Fare İntalı MCAO Modelinin Standartlaştırılması: Kalite Kontrol Ölçümleriyle Detaylı Bir Protokol

Özet

Bu protokol, farelerde optimize edilmiş 60 dakikalık orta beyin arter tıkanması (MCAO) tekniğini gösterir. Protokol, çok modlu yaklaşımlarla doğrulanmış, minimum ölüm oranı ile %87,5 başarı oranı sağlanmış ve inme araştırmaları için tekrarlanabilir enfarkt ve davranışsal sonuçlar elde etmektedir.

Özet

Fare orta beyin arter tıkanması (MCAO) modeli, iskemik inme patofizyolojisini açıklamak ve nöroprotektif tedavileri doğrulamak için referans standart olarak kalmaktadır. Ancak ince cerrahi sapmalar, enfarkt hacmini ve davranış sonuçlarını derinden değiştirebilir. "Görselleştir, sonra sistematikleştir" çerçevesi kullanarak, model kurulumu ve doğrulamasının her adımını yeniden inceledik. Anatomik yönüm ve filament yerleşimini standartlaştırmak için önemli cerrahi işaretlerin ve kritik adımların ayrıntılı fotoğraf dokümantasyonu gerçekleştirildi. 2,3,5-Trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyama, reperfüzyondan sonraki 24 saat ve 72 saat içinde infarktların hacmi ve topolojisini hassas şekilde haritalamak için kullanılmıştır. Nörolojik eksiklikler Zea-Longa, Bederson ve modifiye Garcia ölçekleriyle derecelendirildi. Yirmi dört erkek Sprague-Dawley faresi 60 dakikalık geçici MCAO geçirdi; İnfarkt hacmi ve nörolojik skorlar 24 saat ve 72 saat arası değerlendirildi. Hayvanların yaklaşık %87,50'si başarılı beyin kan akışı blokajı (Zea-Longa ≥ 1 ve kesin TTC tanımlı enfarkt) elde etti, genel ölüm oranı %12,50 oldu; bu da modelin yüksek isayetini kanıtlıyor. Bu standartlaştırılmış protokol, preklinik inme araştırmaları için teknik olarak geliştirilmiş, tekrarlanabilir bir temel sağlar ve inme patofizyolojisi ile terapötik müdahaleleri araştıran çalışmalarda laboratuvarlar arası tutarlılığı kolaylaştırır.

Giriş

İnme, dünya genelinde ölüm nedenlerinin ikinci ve engelliliğin üçüncü en yaygın^{nedenidir 1,2}. İnme, düşük ve orta gelirli ülkeleri orantısız şekilde etkiler; burada ortalama olarak yüksek gelirli ülkelerden 15 yıl erken^{gerçekleşir 1}. İki ana tip iskemik inme (%85) ve intraserebral kanamadır (%15)³. İnmelerin büyük çoğunluğunu oluşturan iskemik felç, beyin kan akışı tıkanıklığından kaynaklanır ve hücre ölümüne ve beyin^{enfarktüsüne yol açar 4}. İskemik zincirleme, önemli prooksidatif süreçler dahil olmak üzere birden fazla biyokimyasal olay^{içerir 5,6}.

Kapsamlı preklinik ve klinik çabalara rağmen, yalnızca birkaç tedavi — özellikle doku plazminogen aktivatörü ile damar içi tromboliz ve mekanik trombektomi — etkili olduğunu kanıtlamış olup, bu tedaviler dar terapötik aralıklar ve katı hasta seçim kriterleriyle sınırlıdır. Bu nedenle, iskemik yaralanma, nörovastik onarım ve inme sonrası iyileşmenin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların aydınlatılması acil bir ihtiyaç vardır. Bu hedefe ulaşmak için tekrarlanabilir, klinik olarak önemli bir hayvan modeli vazgeçilmezdir.

Orta beyin arter tıkanması (MCAO) modeli, kemirgenlerde iskemik felç^{incelemek için geniş çapta kullanılır 7,8}. İntraluminal filament tıkanma yöntemi, MCAO'nun en klasik ve yaygın kullanılan^{tekniklerinden biridir 9}. Bu teknik, kraniektomi gerektirmeden hem kalıcı hem de geçici tıkanıklıkları modelleyebilir. Endovasküler teller kullanılarak kullanılan daha yeni bir transfemoral teknik, sıçanlarda geçici MCAO indükleme konusunda umut vermiş ve daha tutarlı sonuçlar^{sunmaktadır 10}. Bu model, genellikle intraluminal filament^{tekniği 11} kullanılarak orta serebral arterin tıkanmasını içerir. MCAO, fokal serebral hipoperfüzyona neden olur ve bu da iskemiye ve reperfüzyon yaralanmasına^{yol açar 12}.

MCAO, inme patofizyolojisi ve olası tedavileri araştırmak için değerli olsa da, değişken lezyon^{hacimleri üretebilir 7}. Bu nedenle, MCAO modelindeki iyileştirmeler—örneğin reperfüzyon tekniklerinin geliştirilmesi, standart işletim protokollerinin oluşturulması ve birleşik değerlendirme kriterlerinin geliştirilmesi—enfarkt konumu ve hacmindeki değişkenliği azaltarak iskemik felç araştırmalarında faydasını artırabilir.

Bu protokol, tutarlı sonuçlar elde etmek için yaklaşık 10–15 ameliyat öğrenme eğrisi gerektirir¹³. Başarı oranları, operatör deneyimine ve fare^{suşuna göre değişebilir.} Model, akut iskemik inme çalışmaları için uygundur ancak hipertansiyon veya diyabet¹⁵ gibi insan eş hastalıklarını tam olarak kopyalamayabilir. Buna göre, deneysel değişkenliği standartlaştırılmış prosedürler ve titiz kalite kontrol önlemleriyle azaltmayı amaçlayan optimize edilmiş bir MCAO protokolü geliştirmeye ve titizlikle doğrulamaya çalıştık. Standartlaştırma ve veri güvenilirliğinde çift kazanım sağlamak için dört tamamlayıcı yenilik entegre edildi: (1) İki zaman noktası boylamasına değerlendirme—Zea-Longa, Bederson ve Modified Garcia ölçeklerinden nörolojik puanlar, reperfüzyon sonrası 24 saat ve 72 saat içinde 2,3,5-Trifeniltetrazolyum klorür (TTC) türetilen enfarkt hacimleriyle paralel olarak alındı; bu da ödem çözümlülüğü ile fonksiyonel iyileşme arasındaki zamansal ilişkiyi belirledi; (2) Üç ölçekli çapraz doğrulama—entegre üç ölçekli kalibrasyonla kör çift araştırmacı puanlama, davranışsal değerlendirmenin hassasiyetini ve hassasiyetini önemli ölçüde artırdı; (3) Tüm kurs hipotermik hızlı kesit—"90 saniyelik buz banyosu çıkarımı ve ardından önceden soğutulan kalıplarda tek adımlı 2 mm koronal dilimleme" standart bir çalışma prosedürü (SOP) kurulmuş, bu da otolizi ve insan hatasını en aza indirerek yüksek isabetli hacimsel ölçümler sağlanmıştır; (4) Entegre kalite kontrol çerçevesi—ameliyat öncesi oruç, anestezi derinliği kontrolü, ameliyat öncesi termoregulasyon ve çapraz kontaminasyon önlemeyi kapsayan kapsamlı bir SOP, tekrarlanabilir ve kolayca aktarılabilir bir MCAO standart işletim prosedürü sunmak için oluşturulmuş, laboratuvarlar arası tutarlılık ve çapraz karşılaştırılabilirlik için sağlam bir temel oluşturmuştur.

Protokol

Deney, Capital Medical Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Deneyleri ve Deneysel Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylandı ve denetlendi. Tüm protokoller, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne (NIH Yayını 80-23, 1996 rev.) uygun olmakla birlikte, steril ekipman ve aseptik teknikler gereklidir.

1. Hayvan seçimi

1. Sertifikalı bir laboratuvar hayvanı tedarikçisinden (Lisans No. SCXK (Pekin) 2021-0011) ve MCAO'nun bir modelini oluşturmak amacıyla oluşturuldu.
2. Hayvanları geleneksel olarak imtiyazlı yiyecek ve su ile barındırır; tüm prosedürler Uluslararası Etik Koduna uyguluyordu.
3. Filament boyutu seçiminde hayvan vücut ağırlığına dayalı aşağıdaki kriterleri kullanarak tutarlı tıkanmayı sağlayasınız:
   - 220–250 g: 0,33–0,35 mm çapında
   - 250–280 g: 0,35–0,38 mm çapında
   - 280–310 g: 0,38–0,40 mm çapı
   NOT: Bu spesifikasyonlar, damar çapındaki yaşa bağlı artışları hesaba katır ve SAH veya eksik tıkanma¹³ insidansını azaltır.

2. Örneklem büyüklüğü

1. Örneklem büyüklüğünü hesaplama yazılımı kullanarak hesaplayın. MCAO grubunda %35 ± %10 ±(ortalama SD) infarkt hacmi ile SHAM grubunda %0 ± %2 olduğunu gösteren ön verilere dayanarak, bir etki büyüklüğü (Cohen's d) tahmin edin. İki kuyruklu bir Mann-Whitney U testi için (t-testine parametrik olmayan alternatif), α = 0.05 ve kuvvet (1-β) = 0.80 ile minimum örneklem büyüklüğü hesaplanın.
   NOT: Etki büyüklüğü 3.5 olarak tahmin edildi ve minimum örneklem büyüklüğü grup başına 6 hayvandı.
2. Beklenen ölüm oranını (%12,5) ve dışlanma oranını (%5–10) hesaba katmak için, MCAO grubundan 24 fare ve SHAM grubundan 6 fare dahil edilsin; bu da birincil son nokta için yeterli güç (>0,90) sağlar (24 saat infarkt hacmi).

3. Dahil etme ve dışlama kriterleri

1. Aşağıdaki kriterleri karşılayan hayvanlar dahil edilsin: (1) erkek Sprague-Dawley sıçanları, 240–270 g, 6–8 haftalık; (2) önceden var olan nörolojik eksikliklerin olmaması (ameliyat öncesi nörolojik puan = 0); (3) anesteziyi komplikasyonsuz başarılı bir şekilde indüksiyon.
2. Eğer hayvanlar şu örnekleri gösteriyorsa, analizden dışlanın: (1) nekropsi sırasında görülen subaraknoid kanama (SAH); (2) deneysel müdahaleyle ilgisi olmayan erken ölüm (NOT: Bu kriterler, çalışma başlamadan önce seçilme yanlılığını en aza indirmek için önceden belirlenmiştir.
3. Hayvan iplasma politikası: Teknik cerrahi başarısızlık veya ameliyat dışı ölüm nedeniyle istismarcı gücü korumak için yalnızca hariç tutulan hayvanları değiştirin. Başarısız modellemelerle (başarısız tıkanma) hayvanları değiştirmeyin, ancak varyantlığı yapay olarak azaltmaktan kaçınmak için başarı oranı hesaplamasının bir parçası olarak rapor edin.

4. Ameliyat öncesi hazırlıklar

1. Otoklavlı aletler, steril filament ve örtülü bir alan hazırlayın.
2. Rutin oruç zorunlu değildir; Gerekirse, oruç süresini 2–4 saat ile sınırlayın. İzofluran (%3–4) ile anestezi başlatın ve işlem sırasında %30–40 O₂ oranında 1,5–2 oranında tutulun. Anestezi derinliğini, düzeltme refleksinin kaybı ve ayak parmağı sıkıştırma ile doğrulayın.
3. Rektal sıcaklık izleme ile geri besleme kontrollü ısıtma pediyle vücut sıcaklığını 37 ± 0,5 °C arasında tutun.
4. Boynu ve saç derisini tıraş edin, ardından bölgeyi povidon-iyot ve %70 etanol ile temizleyin.
5. Ameliyattan 30 dakika önce ve ameliyat sonrası her 12 saatte bir 48 saat boyunca buprenorfin (0,05 mg/kg, deri altı) veya günde bir kez 3^{gün boyunca} meloksikam (1 mg/kg, deri altı) verin. Ağrıyı bakım davranışı, duruş ve spontan aktivite izleyerek değerlendirmek; Rahatsızlık belirtileri devam ederse ek ağrı aljezi verin.

5. MCA'nın Tıkanması

1. Fareyi sırt yatağı pozisyonuna yerleştirin, başı hafifçe uzatarak ventral boynu açığa çıkarın.
2. Iris makası ile orta çizgi servikal kesi (1,5–2,0 cm) yapın.
3. Sternomastoid ve omohyoid kasları kesin bir şekilde ayırın; forseps kullanılarak sol ortak karotis arter (CCA) bifurkasyonunu ortaya çıkarır.
4. Dış karotis arteri (ECA) distal olarak kalıcı 4-0 ipek dikiş ile ve proksimalda geçici bir ligaturla bağlanın. Mikromakas kullanarak iki ECA ligatürü arasında küçük bir kesi oluşturun.
5. CCA ve iç karotis arteri (ICA) geçici olarak mikrovasküler kelepçelerle (60 g basınç) kapatın.
6. ECA kesisinden 4-0 silikon kaplı monofilament (0,35–0,40 mm çapında) yerleştirin. Onu CCA'ya geriye doğru ilerlet, sonra CCA ikişlenmesinin ötesine yönlendir.
   NOT: Filamentin ICA'ya kranial tabana doğru girdiğinden emin olun, pterygopalatine arteri (PPA) değil, yansal dallanan. <10 mm mesafede dirençle karşılaşılırsa, filamenti geri çekin, hayvanın başını karşı tarafa 30° döndürün ve PPA orijinasının ötesine yönlendirmek için tekrar ilerleyin.
7. Filamenti CCA bifurkasyonundan 18–20 mm ilerleterek hafif direnç MCA kökeninin tıkandığını gösterene kadar. Derinliği, filament üzerindeki önceden işaretlenmiş referans çizgisi ile (silikon stoper'a 2 mm yakın konumda) doğrulayın ve ECA kütüğü yerleştirme noktasından kaliper ile ölçülür. Filament yere geldiğinde CCA kelepçesini bırakın.

6. Reperfüzyon

1. 60 dakika tıkanıklıktan sonra kesiyi tekrar açın ve geçici ECA ligatürünü gevşedin.
2. Filamenti nazikçe çekerek ucu ECA kütüğünden geçene kadar kan akışını yeniden sağlayın. Sırt kanamasını önlemek için derhal bir kalıcı ligatür kalıbın proksimal kısmına yerleştirin. Yarayı katmanlar halinde kapatın.
3. Fareyi sürekli izleme için ısıtılmış bir kurtarma kafesine nakledin.

7. Sahte ameliyat

1. Hayvanı, yukarıda MCAO için tarif edilen prosedürle (oruç, anestezi, sıcaklık kontrolü, steril örtük) hazırlayın.
2. Yukarıda belirtildiği gibi servikal kesi ve CCA bifurkasyon maruziyeti yapılsın.
3. Gemiyi disek edin ve açığa çıkarın. Filamenti sokmayın.
4. Arterler serbest kalsın; Beyin iskemiyi indükleme.
5. 10 dakikalık pozlamadan sonra kesiyi katmanlar halinde kapatın. Hayvanı izleme için ısıtılmış bir kurtarma kafesine nakledin.

8. Ameliyat sonrası nörolojik skorlar

1. Reperfüzyondan 24 saat ve 72 saat sonra, infarkt hacmi ölçümü için fedakarlıktan hemen önce değerlendirin.
2. Hayvanı sessiz bir odada, 25 °C'de 30 dakika boyunca alıştırın.
3. İki bağımsız araştırmacının grup dağılışına kör olmasını sağla. Her araştırmacının skorlarını ayrı sayfalara ayrı sayfalara yazdırın; Herhangi bir puan farkı ≥1 puan yeniden değerlendirmeyi tetikler.
4. Ölçekler (uygulama sırasıyla birlikte):^{Zea-Longa 17} (Tablo 1), Bederson¹⁸ (Tablo 2) ve Modified Garcia¹⁹ (Tablo 3) puanlamaları, tutarlı kriterler için en son yayımlanmış protokollere uygun şekilde gerçekleştirilin.
5. İstatistiksel analiz için iki gözlemcinin ortalamasını kullanın. Ortalama puanlar %>10 farklıysa, herhangi bir hayvandan veri hariç tutulun ve yerine yeni bir denek ekleyin.

9. Beyin enfarkt hacminin ölçümü

1. Reperfüzyon sonrası 24 saat ve 72 saat sonra, sıçanları %5 izofluran ile derin bir anestezi altına alın. Devam etmeden önce derin anestezi, düzeltici refleks kaybı ve ayak sıkıştırma tepkisi ile stabil solunumu doğrulayın.
2. Derin anestezi onayından sonra 90 saniye içinde beyni hızla çıkarın, buz gibi PBS ile durulayın ve soğutulmuş fare beyin matrisi kullanarak 2 mm koronal dilimlere kesin. Dilimleme sırasında aşağıdaki önlemlere uyun
   1. Tüm işlemi buzda 0–4 °C sıcaklıkta tutun; Beyni 90 saniye içinde toplap önceden soğutulmuş bir matrikse düz konumlandır.
   2. Kesin bir bıçak kullanarak kesit, kesin ve temiz kesimler yapın; her dilimi rostro-kaudal sırayla buz gibi soğuk PBS'ye toplayın.
   3. Çapraz kontaminasyonu önlemek için hayvanlar arasında matris ve bıçağı %75 etanol ile hemen temizleyin.
3. %2 TTC'yi 37 °C'ye kadar önceden ısıttıktan sonra, dilimleri tamamen batırın ve 20 dakika boyunca karanlıkta kuluçka yapın, her 5 dakikada bir 20 dakikada nazikçe döndürün.
4. Reaksiyonu hemen durdurun, 4 °C PBS ile üç kez durulayın. Sonra gece boyunca 4 °C'de %4 paraformaldehit sabitlensin.
5. 300 dpi'da, her dilimi bir kez her iki tarafı fotoğraflayın.
   1. Gölgeleri ve yansımaları ortadan kaldırmak için beyaz bir arka plana sabit aydınlatma kullanın.
   2. Dilimleri örtüşmeden düz yerleştirin ve her çerçeveye bir ölçek çubuğu ve kimlik etiketi ekleyin. Kamerayı bölümlere dik tutun ve odak uzaklığı ile beyaz dengesini sürekli tutun.
6. ImageJ kullanarak enfarkt hacmini nicelikle ölçe.
   1. 300 dpi'lik görüntüyü (RGB formatı) içe aktarın ve 8 bitlik gri tonlamaya dönüştürün (Görüntü > Tip > 8-bit).
   2. Otsu'nun otomatik eşik işaretini uygulayın (Görsel > Otomatik Eşik >Ayarla > Otsu'yu seçin) infarktı (beyaz) canlı dokudan (kırmızı) ayırın.
   3. İpsilateral yarımküre sınırını çizmek için Freehand seçimleri aracını kullanın.
   4. Alanı ölç (Analiz > Ölç) ve piksel sayısını kaydet.
   5. İnfarkt hacmi hesaplanın: Σ (infarkt alanı × dilim kalınlığı [2 mm]) × (kontralateral yarımküre hacmi/ipsilateral yarımküre hacmi), kontralateral yarımkürenin yüzdesi olarak ifade edilir.

10. İstatistiksel analiz

1. Verileri uygun ± ortalama standart sapma (SD) veya medyan [çeyreklerarası aralık] olarak sunun.
2. Normal dağılım olmayan veriler için eşleşmemiş Student's t-testi veya Mann-Whitney U testi kullanılarak gruplar arası karşılaştırmalar yapın.
3. İstatistiksel anlamlılığı P < 0.05'e ayarlayın. Tüm analizleri uygun istatistiksel analiz yazılımı kullanarak gerçekleştirin.

Sonuçlar

Hayvanlar, terminal TTC boyama için reperfüzyon sonrası 24 saat (n = 10) veya 72 saat (n = 10) hayatta kalma gruplarına rastgele olarak dağıtıldı. Ek 4 sıçan MCAO geçirdi ancak planlanan son noktadan önce öldü (ölüm oranı %12,5). SHAM grubu n = 6'dan oluşuyordu. Böylece kullanılan toplam hayvan sayısı 30 (24 MCAO + 6 SHAM) oldu.

Fareler, serebral iskemiyi indüklemek için 60 dakikalık MCAO geçirdi (Şekil 1). Reperfüzyon intraluminal filamentin çıkarılması ve ECA'da proksimal ligatürün serbest bırakılmasıyla başlatıldı. 24 MCAO faresinden 3'ü 72 saat içinde öldü; biri ölüm sonrası TTC lekelenmesinde 24 saat içinde yaygın enfarktüs gösterdi, diğeri ise 72 saat içinde belirsiz nedenlerle öldü. İki ek fare başarısız modelleme nedeniyle dışlandı (nörolojik skorlar kriterleri karşılamadı ve TTC boyama infarkt göstermedi). Böylece, 72 saat ölüm oranı %12,50 idi. Başarılı model kurulumunu 24 saat boyunca hayatta kalma artı 1–3 Longa puanı olarak tanımladık ve başarılı modelleme oranı %87,50'ye ulaştı.

Nörolojik fonksiyon, inme başlangıcından 24 saat ve 72 saat sonra (enfarkt hacmi ölçümü öncesi) değerlendirildi. Literatürde en yaygın olarak kullanılan üç ölçek—Zea-Longa, Bederson ve modifiye Garcia—kapsamlı bir değerlendirme sağlamak için kullanılmıştır (Şekil 2). 24 saat içinde fareler (n = 20) Zea-Longa ölçeğinde 2,02 ± 0,41, Bederson ölçeğinde 2,80 ± 0,41 ve değiştirilmiş Garcia ölçeğinde 8,15 ± 1,18 puan aldı; bu açıklıklar 72 saatte belirgin kaldı (Zea-Longa: 1,65 ± 0,59; Bederson: 1.93 ± 0.38; değiştirilmiş Garcia: 11.00 ± 1.34). İnfarkt hacmi, kontralateral yarımküre yüzdesi olarak ifade edildiğinde, MCAO'dan sonraki 24 saatte %27,61 ± %2,81 olmuş ve 72 saatte %4,18 ± 28,32'ye düşmüştür.

Şekil 1: Farede sol servikos-serebral arterial fizyolojinin ve orta beyin arter embolizminin şematik diyagramı. (A) serviko-serebral arterial anatomisi, (B) yerleştirme öncesi, (C) yerleştirme sonrası ve (D) filament malpozisyonunun pterygopalatine artere çarpması şematik diyagramı. CCA: ortak karotis arter; ICA: iç karotis arter; ECA: dış karotis arter; PPA: pterygopalatin arter; MCA: orta beyin arter. "Kara üçgen": kesi yeri; Mavi çizgi: filament. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Sıçanlarda beyin arter tıkanmasından sonra enfarkt hacmi ölçümü ve nörolojik davranışsal değerlendirme. (A) Beyin kesitlerinde TTC boyaması. (B) 72 saatlikteki infarkt hacmi 24 saatlikten daha küçüktür. (C,D) 72 saatlikteki Zea-Longa ve Bederson puanları 24 saattekilerden daha düşüktür. (E) 72 saatlikteki değiştirilmiş Garcia puanları, 24 saattekilerden daha yüksektir. ****P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tezahür	Skor / puan
Nörolojik açığı yok	0
Kuyruk süspansiyonu sırasında kontralateral ön uzuv bükülüp addukt edildi (hafif nörolojik defisit)	1
Sürünürken kontralateral tarafa spontan dairesel hareket (orta derecede nörolojik defzukluk)	2
Ayakta dururken veya yürürken karşı tarafa düşmek	3
(şiddetli nörolojik eksiklik)
Bilinç bozgunluğu ile eşlik eden kendiliğinden hareket yok	4

Tablo 1: Zea-Longa ^puanı.

Tezahür	Skor/puanlar
Hayvanın kuyruğunu tutup kalkın ve vücudunu bankın 10 cm üzerinde asılı kalacak şekilde kaldırın. Normal farelerde her iki ön uzuv yere doğru uzanmış kalır. Nörolojik eksiklikleri olan fareler aşağıdaki davranışları gösterebilir:
Nörolojik açığı yok	0
Paretik ön uzuv karın bölgesine yakın şekilde bükülür ve tutulur, etkilenmemiş uzuv ise banka doğru uzanır	1
1'de tanımlanan davranışa ek olarak, hayvan bankta yatağa yatırıldığında paretik tarafa doğru yan itmeye karşı direnç belirgin şekilde azalır	2
1 ve 2'de tanımlanan davranışlara ek olarak, hayvan yürürken paretik tarafa doğru daireler çizer	3

Tablo 2: Bederson ^puanı.

Madde	Tezahür	Skor/puanlar
a) Kendiliğinden Hareket	Normal aktivite	3
(Sıçanın ev kafesindeki aktivitesini 5 dakika boyunca gözlemleyin)	Hafif engelli	2
	Orta derecede bozukluk	1
	Kendiliğinden hareket yok	0
b) Simetrik Uzuv Hareketi	Simetrik duruş	3
	Asimetrik duruş	2
	Hemipleji	1
c) Ön Uzuv Uzatma	Simetrik	3
(Kuyruğu tutun ve ön uzuvları masanın kenarına doğru getirin; ön pati uzanışına dikkat edin)	Hafif asimetrik	2
	Belirgin şekilde asimetrik	1
	Hemipleji	0
d) Tutuş ve tırmanma yeteneği	Güçlü bir tutuşla güçlü tırmanıyor	3
	Tek taraflı eksiklik gözlemlendi	2
	Tırmanamıyor veya daire çizemiyor	1
e) Vücutta iki taraflı dokunsal refleks	Her iki tarafta simetrik	3
	Bir tarafta yavaş tepki	2
	Bir taraftan yanıt yok	1
f) İki taraflı vibrissae dokunma tepkisi	Simetrik	3
	Asimetrik	2
	Yanıt yok	1

Tablo 3: Değiştirilmiş Garcia puanı. Toplam puan: 0–18 puan; Daha yüksek puanlar daha iyi nörolojik fonksiyonu gösterir.

Tartışma

Bu çalışmanın temel amacının biyolojik keşif değil, metodolojik standartlaştırma olduğunu netleştirmek önemlidir. Standartlaştırılmış bir MCAO protokolü geliştirmek, laboratuvarlar arası değişkenliği azaltmak ve iskemik inme araştırmalarında tekrarlanabilirliği artırmak için hayati öneme sahiptir. Bu protokol, titiz kalite kontrol önlemleriyle prosedürel şeffaflığı artırır ve standart filament yerleştirme, sıcaklık düzenlemesi ve histolojik işlem gibi MCAO modellemesinde yaygın teknik eksiklikleri giderir.

İnfarkt hacmindeki gözlem edilen azalma 24 saatten 72 saate ve kısmi nörolojik iyileşme, geçici MCAO'da beklenen patofizyolojik olguları temsil etse de, bu çalışmanın katkısı, bu uç noktaların zamansal güvenilirliğini titizlikle standartlaştırılmış bir prosedürle belirlemekte yatmaktadır. Detaylı, adım adım teknik bir çerçeve sunarak, bu protokol, nöroinflamatuar kaskadlar, apoptotik yollar veya terapötik müdahaleler gibi gelecekteki mekanik çalışmaların tekrarlanabilir ve karşılaştırılabilir temel veriler üzerine inşa edilmesini sağlar. Bu çalışmayı, JoVE'nin kapsamına uygun teknik bir kaynak olarak açıkça konumlandırıyoruz; mekanik içgörüleri ilerletmek yerine standartlaştırılmış preklinik inme araştırmalarına temel sağlıyoruz.

Bu protokoldeki birkaç adım, tutarlı iskemi ve reperfüzyon sağlamak için özellikle önemlidir. İlk olarak, tekrarlanabilir MCAO elde etmek için oklüzyon çizgisinin hafif bir direnç hissedilene kadar hassas şekilde ilerletilmesi gereklidir; çünkü yerleştirme derinliğindeki küçük bir sapma eksik tıkanmaya veya subaraknoid kanamaya yol^{açabilir 20,21}. İkinci olarak, ameliyat sırasında normal vücut sıcaklığını (37 ± 0,5 °C) ve ameliyat sonrası sıcaklık yönetimi çok önemlidir; çünkü çok düşük ya da çok yüksek vücut sıcaklığı enfarkt alanını ve nörolojik sonucu önemli ölçüde^{değiştirebilir. 12,22}. Üçüncüsü, beynin 90 saniye içinde hızla çıkarılıp buz banyosu soğutması otolizi en aza indirebilir ve doku bütünlüğünü koruyabilir, böylece TTC boyama ve hacim analizinin doğruluğunu^{sağlar 23}. Bu adımlar tutarlı şekilde uygulanabilirse, model sadıklığı ve çalışmalar arasında karşılaştırılabilirlik önemli ölçüde artırılır.

Geleneksel MCAO yöntemini tekrarlanabilirliğini ve kullanım kolaylığını artırmak için geliştirdik. Önceden soğutulan beyin dilim kalıpları ve standart dilimleme protokollerinin kullanımı, insan hatalarını ve dilim artefaktlarını azaltmıştır. Ayrıca, iki kör araştırmacının üç ölçekli (Zea-Longa, Bederson ve modifiye Garcia) nörolojik fonksiyon değerlendirmesinin benimsenmesi, fonksiyonel değerlendirmenin sağlamlığını ve hassasiyetini^{artırmıştır} 17,18,19. Her program aşamasını kapsayan ayrıntılı standart işletim prosedürleri sayesinde, filament malpozisyonu, erken reperfüzyon veya ameliyat sonrası hipotermi gibi yaygın sorunların tespit edilmesine yardımcı olur. Yaygın komplikasyonlar için sorun giderme rehberliği şunları içerir: (1) 10–12 mm mesafede direnç eksikliği ve anında nörolojik iyileşme ile tanınan yanlış yerleştirilmiş tıkanma hattı (PPA girişi); karşılaşılırsa filamenti hemen geri çekin, hayvanın başını karşı tarafa 30° döndürün ve hafif medial angulasyonla kranial tabana doğru yeniden ilerleyin; (2) Tıkanma sırasında ani nörolojik iyileşmeyle belirtilen erken reperfüzyon—silikon stoper'ın ECA kütüğüne sağlam şekilde sabitlendiğinden emin olun, filament çapının arter boyutuyla eşleştiğinden emin olun (240–270 g farelerde 0,35–0,40 mm), ve yer değiştirme devam ederse daha uzun filament kullanmayı (silikon kaplamayı 0,5 mm artırın) düşünün; ve (3) Ameliyat sonrası hipotermi (rektal sıcaklık <36ºC)—ısıtma pedinin sıcaklığını 38 °C'ye çıkarmak, hayvanın 30 cm yukarısına ısı lambası yerleştirmek ve sıcak steril salin (0,5 mL, intraperitoneal, 37ºC) verilmesi.

Bu gelişmelere rağmen, bu protokolün birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, bu teknik, tutarlı başarı oranları elde etmek için önemli bir öğrenme eğrisi (10–15 ameliyat) gerektirir ve fare damar anatomisindeki bireysel değişiklikler filament yerleşimini^{etkileyebilir 21,24}. İkinci olarak, mevcut protokol, ameliyat sırasında kalite kontrolünü sınırlayan ve eksik tıkanıklığı^olmayan hayvanların erken dışlanmasını engelleyen intraoperatif serebral kan akışı izleme (LDF veya LSCI) yerine post-hoc doğrulamaya (nörolojik puanlama ve TTC boyama) dayanmaktadır. Üçüncü olarak, doğrulama genç erkek Sprague-Dawley fareleriyle sınırlıydı ve genellenebilirliği dişiler, yaşlı hayvanlar ve komorbid^{modellerle sınırladı 26,27}. Gelecekteki çalışmalar şunları içermelidir: (1) cinsiyeti biyolojik değişken olarak ele almak için her iki cinsiyet; (2) damar eş hastalıkları olan yaşlı sıçanlarda (12–18 aylık); ve (3) ilaç müdahale çalışmalarında tekrarlanabilirliği artırmak için gerçek zamanlı CBF izleme.

Bu yöntem, sonuçlarının tutarlılığı ve translasyonel önemi kritik öneme sahip olduğu için preklinik ilaç taramasında özellikle değerlidir. Bu makalede açıklanan standart protokol, iskemik inme araştırmalarının titizliğini ve tekrarlanabilirliğini artırmak için büyük umut vaat etmektedir. Bu protokolün gelecekteki uygulamaları şunları içerir: (1) reperfüzyon döneminde uygulanan nöroprotektif ajanların preklinik taraması; (2) 24 saat ve 72 saat zaman noktaları kullanılarak iskemi-reperfüzyon yaralanmalarının mekanik çalışmaları; (3) inme sonrası nöroplastisite ve fonksiyonel iyileşmenin araştırılması; ve (4) terapötik hedeflerin genetik veya farmakolojik müdahalelerle birlikte doğrulanması. Detaylı ve video destekli SOP sunarak, amacımız bu yöntemin çeşitli profesyonel seviyelerdeki laboratuvarlarda yaygın olarak benimsenmesini kolaylaştırmak ve nihayetinde daha güvenilir ve klinik açıdan ilgili preklinik inme araştırmalarına katkıda bulunmaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2% TTC boyama solüsyonu	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8170	25 g/şişe, ≥98 % saflık
4% PFA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1110	500 mL kullanıma hazır
Emici sütür	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	VCP345H	5-0 Vicryl
Adson forseps	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11010	1×2 diş, 12 cm
Dumont kavisli forseps	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11052	11 cm uzunluğunda, 0.05 mm ince uç
Geri beslemeli ısıtma pedi	Shenzhen Reward Life Science & Technology Co., Ltd.	69001	37 ± 0.3 °C kapalı döngü
ImageJ	National Institutes of Health	sürüm 1.53k
Iris makas	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14060	Kavisli uç, 10 cm
Mikro-vasküler klipsler	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	JD-16010	1.5 cm kavisli klips
Emici olmayan ipek	Shanghai Pudong Jin-Huan Medical Products Co., Ltd.	S-2304	6-0 Siyah ipek iplik
PASS yazılımı	NCSS, LLC, Kaysville, UT, USA	sürüm 15.0	Örnek boyutu hesaplama yazılımı
Sıçan beyin matrisi	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	68610	2 mm koronal yuvalar
Silikon kaplı naylon filament	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	60-1250	0.35 mm OD, 30 mm silikon uç, EO-steril
Küçük hayvan anestezi makinesi	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	R500IE	Isofluran buharlaştırıcı, indüksiyon odası & maske dahil
SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	sürüm 26.0	İstatistiksel analiz yazılımı
Vannas mikro makas	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14058	Kavisli uç, 8 cm