Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare Derisindeki Dokunma Duyusal Akson Morfolojisinin İntravital İki Fotonlu Görüntülemesi

846 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69589

⸱

30 Aralık 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, farelerin ön pençe derisindeki düşük eşikli mekanoreseptör (LTMR) akson terminallerinin görselleştirilmesi için in vivo iki fotonlu görüntüleme yaklaşımını sunmaktadır. Bireysel aksonların tekrarlanan, yüksek çözünürlüklü görüntülemesi kullanılarak, bu yöntem gelişim sırasında ve yetişkinlerde deri duyusal devresinin yapısı ve işlevini incelemek için yeni bir platform sağlar.

Özet

Düşük eşikli mekanoreseptörler (LTMR'ler), titreşim, saç sapması ve basınç gibi zararsız hafif dokunma uyarılarını algılayan somatosensorik nörnelerdir. Çevrede alt tipe özgü aksonal terminaller oluşturur ve aksonları omuriliğe doğru merkeze yansıtarak dokunsal bilgi iletirler. LTMR gelişimi ve organizasyonu hakkında mevcut anlayış, aksonal kablolama ve yeniden yapılandırmanın dinamik ve zamansal süreçlerini ortaya koyamayan sabit dokulardan gelmektedir. Burada, fare ön patisinde gelişim sırasında ve yetişkinlerde LTMR akson morfolojisini görselleştirmek için iki fotonlu görüntüleme yöntemi sunulmaktadır. İki foton mikroskobi, sağlam deride yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayabilir ve aynı akson terminallerinin doğum sonrası zaman noktalarında tekrar görüntülenmesini mümkün kılar. İki foton görüntüleme, yeni fare genetik araçlarıyla birleştirilerek alttipe özgü akson gelişimini ortaya çıkarabilir. LTMR'lerin kronik görüntülemesi, yaralanma sonrası devre montajı ve onarımının incelenmesini mümkün kılar. Bu yaklaşımlar, somatosensory akson gelişimi ve yenilenmesini düzenleyen hücresel mekanizmalara dair yeni içgörüler sağlayacak in vivo bir sistem sunar.

Giriş

Dokunma, gelişen en erken duyudur ve organizmaların fiziksel dünyayı nasıl deneyimlediği ve tepki verdiği konusunda merkezi bir rol oynar. Dokunma, dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının alt tipleri olan düşük eşikli mekanoreseptörler (LTMR) tarafından tespit edilir; bunlar zararsız mekanik uyaranları (girinti, titreşim ve saçsapması 1,2) gibi etkileridir. LTMR'ler psödounipolardır ve periferik aksonları periferik dokulara genişleterek alt tipe özgü terminaller oluşturur. Merkezi aksonları, omurilik nöronları ile sinaptik bağlantılar kurarak merkezi sinir sistemine dokunsal bilgiiletir 3. Ancak, dokunmatik devrelerin nasıl kurulduğu ve bakımı yeterince anlaşılmamaktadır.

1960'lar ve 1970'lerde kedilerde yapılan önceki temel çalışmalar, bu fonksiyonel olarak farklı mekanoreseptörleri ve tüylü ciltlerde yanıt özelliklerini ilk olarak tespitetmiştir 4,5. LTMR alt tipleri, benzersiz morfolojileri, iletkenlik hızları ve yanıt özellikleriile sınıflandırılır 2. Başlıca LTMR alt tipleri Aβ hızlı adapte olan (RA) ve yavaş adapte olan (SA) LTMR'ler, Aδ-LTMR'ler ve C-LTMR'ler 2,6,7'dir. Aβ RA-LTMR'ler, Aδ-LTMR'ler ve C-LTMR'ler, saçfolikülleri 2 etrafında uzunlamasına lanseol kompleksler oluşturur. Aδ-LTMR'ler, kuyruk tarafındaki saç foliküllerinin etrafında polarize lanseol uçlar oluşturur; bu, saç sapmasına yön seçici yanıtları için gereklibir özellik 7. Lanseolat komplekslerdeki aksonal uçlar, saç saplarıyla yakından hizalanır ve terminal Schwann hücrelerinden gelen parmak benzeri süreçlerle örtülüdür; bu süreçler trofik destek sağlar ve aksonalmorfogenez 8,9,10'u etkiler. Çamur deride, Aβ RA-LTMR aksonları, dermal papillalar içinde yer alan ve deri boyunca harekete ayarlanmış oval şekilli yapılar olan Meissnerkorpusüküllerinde sonlanır 2,11.

LTMR aksonal terminallerin organizasyonu, geliştirme sırasında hem içsel programlar hem de cilde bağımlı ipuçları tarafındandüzenlenir 12,13. Hasar gördüğünde, LTMR disfonksiyonu mekanik allodinni12,14 gibi patolojik durumlarla ilişkilidir. Ancak, sağlam deride LTMR gelişimi ve korunması mekanizmaları belirsizdir. Gelişimleri hakkında bilinenlerin çoğu, sabit dokulardan kaynaklanır ve bu dokular, in vivo 6,15,16,17,18 içinde gerçekleşebilecek dinamik süreçleri yakalayamaz. Örneğin, Aβ RA-LTMR'ler ve Aδ-LTMR'ler, erken doğum sonrası gelişim sırasında saç folikülleri ve aksonal budama etrafında aktif innervasyonlargösterir 19. Saç foliküllerinin innervasyonu ve bakımının in vivo nasıl sağlandığı hâlâ bilinmemektedir.

Canlı dokular içindeki floresan etiketli yapıların görselleştirilmesini sağlayan gelişmiş bir görüntüleme tekniği olan iki fotonlu lazer taramalı mikroskopi, dinamik fizyolojik süreçlerin yüksek çözünürlüklü in vivo görüntülemesinimümkün kılmıştır 20,21. İki fotonlu görüntüleme sırasında, kısa süreli yakın kızılötesi ışık darbeleri floroforları yalnızca odak düzleminde uyarır, böylece sinyali küçük bir hacimle sınırlar ve odak dışıfloresansı 21,22 en aza indirir. Bu hapsetme fototoksisiteyi önemli ölçüde azaltır ve yapıların üç boyutlu, mekansal olarak çözülebilirgörüntülenmesini sağlar 20,23,24. Ayrıca, iki foton mikroskopide kullanılan daha uzun uyarılma dalga boyları doku içinde daha az saçılır; bu da karmaşık ortamlarda daha derin nüfuz ve daha düşük gürültü sağlar 20,25,26. Örneğin, iki fotonlu görüntüleme, omurilik sırt boynuzu nöronlarında yapısal sinaptik plastisite ve nöronalaktiviteleri ortaya koydu 27,28,29. Ayrıca, saç foliküllerinin kronik in vivo iki fotonlu görüntülemesi, fare kulak derisindeki homeostazları hakkında bilgiler ortayaçıkardı 23. Bu nedenle, iki foton mikroskopi, özellikle tekrarlayan ve gelişimsel ve kronik değişiklikleri takip etmek için uzun vadeli görüntüleme gerektiğinde, ciltteki LTMR yapılarını in vivo incelemek için oldukça uygundur.

Floresan raporlayıcıları ifade eden genetik olarak değiştirilmiş fare çizgileriyle eşleştirildiğinde, iki foton mikroskobu deride nöronal morfolojiyiortaya çıkarabilir 3. Somatosensori sistemde, thy1 promotoru (Thy1-YFP30) kontrolü altında ifade edilen sarı floresan protein (YFP), tüylü ciltte Aβ-LTMR lanseolat komplekslerini ve labros deride Meissner korpuskülleriniseçici olarak etiketler 30,31. Thy1-YFP farelerinde, işaretlenmiş aksonlar miyelin baziz protein ve nörofilament için pozitiftir; bunlar miyelinli Aβ aksonları30,31 için belirteçlerdir. Ayrıca, tamoksifen indüklenebilir Cre rekombinazının (CreER) TrkB (tropomiozin reseptörü kinaz B) geninin ekspresyonuyla yönlendirildiği TrkBCreER, gelişim sırasında Aδ-LTMR'leri seçici olaraketiketler 7. Ciltte, iki foton mikroskopi, anestezi altındaki farelerde LTMR'lerin görüntülenmesinde en etkili olur; çünkü farenin hareketi yüksek çözünürlüklü görüntüleme kaydını etkiler. CreER'in indüklediği ekspresyonun ardından aksonal terminallerde floresan proteinlerin görselleştirilmesi zaman alır ve her transgenik hat için minimum bekleme süresi belirlenmelidir. Genel olarak, bu metodoloji, tüm gelişim evrelerindeki farelerde ve yetişkinlerde LTMR'lerin görselleştirilmesine uygulanabilir.

Bu protokol, gelişmekte olan ve yetişkin farelerin tüylü ve tüylü derisinde LTMR akson morfolojisini yüksek çözünürlükte incelemek için iki foton mikroskopisi kullanım prosedürlerini açıklar. Protokol, optimal yüksek çözünürlüklü ve kronik görüntüleme için birkaç ipucu içerir. Bu bütünleşme yaklaşımı, dokunma duyusal aksonlarının in vivo olarak toplanmasını ve plastisitesini yönlendiren hücresel mekanizmaların araştırılmasını mümkün kılar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Vanderbilt Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Deney yapanların güvenliği için tüm işlemler laboratuvar önlükleri, steril eldivenler ve maskelerle gerçekleştirildi. Tüm aletler kullanımdan önce iyice sterilize edildi ve tüm deneysel yüzeyler her deneyden önce ve sonra %70 etanol ile temizlendi. Bu çalışmada kullanılan fareler hem ergen hem de yetişkin hayvanlardı ve Thy1-YFP, TrkBCreER, Ai140 suşlarından türetildi. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Enstrümanların hazırlanması

  1. Lazeri aç. Lazerin ısınması için bolca zaman tanı. Bu çalışmada, darbe süresi 100 femtosaniye (fs) ve tekrar hızı 80 ± 0.5 megahertz (MHz) olan Chameleon Discovery NX lazeri kullanılmıştır.
  2. İki fotonlu mikroskobu açın ve bilgisayarda kontrol ve algılama yazılımını açın.
  3. Anestezi sırasında hipotermiyi önlemek için ısıtma pedini açın ve 37 °C'ye ayarlayın.

2. Anestezi ve ön pati görüntüleme için hazırlanır

  1. Anestezi başlatmak için, fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve fare düz refleksini kaybedip düzenli ve düzgünlü solunum gösterene kadar sistemi %3,5 isofluran olarak ayarlayın (kurumsal onaylı protokollere uygun olarak). Oda havası taşıyıcı olarak kullanılır ve dakikada 1.0 litre (L/dakika) olarak ayarlanmalıdır.
  2. Fareyi görüntüleme platformundaki ısıtma pedine yerleştirin ve izofluranı %1,5, oksijeni ise dakikada 0,5 L/m'e indirin. İzofluran burun konisi üzerinden iletmelidir. Doğum sonrası 20. günden küçük farelerde isefloran anestezini sürdürmek için %2-4 olarak ayarlanır. Pedal ve palpebral reflekslerin kaybını, solunum hızını ve derinliğini, genel kas tonusunu değerlendirerek her 10 dakikada bir anestezik derinliğini izleyin.
  3. Görüntüleme sırasında hareket bozukluklarını, özellikle nefes alımı ile ilgili hareketleri en aza indirmek için, fare patiden ayrı bir aşamaya yerleştirilmelidir. Bu protokol için fare gövdesi, patinin monte edildiği görüntüleme platformuna doğrudan bitişik ama dokunmayan bir platforma dayanır.
  4. Görüntüleme sırasında kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın.
  5. Tüyleri temizlemek için pamuklu çubukla patiye nazikçe depilasyon kremi uygulayın. Ciltte bir dakika bekledikten sonra kremi çıkarın ve fare patisini %70 etanol ve suyla temizleyin.
  6. Deriyi nazikçe gererek cilt yüzeyini stabilize edin. Steril 30 G iğne ve siyah mürekkep kullanarak, cildi ve dövmeyi nazikçe delin, hedeflenen görüntü bölgesinin her iki yanında bitişik iki nokta bulunsun. Noktaların yaklaşık 2 milimetre (mm) aralıklı olduğundan emin olun. Dövme işlemi tamamlandıktan sonra, iğneyi düzgün şekilde bir keskin bir kapta atın.
  7. Cam mikroskop slaytı üzerine, köşelere dört nokta vakum yağı koyun ve slaytın ortasına yaklaşık 1 mm kalınlığında küçük bir kil parçası (örneğin, DAS Air-Sertleştirici Modelleme Kil) yerleştirin. Kaydırı objektif lensin altına yerleştirin ve farenin patisini doğrudan kil parçasının üzerine ortalayın (Şekil 1A,B). Fare patisini kaydırakta nazikçe yuvarlayıp düzleştirin ve kile bastırın. Sürgü sabitlemek için dikkatlice 22 mm x 60 mm ölçülerinde bir örtü patanın üstüne yerleştirin. Fare derisinin açısını, örtü yüzeyi ve deri görüntüleme düzlemiyle paralel olana kadar coverslip'in her köşesine hafif bir baskı uygulayarak ayarlayın. Görüntüleme sırasında hafif kuvvet kullanmak olası cilt yaralanmasını önlemeye yardımcı olur.
  8. Tüpren deriyi görüntülemek için, kaydırı objektif lensin altına yerleştirin ve farenin patisini adım 2.7'de detaylandırıldığı gibi slayt üzerinde ortalayın. Patiyi döndürmek için cımbız kullanın, böylece tüs deri yukarıya bakacak. Cımbızların düz ucunu kullanarak patiyi nazikçe kile bastırın. Pati düz olduğunda, örtü slip'i üstüne koyun ve 2.7. adımda tarif edildiği gibi aşağıya basın.

3. LTMR morfolojisinin iki foton mikroskop görüntülemesi

NOT: Aşağıdaki parametreler, belirli deneye göre ayarlanabilir. Bu deney için, 1 sayısal açıklığa ve 2.00 mm çalışma mesafesine sahip 20x suya battırma objektif lens kullanıldı. 3.1-3.6. adımlar, Thy1-YFP farelerinin sağ ön patisi için kullanılan özel parametreleri tanımlar; bu parametreler referans rehberi olarak hizmet edebilir.

  1. Fare pençesinin üzerine bir damla damıtılmış su koyun.
  2. Objektif lensi su sütunu oluşana kadar aşağı indirin.
  3. Objektif lens fare pençesinin üzerinde ortalandığında, mikroskop kutusunu kapatın ve X, Y ve Z kontrolörleri aracılığıyla sample üzerinde LED ekranı kullanın. LED ekran, mikroskobun yerleşik LED'iyle aydınlatılan canlı bir görüntü gösterir.
    NOT: LED modu, objektif lensin ilgi alanına odaklandığını doğrulamak için kullanılır, ardından iki foton moduna geçilir. LED görüntü, kan damarları ve saç folikülleri gibi yüzey özelliklerini gösteriyor ve hizalama ile hedefleme için görsel bir rehber görevi görüyor. Fare patisindeki dövmeler LED ekranda siyah noktalar olarak görünür. Bu işaretleri kullanarak siyah noktalar arasındaki alanı bulun ve odaklanın. Bu, fare pençesinin aynı alanının tekrar tekrar görüntülenmesini sağlar.
  4. Örnek bulunduğunda, LED ekranı kapatın. Dokudan iki fotonlu görüntüleme yapmak için, mikroskobu aynadan dikroik ayarına geçirerek mikroskobun sağ üst tarafındaki bir kolu çevirin.
  5. Karartma perdelerini kapatın ve YFP'yi görselleştirmek için dedektörü açın.
  6. Prairie View kullanarak deklanşörü açın ve yazılımı görüntüleme moduna geçirin. Thy1-YFP görüntülemesi için, ayarlanabilir lazeri 960 nanometre (nm) olarak 700-800 kazanç elde etmeye açın. GFP görüntüleme sırasında ayarlanabilir lazeri 920 nm olarak ayarlayın.
    1. Doğum sonrası 10. gün veya daha küçük fareler için, başlangıç lazer gücünü 50'ye ayarlayın ve istenen sinyal yoğunluğuna ulaşana kadar artırın. Bu düşük başlangıç lazer gücü ışık nüfuzunu ve fotohasar riskini en aza indirir. Lazer dalga boyu, kazanç ve güç ayarlandıktan sonra taramaya başlayın.
      NOT: Yüksek çözünürlüklü 1.00x görüş alanı görüntüsü veya Meissner korpusüküllerinin parmak uçlarında görüntü yakalamak için, 1024 x 1024 boyutunda görüntü boyutu, 601.9 μm x 601.9 μm görüntü alanı ve 0.588 μm x 0.588 μm piksel boyutu kullanılması önerilir. Saç köklerinin etrafındaki lanseol uçların görüntülenmesi için, 8.00x yakınlaştırmada 1024 x 1024 görüntü boyutu, 75.2 μm x 75.2 μm görüntüleme alanı ve 0.147 μm x 0.147 μm piksel boyutu olması önerilir. Görüntüleme alanı ve piksel boyutu zoom ayarıyla değişir.
  7. X, Y ve Z kontrolörlerini kullanarak görüntü alanını bulun, gerektiğinde zoom'u ayarlayın ve görüntü alımı başlatın. Optimal görüntü genellikle cilt yüzeyinin yaklaşık 10-20 μm altında başlangıç pozisyonunda elde edilir.
    NOT: Tüylü cildin yüksek çözünürlüklü görüntüsü genellikle 1 μm veya 2 μm boyutunda ve yaklaşık 40-120 dilim içerir. Bu arada, glabrous derinin yüksek çözünürlüklü görüntüsü genellikle 2 μm ile 4 μm arasında yaklaşık 80-100 dilim içeren bir adım boyutuna sahiptir. Bu, tipik bir z-aralığı 100-250 μm arasında olur ve genel maksimum görüntüleme derinliği yaklaşık 300 μm'dir.
  8. İzofluran maruziyetinin süresini en aza indirmek ve hayvanda anestezi kaynaklı yan etkiler riskini azaltmak için görüntüleme seansı 25 dakika ile sınırlı olacak. Ekstra izofluran, anestezi kömür filtresi kutusu tarafından emilir ve normal çöpe atılabilir.

4. Ameliyat sonrası bakım

  1. Fare patisini cam kaydıraktan çıkarın ve fareyi kurtarma kafesine geri götürün.
  2. Fare kafesini bir ısıtma pedinde sıcak tutun, fare anesteziden tamamen iyileşene kadar.
  3. Fareyi tekrar ev kafesine yerleştirin, farenin kafes arkadaşlarıyla bütünleştiğinden emin olmak için onu 30 dakika daha gözlemleyin.

5. LTMR morfolojisinin in vivo kronik görüntülemesi

  1. 2.4-3.3 numaralı adımları takip ederek fareyi iki fotonlu mikroskop altına yerleştirin.
  2. LED ekranı kullanarak önceki görüntüleme oturumundan mürekkep noktalarını bulun. İstenilen alanın yakalanması için ekranı noktalar arasında yönlendirin. Mikroskopta tarama modunda, aynı bölgeyi tespit etmek için büyük sinirler veya saç folikülleri gibi işaretleri kontrol edin.
  3. Görüntüleme alanı bulunduktan sonra, görüntülemeye devam etmek için 3.4-3.6 adımlarını takip edin.
  4. Görüntülerin kalitesini ve yoğunluğunu ile cilt alanının iki fotonlu uyarımıyla elde edilen ana aksonların morfolojisini kontrol edin. Görüntü alanlarının önceki görüntüleme oturumunda çekilenlerle karşılaştırılabilir olduğundan emin olun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, gelişim sırasında ve yetişkinlerde ciltte Aβ RA-LTMR ve Aδ-LTMR aksonal yapılarının görselleştirilmesi için iki foton mikroskopisi kullanılmıştır. Olgun lanseol forma uçları, doğum sonrası 20 ve daha büyük farelerde ortaya çıkar ve tam olarakgelişmiştir 19,32. Yetişkin farelerin tüylü derisindeki akson terminallerinin genel organizasyonu, maksimum yoğunluk projeksiyonunda gösterildiği gibi görüntülendi (Şekil 2A). Bu ak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, yenidoğan ve yetişkin farelerin sağlam derisindeki LTMR morfolojisini incelemek için iki foton mikroskopi kullanımını göstermektedir. Bu uzunlamasına görüntüleme yaklaşımı, doku fiksasyonunun sınırlamalarını aşar ve sağlam dokularda aksonal yapıların gerçek zamanlı gözlemini mümkün kılar. İki foton görüntülemeyle görselleştirilen Aβ RA-LTMR ve Aδ-LTMR aksonal morfolojileri, önceki PFA-sabitdokular 2,6,7,19,33,34 gözle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ilgili açıklamalar bildirmemektedir.

Teşekkürler

Bu araştırma boyunca tüm destekleri ve destekleri için Dr. Hannah Elam, Dr. Snighda Mukerjee, Rachelle Larivee ve Dr. Tegy J. Vadakkan'a teşekkür etmek isteriz. İzofluran sisteminin kurulmasında yardımı için Ryan Michael Nuera'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Hanna Gray Bursu (Grant# GT17518) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
20x Objektif Lens – Super NA 1.0Olympus1-U2B965İki Foton Mikroskobu Kurulumu
22x60 Kapak SlipVWR16004-330İki Foton Mikroskobu Kurulumu
Hava Sertleştirme Modelleme KilDASİki Foton Mikroskobu Kurulumu
Anestezi Hava Pompası (HF), 110VRWD Yaşam Bilimleri A.Ş.R510-30İzofluran Sistemi
Anestezi Konsantrik MaskesiRWD Yaşam Bilimleri A.Ş.R510-Mİzofluran Sistemi
Anestezi Indüksiyon Odası & Dash; Fare ve FareRWD Yaşam Bilimleri A.Ş.V105İzofluran Sistemi
Bruker Ultima Araştırmacı Plus Lazer Tarama MikroskobuBruker Nano, Inc. İki Foton Mikroskobu Kurulumu
Kelebek İğneleriFisher Scientific1484041İki Foton Mikroskobu Kurulumu
Chameleon Discovery NX TPC ile: ÇiftTutarlı1385777İki Foton Mikroskobu Kurulumu
Yenidoğan fareleri için tüplü koni maskeRWD Yaşam Bilimleri A.Ş.68680İzofluran Sistemi
Çift emisyonlu filtreler (et525/70m ve et595/50m) ve t565lpxr  Dikroik ışın bayırıcıNikonINVP-01İki Foton Mikroskobu Kurulumu
Epi-Floresan Filtre Seti ET-GFP ET470/40x ve ET252/50m; dichroic T495LPXR Nikon518065İki Foton Mikroskobu Kurulumu
EtanolDecon Laboratuvarları Inc.İki Foton Mikroskobu Kurulumu
Kontrol Cihazı (AC gücü) ile Uzak Kızılötesi Isıtma PediKent ScientificRT-0515İki Foton Mikroskobu Kurulumu
GaAsp Dedektörleri (2) Hamamatsu Fotonik & nbsp;HED-UP-2 İki Foton Mikroskobu Kurulumu
Gaz Filtre KutularıRWD Yaşam Bilimleri A.Ş.R510-31-6İzofluran Sistemi
Yüksek Vakumlu YağSigma AldrichZ273554Görüntüleme Sistemi
İzofluran, USP (250 mL)Piramal Kritik Bakım6679-017-25İzofluran Sistemi
Lazer Kapak Kutusu Teco TeknolojisiGörüntüleme Sistemi
Fareler: B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/JJAX27214
Fareler: B6. Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP,CAG-tTA2)Hze/JJAX30220
Fareler: B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/JCharles Nehri3709
Nair Saç Temizleyici KremiAmazon28001İki Foton Mikroskobu Kurulumu
Ham Veri DosyalarıZenodo10.5281/zenodo.17370834
Büyük Dikdörtgen Insert Tutuculu Sert StandThorlabsMP15Mİki Foton Mikroskobu Kurulumu
Küçük Hayvan Anestezi Operasyon PlatformuRWD Yaşam Bilimleri A.Ş.R510-PGLİzofluran Sistemi
Yatıştırıcı Göz MerhemiBausch + Lombİki Foton Mikroskobu Kurulumu
Superfrost Plus Mikroskop SlaytlarıFisher Scientific12-550-15İki Foton Mikroskobu Kurulumu

Kaynaklar

  1. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  2. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  3. Meltzer, S., Santiago, C., Sharma, N., Ginty, D. D. The cellular and molecular basis of somatosensory neuron development. Neuron. 109 (23), 3736-3757 (2021).
  4. Burgess, P. R., Petit, D., Warren, R. M. Receptor types in cat hairy skin supplied by myelinated fibers. J Neurophysiol. 31 (6), 833-848 (1968).
  5. Iggo, A., Muir, A. R. The structure and function of a slowly adapting touch corpuscle in hairy skin. J Physiol. 200 (3), 763-796 (1969).
  6. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
  7. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  8. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
  9. Handler, A., et al. Three-dimensional reconstructions of mechanosensory end organs suggest a unifying mechanism underlying dynamic, light touch. Neuron. 111 (20), 3211-3229 (2023).
  10. Yamamoto, T. The fine structure of the palisade-type sensory endings in relation to hair follicles. J Electron Microsc (Tokyo). 15 (3), 158-166 (1966).
  11. Cauna, N., Ross, L. L. The fine structure of Meissner's touch corpuscles of human fingers. J Biophys Biochem Cytol. 8 (2), 467-482 (1960).
  12. Olson, W., Dong, P., Fleming, M., Luo, W. The specification and wiring of mammalian cutaneous low-threshold mechanoreceptors. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (3), 389-404 (2016).
  13. Koutsioumpa, C., et al. Skin-type-dependent development of murine mechanosensory neurons. Dev Cell. 58 (20), 2032-2047 (2023).
  14. Duan, B., Cheng, L., Ma, Q. Spinal circuits transmitting mechanical pain and itch. Neurosci Bull. 34 (1), 186-193 (2018).
  15. Botchkarev, V. A., Eichmüller, S., Johansson, O., Paus, R. Hair cycle-dependent plasticity of skin and hair follicle innervation in normal murine skin. J Comp Neurol. 386 (3), 379-395 (1997).
  16. Peters, E. M. J., et al. Developmental timing of hair follicle and dorsal skin innervation in mice. J Comp Neurol. 448 (1), 28-52 (2002).
  17. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3 (4), 389-395 (2003).
  18. Liu, Q., et al. Molecular genetic visualization of a rare subset of unmyelinated sensory neurons that may detect gentle touch. Nat Neurosci. 10 (8), 946-948 (2007).
  19. Meltzer, S., et al. A role for axon-glial interactions and Netrin-G1 signaling in the formation of low-threshold mechanoreceptor end organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (43), e2210421119(2022).
  20. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  21. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  22. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  23. Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nat Protoc. 10 (7), 1116-1130 (2015).
  24. Kamei, R., Urata, S., Maruoka, H., Okabe, S. In vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus. J Vis Exp. (185), e64104(2022).
  25. Rompolas, P., Mesa, K. R., Greco, V. Spatial organization within a niche as a determinant of stem-cell fate. Nature. 502 (7472), 513-518 (2013).
  26. Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 23 (12), 3139-3149 (2006).
  27. Ahanonu, B., Crowther, A., Kania, A., Rosa-Casillas, M., Basbaum, A. I. Long-term optical imaging of the spinal cord in awake behaving mice. Nat Methods. 21 (12), 2363-2375 (2024).
  28. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760(2012).
  29. Matsumura, S., Taniguchi, W., Nishida, K., Nakatsuka, T., Ito, S. In vivo two-photon imaging of structural dynamics in the spinal dorsal horn in an inflammatory pain model. Eur J Neurosci. 41 (7), 989-997 (2015).
  30. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  31. Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 88 (10), 582-595 (2012).
  32. Luo, W., Enomoto, H., Rice, F. L., Milbrandt, J., Ginty, D. D. Molecular identification of rapidly adapting mechanoreceptors and their developmental dependence on Ret signaling. Neuron. 64 (6), 841-856 (2009).
  33. Neubarth, N. L., et al. Meissner corpuscles and their spatially intermingled afferents underlie gentle touch perception. Science. 368 (6497), eabb2751(2020).
  34. Bai, L., et al. Genetic Identification of an Expansive Mechanoreceptor Sensitive to Skin Stroking. Cell. 163 (7), 1783-1795 (2015).
  35. Griffin, J. W., Thompson, W. J. Biology and pathology of nonmyelinating Schwann cells. Glia. 56 (14), 1518-1531 (2008).
  36. Tsai, P. F., Chou, F. P., Yu, T. S., Lee, H. J., Chiu, C. T. Depilatory creams increase the number of hair follicles, and dermal fibroblasts expressing interleukin-6, tumor necrosis factor-α, and tumor necrosis factor-β in mouse skin. Korean J Physiol Pharmacol. 25 (6), 497-506 (2021).
  37. Bourane, S., et al. Low-threshold mechanoreceptor subtypes selectively express MafA and are specified by Ret signaling. Neuron. 64 (6), 857-870 (2009).
  38. Jung, Y., Ng, J. H., Keating, C. P., Senthil-Kumar, P., Zhao, J. Comprehensive evaluation of peripheral nerve regeneration in the acute healing phase using tissue clearing and optical microscopy in a rodent model. PLoS One. 9 (4), e94054(2014).
  39. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606 (7912), 137-145 (2022).
  40. Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Exp Dermatol. 26 (5), 379-383 (2017).
  41. Meleshina, A. V., et al. Multimodal label-free imaging of living dermal equivalents including dermal papilla cells. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 84(2018).
  42. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Somatosens r AksonlarLTMR Aksonlarn Vivo G r nt lemeKronik G r nt lemeK l Folik l nnervasyonuAkson Geli imiMeissner Korpusk lleri
Fare Derisindeki Dokunma Duyusal Akson Morfolojisinin İntravital İki Fotonlu Görüntülemesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.