş atıklar etiketlenmiş kaplara ayrılarak kurumsal politikalara uygun olarak bertaraf edildi. Biyolojik atık, bertaraf edilmeden önce otoklavlanıyor veya kimyasal olarak dezenfekte edilmiş, yüzeyler ve aletler RNase inaktive edici çözeltilerle dezenfekte edilmişti. Koroziflik ve toksisite gibi reaktiflere özgü tehlikeler laboratuvar SOP'lerinde belgelenmiş ve tüm işlemler sırasında gözlemlenmiştir.

Sonuçlar

Kohortlar ve klinikopatologik özellikler
Keşif kohortu 6 çift TDLN/TMLN örneğinden oluşuyordu ve doğrulama kohortu 120 arşivsel lenf nodu örneğinden oluşuyordu ve boylamasına takibi yapıldı. Her iki kohortun da yaş, tümör boyutu, derecesi, reseptör durumu ve nodal durum gibi başlangıç klinikopatolojik özellikleri Tablo 1'de özetlenmiştir.

Dizileme kalitesi ve küresel veri yapısı
Tüm 12 keşif kütüphanesi, örnek başına yaklaşık 30 milyon o...

Tartışma

HER2-pozitif meme kanseri, modern sistemik tedaviye rağmen artan invazivlik, sık lenf düğümü metastazı (LNM) ve düşük sonuçlarla karakterize^{edilir 15}. Geleneksel klinopatolojik faktörler bu alt tipte prognozu yalnızca kısmen açıklar; bu da nodal yayılma riskini yakalayan biyolojik temelli belirteçler^{için boşluk bırakır. 16}. RNA-seq ile eşleşen tümör drenajı lenf düğümleri (TDLN) ve tümör-metastatik lenf düğümleri (TMLN) karşılaştır...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Biyoanalizör	2100-BA	Agilent, ABD	RNA bütünlüğünü ve kalite kontrolünü değerlendirmek için ekipman.
DESeq2	Yok	R Biyoiletken	RNA-dizili verileri için diferansiyel ifade analiz yazılımı.
FastQC Yazılımı	Yok	Babraham Biyoinformatikleri	Dizi kalitesini değerlendirmek için RNA-seq verileri için kalite kontrol yazılımı.
HEK293 Hücre Hattı	ATCC-CRL-1573	ATCC, ABD	Transfeksiyon deneyleri için kullanılan insan embriyonik böbrek hücre hattı.
qRT-PCR Kiti	4385616	ThermoFisher, ABD	Gen ifadesini doğrulamak için nicel PCR kiti.
RNA Çıkarma Kiti	74204	Qiagen, Almanya	Yüksek kaliteli RNA'yı doku örneklerinden izole etmek için kullanılan RNA çıkarma kiti.
RNA Dizileme Kiti	RS-122-2001	Illumina, ABD	RNA kütüphanesi hazırlama kiti, RNA örneklerinin dizilenmesi için.
Dizileme Platformu	NovaSeq 6000	Illumina, ABD	RNA kütüphanelerini dizilemek için yüksek verimli RNA dizileme platformu.
Doku Dondurma Ekipmanı	TFE-300	Thermo Fisher, ABD	Sıvı azotta doku örneklerinin dondurulması için ekipman.
Timpanik Termometre	55678-TT	ThermoScience, Japonya	Vücut sıcaklığı ölçümü için kullanılan doğru termometre.