Yöntem makalesi

Osteoartritin Preklinik Çalışmaları İçin Standartlaştırılmış İnstabilitelikten Kaynaklanan Hayvan Modelleri

DOI:

10.3791/69612

⸱

23 Aralık 2025

 ,  , 
1Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University (Zhejiang Provincial Hospital of Chinese Medicine), 2The First School of Clinical Medicine, Zhejiang Chinese Medical University, 3Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Hematology, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University (Zhejiang Provincial Hospital of Chinese Medicine), 4Department of Orthopedic Surgery, the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Orthopedics Research Institute of Zhejiang University, 6Key Laboratory of Motor System Disease Research and Precision Therapy of Zhejiang Province, 7Clinical Research Center of Motor System Disease of Zhejiang Province

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, osteoartrit araştırmaları için uygun hayvan modelleri oluşturmayı amaçlamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dünya genelinde en yaygın eklem hastalığı olan diz osteoartriti (OA), önemli bir küresel sağlık yükü oluşturur ve patogenezi ile tedavi stratejileri üzerine kapsamlı araştırmalar gerektirir. Çok sayıda çalışmaya rağmen, model oluşturma için standartlaştırılmış metodolojiler hâlâ eksik durumda. Bu açığı gidermek için, osteoartritin instabiliteli hayvan modellerinin geliştirilmesi için kapsamlı ve tekrarlanabilir protokoller sunuyoruz; özellikle farelerde Medial Menisküs Destabilizasyonu (DMM) modeli ve sıçanlarda Medial Menisküs Yırtığı (MMT) modeli. Ayrıca, preklinik oyma araştırmalarında metodolojik tutarlılığı teşvik etmeyi amaçlayan, ameliyat sonrası ağrı eşikleri ve mekansal yürüyüş stabilitesi değerlendirmek için basit ve kolay uygulanabilir bir prosedürü tanımlıyoruz. Histolojik ve davranışsal doğrulama, her iki modelin başarısını doğruladı; Osteoarthritis Research Society International (OARSI) puanları belirgin şekilde yükseldi, adım uzunluğu önemli ölçüde değişti ve DMM ile MMT gruplarında mekanik ağrı eşikleri kontrollere kıyasla önemli ölçüde azaldı; bu da belirgin eklem dejenerasyonu ve aşırı duyarlılığı gösteriyordu. Bu doğrulama sonuçları, iki modelin tekrarlanabilirliğini ve translasyonel önemini vurgular. Böylece, ayrıntılı video dokümantasyonu sağlayarak bu çalışma prosedürel standartlaştırmayı teşvik eder ve laboratuvarlar arası tutarlılığı kolaylaştırır; böylece Ortalama Araştırma Sonuçlarının güvenilirliği ve karşılaştırılabilirliğini artırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoartrit (OA), son derece yaygın bir dejeneratif eklem hastalığıdır ve dünya genelinde engelliliğin başlıca nedenlerindenbiridir 1,2. Kapsamlı araştırmalara rağmen, etkili hastalık değiştirici OA ilaçlarının (DMOAD'ler) geliştirilmesi nispeten yavaşilerlemiştir 3. Artık OA'nın, eklem kıkırdak, subkondral kemik, tendonlar ve sinovyum 4,5 dahil olmak üzere birden fazla peri-artiküler dokuda karmaşık patolojik değişiklikleri içeren çok faktörlü bir hastalık olduğu yaygın olarak kabul edilmiştir. OA'nın çeşitli patolojik süreçleri üzerine etkili preklinik araştırmalar, iyi tanımlanmış ve uygun hayvan modellerinin kullanılmasını gerektirir. Çeşitli OA hayvan modelleri kurulmuş ve 6,7,8,9,10,11 rapor edilmiş olsa da, birçok çalışma uygun olmayan hayvan modelleri kullanmaya devam etmektedir ve bu da bulgularının translasyonel önemini sınırlamaktadır. Bu sorunu ele almak için, preklinik OA araştırmaları ve model standartlaştırması için pratik bir referans olarak hizmet vermek üzere Medial Menisküs (DMM) ve Medial Meniskus Yırtığı (MMT) prosedürlerinin tekrarlanabilir destabilizasyonu dahil olmak üzere standart instabiliteyle indüklenen OA modelleri video formatında sunuyoruz.

Önceki çalışmalarda bildirildiği gibi, meniskal instabilite, klinik vakalarda diz eklemi dejenerasyonuna katkıda bulunan önemli bir faktördür. Bu nedenle, fare ve sıçanlarda cerrahi olarak indüklenen meniskal instabilite, OA'nın deneysel indüksiyonu için etkili bir yaklaşım olarak hizmet eder. Bu bağlamda, farelerde DMM modeli ve farelerde MMT modeli dahil olmak üzere iki temsili instabilitesizlikle tetiklenen OA modeli sunuyoruz. Farelerdeki DMM modeli, OA'nın moleküler mekanizmalarını araştırmak için özellikle değerlidir; çünkü fareler transjenik manipülasyona açıktır ve bu model, insan OA'sını yakından taklit ederek yavaş ve uzun süreli bir hastalık ilerlemesi sergiler. Ancak, DMM modelinin subkondral kemikteki patolojik değişikliklere odaklanan çalışmalar için daha az uygun olduğunu belirtmek önemlidir; alternatif modeller daha iyi translasyonel önem sağlayabilir.

Ayrıca, farelerde MMT modelini fare DMM modelini tamamlamak için kurduk. MMT prosedürü, hem eklem kıkırdak hem de subkondral kemiği kapsayan daha kapsamlı yapısal hasara yol açar ve böylece klinik ortamlarda gözlemlenen OA'nın ileri patolojik özelliklerini daha iyi yansıtır. Bu da sıçan MMT modelini, biyomalzemelerin değerlendirilmesi, rejeneratif tedaviler ve eklem onarımını hedefleyen ilaç dağıtım sistemleri dahil olmak üzere biyomühendislik ve translasyon araştırmaları için özellikle uygun kılar. MMT ve DMM cerrahi teknikleri önceki çalışmalarda tanımlanmış olsa da, araştırma laboratuvarlarında standartlaşma, tekrarlanabilirlik ve teknik hassasiyeti garanti eden kapsamlı, adım adım görsel bir protokol eksiklik yaşamaktadır. Bu açığı gidermek için, hayvan hazırlığından ameliyat sonrası bakıma kadar model kurulumunun her kritik adımını gösteren ayrıntılı bir video tabanlı gösterim geliştirdik. Ayrıca, OA indüksiyonu sonrası fonksiyonel değerlendirme için tutarlı bir çerçeve sağlamak amacıyla biri ağrı eşiğini değerlendirmek için, diğeri mekânsal yürüyüş kararlılığını analiz etmek için yaygın kullanılan iki davranışsal değerlendirme yöntemi sunuyoruz. Bu nedenle, cerrahi ve davranışsal protokolleri entegre ederek, bu makale preklinik OA araştırmalarında metodolojik standartlaştırmayı teşvik etmeyi ve böylece çalışmalar arasında veri karşılaştırılabilirliğini ve çeviri önemini artırmayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel prosedürler, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Hayvan Etik ve Refah Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütüldü ve IACUC-20251020-11 protokol numarası altında onaylandı. DMM ameliyatı için 10-12 haftalık erkek C57BL/6 fareleri kullanılırken, MMT işlemi için 200-225 g ağırlığındaki erkek Sprague-Dawley fareleri seçildi. Tüm hayvanlar belirli patojensiz (SPF) koşullar altında barındırıldı ve deneylerden önce bir haftalık bir alışma sürecine izin verildi. Standart hayvanlık koşulları korundu; hayvan refahı ve deneysel tutarlılığı sağlamak için haftada en az iki kez yiyecek, su ve yatak malzemeleri değiştirildi.

1. Hayvan hazırlığı

  1. Kurumsal yönergelere uygun olarak ameliyattan önce uygun analjezi (örneğin buprenorfin) uygulanır. Hayvanı inhalasyon anestezi ile anestezi yapın (örneğin, %2 izofluran 0,4 L/dakika ile indüksiyon odasında 4 L/dakika taze gaz akışı) ve işlem boyunca burun konusuyla anestezi sürdürün. Pedal yoksunluk refleksinin olmadığından emin olarak anestezi derinliğini doğrulayın.
  2. Alt göz kapağının konjonktival kesesine 2-3 mm uzunluğunda bir göz merhemi şeridi uygulayın ve göz kapağını nazikçe masaj ederek merhemin göz yüzeyinde eşit dağılmasını sağlayın.
  3. Sağ diz eklemini çevreleyen tüyleri tıraş edin ve cerrahi bölgeyi povidon-iyot ile üç aşamalı bir temizlik işlemiyle dezenfekte edin ve ardından %70 etanol ekleyin. Hayvanı steril bir ameliyat masasına yerleştirin.

2. Farelerde DMM ameliyatı

NOT: Bu prosedür, normalde medial menisküsü tibial platoya sabitleyen medial meniskosibiyal bağın (MMTL ) kesilmesi yoluyla eklem destabilizasyonunu indükte eder.

  1. Anestezi altındaki fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve sağ dizin üzerinde yaklaşık 3-5 mm uzunluğunda küçük bir medial parapatellar deri kesisi yapın.
  2. Eklem kapsülü ortaya çıkarmak için üst üzerindeki yumuşak dokuları dikkatlice diseksiyona geçirin. Patellar tendona medial bir kesi yapın ve diz eklemini görmek için patellayı yan tarafa nazikçe kaydırın. MMTL'nin, medial meniskusun ön boynuzunu tibial platoya bağlayan ince, bağlı bir bant olarak göründüğünü doğrulayın. Görselleştirmeyi geliştirmek ve eklem kıkırdağına zarar verme riskini en aza indirmek için stereomikroskop kullanın.
  3. MMTL'nin tibial tutuşunu mikro-makas, #11 skarpel bıçağı veya bükülmüş bir şırınga iğnesi ile dikkatlice kesin. Bükülü bir şırınga iğnesi kullanıldığında, küt kenar alttaki eklem kıkırdağını korumaya yardımcı olur. Medial meniskusun dengesizleşmesini gözlemleyerek başarılı bir transseksiyon doğrulan.
  4. Kesilmiş eklem kapsülü 8-0 ile kapatın emilebilir dikişler, ardından cilt kesisinin yara klipsleri veya 6-0 dikişlerle kapatılması.
    NOT: Dikiş sırasında eklem kıkırdaklarının delinmesini veya zarar görmesini önlemeye dikkat edin ve kesiyi kapatırken eklem sıkılığının düzgün şekilde korunduğundan emin olun.
  5. Hayvanın bir ısıtma pedinde iyileşmesine izin verin ve tam hareket kabiliyeti geri kazanana kadar yakından izleyin.

3. Farede MMT ameliyatı

NOT: Bu prosedür, medial kollateral bağın (MCL) kesiminden sonra medial menisküste tam bir yırtık oluşturarak OA'yı indükler ve böylece eklem instabilitesi ve ilerleyici kıkırdak dejenerasyonuna neden olur.

  1. Anestezi altındaki fareyi uygun şekilde konumlandırın ve sağ dizin üzerinde yaklaşık 6-8 mm uzunluğunda medial parapatellar bir kesi yapın.
  2. Kas katmanlarını ayırmak ve MCL'yi net şekilde ortaya çıkarmak için küt diseksiyon yapın (Şekil 2).
  3. Cerrahi makas kullanarak, MCL'yi tam olarak ortasından kesin.
  4. Kesilmiş MCL'yi nazikçe geri çekerek alttaki medial menisküsü ortaya çıkarın. İnce forseps kullanarak menisküsü kavrayıp en dar bölgesinde tam kalınlıkta bir kesim işlemi yaparak tam bir yırtık oluşuyor.
  5. Yumuşak dokuları yeniden konumlandırın ve kesiyi katmanlar halinde kapatın; kas ve fasya için 5-0 emilebilir dikişler kullanın, ardından deri kapatılması için yara klipsi veya 5-0 emilmez dikiş kullanabilirsiniz.
  6. Hayvanın iyileşmesine izin verin, adım 2.5'te açıklanan aynı prosedürü takip edin.

4. Davranışsal değerlendirmeler

  1. Ameliyattan önce başlangıç değerlendirmeleri yapın ve belirlenen ameliyat sonrası zaman noktalarında (örneğin 2, 4 ve 8 hafta) tekrar değerlendirmeler yapın.
    NOT: Operatörler arası değişkenliği en aza indirmek için, deneysel gruplamaya kör olan aynı eğitimli operatör tarafından davranışsal testler yapıldı. Her ölçüm hayvan başına üç kez tekrarlandı ve analiz için ortalama değer kullanıldı.
    1. Basitleştirilmiş mekanik çekilme eşik testi
      1. Fareleri yükseltilmiş tel örgülü platformda ayrı bölmelere yerleştirin ve test öncesi en az 30 dakika alışmalarına izin verin. Mekanik ağrı hassasiyeti daha sonra elektronik von Frey anestezimetre kullanılarak değerlendirilir.
      2. Von Frey filamenti kullanarak, probu farenin sağ arka patisinin plantar yüzeyine uygulayın vekuvveti kademeli olarak artırın.
      3. Yanıtı kaydedin, olumlu tepkinin ani pati çekilmesi, irkilme veya yalama ile gösterildiğini not edin. Zaman içinde duyarlılık değişikliklerini değerlendirmek için tutarlı bir yanıtın varlığını veya yokluğunu değerlendirin.
    2. Yürüyüş analizi
      1. Değerlendirme için otomatik bir yürüyüş analiz sistemi kullanın.
      2. Hayvanın cihazın cam yürüyüş yolundan gönüllü olarak geçmesine izin verin. Geçerli bir denemeyi, hayvanın duraklamadan sabit bir tempoda hareket ettiği bir deneme olarak tanımlayın. Sistem yazılımının pati izlerini otomatik olarak tanımlamasını ve birden fazla yürüyüş parametresini hesaplamasını bekle. Sağ (işletilen) arka uzuv için temel metrikleri, duruş fazının süresi, sallama hızı ve pati baskısı gibi temel metrikleri analiz edin ve bunları kontralateral uzuv ve sahte kontrolleriyle karşılaştırın.
        NOT: Tüm hayvanlar, temel değerlendirmeden önce günlük eğitim seanslarıyla test cihazına alıştırıldı. Her hayvan için her zaman noktası için üç koşu kaydedildi ve sadece hayvanın duraklamadan tutarlı hız sürdüğü denemeler geçerli sayıldı. Tüm ölçümler, operatörler arası değişkenliği en aza indirmek için çift kör bir tasarım altında eğitimli operatörler tarafından gerçekleştirildi ve tekrarlanan çalışmalar verilerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için ortalamaya alındı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DMM OA fare modelinin karakterizasyonu ve doğrulanması
1 haftalık bir alışma döneminden sonra, Şekil 1'de gösterilen prosedürle farelerde DMM kaynaklı osteoartrit (OA) modeli oluşturuldu. Patolojik ve davranışsal değerlendirmeler ameliyattan iki hafta sonra yapıldı. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, en belirgin dejeneratif değişiklikler medial femorotibial eklemde lokalize olmuştur. Kıkırdak dejenerasyonunun kapsamı, DMM model grubunda kontrol g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yaygın olarak kullanılan iki cerrahi OA modelinin indüksiyonu ve değerlendirilmesi için standart bir çerçeve sağlar. Bu modeller, insan travma sonrası OA'nın patofizyolojik özelliklerini yakından kopyaladıkları ve güçlü translasyonel önem sağladıkları için özellikle değerlidir. DMM modeli medial meniskosibiyal bağın kesimini içerirken, MMT modeli medial menisküsün doğrudan yırtılmasını içerir. Laboratuvarımızda, DMM prosedürü rutin olarak farelerde uygulanır; çünkü bu türde ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Araştırma Projesi (Hibe No. 2025JKJNTZ09) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 32401092) tarafından maddi olarak desteklendi. Ayrıca, bu araştırmanın başarılı bir şekilde tamamlanması için hayati öneme sahip yürüyüş analizi hizmetleri sunduğu için Hangzhou Xinyao Biotechnology Co., Ltd.'ye içten teşekkürlerimizi sunarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yürüyüş analiz sistemiŞanghay Xin Ruan Bilgi Teknolojileri A., LtdXR-FP202
LipozikOftalmik Merhem
FarelerNanjing Model Hayvanlar Enstitüsüc57/BL6
Ağrı testi sistemiŞanghay Xin Ruan Bilgi Teknolojileri A., LtdXR-XZDelektronik von Frey anesteziometresi
FareNanjing Model Hayvanlar EnstitüsüS/D

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barnett, R. Osteoarthritis. Lancet. 391 (10134), 1985(2018).
  2. Chen, S., et al. Epidemiological trends and characteristics of osteoarthritis in China during 1990-2021. J Orthop Translat. 17 (51), 218-226 (2025).
  3. Xingyan, A., Jiao, W., Ke, X., Robert Chunhua, Z., Jiacan, S. Perspectives on osteoarthritis treatment with mesenchymal stem cells and Radix Achyranthis Bidentatae. Aging Dis. 15 (3), 1029-1045 (2024).
  4. Konstantinos, H., et al. Translational genomics of osteoarthritis in 1,962,069 individuals. Nature. 641 (8065), 1217-1224 (2025).
  5. Samantha, A. Low-dose methotrexate fails to treat inflammatory knee osteoarthritis. JAMA. 334 (4), 295(2025).
  6. Zaki, S., Blaker, C. L., Little, C. B. OA foundations - experimental models of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 30 (3), 357-380 (2022).
  7. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  8. Parrish, W. R., et al. Intra-articular therapy with recombinant human GDF5 arrests disease progression and stimulates cartilage repair in the rat medial meniscus transection (MMT) model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 25 (4), 554-560 (2017).
  9. Thever, Y., Shen Xuanrong, M., Rong Chuin, T., BinAbd Razak T, H. R. Comparison of early-stage knee osteoarthritis induced by medial meniscus tear versus tibial osteotomy in the rat model. Cartilage. 15 (1), 19476035241292320(2024).
  10. Minghao, Q., et al. Pip5k1c Loss in Chondrocytes Causes Spontaneous Osteoarthritic Lesions in Aged Mice. Aging Dis. 14 (2), 502-514 (2023).
  11. Wakale, S. How are Aging and Osteoarthritis Related. Indira Prasadam Aging Dis. 14 (3), 592-604 (2023).
  12. Alicia, S., Eleri, L. F. M., Oakley, B. M., Elodie, N., Jeffrey, S. M. Normative preclinical algesiometry data on the von Frey and radiant heat paw-withdrawal tests: an analysis of data from more than 8,000 mice over 20 years. J Pain. 25 (7), 104468(2024).
  13. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  14. McAlindon, T. E., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 22 (3), 363-388 (2014).
  15. Sharifah Zakiah Syed, S., et al. Comparison of bone and articular cartilage changes in osteoarthritis: a micro-computed tomography and histological study of surgically and chemically induced osteoarthritic rabbit models. J Orthop Surg Res. 16 (1), 663(2021).
  16. Zengfa, D., et al. IRF1-mediated upregulation of PARP12 promotes cartilage degradation by inhibiting PINK1/Parkin-dependent mitophagy through ISG15 attenuating ubiquitylation and SUMOylation of MFN1/2. Bone Res. 12 (1), 63(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Osteoartrit Modelleristikrars zl k Kaynakl ModellerMedial Menisk s Y rtMedial Menisk s DestabilizasyonuPreklinik OsteoartritA r E i i De erlendirmesiY r y StabilitesiHistolojik Do rulamaEklem Dejenerasyonu
Video yakında

İlgili makaleler