Method Article

Gözenekli Membran Insertleri ve RTddPCR Kullanarak Aksonal MRNA'ların İzolasyonu ve Nicelesi

DOI:

10.3791/69601

⸱

February 6th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Rutgers University- Newark, 2College of Arts & Sciences, Boston University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, gözenekli membran insertleri kullanarak aksonal mRNA'ları izole etmek için sağlam bir yöntem sunmaktadır; böylece toplam nöron ve nörit ayrımı ve RNA arındırmasını mümkün kılar. RTddPCR ile birleştiğinde, bu yaklaşım düşük kopyalı transkriptlerin mutlak nicelendirilmesini sağlar; mRNA taşınımı ve yerel çeviri çalışmalarını yüksek duyarlılık, tekrarlanabilirlik ve geniş deneysel uygulama ile kolaylaştırır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronlar içindeki mRNA lokalizasyonu ve translasyonunun mekansal dinamikleri, nöron bağlantısı, sinaptik plastisite ve hasara yanıt gibi çeşitli nöronal fonksiyon mekanizmaları için gereklidir. Nöronların aşırı polaritesi nedeniyle, bu fonksiyonların çoğu aksonların belirli transkriptleri yerel olarak çevirme yeteneğine dayanır. Ancak, bu subhücresel RNA popülasyonlarını nicelik olarak ölçmek teknik olarak zordur. Burada, kültürlenmiş kemirgen nöronlardan ayrı somatik ve akson olarak zenginleştirilmiş bölmeler elde etmek ve bölme-spesifik mRNA ifadesini nicelendirmek için tekrarlanabilir bir yaklaşımı tanımlıyoruz. Birincil kemirgen embriyonik veya yetişkin nöronları 1-3 μm boyutunda gözenekli membrana sahip insertler üzerinde kültürlendi. Bu zarlar yalnızca aksonlara izin verir ve somatik ve aksonal bölmelerin fiziksel ayrılmasına olanak tanır. RNA, ardından tüm nörondan ve akson zenginleştirilmiş fraksiyonlardan ayrı ayrı izole edildi; bu fraksiyonlar, gen spesifik primerlerle ters transkriptaz damlacıklı dijital PCR (RTddPCR) için daha sonra kullanıldı. Bu sistem, subhücre bölmeleri arasında mutlak nicel bir karşılaştırma sunar ve lokalize transkripsiyonların yüksek hassasiyetle tespit edilmesini sağlar. Bu yaklaşım, sabit durumlu RNA bolluğunu ölçer ve nörotrofik faktörlere, strese veya yaralanma modellerine yanıt olarak zaman içinde aksonal RNA değişikliklerinin incelenmesini kolaylaştırır. Fiziksel bölümlendirme ve RTddPCR analizinin birleşimi, çapraz kontaminasyonu azaltır ve nadir transkriptlerin tam kopya sayılarını sağlar; yüksek hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve akson büyümesi ile yenilenmesini kontrol eden düşük kopya sayısı mRNA'ların tespitini sağlar. Bu yöntem, protein sentezini ölçmek, RNA kararlılığını incelemek ve siRNA veya belirli proteinleri bloklayan ilaçlarla pertürbasyon deneyleri yapmak gibi sonraki akım testlerle de çalışır. Önemli olarak, bu teknik farklı nöronal alt tipler, gelişim evreleri veya yaralanma modelleri için uyarlanabilir. Genel olarak, bu yaklaşım, aksonal mRNA lokalizasyonunun moleküler temelini ve bunun nöronal fonksiyonları ile hastalık mekanizmalarını nasıl etkilediğini incelemek için esnek, hassas ve tekrarlanabilir bir yöntemdir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronlar biyolojideki en yapısal olarak karmaşık ve polarize hücrelerden biridir. Bazen bir metreyi aşan mesafelere ulaşabilen uzun süreçleri vardır. Bu polarite, hücresel iletişimi ve protein homeostazını farklı şekillerde karmaşıklaştırır. Bu gereksinimleri karşılamak için gelişmiş bir yaklaşım, mRNA'ları aksonlar ve dendritler gibi uzak bölmelere taşımak, böylece yerelsinyallere 1,2,3 yanıt olarak düzenlenmiş bir şekilde çevrilmelerini kolaylaştırmaktır. Yerel çeviri, aksonların proteinleri uzaylı-zamansal bir şekilde sentezlemesini sağlar. Bu süreç, aksonal gelişim, sinaptik plastisite, yaralanma sonrası yenilenme ve gelişimsel ile ekstrasellüler uyarılaraverilen yanıtlar için kritik öneme sahiptir 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Aksonlardaki lokalize mRNA'ların işlevlerini analiz edebilme yeteneği, hem normal nöronal fonksiyonlarda hem de patofizyoloji bağlamında rollerini anlamak için çok önemlidir. Aksonal mRNA çevirisinin düzensizliği, amiyotrofik lateral skleroz (ALS)17,18,19, spinal kas atrofisi (SMA)20,21 ve Alzheimer hastalığı (AD)22 gibi çeşitli nörodejeneratifhastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Hasar sonrası aksonal yenilenme, sitoskelet proteinlerinin, sinyal moleküllerinin vereseptörler 3,23,24,25,26,27,28'in hızlı ve hassas translasyonuna büyük ölçüde bağlıdır. Bu yeni kavramlara rağmen, disiplin, aksona özgü mRNA popülasyonlarını etkili şekilde niceltme ve yakalama konusunda zorluklarla karşı karşıya kalmaktadır.

Aksonal transkriptomikin zorluklarından biri, soma ve aksonların temiz ayrılmasını sağlamak. MRNA'ların çoğu soma açısından zenginleştirildiğinden, hücre vücudundan gelen küçük miktarlarda kontaminasyon bile belirli bir mRNA'nın aksonal içeriği değerlendirilirken sonuçları etkileyebilir. Mikrofluidikodalar 29,30,31,32 veya Campenot odaları 33 gibi geleneksel teknikler, iki bölme arasında yönlü aksonal büyüme ve net ayrım sağlar, ancak aksonal verim, toplu RNA dizileme (RNA-seq), RNA ko-immünopresipitasyonu ve ardından RNA dizileme veya nicel polimeraz zincirleme reaksiyonu (qPCR) gibi biyokimyasal çalışmalar için çok düşük olabilir. Toplu RNA-seq ve qPCR, ne kadar faydalı olursa olsun, aksonlarda düşük kopya transkriptlerini doğru şekilde tespit etmek için gerekli hassasiyetten genellikle yoksun ve bu da fizyolojik olarak anlamlı türlerin yanlış tahminine yol açar.

Bu zorlukları ele almak için, biz ve diğerleri aksonlar ve somataların fiziksel ayrılması içingeçirgen membran insertleri kullandık 34,35,36,37,38,39,40,41. Bu ekler, mikro gözenekli bir yüzeyde nöronların gelişmesini sağlar ve aksonlar bu bölgelerden alt bölmeye ulaşabilir, ancak soma uzanamıyor. Bu temel ama etkili mimari, soma ve aksonların net fiziksel ayrımıyla çok sayıda nöronun kültürlenmesini mümkün kılar. Membran tabanlı yöntem önemlidir çünkü mikrofluidik cihazlarla ilgili teknik sorunları önler ve moleküler ve biyokimyasal çalışmalar için kullanılabilecek yüksek miktarda aksonal materyal sağlar. Insert sistemi mekanik yaralanma gibi durumlarda kullanımı da kolaydır, bu da onu sinirsel onarımla ilgili birçok farklı deneysel ortamda kullanışlı kılar. Burada açıklanan yöntem, kültür koşullarını iyileştirerek, membran gözenek özelliklerini ayarlayarak ve düşük verimli aksonal RNA örnekleri için ters transkriptaz damlalı dijital PCR (RTddPCR) tabanlı doğrulamayı içererek nöronal verimini ve saflığı daha da optimize eder.

Ayrıca aksonal fraksiyonların saf olduğundan emin olmak da önemlidir. Aksonları, üst yüzeyden kalan somatik maddeleri dikkatlice çıkardıktan sonra alt odadan çıkarıyoruz. Primer doğrulaması, aksonal işaretleyicilerin güçlü zenginleşmesini ve somatik belirteçlerin olmadığını veya önemsiz olduğunu göstermektedir. Moleküler doğrulama bu ayrımı pekiştirir: aksonal fraksiyonlar, Gap43 gibi tanınmış aksonal mRNA'larla zenginleştirilir ve Actγ42'nin daha düşük ekspresyonu vardır. Bu, insert sisteminin soma içeriği önemsiz olan aksonal örnekler yaptığını ve bunun daha ileri inceleme için iyi olduğunu gösteriyor.

Zenginleştirilmiş aksonal fraksiyonlar izole edildikten sonra, sonraki engel çok düşük kopya sayılarında bulunan mRNA'ları ölçmektir. Aksonal fraksiyonlardan alınan az başlangıç materyali ve aksonda düşük kopya sayısı mRNA'ların varlığı, standart ölçü eğrileri kullanan geleneksel ters transkriptaz nicel PCR'nin (RT-qPCR) hassasiyet sınırlarını zorlar. Ayrıca, RT-qPCR belirli bir transkriptin mutlak kopya numaralarını da sağlamaz. RTddPCR ise, cDNA örneklerini binlerce damlaya ayırır ve bu da Poisson istatistikleriyle kesin bir transkript sayısı elde etmeye yardımcı olur. Bu, tek bir nanogram toplamRNA 5,6,7,43'te transkriptlerin birkaç kopyası bulunsa bile transkriptleri güvenilir şekilde bulmayı mümkün kılar.

Bu makalede, farklı yetişkin veya embriyonik kemirgen nöronları ekleme üzerine kültür yöntemleri, tüm nörondan ve aksonal zenginleştirilmiş bölümlerden RNA'nın izolasyonu, aksonal saflığın kontrolü ve mRNA kopyalarının RTddPCR tabanlı mutlak nicelenmesi gibi sade bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yöntemler, bazal koşullarda aksonlara lokalize olan spesifik mRNA'ların seviyelerini ve aksotomi sırasında veya büyüme faktörü uyarısı veya nörotoksik sinyallere yanıt olarak nasıl değiştiklerini belirlemek için kullanılabilir. Bu yöntemi protein ko-immünopresipitasyonlarıyla birleştirerek, aksonlardaki riboküler protein (RNP) komplekslerinin dinamikleri de değerlendirilebilir. Örneğin, bu yöntemi, aksonal Ras GTPaz aktive eden protein bağlayıcı protein 1 (G3BP1) granüllerinde bulunan mRNA'ları kapsamlı şekilde incelemek için kullandık. G3BP1, stresgranülleri 44'ün temel bileşenidir ve önceki çalışmalarımız aksonal protein sentezini inhibe ettiğini ve bunun sonucunda hem PNS hem de MSS aksonrejenerasyonunu blokladığını göstermiştir 5. Ayrıca, bu yöntem ALS, SMA ve AD gibi çeşitli patofizyolojik durumlarda aksonal translasyon düzensizliğinin rolünü araştırmak için kullanılabilir.

Bu çalışmanın amacı, aksonal mRNA'ları ölçmek için hassas, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir yöntem oluşturmak ve test etmektir. Bölümlendirilmiş insert tabanlı kültürleri RTddPCR tabanlı niceliklendirme ile birleştirerek, aksonal transkriptomiklerin kalıcı sorunlarına bir çözüm sunuyoruz. Bu metodoloji, yerel çeviriyle ilgili temel keşifleri mümkün kılmakla kalmaz, aynı zamanda sinirsel onarım ve nörodejenerasyonda terapötik müdahalelere odaklanan translasyonel araştırmalar için de temel oluşturur.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre tohumlaması için insertlerin hazırlanması

  1. Uygun gözenek boyutundaki ekleri 6 delikli bir plakaya yerleştirin.
    NOT: Aksonları soma'dan ayırmak için 1 μm gözenek boyutu, tüm nöritleri (aksonlar ve dendritler) soma'dan ayırmak için ise 3 μm gözenek boyutu kullanın.
  2. 6 kuyu plakaya 100 μg/mL poli-L-lizin (PLL) ekleyin, böylece eklerin altına ve girişlerin üstüne (2 mL/kuyu ve 1 mL/insert) değinsin.
  3. 37 °C'de gece kuluçka yapın.
  4. Kuyrukları (iç kısımların altını) ve eklerin üst kısmını steril ultrasaf suyla yıkayın - 4 yıkama × 5 dakika.
  5. Sadece dorsal kök ganglion (DRG) nöronları için, 5 μg/mL laminin (2 mL/iyi ve 1 mL/insert) ekleyin ve en az 1 saat 37 °C'de kuluçka yapın. Hem üst hem alt kısmının eşit şekilde kaplamalı olduğundan emin olun.
  6. 100 U/mL Penisillin/Streptomisin içeren steril fosfatlı tuzlu (PBS) (pH 7.4) ile yıkayın - 2 yıkama × 5 dakika
  7. Diseksiyona devam edin ve embriyonikkortikal 5, hipokampal45 ve bazal ön beyin kolinergiknöronları 31,32 için 1 ×10 6 hücre/insert tohumu ekleyin. Yetişkin sıçan DRG'leri için, 6-8 DRG/insert 5,7 plaka yapın (Şekil 1).

2. 6-kuyu insertlerinden nöronal subhücre fraksiyonlarının toplanması

  1. Aliquot 250 μL TRIzol, her bir insert için 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde ve bir 6 kuyruklu plakada bir kuyruk/insert içinde. Bir kenara bırak.
  2. Başka bir 6 kuyu plakaya 2 mL steril PBS ekleyin. Kuyup/plaka sayısı, insertlerin sayısıyla orantılı olmalıdır.
  3. Ekin üst ve altından kültür ortamını aspire edin ve insert PBS içeren 6 kuyruklu bir plakaya aktarın.
  4. Forseps kullanarak inserti nazikçe yerleştirin ve üzerine 2 mL PBS ekleyin. Maddeyi insertin üst ve altından aspirasyon yapın ve tekrarlayın. Toplamda, PBS ile iki kez yıkayın ve taze PBS içinde bırakın (insertin üst ve alt kısmında sırasıyla 1 mL ve 2 mL).
  5. Tüm nöron fraksiyonunun izolyasyonu
    1. Steril hücre kazıyıcı kullanarak, tüm nöron fraksiyonunu (insertin üstünden) kazıyın. Hücrelerin ayrılmaya başlaması için yeterli basıncı uygulayın ama zar kırılmaz (Şekil 1).
    2. Tüm nöronu insertten topla ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktar.
    3. Tüpü 10000-15000 g arasında 2 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Üst maddeyi atıp lizatı 250 μL TRIzol'de yeniden süzülür.
    5. Bu tüpü tüm nöron fraksiyonu olarak etiketleyin.
    6. Nörit fraksiyon toplama sürecine devam edin.
  6. Nörit fraksiyonunun izolasyonu
    1. Steril bir pamuk çubuğu alın ve bir uçunu kullanarak tüm nöron tarafında yukarıdan aşağıya çok yavaş bir zig-zag deseniyle hareket edin. Inserti 90 derece döndürün ve işlemi sürüngenin diğer ucuyla tekrarlayın (çift taraflı bir sürüntü kullanıyorsanız veya tek taraflı için yeni bir sampon kullanın). Bu sürüntü atın (Şekil 1).
    2. Yeni bir sampon kullanın ve iç kısmın ortasından başlayıp dışa doğru hareket ederek konsantrik daireler çizerek hareket edin. Duvarları (çevresini) de temizlediğinizden emin olun.
    3. Membran insertini ters çevirin (nörit tarafı yukarıya bakacak şekilde) ve yeni steril bir bistürle bıçakla pensle tutarak membranı kesin. Çevrede ~2-3 mm mesafe bıraktığınızdan emin olun.
    4. Kesilen zarı, nörit tarafı aşağıya bakacak şekilde TRIzol içeren 6 delikli plakaya yerleştirin. Suyla örtülü olduğundan emin olun.
    5. 6 kuyu plakasından nöurit lizat içeren TRIzol'u toplayıp 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  7. Hem tüm nöron hem de nörit lizatları için RNA izolasyonuna devam edin veya lizatları daha sonra işlemek üzere -80 °C'de saklayın.

3. RNA izolasyonu ve nicel

  1. RNA izolasyonu
    NOT: Bu bölüm için, her zaman RNase içermeyen bir ortamda, özel ve steril plastik eşyalar ve eldivenlerle çalışın.
    1. 1 ml TRIzol başına 0,2 ml kloroform ekleyin, 15 saniye sertçe çalkalayın ve oda sıcaklığında 2-3 dakika kuluçka yapın. 12.000 × g sıcaklığında 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın; organik, fazlar ve sulu (RNA içeren) katmanlara ayrılın.
    2. Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın, böylece interfaz kaçının. RNA'yı çökeltmek için 1 hacim izopropanol ekleyin ve nazikçe karıştırın. Oda sıcaklığında (veya daha yüksek verim için -20 °C'de daha uzun) 10 dakika kuluçka geçirerek RNA çökeltirin. 12.000 × g sıcaklıkta 10 dakika boyunca 4 °C'de pellet RNA'ya santrifüj yapın.
    3. Üst malzemeyi atın ve peleti 1 mL %75 etanol ile yıkayın. Kısa bir süre 7.500 × g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca girdab ve santrifüj yaptım.
    4. Çözülen RNA: Etanol yıkamasını dikkatlice çıkarın ve pelleti 5-10 dakika boyunca hava ortamında kurutarak tamamen kurumayı önleyin. Pellet, RNase içermeyen küçük bir hacimde veya 1x Tris-EDTA (TE) tamponunda yeniden askıya alın, tam çözünme için 55-60 °C sıcaklıkta kuluçka yapın. Arındırılmış RNA'yı -80 °C'de sakla.
  2. RiboGreen testi kullanılarak RNA nicelendirmesi
    NOT: Aşağıdaki RiboGreen testi, nükleik asitler için özel bir floresan boya kullanır; UV emici yöntemlerine göre daha yüksek duyarlılık, özgülük ve sağlam RNA'yı tespit etme yeteneği sunar. DNA kontaminasyonu sorun varsa DNAZ tedavisini düşünün.
    1. 1x TE tamponunu hazırlayın, verilen 20x TE tamponunu RNase içermeyen suyla 20 kat seyreltin. RiboGreen çalışma çözümlerini hazırlayın ve ışığa duyarlı boya folga ile korun. Konsantre boya yüksek aralıklı test için 1x TE'de 1:200 (10 ng/mL-1 μg/mL) veya düşük aralık testi için 1x TE'de 1:2000 (2.5 ng/mL-50 ng/mL) seyreltin. RNA standartlarını, beklenen örnek aralığını kapsayacak şekilde kitin RNA standardını 1x TE'de seri seyreltme ile hazırlayın. Standartları üçlü olarak çalıştırın.
    2. Numuneleri, testin dinamik aralığına uyacak şekilde 1x TE'de RNA örnekleri seyreltileyerek hazırlayın. Örnekleri üçlü olarak çalıştırın.
    3. Eşit hacimde RiboGreen çalışma çözeltisi ve RNA standardı veya numune ekleyin (örneğin, her biri 100 μL). Oda sıcaklığında, ışıktan korunarak 2-5 dakika kuluçka yapın. Floresansı uygun ayarlarla ölçün (uyarılma ~500 nm, emisyon ~525 nm). Reaktif boş ölçümü ve çıkarma (1x TE + RiboGreen boyası).
    4. Analiz ve nicelik: Standartların floresans değerlerini konsantrasyonlarıyla karşılaştırarak standart bir eğri çizin. Bu eğri, örneklerdeki RNA konsantrasyonunu belirlemek için kullanın (Şekil 2).

4. cDNA sentezi

  1. Tüm bileşenleri buz üzerinde eritin. Her tüpü hafifçe karıştırarak hafifçe karıştırın ve kısa bir süre aşağı çevirin. Buz üzerindeki PCR tüpünde, her reaksiyon için aşağıdaki bileşenleri birleştirin:
    RT master mix (5x): 4 μL
    RNA Örneği: değişken (toplam RNA 1 μg'ye kadar)
    Nukleazsız Su: toplam hacmi 20 μL'ye kadar
    NOT: Şablonsuz kontrol (NTC) için, RNA örneğini nükleazsız su ile değiştirin.
  2. Tüpleri nazikçe karıştırıp döndürerek içeriği alt kısımdan toplayın ve termosiklör programını çalıştırın.
    Astar tavlama: 2 dakika boyunca 25 °C
    cDNA sentezi: 55 °C 10 dakika
    Isı inaktivasyonu: 95 °C 1 dakika

5. Primer tasarımı ve doğrulama

NOT: RTddPCR primer tasarımı genellikle nicel qPCR ile aynı prensipleri takip eder, ancak pozitif ve negatif damlacıkların net ayrılmasını sağlamak için ek özen gerektirir. Bu süreci kolaylaştırmak için NEB, IDT veya ThermoFisher'dan primer tasarım araçlarını kullanın. Başarılı bir RTddPCR testi, yüksek özbaşlılık ve sağlam amplifikasyon ile tanımlanır; bu da amplifikasyonlu (pozitif) ve amplifikasyonsuz (negatif) damlacıklar arasında belirgin bir ayrım oluşturur. PCR primerlerinin tasarımı için aşağıdaki NCBI RefSeq erişim kimlikleri kullanılmıştır:

Oyuncu: NM_001127449.1
Forvet 1: CAGTCTAACAGGGTGGGAAAG
Ters 1: CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC
Amplikon Süresi: 98
İlerici 2: GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT
Ters 2: GACTTTCCCACCCTGTTAGAC
Amplikon Süresi: 118

Gap43: NM_017195.3
İleriye 1: GGAAATTCTTGCACTGTACCC
Ters 1: GACTCCTCAGAACGGAACAT
Amplikon Uzunluğu: 122
İleri 2: CAGTCATCTTGGGAAATTCTTGC
Ters 2: CATTGCACACACACACACTTGG
Amplikon Süresi: 116

  1. Önerilen primer uzunluğu 18-30 baz çifti ve GC içeriği %40-60 olan bir primer tasarlayın. Erime sıcaklığının (Tm) 55-65 °C arasında olduğundan ve ön ile geri primerlerin birbirine 2-5 °C içinde olduğundan emin olun. Bağlama özgüllüğünü artırmak için 3′ ucunda son beş taban içinde bir veya iki G veya C tabanı içeren bir GC kelepçesi ekleyin, ancak uzun Gs veya C serilerinden kaçının.
  2. Primer özgüllüğünü, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) gibi hizalama araçları kullanarak doğrulamak, primerlerin yalnızca hedef dizisine bağlanmasını sağlamak için. Tasarım amplikonları 50-200 baz çifti boyutunda, ~100 baz çifti optimal olarak kullanılır; kısa ürünler daha verimli ve primer-dimerlerden ayırt edilir.
    NOT: Bu çalışmada, kısa PCR ürünleri genellikle RT-ddPCR'deki uzun PCR ürünlerine göre daha yüksek verimlilikle güçlendirilir.
  3. Astar dimerlerini %50-60 GC içeriğine sahip astarlar tasarlayarak, ikincil yapılardan kaçınarak ve 3' tamamlayıcılık olarak en aza indirin. Astar doğrulaması sırasında, agaroz jel elektroforezi kullanın ve primer dimerlerini değerlendirmek için her zaman şablonsuz bir kontrol kullanın.
  4. Şablonun ikincil yapı oluşturma olasılığı yüksek olan bölgelerde primer tasarlamaktan kaçının, çünkü bu amplifikasyon verimliliğini etkileyebilir.

6. RTddPCR

NOT: Üreticinin talimatlarına ve daha önce Das ve ark. (2022)43 tarafından tanımlandığı gibi, testin tekrarlanabilirliğini artırmak için birkaç küçük ayarlama yapılarak RTddPCR yapmak için QX200 ddPCR Sistemi (Bio-Rad) ile uygulanın.

  1. RTddPCR reaksiyonlarını, uygun cDNA kullanarak ddPCR kullanıma hazır evrensel karışım ve hedefe özgü primerlerle hazırlayın.
  2. Damlaları damla üreteci kullanarak üretin.
  3. Uç nokta floresansını damla okuyucu ile okuyun ve dahili yazılımla verileri analiz edin.
  4. Kesin nicelik ve tekrarlanabilir damla oluşumunu sağlamak için aşağıdaki kalite kontrol önlemlerini kullanın:
    1. Plaka etkilerini en aza indirmek için primer setlerini aynı satır veya sütunda tutarlı şekilde çalıştırın.
    2. Küçük hacimlerde pipetlemeleri azaltmak için master miksler hazırlayın.
    3. Kabarcıkları önlemek için düşük akış hızında pipet yapın ve numune dağıtımı için çok kanallı pipetler kullanın.
    4. Damla oluşumundan sonra plakaları nazikçe tutun ve buharlaşmayı önlemek için hemen kapatın.
    5. Tüm reaksiyonları buz üzerinde hazırlayın ve reaktifler için tekrar eden donma-erime döngülerinden kaçının.
    6. Her primer seti için kontaminasyonu izlemek için şablonsuz kontroller ekleyin.
    7. 10.000'den az kabul edilen damlacık içeren kuyular analizden hariç tutulur.
    8. Tüm örnekler için teknik kopyalar yaparak tekrarlanabilirliği sağlanır.
  5. Damlacık floresans genlik grafiklerini manuel olarak inceleyerek otomatik eşik belirlemenin doğruluğunu doğrulayın.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PLL kaplamalı 1 μm insertler üzerinde kaplamalı primer embriyonik kemirgen kortikal nöronları ve BFCN'ler sağlam yapışır ve nöriteleri in vitro (DIV) 5-7 gün boyunca membran boyunca uzatır. 11 DIV'de kültürler yoğun ağlar gösterir. Yetişkin sıçan DRG'leri için, PLL kaplamalı 3 μm eklere bir kat laminin eklemek, 5 DIV ile karşılaştırılabilir aksonal uzantıyı elde etmeye yardımcı olur. Bu gözlemler, insertlerin uzun vadeli nöronal büyümeyi destekleme ve aşağı akış RNA ekstraksiyonu için yeterli aksonal materyal sağlayabildiğini doğrulamaktadır. Ölçeklendirme ihtiyacı olduğunda, yeterli malzeme sağlamak için birden fazla inserti birleştiriyoruz.

Bireysel insertlerden TRIzol ekstraksiyonu, ters transkripsiyon ve ardından ddPCR için yeterli RNA sağlar. RiboGreen nicel gösterişi, tüm nöron fraksiyonlarından tutarlı RNA verimlerini (212,85 ng/insert) ve nörit fraksiyonlarından daha düşük verimleri (42,75 ng/insert) doğrular (Şekil 2). Genellikle tüm nöron fraksiyonundan ~5-7 kat RNA alırız, nörit zenginleştirilmiş fraksiyona karşılık.

Tüm primerler RTddPCR deneylerinden önce doğrulanır. Her hedef transkript için, aynı nöronal örneklerden üretilen cDNA üzerinde en az iki primer seti sipariş edilip geleneksel PCR kullanılarak test edilir. En güçlü ve en spesifik bandı üreten primer çifti RTddPCR için seçilir (Şekil 3A). Örneğin, Gap43 için primer set 1'i seçtik. Actγ için elde edilen belirsiz sonuçlarda, tavlama sıcaklıklarını optimize etmek için gradyan PCR uygularız (Şekil 3B). Bu, mutlak nicelik için yalnızca iyi doğrulanmış primerlerin kullanılmasını sağlar ve damla ayrımında artefakt olasılığını azaltır.

Kazıma ve sürünme işlemi, somatik ve nörik bölmeleri güvenilir şekilde ayırır. Tüm nöron fraksiyonlarından izole edilen RNA, Actγ46,47,48,49 gibi transkriptlerin zenginleşmesini gösterir (Şekil 4). Buna karşılık, akson/nörit fraksiyonları sınırlı hacimleriyle tutarlı olarak belirgin şekilde daha düşük toplam RNA verir, ancak Gap43 gibi distal süreçlere lokalize olduğu bilinen transkriptlerin zenginleşmesini gösterir (Şekil 4). Soma ile sınırlı transkriptlerin minimum çapraz algılanması, insertler dikkatlice ele alındığında ve optimal yoğunlukta kaplama yapıldığında yüksek bölme saflığını gösterir.

Olumlu sonuçlar şu şekilde karakterize edilir: (1) net aksonal uzantıya sahip sağlam nöron morfolojisi, (2) zar yırtılmadan temiz ayrılma bölümleri, (3) pozitif ve negatif damlacıklar arasında belirgin ayrım sağlayan doğrulanmış primerler ve (4) aksonal transkriptler için güçlü RTddPCR sinyalleri. Optimal olmayan deneyler, düşük RNA verimliliği, nörit fraksiyonlarındaki soma işaretleyicileriyle kanıtlanan çapraz kontaminasyon veya primer dimerizasyonu nedeniyle artan damla "yağmuru" gibi RTddPCR artefaktlarına yol açar. Bu sorunlar genellikle insert membran hasarı, aşırı kazıma basıncı veya yetersiz primer tavlama sıcaklığı optimizasyonu ile ilişkilidir.

Şekil 1
Şekil 1: Membran insertleri kullanılarak bölme-spesifik RNA izolasyonuna genel bakalım. Kemirgen nöronları 1-3 μm gözenek boyutuna sahip yarı geçirgen eklerde kültürlendi; bu da nörite uzanmasına izin verirken soma kısıtlamasını sağladı. Tüm nöron hazırlığı için, üst bölmedeki hücreler steril bir kazıyıcı kullanılarak kazılıp pellet edildi ve ardından RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve RTddPCR için TRIzol ile lizleştirildi. Insert membranından kalıntı hücresel kalıntılar steril pamuk çubukla çıkarıldı. Nörit hazırlığı için, artık sadece nöritleri içeren insert membranı ters çevrilip bir smalı bıçağı ile kesildi ve doğrudan TRIzol'a batırıldı, ardından RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve RTddPCR yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2
Şekil 2: RiboGreen testi kullanılarak standart RNA konsantrasyon eğrisi. (A) Floresans yoğunluğu, RiboGreen RNA nicelendirme testi kullanılarak bir sıra RNA standartları üzerinde ölçüldü. Doğrusal bir regresyon analizi, RNA konsantrasyonu ile floresan sinyali arasında güçlü bir korelasyon ortaya koydu (R² = 0.9956). Bire yakın R² değeri, doğru RNA nicelendirmesi için RiboGreen testinin mükemmel doğrusal ve güvenilirliğini gösterir. (B) A'da elde edilen eğim için (y=19.738x + 14.905) denklemi kullanılarak, her kesim için toplam RNA hesaplandı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3
Şekil 3: PCR ve agaroz jel elektroforezi ile primer doğrulaması. (A) Actγ ve Gap43 için cDNA kullanılarak PCR amplifikasyon ürünleri, primer özelliğini değerlendirmek için %2 agaroz jel üzerinde çözüldü. Her gen için iki bağımsız primer seti (set 1 ve set 2) test edildi. DNA boyut belirteçleri (merdivenler) bitişik şeritlerde moleküler ağırlıklar gösterilir (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Beklenen boyuttaki belirgin tek bantlar, seçilen primer setlerinin başarılı amplifikasyonunu ve özgüllüğünü doğrular. (B) PCR amplifikasyonu, Actγ primer seti 2 kullanılarak bir sıcaklık gradyanı (55-65 °C) boyunca yapılarak optimal tavlama sıcaklığı belirlendi. Amplifikasyon ürünleri, %2 agaroz jeliyle ve DNA merdiveni (şerit 2, boyutlar gösterilmiştir) çözdü. Test edilen aralıkta beklenen boyutta tutarlı tek bantlar gözlemlenmiş, en güçlü amplifikasyon 55 °C olarak tespit edilmiştir; bu da bu primer seti için optimal sıcaklık olduğunu göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4
Şekil 4: Seçilen transkriptlerin RTddPCR analizi ve mRNA kopyalarının nicelendirilmesi. (A,B) (A) Actγ ve (B) Gap43 için damla ayrımını gösteren temsil tek boyutlu genlik grafikleri. Her nokta tek bir damlayı temsil eder; mavi damlacıklar pozitif amplifikasyonu, gri damlacıklar ise negatif amplifikasyonu gösterir. Y ekseni genliği, X ekseni ise ddPCR plakasındaki kuyu konumunu gösterir. Pozitif (mavi) ve negatif (gri) damlacıklar arasındaki net ayrım, hedef transkriptlerin belirtilen primer setleriyle sağlam bir şekilde tespit edildiğini doğrular. (C) Tüm nöron ve nörit fraksiyonlarında Actγ ve Gap43 transkriptleri için toplam RNA transkriptlerinin μL/μL ve ng başına kopya sayısını özetleyen tablo. Kopya sayı tahminleri, ddPCR damlacık sayıları kullanılarak mutlak niceliklendirme yoluyla elde edildi (A,B panellerinde gösterilmiştir). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tekrarlanabilirlik için birkaç adım çok önemlidir. Insert kaplama, nöronal yapışmayı teşvik etmek için uniform olmalıdır; eksik kaplama kötü nörite/aksonal büyümeye yol açar. Hücre kaplama yoğunluğu da aynı derecede önemlidir; çünkü aşırı yoğunluk dendritik çaprazlığı artırırken, seyrek kaplama yetersiz aksonal RNA sağlar. Kazıma-tarama dizisi hassasiyetle yapılmalıdır: çok az basınçta somatik kontaminasyon oluşurken, çok fazla basınç inserte zarar verme riski taşır.

Primer doğrulaması başka bir kritik adımı temsil eder. Her transkript için iki bağımsız primer seti çalıştırmak en güvenilir çiftin seçilmesini sağlarken, gradyan PCR tavlama sıcaklıklarını daha da iyileştirebilir. Bu uygulama, primer-dimer oluşumunu azaltır, damlacık berraklığını artırır ve biyolojik kopyalar arasında tekrarlanabilir nicelik sağlar. Bu yaklaşım yüksek bölümsel saflık sağlasa da, somatik malzemeden kaynaklanan iz kontaminasyonu tamamen dışlanamaz. Aksonal RNA verimleri doğası gereği düşüktür, bu da yüksek girdi gerektiren tam transkriptom dizileme gibi analizlerin kapsamını sınırlar. Bu yöntemin kritik sınırlamalarından biri, distal ve proksimal aksonlar arasında transkript lokalizasyonunu ele alamamasıdır. Membran gözenekleri üzerinden glial veya endotel uzantıları belirli koşullarda bildirilmiş olsa da, kültür sistemimiz bu olasılığı en aza indirmektedir. Yetişkin DRG kültürlerinde, sitozin β-D-arabinofuranosid (Ara-C)5,7 eklenmesi ve diğer nöronal kültürler (kortikal, hipokampal ve BFCN)5,45 için serumsuz ortamların kullanılması, glial ve endotel hücre çoğalmasını etkili bir şekilde kısıtlar. Ayrıca, burada kullanılan sert polikarbonat veya polietilen tereftalat (PC/PET) zarları elastik değildir ve aktif hücre göçüne izin vermezdir. Ayrıca, DRG kültürleri için büyük çaplı aksonların geçişini sağlamak için 3 μm gözenek boyutunda insertler kullanıyoruz. Buna karşılık, kortikal veya BFCN kültürleri için 1 μm gözenek boyutunda insertler kullanılır, bu da glia göçünü daha da kısıtlar. Bu özellikler, kurulumumuzu, esnek gözeneklerden endotel göçünü destekleyen PDMS tabanlı mikro cihazlardan ayırır. Öncekiraporlar 34,35,36,40 ile tutarlı olarak, bu çalışmadaki moleküler doğrulama, aksonal transkriptlerin (örneğin Gap43) güçlü zenginleşmesini ve somatik belirteçlerin (örneğin Actγ) önemsiz tespit edilmesini doğrularak, zardan geçen malzemenin nöronal özgüllüğünü desteklemektedir. Fiziksel kısıtlama glia göçünü tamamen ortadan kaldırmadığından, araştırmacılar ayrıca Gfap'ı negatif bir belirteç olarak kullanmalıdır.

Mikrofluidik cihazlara kıyasla, insert sistemi daha basit, daha ölçeklenebilir ve rutin kültür iş akışlarıyla uyumludur. Özel ekipmanlardan kaçınır ve tekrarlanabilir akson-soma ayrımı mümkün kılar. Insertleri RTddPCR ile birleştirerek, bu yöntem hem erişilebilirlik hem de yüksek hassasiyet sağlar ve genellikle qPCR tespit eşiklerinin altında olan transkriptlerin mutlak nicelendirilmesini sağlar. Bu protokol, aksonal transkript lokalizasyonundaki değişiklikleri incelemek, gelişimsel, nörotoksik veya yaralanma uyaranlarına yanıt olarak lokal çeviriyi değerlendirmek ve ayrıca nörodejeneratif hastalıklar veya nörogelişimsel bozukluklarda rol oynayan RNA taşıma kusurlarını incelemek için oldukça uygundur. Gelecekteki iyileştirmeler, birden fazla mRNA'nın eşzamanlı nicelendirilmesi için çoklu RTddPCR veya transkriptom kapsamını genişletmek için düşük girdili RNA dizileme yaklaşımlarıyla entegrasyonu içerebilir. Ayrıca, bu sistemi insan iPSC'den türetilen nöronlara uyarlamak, hastalık modellemesi ve rejeneratif çalışmalara da uygulanabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PKS, akson yenilenmesi ve nörodejenerasyon için G3BP1 hücre geçirgen peptidinin kullanımıyla ilgili ABD patentlerine sahiptir. Diğer yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtiyor.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Merkin Çevresel Nöropati ve Sinir Yenileme Merkezi'nden (P.K.S.'ye) alınan hibelerle desteklendi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6-kuyu plaka için hücre kültürü insertleri, 1.0  μ m Gözenek Boyutu, SterilCorning353102Tüketim Malzemeleri
6-kuyu plaka için hücre kültürü insertleri, 3.0  μ m Gözenek Boyutu, SterilCELLTREAT230603Tüketim Malzemeleri
Dar Bıçaklı Hücre KaldırıcıVWR76036-006Tüketim Malzemeleri
CELLSTAR 6-kuyu doku kültür plakalarıVWR82050-842Tüketim Malzemeleri
ddPCR 96-Well Plakaları Bio-rad12001925Tüketim Malzemeleri
ddPCR Damla Okuyucu Yağı Bio-rad1863004Reaktifler
QX200/QX100 Damla Jeneratörü için DG8 KartuşlarıBio-rad1864008Tüketim Malzemeleri
LamininGibco/Fisher Scientific23017-015Reaktifler
LunaScript RT SuperMix KitiNEBE3010LReaktifler
Floresans bazlı, 96 kuyruklu, siyah mikroplakalarThermo FisherM33089Tüketim Malzemeleri
PCR Plaka Isı Sızdırmazlığı, folyo, delinebilirBio-rad1814040Tüketim Malzemeleri
Poli-LisinSigmaP1274Reaktifler
PTC Tempo 96 Termal DöngücüBio-rad12015382Ekipman
QuantaSoft yazılımıBio-RadPCR veri analiz yazılımı
Quant-it RiboGreen Reaktif ve RNA Analiz KitiThermo FisherR11490Reaktifler
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-rad1864034Reaktifler
EvaGreen için QX200 Damla Üretim YağıBio-rad1864005Reaktifler
QX200 Damla JeneratörüBio-rad17005227Ekipman
QX200 Damla OkuyucuBio-rad17005228Ekipman
TRIzol ReaktifiInvitrogen15-596-026Reaktifler

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agrawal, M., Welshhans, K. Local translation across neural development: A focus on radial glial cells, axons, and synaptogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 717170(2021).
  2. Dalla Costa, I., et al. The functional organization of axonal mRNA transport and translation. Nat. Rev. Neurosci. 22 (2), 77-91 (2021).
  3. Sahoo, P. K., Smith, D. S., Perrone-Bizzozero, N., Twiss, J. L. Axonal mRNA transport and translation at a glance. J. Cell Sci. 131 (8), (2018).
  4. Alber, S., et al. PTBP1 regulates injury responses and sensory pathways in adult peripheral neurons. Sci Adv. 9 (30), eadi0286(2023).
  5. Sahoo, P. K., et al. Disruption of G3BP1 granules promotes mammalian CNS and PNS axon regeneration. Proc Natl Acad Sci. 122 (9), e2411811122(2025).
  6. Sahoo, P. K., et al. A Ca2+-dependent switch activates axonal casein kinase 2α; translation and drives G3BP1 granule disassembly for axon regeneration. Curr Biol. 30 (24), 4882-4895.e6 (2020).
  7. Sahoo, P. K., et al. Axonal G3BP1 stress granule protein limits axonal mRNA translation and nerve regeneration. Nat Commun. 9 (1), 3358(2018).
  8. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359 (6382), 1416-1421 (2018).
  9. Van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).
  10. Zahavi, E. E., et al. Repeat-element RNAs integrate a neuronal growth circuit. Cell. 188 (16), 4350-4365.e22 (2025).
  11. Rajgor, D., Welle, T. M., Smith, K. R. The coordination of local translation, membranous organelle trafficking, and synaptic plasticity in neurons. Front Cell Dev Biol. 9, 711446(2021).
  12. Oliveira, M. M., Klann, E. A deep dive into local mRNA translation in neurons. Proc Natl Acad Sci. 118 (45), e2117116118(2021).
  13. Sun, C., et al. The prevalence and specificity of local protein synthesis during neuronal synaptic plasticity. Sci Adv. 7 (38), eabj0790(2021).
  14. Castillo, P. E., Jung, H., Klann, E., Riccio, A. Presynaptic protein synthesis in brain function and disease. J Neurosci. 43 (45), 7483-7488 (2023).
  15. Younts, T. J., et al. Presynaptic protein synthesis is required for long-term plasticity of GABA release. Neuron. 92 (2), 479-492 (2016).
  16. Nagano, S., Araki, T. Axonal transport and local translation of mRNA in neurodegenerative diseases. Front Mol Neurosci. 14, 697973(2021).
  17. Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nat Commun. 12 (1), 6914(2021).
  18. Bar Avi, O., Perlson, E. Navigating the pathways: Tar-DNA-binding-protein-43 aggregation, axonal transport, and local synthesis in amyotrophic lateral sclerosis pathology. Neural Regen. Res. 20 (10), 2921-2922 (2025).
  19. Ionescu, A., Altman, T., Perlson, E. Looking for answers far away from the soma-the (un)known axonal functions of TDP-43, and their contribution to early NMJ disruption in ALS. Mol. Neurodegener. 18 (1), 35(2023).
  20. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: The role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  21. Rehorst, W. A., et al. Muscle regulates mTOR dependent axonal local translation in motor neurons via CTRP3 secretion: Implications for a neuromuscular disorder, spinal muscular atrophy. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 154(2019).
  22. Twiss, J. L., Buchanan, C. N. Regulation of subcellular protein synthesis for restoring neural connectivity. Int J Mol Sci. 26 (15), 7283(2025).
  23. Gomes, C., et al. Axonal localization of neuritin/cpg15 mRNA is limited by competition for HuD binding. J Cell Sci. 130 (21), 3650-3662 (2017).
  24. Lee, S. J., et al. hnRNPs interacting with mRNA localization motifs define axonal RNA regulons. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2091-2106 (2018).
  25. Lee, S. J., et al. Selective axonal translation of the mRNA isoform encoding prenylated cdc42 supports axon growth. J Cell Sci. 134 (7), jcs251967(2021).
  26. Merianda, T. T., et al. Axonal amphoterin mRNA is regulated by translational control and enhances axon outgrowth. J Neurosci. 35 (14), 5693-5706 (2015).
  27. Patel, P., et al. Intra-axonal translation of Khsrp mRNA slows axon regeneration by destabilizing localized mRNAs. Nucleic Acids Res. 50 (10), 5772-5792 (2022).
  28. Smith, T. P., Sahoo, P. K., Kar, A. N., Twiss, J. L. Intra-axonal mechanisms driving axon regeneration. Brain Res. 1740, 146864(2020).
  29. Huang, N., Sheng, Z. H. Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism. Cell Regen. 11 (1), 33(2022).
  30. Ionescu, A., Perlson, E. Microfluidic neuromuscular co-culture system for tracking cell-to-cell transfer and axonal transport of labeled proteins. Methods Mol Biol. 2431, 145-161 (2022).
  31. Dasgupta, S., et al. Cortical brain injury causes retrograde degeneration of afferent basal forebrain cholinergic neurons via the p75NTR. eNeuro. 10 (8), (2023).
  32. Dasgupta, S., Pandya, M. A., Friedman, W. J. Microfluidic cultures of basal forebrain cholinergic neurons for assessing retrograde cell death by live imaging. Bio-protoc. 15 (1), e5149(2025).
  33. Bi, J., Tsai, N. -P., Lin, Y. -P., Loh, H. H., Wei, L. -N. Axonal mRNA transport and localized translational regulation of κ-opioid receptor in primary neurons of dorsal root ganglia. Proc Natl Acad Sci. 103 (52), 19919-19924 (2006).
  34. Hirai, T., et al. Aberrant plasticity of peripheral sensory axons in a painful neuropathy. Sci Rep. 7 (1), 3407(2017).
  35. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
  36. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat Cell Biol. 10 (2), 149-159 (2008).
  37. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  38. Brown, K. C., et al. An experimental protocol for the Boyden chamber invasion assay with absorbance readout. Bio Protoc. 14 (15), e5040(2024).
  39. Willis, D. E., Twiss, J. L. Profiling axonal mRNA transport. Methods Mol Biol. 714, 335-352 (2011).
  40. Zheng, J. -Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21 (23), 9291-9303 (2001).
  41. Shigeoka, T., et al. On-site ribosome remodeling by locally synthesized ribosomal proteins in axons. Cell Rep. 29 (11), 3605-3619.e10 (2019).
  42. Sun, Y., Joyce, P. A. Application of droplet digital PCR to determine copy number of endogenous genes and transgenes in sugarcane. Plant Cell Rep. 36 (11), 1775-1783 (2017).
  43. Das, A., Das, D., Panda, A. C. Quantification of circular RNAs using digital droplet PCR. J Vis Exp. (187), e64464(2022).
  44. Desai, M., Gulati, K., Agrawal, M., Ghumra, S., Sahoo, P. K. Stress granules: Guardians of cellular health and triggers of disease. Neural Regener Res. 21 (2), 588-597 (2026).
  45. Agrawal, M., et al. Restoring DSCAM expression rescues neuronal morphology and axon guidance deficits in Down syndrome. bioRxiv. , (2025).
  46. Bassell, G. J., et al. Sorting of β-actin mRNA and protein to neurites and growth cones in culture. J Neurosci. 18 (1), 251-265 (1998).
  47. Moradi, M., et al. Differential roles of α-, β-, and γ-actin in axon growth and collateral branch formation in motoneurons. J Cell Biol. 216 (3), 793-814 (2017).
  48. Willis, D. E., et al. Extracellular stimuli specifically regulate localized levels of individual neuronal mRNAs. J Cell Biol. 178 (6), 965-980 (2007).
  49. Zhang, H. L., et al. Neurotrophin-induced transport of a β-actin mRNP complex increases β-actin levels and stimulates growth cone motility. Neuron. 31 (2), 261-275 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Axonal mRNA IsolationPorous Membrane InsertsDroplet Digital PCRNeuronal CompartmentalizationRNA QuantificationLocal Protein SynthesisNeurite FractionGrowth Cone AnalysisRNA LocalizationSynaptic Plasticity

Related Articles