Yöntem makalesi

Ixodid kene araştırmalarında 3D baskılı bir odada yapay bir zardan beslenen kene kanı

796 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69606

⸱

20 Mart 2026

 , 
1Department of Entomology, University of Arizona, 2Department of Entomology, Kansas State University

Bu makalede

Özet

Bu yöntem, 3D baskılı bir oda ve laboratuvarda üretilmiş silikon membranı içeren in vitro kene kan besleme sisteminin geliştirilmesini öngörür. Sistem, kenelerin yapay beslenmesini sağlar, çeşitli beslenme evrelerinde kolayca örnekleme alınır ve düşük miktarda kan kullanılır; bu da ixodid kenelerini incelemek için paha biçilmez bir araç sağlar.

Özet

Bu çalışma, yüksek çözünürlüklü fotopolimer reçineden oluşturulmuş 3D baskılı bir oda kullanılarak yapay silikon bir zar üzerinden kene besleme sistemi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Yöntem, besleme odasının tasarımını, silikon zarın hazırlanmasını, sistemin montajını ve kene beslemesi için optimize edilmiş koşulları içerir. Keneler, Amerika Birleşik Devletleri'nde ve dünya çapında hastalıkların önde gelen vektörlerinden biridir. Kene araştırmaları, kene kaynaklı hastalıkların önlenmesi ve sıklığını azaltmak için etkili stratejiler geliştirmek için gereklidir. Zorunlu hematofagot ektoparazitler olarak, keneler hayatta kalmak ve hastalık bulaştırmak için kanla beslenmek zorundadır; bu da vektör-konak etkileşimlerini, patojen iletimi ve kenelerin biyolojisi, fizyolojisi ve anatomik morfolojisini araştırırken kan beslenmesini temel bir süreç haline getirir. Silikon membranlı kene besleme sistemleri son birkaç on yılda yaygın olarak kullanılmakta ve geliştirilmiştir. Ancak, mevcut birçok sistem tek bir kene türüne, yaşam evresine veya belirli koşullara göre uyarlanmıştır. Bu protokolde tanımlanan kene besleme sistemi, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki en önemli kene vektör türlerinden Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis ve Rhipicephalus sanguineus yetişkinlerinden hem kısmen beslenmiş hem de tam şişmiş örneklerin elde edilmesinde başarıyla kullanılmıştır. Sistem, Dermacentor variabilis yetişkinleri ve nymphal A. americanum'un beslenmesini başlatmada başarılı olmuştur; en yüksek beslenme oranları (%>85) yetişkin A. americanum'da gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada geliştirilen besleme odası, patojen iletimi ve toksikolojik çalışmalarda kritik olan 100 μL'ye kadar düşük miktarda farklı kanla kullanılmak için uyarlanabilir. Kamdanın minimum yüksekliğine sahip şeffaf kapak, kenelerin kene beslenme süresi boyunca gözlemlenmesini kolaylaştırıyordu.

Giriş

Keneler, kanla beslenen zorunlu ektoparazitlerdir ve bakteriler, virüsler ve hayvanlara hastalık veren parazitler dahil olmak üzere çok çeşitli patojenleri taşıyıp iletebiliyorve bulaştırabilirler 1,2,3,4. Amerika Birleşik Devletleri'nde bir numaralı hastalık vektörü olarak, dünyanın geri kalanındaki sivrisineklerden sonra ikinci sırada yer alan 2,3,5, birkaç kene türü patojenle ilişkili hastalıkları bulaştırabilirken, diğer türlerin de bulaşıcı olmayan hastalıklara neden olduğu bilinmektedir; örneğin alfa-gal sendromu (AGS, kırmızı et alerjisi olarak da bilinir), bu hastalık son yıllarda dünya çapında giderek daha fazlabildirilmektedir 6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Kene biyolojisi, fizyolojisi, genetiği ve vektör yetkinliğini anlamaya yönelik araştırmalar, hem bulaşıcı hem de bulaşıcı olmayan kene kaynaklı hastalıkların ekonomik ve halk sağlığı yükünü azaltmaya yönelik stratejiler geliştirmek için gereklidir. Kene-konak etkileşimlerini incelemek, belirli araştırma sorularını ele almak için kısmen beslenen veya tamamen şişmiş keneleri gerektirir. Bu, canlı hayvan beslemesiyle sağlanabilir ve kenelerin tam yaşam döngülerinitamamlamasını sağlar 17. Kene beslenmesinde canlı hayvanların kullanımı, kene kolonilerinin geliştirilmesi ve sürdürülmesinde son derece etkiliolsa da uygulanması zor olabilir ve konak bulunabilirliği kısıtlamaları ile tesis düzenlemeleri nedeniyle her araştırma hipotezine uygulanmayabilir. En önemlisi, in vitro kene besleme sistemlerinin başarılı uygulanması, canlı hayvanların kullanımını azaltmaya yardımcı olur ve bu, "Hayvan Kullanımı Alternatifi (3R)" çerçevesi kapsamında (değiştirme, azaltma, iyileştirme)20 kapsamında araştırmalarda önemli bir hedeftir.

Yapay zar kene besleme sistemlerinin araştırmalarda kullanılmasının birçok avantajı vardır ve bu da çok çeşitli bilimsel soruları ele almak için geniş fırsatlar sunar. Bunlar genel olarak üç grupta özetlenebilir; (1) Beslenme sırasında kene alfa-gal üretimi gibi farklı kan kaynakları kullanılarak konak kanı varyasyonu ve vektör-konak etkileşimleri üzerindeki etkisinindeğerlendirilmesi 21, (2) kan ile bileşiklerin verilmesiyle akarisittoksisitesinin değerlendirilmesi 22 ve kan beslemesi sırasında kene salgılanan bileşiklerin geri kazanılması23, (3) kan beslemesi sırasında doğal edinimle patojenlerin taşınması yoluyla vektör yetkinliğinindeğerlendirilmesi 24, 25,26,27 ve diğerleri. Ayrıca, yapay zar besleme sisteminin doğası, konakçı ile ilgili varyasyonlar getirmeden çeşitli tedaviler ve konsantrasyonların büyük ölçekli test edilmesine olanak tanır; küçük ölçek ve hacimde, canlı hayvanlara olan ihtiyacı azaltır.

Yapay zarlar aracılığıyla kene besleme sistemleri, araştırmalarda ve kene kolonisi yetiştirilmesini desteklemek içinyaygın olarak kullanılmıştır 19,28,29, bazı durumlarda kenenin uzun yaşam döngüsünün tamamlanmasınımümkün kılar 30,31. Kene besleme sistemlerinin ve materyallerinin optimize edilmesine dair birçok protokol farklı kene türleriiçin rapor edilmiştir 32,33,34. Buna rağmen, in vitro kene beslenmesinin sistem koşullarına, kullanılan malzemelere ve en önemlisi kene türlerine veevrelerine bağlı olarak oldukça değişken olabileceği iyi bilinmektedir. Ayrıca, birçok sistem, yüksek etkili olan ancak önemli kan hacimleri nedeniyle maliyetli olabilen sürekli akış sistemleri gibi büyük miktarda kanhacmine dayanır. Bu protokol, Amerika Birleşik Devletleri'nde beş farklı kene hastalığı vektör türünün yetişkin evrelerinde başarılı olduğu kanıtlanmış yapay bir kene besleme sistemini detaylandırmaktadır. Bunlar arasında Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis, Rhipicephalus sanguineus ve Dermacentor variabilis bulunur.

Protokol

Kene besleme deneyleri, ticari olarak mevcut defibrinli sığır kanı (Hemostat Laboratuvarları, CA, ABD) ve defibrinli insan kanı (Bioivt, CA, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi; bu kan, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokol ve yönergelere uygun olarak kan toplayan ve işliyor. Bu çalışmada kene beslemesi için canlı omurgalı hayvan kullanılmamıştır. Bu protokolde kullanılan tüm keneler, Oklahoma State Üniversitesi kene yetiştirme tesisinden satın alınmıştır. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Kene besleme odaları

  1. Odaları, 35 mm x 10 mm boyutlarında bir Petri kabına sığacak şekilde ücretsiz bir 3D tasarım yazılımı kullanarak tasarlayın. Basılı parça boyutları (Şekil 1A) şu şekildedir: odacık gövdesi ( bölüm i) 25 mm (iç çap) x 20 mm (yüksek), tabanda 3 mm duvar kalınlığı, üst kapak halkası 6 mm duvar kalınlığı ( bölüm ii), 30 mm (iç çap) x 5 mm (yüksek) ve 3,5 mm duvar kalınlığı ve dış halka (iii. bölüm) 31 mm (iç çap) x 5 mm (yüksek) ve 3 mm duvar kalınlığı.
    NOT: Kapak halkası mıknatısları yerleştirmek için dört adet dairesel 3 mm (çap) x 2 mm (yükseklik) açıklıktan oluşur. Odanın üst kısmında mıknatısları bağlamak için aynı boyutta açıklıklar da vardır (Şekil 1B). 3-B model tasarımı, en yaygın 3B yazıcı dosya formatı olan .stl dosyası olarak kaydedilmelidir. Bu protokolde kullanılan 3D tasarımı içeren dosyalar talep üzerine sağlanacaktır.
  2. Gri veya beyaz fotopolimer reçinelerle (Şekil 1A) veya .stl dosyasından 3D modelleri yazdıran başka bir yüksek çözünürlüklü 3D yazıcı/servis kullanarak yazıcı odaları.
    NOT: Bu protokol, Arizona Üniversitesi'nin baskı hizmetlerini ve reçinelerini kullandı. Yüksek çözünürlüklü reçinelerin kullanılması, detaylı ve dayanıklı odaların oluşturulmasını sağlar.
  3. Eldiven kullanarak, montajdan önce parçalarda reçine kalıntısı olmadığından emin olun; yıkayarak ve gerekirse ince zımpara kağıdıyla (180 ila 200 çukur) nazikçe zımparalayın. Parça i'nin düz tabanının (Şekil 1A) düzgün olduğundan emin olun. Bu, silikon zarın doğru yapışmasını sağlar ve sızıntı riskini azaltır.
  4. Tüm kuru parçaları 10 dakika UV ışığına maruz bırakarak tam reçine polimerizasyonu elde edin.
    NOT: Baskı için toksik reçineler kullanan çoğu 3D baskı servisi, reçineni kürlemek için UV ışığı kullanır (modelleri sertleştirir ve reçine toksisitesini giderir); ancak bazen "tam olarak iyileşmemiş" olarak kalır. Tamamen kürlenmemiş bir model dokunulduğunda hafifçe yapışkan kalır ve polarize olmayan reçine taşıyabilir; bu da toksik olabilir veya kullanım sırasında tahrişe yol açabilir. Ekstra UV ışığı maruziyeti, reçine tamamen sertleşmeyi sağlar.
  5. 3 mm x 2 mm yuvarlak mıknatısları, odaların ve kapak halkalarının üstündeki yarıklara şeffaf epoksi yapıştırıcı ile yapıştırın. Oda sıcaklığında (20–25 °C/minimum 16 saat) gece boyunca kurumasına izin verin. Mıknatısların kutuplarının, kapak halkasının üst kısmındaki mıknatısların çekim gücüne uyacak şekilde tek bir yönde olduğundan emin olun (Şekil 1A, bölüm ii).
  6. Model için tüm parçaları birleştirerek tüm bileşenlerin doğru uyumunu sağlamak için, Şekil 1A–C'de gösterildiği gibi.

2. Zar hazırlığı

  1. 30 cm x 30 cm boyutlarında bir plastik sargıyı temiz bir yüzeye yerleştirin ve düz bir yüzeye gererek kenarlarını bantla sabitleyerek kırışık olmadığından emin olun (Şekil 2Ai).
  2. 4–5 tek tek lens temizleme kağıdını 5 cm aralıklı uzun bir plastik/streç sarğı parçasının üzerine yerleştirin (Şekil 2Aii).
  3. Aşağıda verilen bileşenler ve miktarlar kullanılarak silikon zarı hazırlayın.
    NOT: Bu miktarlar, her biri 5–6 besleme odası kapasiteli 4–5 (7 cm × 12 cm) zar için yeterlidir ve toplamda 20–30 odaya ulaşabilir.
  4. Silikon karışımı, 15 g silikon şeffaf silikon (20–25 Shore A sertliği) birleştirerek ve 4,5 g silikon yağı (toplam silikonun %30'u) ve 2,9 g heksan (toplam silikonun %19,3) eklenerek hazırlanır. Malzemeleri plastik bir tartı botuna yerleştirin ve spatula ile nazikçe karıştırın (Şekil 2Aiii).
    NOT: Malzemeleri nazikçe karıştırarak minimum kabarcık oluşumunu sağlayın.
  5. Lens kağıdının küçük kenarına 2–3 g silikon karışımı yerleştirerek plastik sargıya sabitleyin. Silikonun lens kağıdından sızması için 5–10 saniye bırakın (Şekil 2Aiv).
  6. Silikon karışımını, kapağ, cetvel veya spatula gibi düz kenarlı bir aletle lens kağıdı sayfası boyunca eşit şekilde yayın. Kullanılan nesnenin lens kağıdının tamamını kapladığından emin olun (Şekil 2Av). Bu, tek bir darbede silikon örtüsünü sağlar ve membran kenarındaki dalgalanmaları önler.
  7. Tüm silikon karışımının membranda kullanıldığından emin olun, yayma aracını yayma için başlangıç pozisyonuna geri getirin. Yayma aracında bazı silikon karışımları tutulduğundan, aletin tekrar toplanması tüm silisonun boşlukları önlemek için kullanılmasını sağlar (Şekil 2Avi).
    NOT: Zar, dalgalanma olmadan eşit şekilde saydam görünmelidir (Şekil 2B).
  8. Farklı kalınlıklardaki membranları başlangıçta daha fazla veya daha az silikon karışımı ekleyerek hazırlayın; çünkü kalınlık ancak zarlar kuruyana kadar ölçülemez.
  9. Zarlar oda sıcaklığında (20–25 °C/minimum 16 saat) gece boyunca hava kurumasına izin verin.
  10. Dijital dış mikrometre ölçüm aracı kullanarak membran kalınlığını ölçin. Farklı yetişkin kene türleri için farklı membran kalınlıkları kullanılır; kısa ağız parçalarından (70 μm membran kalınlığı) uzun ağız parçalarına (200 μm membran kalınlığı) kadar değişir.
  11. Daha önce monte edilmiş tüm parçaları çıkarın ve alt kenara silikon yapıştırıcı uygulayın. Yapıştırıcının hassas yerleştirilmesi için 1 ml'lik bir şırınga kullanın ve silikon yapıştırıcı ile doldurun (Şekil 2Ci).
  12. Yapıştırıcı uygulamak için şırınganın ucuna (iğne yerine 200 μL pipet ucu) yerleştirin (Şekil 2Cii) ve şırınganın ucuna vidalasın, iğne ucu gibi (Şekil 2Ciii). Bu, her odanın alt kenarına ince yapıştırıcı uygulanmasını sağlar (Şekil 2Civ).
  13. Odayı membranın üzerine (Şekil 1, bölüm i) ağırlıklı bir nesne ile yerleştirerek yerleşmesini sağlar. Oda sıcaklığında (20–25 °C/minimum 16 saat) gece boyunca bekletilmesine izin alın (Şekil 2D,E).
    NOT: Herhangi bir düz ağırlıklı nesne kullanın. Bu protokol 2,5 kg ağırlığında bir akrilik parçası kullandı (Şekil 2E).
  14. Membran fazlasını kavisli makasla bölerek kesin (Şekil 3A).
  15. Kene beslemesi için odayı kullanmadan önce, zarın hazırlandığı (adım 2.1) kalan plastik sargıyı çıkarın (Şekil 3B).
  16. Odanın parçalarını tekrar birleştirin, altına 35 mm x 10 mm boyutlarında bir Petri kabı ekleyin ve kapların kapaklarını odaların kapakları olarak ters çevirip mıknatısların arasına yerleştirerek kullanın (Şekil 3C,D).
    NOT: Kapakları ters çevirilmiş kullanın, çünkü kapak tutucu halkası ters olduğunda kapağa tam olarak uyum sağlar (bkz. Şekil 3C,D'deki parça açıklamaları).
  17. Odanın membranını, 35 mm x 10 mm Petri kaplarının alt kısmıyla damıtılmış suda bekletin. Zarı oda sıcaklığında (20–25 °C/minimum 16 saat) gece boyunca suda bekletin. Zar başlangıçta hidrofobik olduğundan, kan eklemeden önce suya battırmak hapsolmuş kabarcıkların oluşumunu azaltmaya yardımcı olur.
    NOT: Baloncukların olmaması, hidrofobisiyetin kaldırıldığını doğrular.

3. Kene besleme ve kan hazırlığı

  1. Her odanın kapaklarında (35 mm x 10 mm Petri kaplarından) (Şekil 1A'da IV. bölüm) 2–3 küçük nefes deliği açın (Şekil 3E) adım 2.16'da belirtilmiştir. Isıtılmış metal bir skalpel veya ince metal bir spatula kullanarak kapaktaki solunum deliklerini delin.
    NOT: Solunum delikleri, nem yuvasının içine girmesini sağlar.
  2. Kanı gentamisin sülfat ile takviye ederek son konsantrasyon 50 μg/mL olarak alın. Antibiyotikleri sadece 1 hafta içinde kullanılacak kana ekleyin ve 4 °C'de saklayın. Antibiyotik uygulamadan önce ve sonra sığır kanını (veya başka hayvan kanını) 4 °C'de tutun.
  3. 2–3 ml kan temiz 35 mm x 10 mm Petri kabına yerleştirilin, ardından odayı üzerine yerleştirin. Bir odada kullanılan kan miktarını artırmak veya azaltmak için ayar halkasını döndürerek oda yüksekliğini ayarlayın (Şekil 1A'dan bölüm iii). Odanın yüksekliğini ayarlayın, Petri kabının altından membrana kadar 1–2 mm boşluk bırakın. Referans için Şekil 4A'daki magenta oklara bakınız.
    NOT: Odaların ayar halkası tasarımı, kullanılan kan hacminin kontrol edilmesini sağlar. yani, Petri kabının alt kısmı ile membran arasında daha büyük bir boşluk olması için boşluğu doldurmak için daha büyük bir hacim gerekir.
  4. Beslenmemiş keneleri eşit sayıda erkek ve dişi halinde odaların içine yerleştirin. Her iki cinsiyetin de her zaman odada yer aldığından emin olun, çünkü bu beslenme oranlarını etkileyebilir (Şekil 4B , odada yetişkin A. americanum'dan 4 erkek ve 4 dişi gösterilmiştir). Kullanım kolaylığı için her odada en fazla 10–15 kene kullanılır (yetişkin evresi için).
    NOT: Olgunlaşmamış evrelerle çalışırken, kene sayısı daha fazladır (bu protokolde sunulmayan bir oda başına 20–50 nimf).
  5. Odaları, 37 °C ± 1 °C sıcaklıklarda, nem kaynağı (yani su bardakları) ile 12:12 saat açık-karanlık bir fotoperiyot altında %63 ± %2 (Şekil 4C) bilgili nem sağlayan bir kaynak ile örtülü kuru banyolara yerleştirin.
    NOT: Bu gereksinimler kene türüne ve laboratuvar koşullarına bağlı olarak değişebilir; Gerekirse başka nem ayarlarını deneyin ve laboratuvar için en iyi kurulumu değerlendirin.

4. Kan ve odaların yerine koymak

  1. Kan değişimleri arasında zarı durulamak için kullanılacak çözeltilerle iki su sepme şişesi hazırlayın. Bir şişeye, damıtılmış suya %0,005 nistatin çözeltisi ekleyin; İkinci şişeye damıtılmış su ekleyin.
  2. 12–16 saat sonra, taze kanla yeni Petri kasalarını hazırlayın ve 37 °C sıcaklıkta kuru banyoya koyun, ardından odayı yerleştirin.
  3. Taze kan ısınırken, kullanılan kandan kamı çıkarın ve zarın alt kısmını 3–5 saniye boyunca damıtılmış suyla durulayın, ardından mantar kontaminasyonunu önlemek için %0,005 nistatin çözeltisiyle 3–5 saniye boyunca durulayın. Membranı tekrar damıtılmış suyla durulayın, kalan nistatin kalıntısını giderin.
    NOT: Bu süreç 5 dakikadan kısa sürer ve üst yüzeydeki membrana bağlı kenelerin beslenmesini etkilemez.
  4. Kullanılan tüm kan ve durulama suyunu %0,5 Sodyum hipoklorit çözeltisi (%10 çamaşır suyu açıcı) içeren bir kaba atın. Kan atığı, kurumsal güvenlik protokolüne uygun olarak atılır.
  5. Durulamadan sonra, kanlı yeni Petri kabına odayı yerleştirin.
    NOT: Yıkamadan önce 2–3 ay boyunca bölmeleri kullanın, ancak kirlenme ve sızıntı yoksa. Odalar ve zarlar kirlenir ve yıkamadan 3 ay sonra kullanımdan sonra kontaminasyon riski altındadır. Bu da kene beslenme oranlarının azalmasına yol açar. Hazneleri 1,5 yıla kadar tekrar kullanın (~10 yıkama döngüsü).
  6. Hazneleri %0,5 sodyum hipoklorit çözeltisine (%10 çamaşır seriştesi) 30 dakikaya kadar koyarak tekrar kullanın, ardından bulaşık sabunu ile yıkayın. Odaları uzun süre (>30 dakika) ağartıcıya maruz bırakmayın, çünkü koku yapışma oranını azaltır ve zamanla reçine bütünlüğünü zayıflatabilir.
    NOT: Uzun süreli çamaşır suyu maruz kalmak, odayı ıslak olduğunda esnek ve kuruduğunda kırılgan hale getirir, bu da kırılmaya yol açar. Bu durum, tekrar edilen gözlemlere göre odanın 4–5 yıkama döngüsünden daha uzun dayanmamasını sağlar. Aynı haznenin yıkamadan sürekli kullanılması (3 aya kadar), kene tutumunun daha hızlı oluşmasına yol açar (hazneye yerleştirildikten sonra 1–3 gün içinde), yeni yıkanmış bir odaya kıyasla (genellikle >7 gün sürer) daha hızlı olur. Bunun nedeni muhtemelen odada beslenen kenelerden kaynaklanan frass ve diğer birikme feromonlarının kokusudur; bu feromonlar, kenelerin beslenmesini tetikleyebilir35,36.

Sonuçlar

Her kene türü için zar kalınlığı.
Her yetişkin kene türü için aşağıdaki membran kalınlığı spesifikasyonlarında en yüksek kene beslenme oranları gözlemlenmiştir: Amblyomma americanum 100–200 μm; A. maculatum 100–250 μm; Rhipicephalus sanguineus 70–100 μm; Ixodes scapularis <150 μm, Dermacentor variabilis <150 μm. Tüm kene türleri beslenme sırasında aynı nem ve sıcaklık koşullarında (%63 RH ve 37 °C) tutuldu (Tablo 1).

Bu protokolde kullanılan keneler ve kan kaynakları
Tüm keneler Oklahoma State Üniversitesi kene yetiştirme tesisinden alındı ve 12:12 saat açık-karanlık bir fotoperiyot altında 20 °C'de %>90 bgöreli nemde tutuldu. Tüm keneler, çeşitli kene türlerinde alfa-gal (αGal) seviyelerini araştıran bir araştırma projesi kapsamında defibrinasyonlu sığır veya insan kanıyla beslendi. Bu çalışma, araştırma grubunun yürüttüğü daha geniş bir alfa-gal sendromu (AGS) projesinde beslenmenin farklı kan kaynakları üzerindeki etkilerini karşılaştırdı. Burada tarif edilen kene örneklerinin çoğu, tam doldurmadan önce kısmen beslenen kenelerde αGal nicelendirme analizleri yapmak için (2–5 günlük beslenme) parçalanmıştır. Sadece Amblyomma americanum kenelerinin (αGal nic ölçüsü için gerekli olmayanlar) bir alt kümesi beslenmeye izin verildi. Burada sığırla beslenen ve insanla beslenen kene besleme oranları arasındaki ayrıntılı karşılaştırmalar sunulmasa da, tam beslenme (yani beslenme başarısı) sığır kanıyla beslenen kenelerde daha fazla sağlanmıştır. Uzun süre besleyicilerde kalmasına izin verilen keneler arasında (n = 35), 15'i tam dolup ulaştı ve bu da %42,8 beslenme başarı oranını temsil ediyor. Bunlardan 9'u sığır kanı, 6'sı ise insan kanı ile beslendi (%60'ı sığır kanı, %40 insan tarafından beslendi).

Kene besleme oranları ile kene beslenme başarı oranları
Bu çalışmada kene besleme oranları, kısmen beslenen kenelerin edinimine (2–5 gün beslenme) dayanarak belirlendi; beslenme başarısı ise tam şişme olarak tanımlandı; bu genellikle dişinin alloscutum renk değişimiyle gösterildi (veri sadece Amblyomma americanum için mevcut). Erkek beslenme oranları, 2 günden (2–5 gün) uzun süreli sürekli besleme olarak tanımlandı. Genel beslenme oranları, sığır ve insan kanıyla beslenen kenelerden alınan verilerin birleştirilmesiyle ve odalara yerleştirilen kenelerden 2–5 gün beslenme veya tam beslenme oranları hesaplanarak hesaplandı. <2 günlük tutunma sonrası bağlanmayan veya ölen keneler beslenme oranlarının hesaplanışında dikkate alındı. Kene beslenme oranları üzerindeki kan kaynağı etkisine dair nicel veriler sunulmasa da, bu gözlemsel kanıtlar, çoğu kene türü için 2–5 günlük beslenme döneminde sığır ve insan kanı arasında bağlanma ve beslenme oranlarının önemli ölçüde farklılaşmadığını göstermektedir. Rhipicephalus sanguineus için istisna gözlemlendi; 3. ve 5. günler arasında insan kanıyla sığır kanına kıyasla daha düşük beslenme oranları gösterdi. Bu in vitro kene besleme sistemi kullanılarak kısmi beslenme ve tam doldurma sağlayan tüm kene türlerinin beslenme oranları Tablo 1'de özetlenmiştir.

Amblyomma americanum dişi kilo ve beslenme evresi sınıflandırması
Kısmen beslenen dişi A. americanum , beslenme günlerine göre şu şekilde sınıflandırılmıştır: (1) beslenmesiz, (2) 2–3 gün kısmen beslenmiş, (3) 4–5 gün kısmen beslenmiş ve (4) şişmiş (Şekil 5). Şişmiş beslenme aşaması, hızlı şişme aşamasının başında keneleri (ağırlıkları 48,9 mg ile 109 mg arasında değişiyor) ve tamamen şişmiş keneleri (ağırlıkları 272,7 mg ile 348,7 mg arasında değişiyor) içeriyordu.

figure-results-1
Şekil 1: Kene besleme odası - 3D model ve membranlı baskılı montaj. Patlatılmış 3D model ve son montaj odası, bireysel bileşenleri gösteren oda: (i) odalı gövde (kene yuvası), (ii) kapak tutucu halkası, (iii) yükseklik ayarlama halkası, (iv) 40 mm x 10 mm Petri kabı kapağı ve (v) 40 mm x 10 mm Petri kabı tabanı kanlı (A). 3D baskılı model ve bireysel parça boyutlarının montajı mm (B) cinsinden gösterilmiştir. Montaj odası, gri 8K çözünürlüklü reçine (C) ile basılmış. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Silikon zar ve oda montajının hazırlanması. (i) 30 cm × 30 cm ölçüsünde plastik sargı, bantla sabitlenmiş, görünür kırışıklıklar olmamasını sağlamak, (ii) dürgünün üzerine yaklaşık 5 cm aralıklı olarak yerleştirilmiş lens temizleme kağıdı, (iii) silikon bileşenlerin spatula ile dairesel hareketlerle nazikçe karıştırılması, (iv) her lens kağıdının kenarlarına 1–2 g silikon karışımı uygulanarak sabitlenmesi, (v) silikon karışımı, kağıttan daha büyük düz kenarlı bir alet kullanılarak lens kağıdına eşit şekilde yayılır (resim cam kapağın kenarını gösterir), (vi) yayma sırasında silikon karışımının azalmasına dikkat edilir; aletin üzerindeki silikon geri döndürülür ve yeniden dağıtılır, böylece eşit kapsam sağlanır (A). Doğru şekilde yayılmış zarlarda hava kabarcıkları veya boşluklar bulunmadı (B). Şırtingenin yapıştırıcı uygulaması için hazırlanması: (i) silikon yapıştırıcı ile doldurulmuş 1 mL şırınga, (ii) şırınga ucuna 200 μL pipet ucu yerleştirilmiş, (iii) pipet ucu sızmaz bir mühür sağlamak için yerinde vidalanmış ve (iv) i (C) kısmının alt kenarına yapıştırıcı yerleştirilmiş. Kurumuş membranın üzerine yerleştirilen odalar (D) ve üstüne sıkı yapışma sağlamak için ağırlıklı bir nesne (2,5 kg ağırlığında kalın akrilik blok; efena ok) yerleştirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Kullanım öncesi oda ve zar hazırlığında son adımlar. Odayı çevreleyen zarın kenarlarının kavisli küçük makasla (A) kesilmesi, kamera kullanılmadan önce plastik filmin çıkarılması (B), nihai model montajı (C), odanın su içeren 40 mm x 10 cm boyutlarında bir Petri kabına yerleştirilmesi ve Petri kabının odanın kapağı (D) olarak kullanılması (i-v numaraları Şekil 1A'da belirtildiği parçaları gösterir), ve solunum delikleri (magenta ok uçlarıyla gösterilen) (E) gösterilen oda kapakları bulunur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Kan besleme sistemi ve kene yerleştirme. Kam, kanla dolu bir kaba yerleştirilir, yükseklik ayarlama halkası vurgulanır (magenta oklar) (A). Eşit sayıda erkek ve dişi kene içeren odanın iç görünümü (B). Kene odaları, nem kaynağı olan kuru banyolarda konumlandırılır; %63 ± %2 bilgili nem (RH) ve sıcaklık 37 °C ± 1 °C (C) tutar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Amblyomma americanum büyüklüğü ve kilo değişimi, beslenme sırasında. Kısmen beslenen kenelerin beslenmemiş kene boyutu ve ortalama ağırlığı gösterilmiştir. Görüntüler, her beslenme aralığında kaydedilen ortalama ağırlığı temsil eden tipik örneklerdir. Eşlik eden tablo, her beslenme zaman noktası için ortalama ağırlıkları, standart sapmaları, analiz edilen kene sayısını, medyanı ve 1 ile 3 dörtlüklerini sunar. 2–3 gün boyunca beslenen kenelerde ağırlık aralığı minimum 7,4 mg ile maksimum 19,2 mg arasında gösterildi. 4–5 gün boyunca beslenen keneler 20,6 mg ile 44,8 mg arasında değişiyordu. Hızlı şişme fazının başında keneler ve tam şişmiş keneler 48,9 mg ile 348,7 mg arasında değişiyordu. Ekli A. americanum dişilerinin 4-5 gün beslenmiş dişi (sarı ok ucu) ve tamamen şişmiş dişi (magenta ok ucu) görüntüsü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Kene türleri ve cinsiyetBeslenen kene sayısı/ Odalara yerleştirilen toplam kene sayısı (Ölen kene sayısı)Beslenme hızı (keneler 2-5 gün biriktirmiştir)Ortalama ağırlık (mg) (SD)Kullanılan membran kalınlığı (μm)
A. americanum dişiler85/97 (12)87.60%37.3 (54.40)*100 - 200
A. americanum erkekleri19/22 (2)86.30%Kaydedilmedi100 - 200
A. maculatum dişileri45/66 (21)68.20%122.4 (141.65)100 - 250
A. maculatum erkekleri36/47 (11)76.60%KaydedilmediKaydedilmedi
R. sanguineus dişileri34/60 (26)56.60%Kaydedilmedi70 - 100
I. scapularis dişileri15/23 (8)65.20%Kaydedilmedi<150
*Aa ile beslenen yetişkin kenelerin bir alt kümesinde değerlendirilen beslenme başarı oranı (n=35) olarak değerlendirildi

Tablo 1: Kene besleme oranları ve ortalama ağırlıklar.

Ek Şekil 1: 3D odanın bir yerine zaten bağlı olan bireysel kenelerin düşük hacimli (100 μL) beslenmesi. Yapay zarın altına silikon yapıştırıcı ile bağlı küçük bir PCR tüpü 100 μL kanla doldurulur. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Kene yapay zar besleme sistemleri, kene araştırmaları için son derece etkili araçlardır ve birçok araştırma laboratuvarında canlı hayvan beslemesine alternatif olarak yaygın olarakkullanılmaktadır 28,29. Bu sistemlerin temel değeri, patojenler, akarisitler, kene kaynaklı bileşikler ve diğer modülatör moleküller dahil olmak üzere kan yemeği yoluyla çeşitli ajanları teslim edebilme veya geri kazanabilmekapasiteleridir 22,23,25,27. Yapay membran besleme sistemlerinin optimizasyonu, sürdürülebilir kene koloni yetiştiriciliğinin gelişimini kolaylaştırabilir ve böylece canlı hayvanlara olan bağımlılığı azaltabilir.

Bu protokolde belirtilen in vitro kene besleme sistemi, yetişkin Amblyomma americanum ve Ixodes scapularis ile özellikle başarılı olmuştur. Kene beslenme başarı oranları, kenelerin beslenmeyi başarıyla tamamlayıp tam dolup taşan oranı olarak tanımlanır. Ancak, kısmen beslenen keneler (genellikle beslenme başlangıcından 3–4 gün sonra), kene biyolojisi veya fizyolojisini inceleyen çoğu kene araştırma laboratuvarı için spesifik deneysel hipotezleri ele almak için yeterli olur. Bu yapay zar besleme sistemi protokolünde ve alfa-Gal (αGal) projesindeki özel araştırma hedeflerini ele almak için, "kene besleme hızı" terimleri kısmen beslenen kenelerin edinilmesini (2–5 gün besleme) ve "kene besleme başarısı" terimleri A. americanum'da tam şişmeyi ifade etmek için kullanılmıştır. En yüksek beslenme oranları A. americanum dişilerinde (%87,6) olup, ardından A. americanum erkekleri (%86,3), A. maculatum dişileri (%68,2), A. maculatum erkekleri (%76,6), I. scapularis dişileri (%65,2) ve R. sanguineus dişileri (%56,6) geldi; A. americanum beslenme başarı oranı ise %42,8 oldu (Tablo 1). Kısmen beslenen dişi A. americanum, besleme günlerine göre 4 kategoriye (beslenme aşamaları) ayrılarak sınıflandırılmıştır; önceki yayınlardanşu şekilde değiştirilmiştir: 21: (1) beslenmesiz, (2) 2–3 gün kısmen beslenmiş, (3) 4–5 gün kısmen beslenmiş ve (4) şişmiş (Şekil 5). Şişmiş beslenme aşaması, hızlı şişme aşamasının başında keneleri (ağırlıkları 48,9 mg ile 109 mg arasında değişiyor) ve tamamen şişmiş keneleri (ağırlıkları 272,7 mg ile 348,7 mg arasında değişiyor) içeriyordu (Şekil 5). Bu yapay zar kene besleme sistemi, aynı araştırma grubu ve işbirlikçileri içinde kısmen beslenen kenelerin sığır kanıyla üretilmesine olanak tanıyarak birçok çalışmanın yapılmasına olanak sağlamıştır; bu keneler daha sonra fareleri enfekte etmek ve kene ısırığı kaynaklı kırmızı et alerjisi olan alfa-gal sendromunun (AGS) iletim hipotezini test etmek için kullanılmıştır; ayrıca bir N-glikozikçalışması için 11,21, 37. Bireysel kurulumun kolaylığı, farklı kan kaynaklarının kullanılmasını mümkün kılmıştır ve şeffaf kapak ile odanın minimum yüksekliği, beslenme döneminde kenelerin stereomikroskop altında yeterli çalışma mesafesi ile görselleştirilmesini kolaylaştırmıştır.

Son zamanlarda elde edilen nemlik değişiklikleri (su banyosu, %90 RH, kuru banyo, %63 ± %2 RH), sıcaklık (37 °C'den 35 °C'ye ve tekrar 37 °C'ye döndü) ve membran kalınlığında (Tablo 1) yapılan değişiklikler, birden fazla kene türünün başarılı beslenmesini mümkün kıldı. Sıcaklık ve göreli nem (RH) in vitro kene beslenmesini kontrol etmek için önemli değişkenler olsa da, zar kalınlığı ve gücü, farklı kene türleri arasında başarılı beslenme için kritikfaktörlerdir 33,38. Kısa ağız parçalarına sahip kenelerin, örneğin Rhipicephalus sanguineus ve Dermacentor variabilis'in, uzun ağızparçalarına sahip kenelere (örneğin Amblyomma türleri ve Ixodes türleri) göre daha ince zarlara ihtiyaç duyacağı göz önünde bulundurulmalıdır. En yüksek kene beslenme oranları Amblyomma americanum ve A. maculatum'da, membran kalınlığı 100–200 μm arasında gerçekleşti; Rhipicephalus sanguineus 70–100 μm kalınlığında; Ixodes scapularis <150 μm kalınlıkta, Dermacentor variabilis <150 μm kalınlıkta (Tablo 1). Yapay zar kene beslemesinde dikkat edilmesi gereken önemli bir faktör, beslenme oranlarındaki dalgalanmaların hâlâ yaşanmasıdır. Bu sistemde, sıcaklıkta hafif bir değişim, yani birkaç gün sonra 37 °C'den 35 °C'ye ve tekrar 37 °C'ye dönmesi, genellikle kenelerin beslenme oranlarını artırır veya geri getirir. Ayrıca, kuru banyodan su banyosuna geçiş Amblyomma türleri ve Ixodes scapularis için benzer sonuçlar verir; ancak bu etki kuru banyolarda %63 ± %2 RH ile daha etkili beslenen Rhipicephalus sanguineus için gözlemlenmemiştir.

Ueti, M. ve ark. (USDA-ARS) tarafından geliştirilen beş bölümlü sürekli akış sisteminden uyarlanan ve daha sonra Yamasaki, Y. ve ark. tarafından ek kene türleri için modifiye edilenler gibi diğer yapay kene besleme sistemleri yüksek verimlilik göstermiş ve sürekli yüksek kene beslenme başarıoranları sağlamıştır 27,40. Ancak, kısmen beslenen kenelerin diseksiyonu için sisteme sık erişim gerektiren çalışmalar, kene yuvasının tekrar tekrar açılıp kapanması zahmetli olabileceği için bu düzenlemeleri daha az uygun hale getirir. Bu protokolde tanımlanan 3D baskılı oda, manyetik kesin kilitli kapak ve bireysel Petri kaplarına sahiptir; bu da kene beslemesinin kolayca ele alınmasını ve görsel olarak incelenmesini sağlar; kurulumu rahatsız etmeden. Şeffaf kapak, görsel izlemeyi rahatsız etmeden sağlar ve gömülü mıknatıslar aracılığıyla odaya güvenli şekilde bağlanır; örneğin Kröber ve Guerin22,29'un orijinal tasarımıyla optimize edilmiş kene besleme sistemlerinin aksine; bireysel görselleştirme, besleme odası kandan çıkarılmadan mümkün değildir; çünkü tüm beslenme üniteleri tek bir plakada entegre edilmiştir ve kenelerin kaçmasını önlemeye yönelik yöntemler kullanılır görselleştirmeye izin vermeyin. Ayrıca, bu in vitro kene besleme sistemi daha da geliştirilerek daha küçük, bölgeye özgü kan hacimleri elde edilebilir. Örneğin, dişi keneler belirli beslenme noktalarına tutunduktan sonra, alt Petri kabı, tutunma alanının hemen altında 100 μL'den az kan içeren 100 μL PCR tüpünün üst kısmı gibi minyatür rezervuarlarla değiştirilebilir (Ek Şekil 1). Bu düşük hacimli beslenme yaklaşımı, patojen edinimi ve iletimi üzerine ayrıntılı çalışmaların yanı sıra kene toksikanları ve konak kaynaklı antikorların etkilerinin araştırılmasına olanak sağlayacak. Bu protokolün, çeşitli yetişkin kene türlerinden kısmen beslenmiş kene elde etmede başarılı olduğu gösterilmiştir. Bu çalışma amacıyla, yumurta bırakma ve tam şişme oranları bu protokolde değerlendirilmemiştir; ancak, ön gözlemlere dayanarak Amblyomma americanum ve Ixodes scapularis ile gerçekleştirilebilecek kene nesli elde etmek amacıyla daha fazla optimizasyon yapılmaktadır. Bu sistemin belki de en yenilikçi özelliği, küçük ölçekli deneysel manipülasyonlar için esnekliğidir; bu da tedavilerin ve çevresel koşulların kontrollü çeşitliliğini sağlarken, aynı zamanda koloni yetiştirme uygulamalarını destekler.

In vitro kene beslemesi, kene biyolojisi, fizyolojisi ve vektör yetkinliği üzerine çalışan araştırmacılar için değerli bir araçtır. Ancak, yapay zar kene beslemesi zaman alan ve emek gerektiren bir iştir. Bu protokol, 3D baskılı bir oda ve güvenli kilitli sistem ile basit laboratuvarda hazırlanmış bir zar içerir; odalar basıldıktan ve zarlar hazırlandıktan sonra basit bir kurulum sunar ve uzun süreli kullanım imkanı sunar. Ayrıca, membran kalınlığını ayarlayarak sistem farklı kene türlerine etkili şekilde uyarlanabilir. Odanın boyutu ve zar kalınlığı dahil olmak üzere ek optimizasyonlar, çeşitli kene yaşam evrelerinde uygulanmasını mümkün kılabilir.

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalede açıklanan araştırmayla ilgili hiçbir maddi çıkar belirtmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, kene beslemesi ve kene odası ile membranının kurulmasında yardımcı olan lisans öğrencileri ve çalışanları Kara Golden, Sydney Ingham ve Omayma Jaddou Najma'nın özenli çalışmalarını takdir etmek isterler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1mL Luer-Lok ŞırıngesiBD309628Luer-Lok Ucu
Gelişmiş Şeffaf Silikon General Electric2810435Şeffaf silikon silikon sıf. Bu silikon kürlendikten sonra su geçirmez bir bariyer oluşturur.
Şeffaf Epoksi YapıştırıcıJB Kaynak-Temiz‎ B009EU5ZM0Amazon ürün numarası
Şeffaf gıda sargısı (yapışkan mühür)Memnun oldumCLO00020
Defibrinasyonlu Sığır KanıHemostat LaboratuvarlarıDBB100
Defibrinasyonlu İnsan KanıBioIVT
Tek kullanımlık spatulalarLevGo, Inc.17211Amazon ürün numarası
Kuru banyo kuluçka makineleriONiLAB ScientificHB120-SAmazon ürün numarası. Isıtma bloğu tersine çevrilerek düz bir yüzey elde edilir.
Gentamisin sülfat tuzuMillipore SigmaG3632-5G
Lens Temizleme KağıdıTiffenEK1546027T
Mikropipet uçları, 200 & mu; L Biotix uTIP63300057Şırınga için. Silikon silikon silikon aplikatörü
Nitril eldivenlerİlham VerCOBALT-OGAmazon ürün numarası
NystatinFisher BiyoreaktifleriBP2949-5
Petri kabı 35 mm x 10 mmFalcon351008
Phrozen Sonic MEGA 8K V2 Reçine YazıcıPhrozenB0F9NBXVVTÜretim hacmi 320 x 175 x 300 mm. Eğer kendi baskısı tercih edilirse, Amazon üzerinden satın alınabilir
Pro 8K fotopolimer  Reçine Aqua GrayPhrozenArizona Üniversitesi aracılığıylaDüşük küçülme. Yüksek Kalite & 8K çözünürlüklü son derece karmaşık 3D modeller.
Yuvarlak mıknatıslar 3mm x 2 mmMealosB08NZTN426Amazon ürün numarası
RPG fotopolimer Reçine Smoke WhitePhrozenArizona Üniversitesi aracılığıylaYüksek Kalite & Son derece karmaşık 3D modeller Etkileyici bükülme ile harika esneklik.
Silikon yağıMillipore Sigma378321-250ml
Tinkercad ücretsiz 3D yazılım tasarımıTinkercadYokhttps://www.tinkercad.com
Tartı tekneleri (100 mL kapasite)Pura Pontamdo-azoc-1030

Kaynaklar

  1. De La Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Front Biosci. 13, 6938-6946 (2008).
  2. Gubler, D. J. In vector biology, ecology and control. Atkinson, P. W. , Springer. Netherlands, Dordrecht. 39-62 (2010).
  3. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. In biology of ticks. 1, Oxford University Press. Cary. 3-17 (2013).
  4. A global brief on vector-borne diseases. , World Health Organization. 1-54 (2014).
  5. Mullen, G. R., Durden, L. A. In medical and veterinary entomology. , Academic Press. Amsterdam. 517-558 (2002).
  6. Choudhary, S. K., et al. Tick salivary gland extract induces alpha-gal syndrome in alpha-gal deficient mice. Immun Inflamm Dis. 9 (3), 984-990 (2021).
  7. Van Nunen, S. A., O'Connor, L. R., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans. Med J Aust. 190 (9), 510-511 (2009).
  8. Fischer, J., et al. Spatial distribution of alpha-gal in Ixodes ricinus – A histological study. Ticks Tick Borne Dis. 11 (5), 101506(2020).
  9. Hamsten, C., et al. Identification of galactose-α-1,3-galactose in the gastrointestinal tract of the tick Ixodes ricinus; possible relationship with red meat allergy. Allergy. 68 (4), 549-552 (2013).
  10. Chinuki, Y., Ishiwata, K., Yamaji, K., Takahashi, H., Morita, E. Haemaphysalis longicornis tick bites are a possible cause of red meat allergy in Japan. Allergy. 71 (3), 421-425 (2016).
  11. Maldonado-Ruiz, L. P., Boorgula, G. D., Kim, D., Fleming, S. D., Park, Y. Tick intrastadial feeding and its role on IgE production in the murine model of alpha-gal syndrome: The tick “transmission” hypothesis. Front Immunol. 13, 1-11 (2022).
  12. Commins, S. P., et al. Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-α-1,3-galactose. J Allergy Clin Immunol. 123 (2), 426-433 (2009).
  13. Commins, S. P., Jerath, M. R., Cox, K., Erickson, L. D., Platts-Mills, T. Delayed anaphylaxis to alpha-gal, an oligosaccharide in mammalian meat. Allergol Int. 65 (1), 16-20 (2016).
  14. Crispell, G., et al. Discovery of alpha-gal-containing antigens in North American tick species believed to induce red meat allergy. Front Immunol. 10, 1056(2019).
  15. Park, Y., et al. Alpha-gal and cross-reactive carbohydrate determinants in the N-glycans of salivary glands in the lone star tick, Amblyomma americanum. Vaccines. 8 (1), 95(2020).
  16. Sharma, S. R., Karim, S. Tick saliva and the alpha-gal syndrome: Finding a needle in a haystack. Front Cell Infect Microbiol. 11, 680264(2021).
  17. Sonenshine, D. E. In biology of ticks. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Vol 1, New York. 51-66 (1991).
  18. Narasimhan, S., et al. Laboratory management of mammalian hosts for Ixodes scapularis host–pathogen interaction studies. Comp Med. 74 (4), 235-245 (2024).
  19. Allan, S. A. Tick rearing and in vitro. feeding. Biology of ticks. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. , Oxford University Press. New York. 445-473 (2013).
  20. Costa-Da-Silva, A. L., Carvalho, D. O., Kojin, B. B., Capurro, M. L. Implementation of artificial feeders in hematophagous arthropod research cooperates with the vertebrate animal use replacement, reduction and refinement (3Rs) principle. J Clin Res Bioeth. 5 (2), 1-3 (2014).
  21. Maldonado-Ruiz, L. P., et al. High levels of alpha-gal with large variation in the salivary glands of lone star ticks fed on human blood. Sci Rep. 13 (1), 21409(2023).
  22. Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro. feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Manag Sci. 63 (1), 17-22 (2007).
  23. Stone, B. F., Commins, M. A., Kemp, D. H. Artificial feeding of the Australian paralysis tick, Ixodes holocyclus, and collection of paralysing toxin. Int J Parasitol. 13 (5), 447-454 (1983).
  24. Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: a tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
  25. Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae.) by membrane feeding. J Med Entomol. 53 (2), 409-415 (2015).
  26. Vimonish, R., et al. Isolation of infectious Theileria parva sporozoites secreted by infected Rhipicephalus appendiculatus ticks into an in vitro. tick feeding system. Parasit Vectors. 14 (1), 616(2021).
  27. Vimonish, R., et al. Quantitative analysis of Anaplasma marginale acquisition and transmission by Dermacentor andersoni fed in vitro. Sci Rep. 10 (1), 470(2020).
  28. Kröber, T., Guerin, P. The tick blood meal: From a living animal or from a silicone membrane. Altex. 24, 39-41 (2007).
  29. Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
  30. Waladde, S. M., Ochieng, S. A., Gichuhi, P. M. Artificial-membrane feeding of the ixodid tick, Rhipicephalus appendiculatus, to repletion. Exp Appl Acarol. 11 (4), 297-306 (1991).
  31. Khoo, B., Cull, B., Oliver, J. D. Tick artificial membrane feeding for Ixodes scapularis. J Vis Exp. (189), e64553(2022).
  32. Krull, C., Böhme, B., Clausen, P. H., Nijhof, A. M. Optimization of an artificial tick feeding assay for Dermacentor reticulatus. Parasit Vectors. 10 (1), 60(2017).
  33. Garcia Guizzo, M., et al. Optimizing tick artificial membrane feeding for Ixodes scapularis. Sci Rep. 13 (1), 16170(2023).
  34. Rochlin, I., et al. Optimization of artificial membrane feeding system for lone star ticks, Amblyomma americanum (Acari: Ixodidae), and experimental infection with Rickettsia amblyommatis (Rickettsiales: Rickettsiaceae). J Med Entomol. 61 (2), 442-453 (2023).
  35. Barré, N., Garris, G., Lorvelec, O. Field sampling of the tick Amblyomma variegatum (Acari: Ixodidae.) on pastures in Guadeloupe: Attraction of CO and/or tick pheromones and conditions of use. Exp Appl Acarol. 21 (2), 95-108 (1997).
  36. Norval, R., Peter, T., Sonenshine, D., Burridge, M. Responses of the ticks Amblyomma hebraeum and A. variegatum. to known or potential components of the aggregation-attachment pheromone. III Aggregation. Exp Appl Acarol. 16 (3), 237-245 (1992).
  37. Park, Y., et al. Alpha-gal and cross-reactive carbohydrate determinants in the N-glycans of salivary glands in the lone star tick, Amblyomma americanum. Vaccines. 8 (1), 1-18 (2020).
  38. Trentelman, J. J., Kleuskens, J. A., Van De Crommert, J., Schetters, T. P. A new method for in vitro feeding of Rhipicephalus australis (formerly Rhipicephalus microplus.) larvae: A valuable tool for tick vaccine development. Parasit Vectors. 10 (1), 153(2017).
  39. Kemp, D. H., Stone, B. F., Binnington, K. C. In physiology of ticks. Obenchain, F. D., Galun, R. , Pergamon. 119-168 (1982).
  40. Yamasaki, Y., Singh, P., Vimonish, R., Ueti, M., Bankhead, T. Development and application of an in vitro. tick feeding system to identify Ixodes tick environment-induced genes of the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi. Pathogens. 13 (6), 1-13 (2024).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Yapay Membranla Besleme3D Yaz c yla retilmi HazneSilikon MembranKene Besleme SistemiIxodid KeneleriVekt r Konak Etkile imiPatojen letimiKene Kaynakl Hastal klarHematofaj Ektoparazitler
Ixodid kene araştırmalarında 3D baskılı bir odada yapay bir zardan beslenen kene kanı
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.