Yöntem makalesi

Yenidoğnan, genç ve yetişkin fare akciğerlerinden alveolar tip II epitel hücrelerinin enfeksîyonel deneysel ortamlara uyarlanabilir izolyasyonu

771 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69581

⸱

19 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, yenidoğan, genç veya yetişkin fare akciğerlerinden (enfekte veya enfekte olmayan) canlı alveolar tip II epitel hücrelerini (AECII) izole etmek için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, AECII'nin akciğer iltihabı ve enfeksiyon sırasında rollerini belirlemeye yönelik moleküler ve/veya fonksiyonel çalışmaların ilerlemesini sağlar.

Özet

Alveolar tip II epitel hücreleri (AECII), akciğerde bağışıklık düzenlemesine kritik katkı sağlar ve bu nedenle pulmoner homeostazı yöneten kilit unsurlardır. Bu fonksiyonlar, AECII'yi özellikle alt hava yolu epitelini hedef alan ve alveolar bütünlüğü bozan solunum virüsleriyle enfeksiyon bağlamında önemli kılar. Preklinik fare modelleri, AECII'nin akciğer iltihabı ve/veya enfeksiyon bağlamındaki rollerini aydınlatmak için hayati araçlardır. Bu protokol, neonatal, genç ve yetişkin evrelerinde fare akciğerlerinden uygulanabilir ve yüksek şekilde saflaştırılmış AECII'nin izole edilmesi için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir ürün hattı sunar. Metodoloji, mekanik ayrıştırma, enzimatik sindirim ve ardından floresansla aktive edilen hücre ayırtmasını (FACS) birleştirerek, moleküler ve fonksiyonel analizler için uygun olduğu kanıtlanmış yüksek zenginleştirilmiş AECII popülasyonları elde etmektedir. Patojenik virüslerle ilgili uygulamalar için, protokol isteğe bağlı bir paraformaldehit (PFA) fiksasyon adımı içerir; bu da RNA bütünlüğünü tehlikeye atmadan daha düşük biyogüvenlik koşullarında güvenli bir kullanım sağlar. Gelişim aşamalarında optimize edilmiş hücre iyileşme ile yetişkin akciğer başına 1.0 × 10.6 AECII hücresi elde eden bu protokol, örneğin viral patogenez, epitel fonksiyonu ve rejeneratif kapasite gibi preklinik çalışmaları destekler.

Giriş

Akciğer gelişimi, fizyoloji, bağışıklık ve onarım süreçlerindeki çok yönlü rolleri nedeniyle, alveolar tip II epitel hücreleri (AECII), akciğer hasarı sonrası homeostazın korunmasına ve yeniden kurulmasına hayati önem taşır. AECII, grip A virüsü (IAV) veya SARS-CoV-2 gibi pandemik virüslerin birincil hücresel hedefleri olduğundan, akıbetleri ve işlevleri enfeksiyon biyolojisi araştırmalarının gündeme gelmiştir. Bu bağlamda, önceki çalışmalar, içsel (örneğin genetik durum 1, yaş 2,3) ve dışsal (örneğin, mikrobiyaluyarı 4) ipuçlarının AECII fenotipleri ve çevresel tetikleyicilere, örneğin havadan yayılan patojenlere karşı tepkisi üzerinde büyük bir etkiye sahip olduğunu bildirmiştir. Özellikle, akciğer iltihabın AECII 5,6'nın transkriptomik, proteomik ve epigenetik durumunda kalıcı değişiklikler bıraktığı gösterilmiştir. AECII'nin akciğer içindeki karmaşık hücresel etkileşimleri ve çeşitli biyotik ve abiotik faktörlerin AECII biyolojisine katkısı, bu hücrelerin daha ayrıntılı incelenmesine olanak tanıyan uygun in vivo modellerin önemini vurgular.

FACS, insan ve hayvan dokularından birincil hücrelerin zenginleştirilmesi ve arındırılması için mevcut altın standart tekniği temsil eder; çünkü çoklu parametrik seçimin (veya dışlanmanın) eşzamanlı uygulanmasını sağlar ve hücre içsel özelliklerin, örneğin boyut, granülarlık veya otofloresans gibi özelliklerin seçim/dışlama iş akışına güvenilir şekilde entegre edilebileceği tek yöntemdir. Bugüne kadar, yayımlanmış birkaç protokol, birincil fare AECII'nin FACS tabanlı izolasyonu için metodolojiler sunmaktadır. Sinha ve Lowell, benzer doku işleme ve akış sitometrisi iş akışına sahip yetişkin farelerden AECII izolasyonu için bir yöntem rapor etti; FACS'tan önce hedef olmayan hücrelerde boncuk tabanlı manyetik tükenme ile AECII'ninzenginleştirilmesini içeriyordu 7. Başka bir protokol, EpCAM pozitif akciğer hücrelerinin manyetik boncuk tabanlı izolasyonunun veya koşullu raporlayıcı faremodeli 8 kullanılarak SPC-pozitif (GFP+) hücrelerin tanımlanmasına dayalı AECII'nin FACS tabanlı izolasyonuna olanak tanıyan transgenik farelerin kullanımını tanımlar. SPC ifadesi fare akciğerlerinde AECII'yi güvenilir şekilde tanımlamakla birlikte, bu yöntem yalnızca özel bir fare raporlayıcı suşuyla birlikte uygulanabilir ve bu nedenle örneğin vahşi tip farelerden AECII izolasyonunu engeller. Önemli olarak, benzer verimler ve AECII saflığı bildirilse de, bu protokollerin hiçbiri AECII'nin yenidoğun, genç veya enfekte konakçılardan izole edilmesi için uyarlama sağlamadı.

Bu amaçla, mevcut protokol, enzimatik sindirim ve FACS kombinasyonu kullanarak farelerden yüksek saf ve uygulanabilir AECII'nin izole edilmesi için uyarlanmış bir dizi iş akışı içermektedir. Bu son teknoloji metodoloji, daha önce geliştirilen FACS tabanlı AECII izolasyonprotokolü 9'a dayanır ve daha fazla tanımlama ve dışlama belirteçleri eklenerek AECII saflığını artıran önemli iyileştirmeler içerir. Önemli olarak, bu güncellenmiş protokol hem " dokunulmuş" hem de "dokunulmamış" sıralama stratejileriyle AECII alımını sunuyor. Ayrıca, doğum sonrası akciğer gelişimi hücresel bileşim ve yapısal yeniden organizasyonla ilgili büyük değişikliklerle ilişkilendirildiğinden, bu protokol yenidoğan, genç ve yetişkin akciğerlerden AECII alımını optimize etmek için uyarlamalar içerir. Bu, AECII biyolojisinin ontogenez döneminde, örneğin akciğer olgunlaşma veya enfeksiyon biyolojisi çalışmaları bağlamında incelenmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, sonraki ex vivo yetiştirme ve IAV ile enfeksiyon için uygulanabilir AECII elde etmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol kimyasal fiksatif paraformaldehit (PFA) kullanılarak bir fiksasyon prosedürü içerir. Bu adım, akciğer hücresi süspansiyonlarında çeşitli solunum yolu patojenlerinin (örneğin SARS-CoV-2, IAV) inaktive edilmesini gerektirir; bu da daha düşük biyokonsentirasyon önlemlerine sahip tesislerde FACS tabanlı AECII izolasyonu dahil sonraki örnek işlenmesine olanak tanır. PFA tabanlı fiksasyon, fonksiyonel çalışmalar için sonraki AECII ex vivo yetiştirimesini engellese de, AECII'nin transkriptomik profillenmesi için solunum enfeksiyonları bağlamında biyolojik rollerini aydınlatmak amacıyla önemli miktarda sağlam RNA alınmasına olanak tanır.

Protokol

Tüm hayvanlar, Helmholtz Enfeksiyon Araştırma Merkezi'ndeki hayvan tesisinde özel patojensiz (SPF) koşullarda ve ulusal ile kurumsal yönergelere uygun olarak yetiştirilmiş ve barındırılmıştır. Sonrasında AECII izolasyonu için naif farelerin ötenazisi, Laboratuvar Hayvan Bilimleri Derneği'nin (GV-SOLAS, Gesellschaft für Versuchstierkunde) ulusal yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. C57BL/6 genetik altyapısına sahip erkek fareler, 2 günlük (yenidoğunlu), 3 haftalık (genç) veya 8-12 haftalık (yetişkin) yaşlarında kullanıldı. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Fare akciğerinin hazırlanması

  1. Fareyi feda edin (kurumsal onaylı protokollere göre):
    1. Yetişkin ve genç fareler için: intraperitoneal enjeksiyonla anestezi aşırı dozu (örneğin, ketamin/ksilazin) uygulanır.
    2. Yenidoğan fareler için: kafasını kesmek.
      NOT: Yetişkin ve genç farelerde servikal çıkıntıdan kaçının, çünkü bu işlem trakeyaya zarar verebilir.
  2. Fare kürkünü %70 (v/v) etanol ile sterilize edin.
    DIKKAT: Yanıcı sıvı. Göz tahriş edicisi. Sıcaktan uzak durun. Kabı sıkıca kapalı tutun ve iç organları açığa çıkarmak için ventral orta hat kesisi yapın.
  3. Deriyi ve peritoneyumu dikkatlice çıkarın.
  4. Fareyi hem jugular damarları hem de vena cava'yı keserek kanı boşaltarak vücuttan kan akmasını sağlar.
  5. Diyaframı dikkatlice çıkarın, kalp ve akciğerleri açığa çıkarın.
    NOT: Akciğerlere zarar vermemeye dikkat edin. Akciğer dokusunun perforasyonu, akciğer dokusunun enzim aracılı sindiriminin sonraki etkinliğini önemli ölçüde engeller.
  6. Kaburga kafesini makasla açın.
  7. Kalbin sağ ventrikülüne bir kanül yerleştirin ve soğuk fosfatla tamponlu salin (PBS) ile perfüze yapın, akciğerden kalan kan temizlenene ve akciğer dokusu solgunlaşana kadar:
    1. Yetişkin fareler için: 26 G kanül kullanın ve akciğeri 10 mL PBS ile perfüze edin.
    2. Yenidoğan fareler için: 30 G kanül kullanın ve akciğeri 1 mL PBS ile perfüze edin.
      NOT: Genç farelerin akciğerlerini, akciğer damarlarında aşırı basınçla alveolar yapının yırtılmasını önlemek için perfüze etmeyin. Perfüzyon iltihaplı akciğerlerde daha az etkili olabilir ve akciğer dokusunda renk değişimi daha az belirgin olabilir. Gerekirse, yetişkin ve genç farelerde aşağıdaki adımdan önce bronkoalveolar bir lavaj yapılabilir.

2. Akciğer dokusunun enzimatik sindirimi

  1. Yetişkin ve genç fareler:
    1. Tükürük bezlerini ve çevresindeki kasları çıkararak trakeayı açığa çıkarın.
    2. Trakeyaya 22 G'lik bir yerleşik kanül yerleştirin, iğnesini çıkarın ve plastik kateteri akciğerlere doğru hareket ettirin.
    3. Hem trakeya hem de kateterin etrafına bir iplik sıkıca bağlayarak onu yerinde tutun.
    4. Akciğer dokusunu dispaz uygulayarak hazırlayın.
      DIKKAT: Soluma durumunda alerji veya astım belirtileri veya nefes alma zorluklarına yol açabilir. Toz solumaktan kaçının. Solunum koruyucu kullanın. İçerikleri/konteynerleri onaylı bir atık bertaraf tesisine gönderin.) Trakeyaya yerleştirilen kateter üzerinden:
      1. Yetişkin fareler için: 2 mL dispaz ekleyin.
      2. Genç fareler için: 500 μL disspase ekleyin.
        NOT: 2.1.4 ile 2.1.5 adımları arasında şırıngaların değişimini kolaylaştırmak için luer slip bağlantısı olan bir şırınga kullanın. Akciğer dokusunun etkin enzimatik sindirimini sağlamak için, bronkoalveolar boşlukların tam enzim doldurulmasını sağlamak hayati öneme sahiptir.
    5. Şırıngayı değiştirin ve işlem sırasında yapıyı korumak için düşük erime aromalı agaroz (%1 (w/v), 45 °C) ile tekrarlayın.
      1. Yetişkin fareler için: 500 μL düşük erime aromalı agaroz kullanın.
      2. Genç fareler için: 200 μL düşük erime oranlı agaroz kullanın.
        NOT: Sıvıların geri akmasını önlemek için şırıngayı bağlı bırakın.
        NOT: Kullanımdan önce: düşük eriyen agarozu ısıyla (95 °C) çözer, agaroz çözeltisini 45 °C'ye kadar soğutun, örneğin termoblokta.
    6. Akciğeri laboratuvar kağıdıyla kaplayın ve agarozun 2 dakika katılaşması için buz ekleyin.
    7. Buz, mendil kağıdı, şırıngayı ve kateteri çıkarın.
    8. İpliği bağlayarak enzimi alt hava yollarında tutmak için trakeayı kapatın.
    9. Kalp ve timusu çıkarın.
    10. Ipliğin üzerindeki trakeayı kesin ve göğüsteki sağlam akciğeri çıkarın.
    11. Akciğer, önceden ısıtılmış disspas (37 °C) içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve akciğer dokusunu oda sıcaklığında (20-25 °C) 45 dakika boyunca dispas içinde kuluçka edin.
      1. Yetişkin fareler için: akciğeri 2 mL dispas içinde kuluçka yapın.
      2. Genç fareler için: akciğeri 1,5 mL dispas ile kuluçka yapın.
  2. Yenidoğan fareleri
    1. Tek akciğer loblarını ince makaslarla 2 mL'lik bir tüpün kapağında toplayıp doğrayın.
    2. 500 μL dispaz ekleyin, kapağı kapatın ve tüpü ters çevirerek tüm dokunun disspasla kaplı olduğundan emin olun.
    3. Akciğer dokusunu oda sıcaklığında 45 dakika boyunca dispase halinde kuluçka edin.

3. Akciğer dokusunun hazırlanması

  1. Yetişkin ve genç fareler için:
    1. Akciğeri dispasdan çıkarın ve akciğer loblarını bronş sapından diseksiyon edin.
    2. Akciğer lobları, 7 mL DMEM + HEPES, 1 μg/mL (nihai konsantrasyon) anti-CD16/32 bloklayıcı antikor ve 100 μL DNA (nihai konsantrasyon ~600 Kunitz birimi) içeren bir Petri kabına (çap: 8,5 cm) yerleştirilin.
      DIKKAT: Soluma durumunda alerji veya astım belirtileri veya nefes alma zorluklarına yol açabilir. Toz solumaktan kaçının. Solunum koruyucu kullanın. İçindekileri/konteyneri onaylı bir atık bertaraf tesisine gönderin.
    3. Akciğer dokusunu forseps ile parçalayın.
      NOT: Akciğer dokusunun etkin enzimatik sindirimini sağlamak için, mekanik doku parçalanmasının tam bir şekilde sağlanması hayati önem taşır.
    4. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın ve 200 rpm'de hafifçe sallayın.
      NOT: Hücre askı gerekirse bir sonraki adıma kadar 4 °C'de saklanabilir.
  2. Yenidoğan fareler için:
    1. Sindirilen doku dahil olmak üzere dispase, 3 mL DMEM + HEPES, 1 μg/mL (nihai konsantrasyon) anti-CD16/32 bloke edici antikor ve 100 μL DNA (nihai konsantrasyon ~ 600 Kunitz birimi) içeren bir Petri kabına (çapı: 5,4 cm) aktarın.
    2. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın ve 200 rpm'de hafifçe sallayın.
      NOT: Hücre askı gerekirse bir sonraki adıma kadar 4 °C'de saklanabilir.
  3. Tüm yaş grupları için devam et:
    1. Hücre süspansiyonu, gözenek boyutu azalan (100 μm - 70 μm - 40 μm) bir dizi naylon hücre süzgeciyle filtreleyerek kalıntıları ve büyük agregaları uzaklaştırın.
    2. Hücre süzgeçlerini ve tüplerini dikkatlice durulayarak hücre kaybını en aza indirin. Örnekler bir arada toplandığında, aynı gruptan farelerin hücre süspansiyonları aynı hücre süzücülerinden geçirilebilir.
      NOT: Tıkanma durumunda hücre süzgeçlerini değiştirin.
    3. Hacme bağlı olarak, filtrelenmiş hücre süspansiyonunu bir veya daha fazla 15 mL'lik tüpe aktarın ve hücre süspansiyonunu 140 x g ve 4 °C'de 12 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Süpernatantı atın ve hücre pelletini eritrosit liz tamponu (ACK tampon) içinde yeniden askıya alın.
      1. Yetişkin ve genç fareler için: 2 mL eritrosit lizis tamponu kullanın ve 2 dakika kuluçka yapın.
      2. Yenidoğan fareler için: 3 mL eritrosit lizis tamponu kullanın ve 3 dakika kuluçka yapın.
    5. Eritrosit lizisini durdurun, 15 mL tüpü DMEM + HEPES + %10 (v/v) FBS ile doldurun ve tekrar 12 dakika boyunca 140 x g ve 4 °C'de santrifüj yapın.

4. Floresansla aktive hücre ayırtımı için antikor boyama

  1. Hücreleri, DMEM + HEPES + %10 (v/v) FBS'de hazırlanmış anti-F4/80, anti-CD93, anti-CD11c, anti-CD11c, anti-CD19, anti-CD31, anti-CD11b, anti-CD16/32, anti-CD45, anti-CD24 ve anti-CD326 florokrom bağlı antikorlar içeren antikor boyama çözeltisine yeniden süzülür.
    NOT: Optimal boyama sonuçları için yalnızca önceden titrlenmiş antikorlar kullanın. Hücre ayırtımı için AECII'nin dokunulmaması gerekiyorsa, antikor boyama çözeltisine anti-CD326 dahil edilmesin.
    1. Yetişkin fareler için: Akciğer başına 600 μL antikor çözeltisi kullanın.
    2. Genç fareler için: Akciğer başına 400 μL antikor çözeltisi kullanın.
    3. Yenidoğan fareler için: Akciğer başına 200 μL antikor çözeltisi kullanın.
  2. Hücre süspansiyonunu antikorlarla 10 dakika boyunca 4 °C sıcaklıkta inkübe edin.
  3. Kuluçkadan sonra, tüpü DMEM + HEPES + %10 (v/v) FBS ile doldurarak hücreleri yıkayın.
  4. 140 x g ve 4 °C'de 12 dakika boyunca santrifüj yapın.
  5. Hücreleri yeniden süzültü DMEM + HEPES + %10 (v/v) FBS:
    1. Yetişkin fareler için: Akciğer başına 300 μL süzülür.
    2. Genç fareler için: Akciğer başına 200 μL süzülür.
    3. Yenidoğan fareler için: Akciğer başına 100 μL süzülme.

5. AECII'nin Sıralaması

NOT: Enstrüman hazırlığı: AECII'yi bir FACS cihazı kullanarak ayırmak için 100 μm nozul takın.

  1. Ayırmadan hemen önce, hücreleri 50 μm hücre süzgecinden filtreleyin. Hücre süzgecini aşırı hücre kaybını önlemek için HEPES ve %10 (v/v) FBS takviyesi olan DMEM ile durulayın:
    1. Yetişkin fareler: Hücre süzgecini akciğer başına 300 μL ile durulayın.
    2. Genç fareler: Hücre süzgecini akciğer başına 200 μL ile durulayın.
    3. Yenidoğan fareler: Hücre süzgecini akciğer başına 100 μL ile durulayın.
  2. Hücreleri sıralamadan önce doğrudan vorteksle yeniden askıya alın.
  3. AECII için gate, I) yüksek yan saçılıma sahip (SSCyüksek), II) soy florokromları için negatif ve III) CD326 florokromu anti-CD326 antikoru ile ilişkili olarak pozitif olduğu olayları tanımlar.
    NOT: AECII olmayan ve AECII olmayan ayrımcılığı kolaylaştırmak için yüksek ila çok yüksek parlaklık indekslerine sahip florokromlar (APC, PE ve BV785 gibi) kullanın. Dokunulmamış bir sıralama yöntemi için (boyama çözeltisinde anti-CD326 hariç tutularak), AECII soy-negatif, SSCyüksek ve otofloresanspozitif/yüksek hücreler olarak tanımlanır. AECII otofloresansı, örneğin FITC veya GFP dedektörlerinde yeşil ışık dedektörlerinde tanımlanabilir.
  4. İleri saçılma yüksekliği ile çift veya agregat hariç tutulur. alan (FSC-H vs. FSC-A) ve yan saçılma yüksekliği vs. alan ( SSC-H vs. SSC-A).
  5. Sıralanan hücreleri, HEPES ve %10 (v/v) FBS ile takviye edilmiş DMEM içeren bir tüpte toplayın ve daha fazla analiz veya kültür için santrifüj yapın.

6. PFA-sabit AECII'den RNA İzolasyonu (Isteğe Bağlı)

NOT: AECII, örneğin solunum yolu virüsü patojenleriyle enfekte olmuş farelerden izole edilirse, AECII izolasyonu patojene bağlı olarak BSL2 veya BSL3 koşulları altında yapılmalıdır. Deney yapan kişi uygun güvenlik koşullarında hücre ayırtmasına erişimi yoksa, yukarıda açıklanan protokolle izole edilen AECII, antikor boyama yapıldıktan sonra PFA ile sabitlenebilir. Bu adım,patojenler 10,11 inaktif hale getirir ve böylece BSL1 koşullarında akış sitometrik AECII sıralaması yapılabilir. Hücreler, fiksasyon süreci nedeniyle artık fonksiyonel testler için kullanılamaz olsa da, moleküler analizler için uygundurlar.

  1. Virüslerin inaktivasyonu için, %4 (w/v) PFA'ya sahip 500 μL içinde antikor etiketli tek hücreli süspansiyonları sabitleyin.
    DIKKAT: Yanıcı katı madde. Yuttuğu veya solunması zararlıdır. Cilt tahrişine, ciddi göz hasarına neden olur. Alerjik cilt reaksiyonu, solunum tahrişi ve kansere neden olabilir. Genetik kusurlara yol açtığı şüpheli. Sıcaktan uzak durun. YUTULURSA: Kendini kötü hissederseniz bir Zehir merkezi/doktor arayın. SOLULURSA: Kişiyi temiz havaya çıkarın ve nefes alması için rahat tutun. Kendini kötü hissedersen bir ZEHIR MERKEZİ/doktoru ara. GÖZLERDE: Birkaç dakika boyunca dikkatlice suyla durulayın. Eğer varsa ve kullanımı kolaysa kontakt lensleri çıkarın. Durulamaya devam edin. EĞER MARUZ KALMAK VEYA ENDİŞE DÜŞERSE: Tıbbi danışmanlık/yardım alın.
    NOT: 3R yönergelerine uygun olarak, bu çalışmada enfekte olmayan farelerden alınan AECII kullanılmıştır. AECII oda sıcaklığında 10 dakika sabitlendi. Fiksasyon süresi, insanlar ve çevre için potansiyel bir risk oluşturan her patojen için ayrı ayrı test edilmelidir. S1 koşullarında sonraki sıralama, PFA fiksasyonundan sonra bir çoğaltılabilir virüs olmadığının BSL2 veya BSL3 laboratuvarında önceden doğrulanmasını gerektirir.
  2. Fiksasyondan sonra hücreleri 140 x g hassasiyetinde 15 dakika boyunca DMEM ve santrifüj ile yıkayın.
  3. Hücreleri 300 μL DMEM + HEPES + %10 (v/v) FBS'ye yeniden süspansiyon ile geçirin ve hücre süspansiyonu 100 μm hücre süzülcüsünden geçirin.
  4. Hücre süzgecini aşırı hücre kaybını önlemek için ek 300 μL DMEM + HEPES + %10 (v/v) FBS ortamı ile durulayın.
  5. Hücreleri 5. adımda tarif edildiği gibi sıralayın. "AECII'nin Sıralaması".
    NOT: %4 (w/v) PFA ile tedavi edilerek herhangi bir virüsün inaktive edildiğine dair zorunlu deneysel doğrulamadan sonra, AECII BSL1 koşulları altında sıralanabilir.
  6. PFA-sabit hücrelerden RNA izolasyonu için RNeasy FFPE Kit'i kullanın.
    DIKKAT: Bu kit tehlikeli kimyasallar içeriyor. Üreticinin talimatlarını takip edin. Aşağıdaki ayarlamalarla birlikte verilen güvenlik veri sayfasına dikkat edin:
    1. Ayırdıktan sonra, hücreleri 140 x g ve 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjle yapın.
    2. Hücreler 150 μL Buffer PKD'ye yeniden süzülün ve 1,5 mL bir tüpe aktarın.
    3. 10 μL Proteinaz K ekleyip 56 °C'de 15 dakika kuluçka yapın, ardından hücre sayısına bağlı olarak 80 °C'de 15 dakikaya kadar kuluçka yapın ( bkz. Tablo 1).
  7. Protokole uygun olarak DNaz tedavisi, yıkama adımları ve 30 μL RNase içermeyen suda nihai elüsyon dahil olmak üzere RNA izolasyon sürecine devam edin.

Sonuçlar

Burada belirtilen protokol, yeni doğumdan genç ve yetişkin farelere kadar çeşitli gelişim aşamalarında fare akciğer dokusundan AECII'nin izole edilmesi ve analizi için optimize edilmiş ve ayrıntılı bir yöntemi temsil etmektedir. Metodoloji, mekanik ve enzimatik akciğer ayrışmasını içerir; optimize edilmiş bir akış sitometrik hücre ayırma iş akışı ile birleşir; enfekte hayvanlardan alınan örneklerin BSL1 koşullarında sonraki Akış Ayırtması için uygun özel protokoller kullanılır.

Deneysel veriler, bu izolasyon prosedürünün (Şekil 1'de özetlenmiştir) uygulanabilir ve son derece saf (%>95) AECII popülasyonlarının üretiminde yüksek etkinliğini ortaya koydu. Akış sıralaması, saf AECII popülasyonları üretti; sıralama sonrası analizler ise yerleşik hücresel belirteçler için neredeyse %100 özbaşlılığı doğruladı (Şekil 2). Sorgulama sonrası hücre örneklerinin nicelendirilmesi, yeni doğunan akciğerlerden 0,15 ×10 6 geçerli AECII ile yetişkin örneklerinden 1,0 × 106 hücre arasında yüksek verimler göstermiştir (Şekil 3A). İzole AECII, izolasyon süreci boyunca tipik morfolojiyi (Şekil 3B) ve hücresel bütünlüğünü korudu (Şekil 3C). Ayrıca, protokolün fonksiyonel çalışmalar için uygulanabilirliği, mCherry raporlayıcı proteinini (IAV-mCherry12) ifade eden fareye uyarlanmış IAV (H1N1, A/Puerto Rico/8/34) ile başarılı ex vivo enfeksiyonla doğrulanmış ve hücrelerin viral replikasyonu destekleme yeteneğinin gösterildiği gösterilmiştir (Şekil 4).

Örnek fiksasyonunu gerektiren deneysel iş akışlarını desteklemek için protokol, PFA fiksasyonunu kullanan özel bir RNA çıkarma yaklaşımı içerir. PFA-sabit AECII'den farklı işlem zaman noktalarında RNA kalitesinin kapsamlı incelenmesi, aşağı akım moleküler analizlere uygun yüksek kaliteli RNA'nın sabit örneklerden güvenilir şekilde çıkarılabileceğini göstermiştir (Tablo 1). Ekstraksiyon edilen RNA'nın kalitesi, ekstraksiyon işlemi sırasında 80 °C'de termal tedavi süresiyle doğrudan ilişki gösterdi ve belirli deneysel ihtiyaçlara dayalı net optimizasyon yönergeleri sundu (Tablo 1, Şekil 5). Nicel ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) analiziyle doğrulama, hem ev genlerinin (ribozomal protein S9, Rps9) hem de AECII-spesifik belirteçlerin (suraktif protein C, Sftpc) PFA-sabitli örnekler ve taze kontrol preparatlarıyla başarılı bir şekilde amplifikasyonunu göstermiştir (Şekil 6).

figure-results-1
Şekil 1: Enzimatik doku sindirimi ve akış sitometrik hücre ayırtımı kullanılarak neonatal, genç ve yetişkin fare akciğerlerinden AECII izolasyonu için şematik iş akışı. Diyagram, farklı yaş gruplarından fare akciğerlerinin sistematik işlenmesini göstermektedir. Fare ötenazi ve akciğer çıkarımı ardından, doku parçalanması için dispaz ile çok aşamalı enzimatik sindirim yapılır. Mekanik bozulmanın ardından, hücreler gözenek boyutlarının azaldığı bir dizi filtrasyon adımıyla arındırılır. Sonrasında eritrositler lizize edilir. AECII'nin özgül zenginleşmesi, hematopoietik belirteçlere (CD45, CD11b, CD11c, F4/80, CD19, CD16/32), endotel belirteci CD31, trombosit işaretleyici CD93 ve bronşiyal epitel hücre belirtkeri CD24'e karşı antikor etiketlemesi kullanılarak negatif seçim yoluyla sağlanır; epitel hücrelerinin CD326'ya karşı antikor etiketlemesi kullanılarak pozitif seçilmesi ve ardından karakteristik SSCyüksekliğine göre akış sitometrik sıralaması yapılır granül AECII profili. Bu protokol, aşağı akım fonksiyonel ve moleküler analizler için son derece saf (%95 ≥ uygulanabilir birincil AECII'nin izole edilmesini sağlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: AECII'nin yetişkin farelerden izolasyonu için kullanılan temsil kapı stratejisi. (A) Akciğer tek hücreli süspansiyonlar, aşağıdaki antijenlere karşı antikorlarla boyanmıştır: F4/80, CD93, CD11c (APC ile birleşmiş) ve CD19, CD31, CD11b, CD16/32, CD45, CD24 (PE ile birleşmiş) ve CD326 (BV785 ile birleşmiş). (B) Saflık analizi için yeniden analiz (A). Sıralanmış AECII, AECII'nin %97,2 saflığını doğrulamak için yeniden analiz edildi. (C) Sıralamadan sonra AECII'nin temsil floresan mikroskopi görüntüleri. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanmıştı. Hücre içi boyama, birincil anti-SPC antikoru (tür: tavşan) kullanılarak yapıldı ve ikincil boyama Alexa 594 (kırmızı) ile eşleştirilmiş keçi anti-tavşan IgG kullanılarak gerçekleştirildi. DAPI ve sadece ikincil antikor ile boyanmış AECII ve primer ile ikincil antikorlarla boyanmış splenositler ilgili kontrol olarak kullanıldı; bu da anti-SPC ve anti-tavşan Alexa 594'ün spesifik bağlanmasını gösterdi. Ölçek çubukları: 20 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Floresansla aktive hücre sıralamasından sonra AECII'nin verim, morfolojisi ve canlılığı. (A) Yenidoğnan, genç ve yetişkin farelerden elde edilen akciğer başına toplam canlı AECII sayısı. (B) Sıralama sonrası sıralanmış AECII'nin ışık mikroskopik görüntüsü. Ölçek çubuğu: 75 μm. (C) Sıralamadan sonra trypan mavisi boyama ile gözlemlenen AECII canlılığı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: IAV-mCherry ile sıralanmış AECII'nin ex vivo enfeksiyonu. Yetişkin farelerden izole edilen AECII hücreleri, Matrigel kaplı doku kültür plakalarında gece boyunca ex vivo olarak yetiştirilerek tutunmaya olanak sağladı. Sonrasında hücreler 8 saat boyunca IAV-mCherry (enfeksiyon çokluğu 2) ile enfekte edildi. mCherry sinyal yoğunluğunda zamana bağlı bir artış gözlemlendi. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: %4 PFA sabit AECII'den RNA bütünlüğü. PFA'nın temsil RNA profilleri, Qiagen FFPE RNeasy Kit ile RNA izolasyonundan sonra abitlenmiş ve sıralanmış AECII'yi modifikasyonlarla sabitlemiştir. 18S ve 28S rRNA için özel zirveler, RNA kalite numarası (RQN) ile birlikte, PFA sabit AECII'den sağlam izole RNA için RNA bütünlüğünü ve kalitesini temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Rps9 ev bakım geninin ve AECII-spesifik gen Sftpc'nin kontrol (tedavi edilmemiş) ve %4 PFA sabit AECII'den amplifikasyon eğrileri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Örnek80 °C'de kuluçka süresi28S/18SRQNRNA bağlantısı [ng/μ]
Kontrol 0,5x106-2105.8
Kontrol 1x106-1.91012.3
PFA sabit 0,5x106526.45.5
PFA sabit 0,5x106101.98.13.7
PFA sabit 0,5x106151.88.22.76
PFA sabit 1 x106528.26.26
PFA sabit 1 x106101.18.45.12
PFA sabit 1 x106150.98.55

Tablo 1: %4 PFA sabit AECII'den izole edilen RNA kalitesi - farklı fiksasyon sürelerinin etkisi. AECII'den RNA, üreticinin protokolüne (FFPE RNeasy Kit) göre izole edildi ve adımda belirtilen değişikliklerle izole edildi. Sabit hücreler, örnekten RNA'yı elüasyon etmek için 80 °C'de 5 dakika, 10 dakika veya 15 dakika kuluçka edildi. RNA bütünlüğü, Agilent'in Fragment Analyzer cihazı kullanılarak belirlendi

Tartışma

Burada belirtilen optimize edilmiş protokol, AECII'nin fare akciğer dokusundan neonatal, genç ve yetişkin yaşlarında izolasyonu ve analizi için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar. Ayrıca, ayırmadan önce isteğe bağlı bir PFA fiksasyon adımı sunar; bu da AECII'nin BSL1 koşulları altında farelerden ayırılmasına olanak tanır; daha önce solunum yolu patojenleriyle enfekte olmuş olsalar bile. Dikkatlice yapılan akciğer maruziyeti ve perfüzyonun birleşimiyle, ardından enzimlerin intratrakeal aşılanması ve akciğere düşük eriyen agarozun entegrasyonu sayesinde, doku yapısı korunur ve yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların geri kazanılmasına olanak tanır. Yan saçılma özelliklerine akış sitometrik sıralaması, soy-negatif kapıtma ve CD326-pozitif hücreler için pozitif seçim eklenmesi, AECII'nin olağanüstü saf popülasyonları ortaya çıkardı. Bu tür saflık, moleküler ve fonksiyonel analizlerin sonraki süreçlerin AECII biyolojisinin içinden temsilci olmasını ve hücre tiplerini kirletmesiyle karıştırılmamasını sağlamak için özellikle önemlidir; bu da gen-ifade ve virüs-konak etkileşim çalışmalarının yorumlanabilirliğini artırır.

Yukarıda bahsedilen protokol, lökositik ve lökositik olmayan antijenlere yönelik geniş bir floresan etiketli antikor yelpazesi kullanılarak AECII dışı bırakılmasını ve ardından yan saçılma özellikleri ile epitelel hücre spesifik molekül CD326'nın ekspresyonuyla AECII'nin pozitif seçilmesini içermektedir. Bu yöntemin AECII popülasyonlarının oldukça saf olduğu gösterilse de (SPC kullanılarak, yani AECII'nin kendine özgü bir belirteçiyle elde edilmiş), elde edilen popülasyonların saflığı şu ana kadar yalnızca post-sortlama hücre içi boyama ile doğrulanabilmiştir. Bu protokol, AECII'nin öncelikle virüs tarafından hedef alındığı ve belirgin hücresel adaptasyonlar gösterdiği SARS-CoV-2 ve grip virüsleriyle enfekte akciğerlerden AECII'yi izole etmek içinuygulanabilir. Ancak, bu yöntem, akciğer kanseri biyolojisi çalışmaları bağlamında fare AECII'nin izole edilmesi için uygun olmayabilir; çünkü EpCAM (CD326), farelerde ve insanlarda pulmoner kanser hücreleri tarafından da ifadeedilir 13. Bu çalışmalar için, SPC promotörünün transkripsiyonel kontrolü altında floresan proteinleri ifade eden transgenik fare suşlarının kullanımı, birincil AECII'nin güvenilir izolasyonu için daha uygun bir yaklaşım sağlayabilir.

Yenidoğan akciğer başına 0,15 × 106 geçerli AECII ve yetişkin akciğer başına 1,0 × 106 hücreye kadar verim, protokolün verimliliğini ve ölçeklenebilirliğini göstermektedir. Büyük AECII miktarlarının başarılı izolasyonuna önündeki büyük engellerden biri, verimsiz enzimatik sindirim ve akciğer dokusunun mekanik parçalanmasıdır. Bu nedenle, 2.1.4. adımda bronkoalveoller boşlukların enzimle tam doldurulmasını sağlamak ve 3.1.3. adımda mekanik doku parçalanmasını dikkatlice yapmak çok önemlidir. Etkili enzimatik sindirim, genellikle aşağıdaki filtre adımlarında bir piston kullanılarak parçalanabilen görünür agregaların minimum katkısı olan bulanık hücre süspansiyonu sağlar. Hücre süzgecinden geçirilemeyen daha büyük agregalar genellikle yetersiz enzimatik sindirim sonucu ortaya çıkar. Enzimatik sindirim sürelerinin uzatılması tavsiye edilmemektedir, çünkü bu, sonrakiimmünboyama 14'ü ve dolayısıyla FACS tabanlı AECII izolasyonunun doğruluğunu olumsuz etkileyebilir.

Enzimatik ve mekanik doku parçalanmasının verimliliğinin yanında, genetik arka plan AECII verimini etkileyebilir. Bu protokol için C57BL/6 arka planındaki fareler kullanıldı. Bildirilen gelişimsel15, immünolojik16 ve fizyolojik 17,18,19 suş-spesifik farklılıklara uygun olarak, diğer laboratuvar fare türlerinin (örneğin, BALB/c, DBA) kullanımının farklı AECII verimlerine yol açabileceği düşünülebilir. Ayrıca, iltihaplı akciğerlerden (enfeksiyon veya enfeksiyon olmayan) kaynaklanan AECII verimi önemli ölçüde azalabilir. Bu, IAV20,21 ve SARS-CoV-2 22,23,24 gibi ana hedefleri temsil eden dolaylı (iltihaplayıcı) veya doğrudan (patojen-aracılı) AECII hücre ölümünün sonucu olabilir.

Mekanik ayrışma, enzimatik sindirim ve akış ayırma sırasında hücresel bütünlüğün korunması, sonraki moleküler ve/veya fonksiyonel analizler için ayrıca önemli bir teşviktir. Bu nedenle, sıralama sonrası AECII yaşamılığı ve hücresel fonksiyonu değerlendirildi. AECII, Matrigel'e yapışabilir ve karakteristik lamellar vücut zengin morfolojisini en az 24 saat boyunca koruyabilmiştir; bu da izolasyon sonrası işlevsel yetkinlik ve ex vivo kültüre uygunluk (enfeksiyon modelleri dahil) olduğunu gösterir.

Sıralanmış AECII'nin IAV-mCherry raporlayıcıvirüsü 12 ile verimli enfekte edilmesi ve güçlü viral çoğaltma gözlemi, bu sistemi epitelyal-içsel antiviral yanıtları aydınlatmak için sağlam bir platform olarak doğrulamaktadır. AECII, yüzey aktif biyosentez, alveolar rejenerasyon ve doğuştan bağışıklık ile ilgili temel süreçleridüzenlediğinden, saflaştırılmış AECII popülasyonlarında IAV replikasyon kinetiği ve konak transkripsiyonel yanıtlarını inceleme kapasitesi, karışık hücreli preparatlarda elde edilemeyen içgörüler sağlayacaktır.

Bu protokolün önemli yeniliklerinden biri, taze ve inaktive edilmiş örneklerin yan yana analizini mümkün kılan bir fiksasyon prosedürünün yer almasıdır. PFA fiksasyonu ve uyarlanmış FFPE RNA çıkarma süreçleri, başarılı nicel ters transkripsiyon PCR (qPCR) ile kanıtlandığı gibi, aşağı akış transkriptomik analizleriyle uyumlu derecede RNA bütünlüğünü korur.

PFA fiksasyon süreleri, boyama kalitesini ve dolayısıyla FACS tarafından AECII'nin geri kazanılmasını etkileyebilir. Ayrıca, RNA'nın verimi ve kalitesi genellikle fiksasyon süreçlerinden etkilenir. Kullanılan in vivo enfeksiyon modeline bağlı olarak, bu yönler deneysel tasarım için dikkate alınmalıdır. Uzun fiksasyon süresinden kaçınmak ve bunun yerine PFA tedavisinin süresini optimize etmek önerilir; böylece gerekli minimum sürenin kullanılmasını sağlamaktır; bu süre ilgili virüsün tam inaktivasyonunu sağladığı deneysel olarak kanıtlanmıştır.

Ribozomal RNA (rRNA) bolluğunun mikrofluidik bir cihazla değerlendirilmesi, biyolojik örneklerdeki mRNA kalitesini tahmin etmek için bir vekil işlevi görür. Özetlenen AECII fiksasyon/RNA izolasyon protokolü, 28S/18S rRNA oranlarının >1 ve RNA kalite numarası (RQN) değerlerinin >8 olduğu gibi, aşağı akış transkriptomik analizler için yeterli kalitede sağlam RNA'nın izolasyonunu sağlar. 80 °C kuluçka aşamasının RNA verimini ve kalitesini kritik şekilde azalttığını belirtmek önemlidir. Termal işlem sürelerinin uyarlanması, sonraki akım uygulamalarda RNA verimi ve kalitesini artırmak için isteğe bağlı olarak uygulanabilir.

Bu metodolojik gelişmeler birlikte, AECII biyolojisinin sağlık, enfeksiyon hastalıkları ve gelişim (yenidoğandan yetişkine kadar) bağlamında incelenmesi için kapsamlı bir araç seti sağlar. Bu yaklaşımla izole edilen yüksek verim ve saflık, transkriptomik, proteomik ve kromatin erişim testlerini ve fonksiyonel testleri (örneğin, ex vivo enfeksiyon) kapsayan çoklu omik profilleme ile AECII'nin ilgili mekanizmlerini in vivo daha ayrıntılı olarak incelemeye olanak tanır.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, uzman teknik yardımları için Tatjana Hirsch ve Friederike Kruse'a, faydalı tartışmaları için Lisa Hönicke ve Justine Smout'a, IAV-mCherry muhabir virüsü sağlayan Yoshihiro Kawaoka'ya teşekkür etmek ister. Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) - TRR 359 - Proje numarası 491676693 (D.B. ve J.H.'ye), COVIPA girişimi (KA1-Co-02, Helmholtz Derneği; D.B.'ye) ve Alman Araştırma Vakfı'ndan (BO 7036/1-1; J.D.B.'ye) bir hibe tarafından finanse edilmiştir. Otto-von-Guericke-Üniversitesi Magdeburg Tıp Fakültesi'nin Açık Erişim Yayın Fonu'nun desteğini kabul ediyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ACK tamponu--8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 200 & mikro; L 0. 5 M EDTA, 1000 mL Milli-Q ekle, pH 7.2'den 7.4'e ayarla
fare karşıtı CD11beBioscience12-0112-83M1/70 klonu; PE bağlantılı
fare karşıtı CD11cBiolegend117310klon N418; APC bağlantılı
fare karşıtı CD16/32BD Biosciences553141klon 93; arındırılmış
fare karşıtı CD16/32BD Biosciences561727klon 2.4G2; PE bağlantılı
fare karşıtı CD19Biolegend115508klon 6D5; PE bağlantılı
fare karşıtı CD24Biolegend101808M1/69 klonu; PE bağlantılı
fare karşıtı CD31Biolegend102408klon 390; PE bağlantılı
fare karşıtı CD326Biolegend118245G8.8 klonu oldu; BV785 bağlantılı
fare karşıtı CD45BD Biosciences553081klon 30-F11; PE bağlantılı
fare karşıtı CD93eBioscience17-5892-82AA4-1 klonu; APC bağlantılı
fare karşıtı F4/80Biolegend123116BM8 klonu; APC bağlantılı
fare karşıtı SPC abcamab211326Ev sahibi tür: tavşan; Klon: EPR19839; arındırılmış
Arya-FüzyonBD BiosciencesHücre Ayırıcı
Aria-II SORPBD BiosciencesHücre Ayırıcı
Biozym Plaque AgaroseBiozym840101H2O'da %1 (w/v)
Hücre süzgeci (100 µ e, 70 ve mikro; M, 40 ve mikro; m)BD Falcon352360, 352350, 352340
CellTrics (50 ve mikro; m)Sysmex04-004-2327
Deoksiribonukleaz I, sığır pankreasından, 2000 Kunitz birimi/şişeSigma-AldrichD4263330 ve mikro infonlarla 1 şişenin taze çözünme içeriği; L DMEM
Dispase, 100 mL (5000 kazeinolitik ünite)Corning354235steril filtrasyon yapmak (gözenek boyutu 0.22 & mikro; m), 15 mL tüplerde 4 mL aliquot hazırlayın, -20 derece derecede depolayın; C
DMEMGibco31885-049düşük glikoz, piruvat ile birlikte, HEPES (nihai konsantrasyon 25 mM) eklenir
FACS DivaBD BiosciencesSıralama Yazılımı
FlowJoFACS verileri için Değerlendirme Yazılımı
Keçi Anti-TavşanAlexa 594 çiftli
Yerleşik kanül Introcan 22GBraun4252098B
RNeasy FFPE KitiQiagen73504
Senfoni S6 SEBD BiosciencesHücre Ayırıcı

Kaynaklar

  1. Stegemann-Koniszewski, S., et al. Alveolar type II epithelial cells contribute to the anti-influenza A virus response in the lung by integrating pathogen- and microenvironment-derived signals. mBio. 7 (3), (2016).
  2. Kumova, O. K., et al. Severity of neonatal influenza infection is driven by type I interferon and oxidative stress. Mucosal Immunol. 15 (6), 1309-1320 (2022).
  3. Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single-cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nat Commun. 10 (1), 963(2019).
  4. Cleaver, J. O., et al. Lung epithelial cells are essential effectors of inducible resistance to pneumonia. Mucosal Immunol. 7 (1), 78-88 (2014).
  5. Boehme, J. D., et al. Epigenetic changes and serotype-specific responses of alveolar type II epithelial cells to Streptococcus pneumoniae in resolving influenza A virus infection. Cell Commun Signal. 23 (1), 278(2025).
  6. Worrell, J. C., et al. Lung structural cells are altered by influenza virus leading to rapid immune protection following re-challenge. Nat Commun. 16 (1), 7061(2025).
  7. Sinha, M., Lowell, C. A. Isolation of highly pure primary mouse alveolar epithelial type II cells by flow cytometric cell sorting. Bio Protoc. 6 (22), (2016).
  8. Chen, Q., Liu, Y. Isolation and culture of mouse alveolar type II cells to study type II to type I cell differentiation. STAR Protoc. 2 (1), 100241(2021).
  9. Gereke, M., et al. Flow cytometric isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells for functional and molecular studies. J Vis Exp. (70), e4322(2012).
  10. Avelin, V., Sissonen, S., Julkunen, I., Österlund, P. Inactivation efficacy of H5N1 avian influenza virus by commonly used sample preparation reagents for safe laboratory practices. J Virol Methods. 304, 114527(2022).
  11. Jureka, A. S., Silvas, J. A., Basler, C. F. Propagation, inactivation, and safety testing of SARS-CoV-2. Viruses. 12 (6), (2020).
  12. Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nat Commun. 6, 6600(2015).
  13. Hanssen, A., Loges, S., Pantel, K., Wikman, H. Detection of circulating tumor cells in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 5, 207(2015).
  14. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
  15. Soutiere, S. E., Mitzner, W. Comparison of postnatal lung growth and development between C3H/HeJ and C57BL/6J mice. J Appl Physiol. 100 (5), 1577-1583 (2006).
  16. Alberts, R., et al. Gene expression changes in the host response between resistant and susceptible inbred mouse strains after influenza A infection. Microbes Infect. 12 (4), 309-318 (2010).
  17. Kida, K., Fujino, Y., Thurlbeck, W. M. A comparison of lung structure in male DBA and C57 black mice and their F1 offspring. Am Rev Respir Dis. 139 (5), 1238-1243 (1989).
  18. Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
  19. Soutiere, S. E., Tankersley, C. G., Mitzner, W. Differences in alveolar size in inbred mouse strains. Respir Physiol Neurobiol. 140 (3), 283-291 (2004).
  20. Koerner, I., Matrosovich, M. N., Haller, O., Staeheli, P., Kochs, G. Altered receptor specificity and fusion activity of the haemagglutinin contribute to high virulence of a mouse-adapted influenza A virus. J Gen Virol. 93 (Pt 5), 970-979 (2012).
  21. Weinheimer, V. K., et al. Influenza A viruses target type II pneumocytes in the human lung. J Infect Dis. 206 (11), 1685-1694 (2012).
  22. Youk, J., et al. Three-dimensional human alveolar stem cell culture models reveal infection response to SARS-CoV-2. Cell Stem Cell. 27 (6), 905-919.e10 (2020).
  23. Ziegler, C. G. K., et al. SARS-CoV-2 receptor ACE2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is detected in specific cell subsets across tissues. Cell. 181 (5), 1016-1035.e19 (2020).
  24. Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904.e8 (2020).
  25. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: Defender of the alveolus revisited. Respiratory Res. 2 (1), 33(2001).
  26. Mason, R. J. Biology of alveolar type II cells. Respirology. 11 (Suppl), S12-S15 (2006).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Alveoler Tip II H crelerMurin Akci er zolasyonuFloresan Aktive H cre Ay klamaEnzimle SindirimMekanik DisosiyasyonSolunum Yolu Vir s EnfeksiyonuPulmoner HomeostazParaformaldehit SabitlemeS rfaktan Protein CKantitatif RT PCR
Yenidoğnan, genç ve yetişkin fare akciğerlerinden alveolar tip II epitel hücrelerinin enfeksîyonel deneysel ortamlara uyarlanabilir izolyasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.