Stomatal ve Epidermal Özelliklerin Peeling, Clearing ve AI Tabanlı Görüntü Analizi Kullanılarak Karakterize Edilmesi

Liisa Kübarsepp; Mait Rungi; Ülo Niinemets; Vivian Kuusk; Riccardo Scodeller; Tiina Tosens

doi:10.3791/69615

Yöntem makalesi

Stomatal ve Epidermal Özelliklerin Peeling, Clearing ve AI Tabanlı Görüntü Analizi Kullanılarak Karakterize Edilmesi

DOI:

10.3791/69615

⸱

27 Mart 2026

Liisa Kübarsepp¹ , Mait Rungi² , Ülo Niinemets²^,³ , Vivian Kuusk² , Riccardo Scodeller² , Tiina Tosens²

¹Centre of Estonian Rural Research and Knowledge, ²Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, ³Estonian Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, epidermal peeling, temizleme teknikleri ve yapay zeka destekli görüntü analizi kullanarak iki farklı türde stoma ve epidermal özellikleri değerlendirmek için karşılaştırmalı bir yöntem sunmaktadır. Amaç, tarımsal uygulamalar ve geniş bitki araştırmaları için stoma fonksiyonunun altında yatan hücresel yapıların yüksek verimlilik, tekrarlanabilir niceliklendirilmesini sağlamaktır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stoma morfolojisinin ve çevresindeki epidermal özelliklerin doğru karakterizasyonu, stoma fonksiyonunu anlamak için gereklidir. Karşılaştırmalı bir protokol, iki tamamlayıcı teknik kullanılarak — epidermal peeling ve yaprak temizleme — kullanılarak sunulmuştur; bu da iki ekolojik olarak farklı iki dikot türü olan Fraxinus excelsior ve Taraxacum officinale'de stomatal ve epidermal hücre büyüklüğünü, şeklini ve yoğunluğunu değerlendirir. Protokol, maliyet ve iş etkili manuel ölçümler (doku temizleme ve soyma) ile yüksek verimli uygulamaları kolaylaştırma potansiyeline sahip yapay zeka destekli görüntü analizi kullanılarak örnek hazırlama, görüntüleme ve özellik niceliği için ayrıntılı adımlar içermektedir. Üç segmentasyon aracı—YOLOv8 tabanlı stoma tespit modeli, hücre segmentasyonu için genel derin öğrenme aracı ve piksel tabanlı sınıflandırıcı—doğruluk ve yöntemler arasında uygunluk açısından değerlendirildi. Hem manuel hem de yapay zeka analizlerinde peeling ve temizleme teknikleri arasında stomatal ve epidermal özelliklerdeki önemli farklılıklar tutarlı şekilde gözlemlenmektedir. Yapay zeka araçları, YOLOv8 tabanlı stoma tespit modeli (StoManager1) stoma özellikleri için en iyi performans gösterdiği tekrarlanabilir nicelik sayını sağladı ve epidermal segmentasyon için hücre segmentasyonu için genel derin öğrenme aracı (Cellpose) kullanıldı. Yapay zeka tabanlı özellik tespiti T. officinale'de oldukça tutarlıydı ancak F. excelsior'da sınırlıydı; sonuçlar manuel ölçümlerden farklıydı ve türe özgü anatomi ile görüntü kalitesinin yöntemin uygunluğunu nasıl etkilediğini gösterdi. Bu bulgular, yapay zeka destekli analizin stoma ve epidermal özellik niceliği için faydalı bir çerçeve sağladığını ancak uzman doğrulama ve pilot testlerin daha geniş veya yüksek verimli uygulamadan önce hayati olmaya devam ettiğini göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stomalar, epidermisteki mikroskobik gözeneklerdir ve bitki gaz değişimi ile transpirasyonunu düzenlemede hayati rol oynarlar. Bu nedenle, stoma işlevinin morfolojik temelini anlamak, ürün performansını iyileştirmek için^{anahtardır 1}. Stoma yapısı ve fonksiyonu üzerine yapılan çoğu çalışma yalnızca stoma morfolojisine odaklanırken, stomanın tepkisinin tam anlaşılması için çevredeki epidermal hücrelerin boyutu ve şeklinin karakterizasyonu da gereklidir. Bu özelliklerin doğru nicelendirilmesi, gaz değişimi ve ürün iyileştirmesinin altında yatan yapı-fonksiyon ilişkilerini anlamak için esastır.

Ürün iyileştirmesi giderek gelişmiş gen düzenleme yaklaşımlarına dayandıkça, fotosentezi, içsel su kullanım verimliliğini ve karbon kazanımını etkileyen stomalar gibi temel morfolojik özellikleri anlamak kritik öneme sahiptir. Bu ihtiyaç özellikle devam eden çevresel değişiklikler altında acildir; çünkü hem fotosentetik kapasitesini hem de verimini koruyan dayanıklı ürünlere olan talep daha sık sık yaşanan kuraklıklar ve sıcak hava dalgaları^{karşısında artmaktadır} ^2,3. Sonuç olarak, standartlaştırılmış görüntüleme ve analiz protokollerine güçlü bir ihtiyaç vardır. Vernik/oje ile stomatal soyma, yaprak yüzeyi izleri elde etmek için stomatal ve epidermal boyut, şekil ve^yoğunluk ^4,5,6 ölçülmesinde en basit yöntemdir. Prosedürü hızlıdır, yıkıcı değildir ve örneklerin hızlı işlenmesini sağlar. Doku temizleme yöntemi, damar ağının eşzamanlı karakterizasyonuna ve yaprak hidroliklerinin daha kapsamlı karakterizasyonuna olanak tanıyan alternatif bir yaklaşımdır.

Kimyasal temizleme, dokuları yumuşatır ve optik olarak şeffaf hale getirir; böylece mekanik bozulma olmadan stoma ve epidermal hücrelerin yerinde görüntülenmesini sağlar. Temizleme, kurutulmuş veya hassas örnekler dahil olmak üzere çeşitli doku tiplerinde geniş çapta uygulanabilir ve sadece stoma görüntüleme için değil, aynı zamanda venasyon ağları, floresan görüntüleme ve iç anatomik yapıların^{görselleştirilmesi için de kullanılabilir} 7,8,9,10,11,12 , böylece stoma özelliklerinin diğer fonksiyonel özelliklerle birlikte analiz edilmesine olanak tanır. Organik çözücüler, sulu çözücüler, hiperhidrasyon veya hidrojel gömülmesi gibi çeşitli temizleme^{yöntemleri mevcuttur 13,14,15}. Bunlar süre, görüntüleme uyumluluğu ve reaktif bulunabilirliği açısından farklılık gösterir. Burada kullanılan protokol basit, maliyet etkin ve özel bir beceri gerektirmez. Her iki teknik de daha uygun fiyatlı ve hızlıdır; örneğin ışık mikroskobu veya taramalı elektron mikroskobu gibi daha emek yoğun yöntemler, örneklerin kimyasal fiksasyonu, gömülmesi ve kesimlenmesini gerektirir.

Stoma ve epidermal özelliklerin analizi için geleneksel yöntemler genellikle mikroskopik görüntülerin manuel segmentasyonuna dayanır; bu durum emek gerektiren, zaman alıcı ve gözlemci yanlılığına tabi olan, veri verimini sınırlandırır^{ve analiz hattının verimliliğini düşürür 16}. Ayrıca, trikomlar ve düzensiz hücre duvarları gibi anatomik özellikler, tutarlı özellik ölçüsünü belirlemede ek zorluklar oluşturur. Otomatik görüntü analiz araçları yüksek verimli veri çıkarımı için büyük umut sunarken, belirli bitki dokuları için optimize edilmiştir ve yaprak tipleri ile hazırlık yöntemleri arasında kolayca aktarılamazlar. Örneğin, StoManager1 (Ek Şekil 1), YOLOv8 tabanlı bir nesne algılama modeli kullanarak stomatal tespit konusunda yüksek hassasiyet sağlar ancak özellikle stomatal özellikler için eğitilmiştir. Cellpose (Ek Şekil 2), giriş verileri önceden eğitilmiş modellere (örneğin, sito, sito2) benzediğinde iyi performans gösteren, büyük, önceden eğitilmiş ve genelci bir segmentasyon modelidir; bu model başlangıçta hayvan hücreleri ve organellere dayanır. Ilastik (Ek Şekil 3), kullanıcı tanımlı açıklamalara dayanan piksel tabanlı bir sınıflandırma aracıdır. Hem Cellpose hem de Ilastik kullanıcı dostu, ancak her biri görüntü kalitesi, arka plan artefaktları ve dokuya özgü özelliklerdeki farklılıklara uyum sağlamak için yeniden eğitim veya ince ayar gerektirebilir.

Ayrıca, stoma ve epidermal morfoloji, tür¹⁷ arasında yüksek değişkenlik gösterir. Stoma yoğunluğu ve boyut gibi özellikler özellikle değişkendir, ancak genellikle ters ilişkilidir ve birlikte stoma kinetiklerinde tür farklılıklarını belirler. Daha büyük stomalar daha düşük yoğunluğu kısmen telafi edebilir, ancak genellikle daha yavaş^{kinetik gösterirler 5}; bu da giderek sıklaşan sıcak hava dalgalarında dezavantajlı olabilir; çünkü hızlı stomatal tepkiler karbon asimilasyonunu sürdürmek ve aşırı su kaybını önlemek için kritik öneme sahiptir. Toplamda bu değişkenlik, stoma özelliklerinin ölçülmesini karmaşıklaştırır ve seçilen protokolün geçerliliğini ve yapay zeka tabanlı sonuçların sağlamlığını tehlikeye atabilir.

Bu protokol, iki klasik hazırlık tekniği olan epidermal peeling ve kimyasal temizlemeler, modern yapay zeka (AI) ve makine öğrenimi (ML) araçlarıyla özellik segmentasyonu ve ölçümü için birleştirir. Farklı ekolojik stratejilere sahip iki yaygın ışık gerektiren dikot türü (F. excelsior ve T. officinale) kullanarak, stomatal ve epidermal özelliklerdeki değişkenliği inceleyerek üç yöntemin karşılaştırılmasını ve olası yanlışlıkların nerede ortaya çıkabileceğini değerlendirdik. Üç yapay zeka aracının performansı değerlendirildi: StoManager1 (STOMA tespiti için YOLOv8 tabanlı derin öğrenme modeli), Cellpose (genel derin öğrenme segmentasyon aracı) ve ilastik (epidermal dokular için piksel tabanlı sınıflandırıcı). Bu bütünleşik yaklaşım, stomatal ve epidermal özelliklerin tekrarlanabilir, yüksek verimli niceliklerini sağlar ve hem ekolojik hem de tarımsal araştırmalarda fenotipik analiz için sağlam ve ölçeklenebilir bir çerçeve sunar. Ancak, yoğun trikomlar, kalın kütiküller veya düşük hücre sınırı kontrastı gibi anatomik özellikler segmentasyon doğruluğunu azaltabilir ve soyma ve temizleme yöntemleri arasında seçim yaparken ve yapay zeka tabanlı nicelik uygulanırken dikkate alınmalıdır.

Bildiğimiz kadarıyla, epidermal soyulma ve kimyasal temizleme yaklaşımlarını, hem stomatal hem de epidermal özellik nicelendirmesi için çoklu yapay zeka tabanlı segmentasyon araçlarıyla doğrudan karşılaştıran ilk adım adım protokoldür. Klasik mikroskopi tekniklerini erişilebilir ML iş akışlarıyla birleştirerek, protokol kullanıcı önyargısını azaltır, veri verimliliğini artırır ve türler arasında tekrarlanabilir fenotiplemeyi kolaylaştırır. Bu yaklaşımı ekoloji, ürün iyileştirme ve iklim değişikliği araştırmaları için geniş çapta uygulanabilir kılar ve model yeniden eğitimi veya transfer öğrenimi yoluyla sürekli araç genişletilmesi için bir temel sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: T. officinale ve F. excelsior yapraklarının toplanması için özel izin veya onay gerekmemiştir, çünkü bu korunmayan türler halka açık bahçe alanlarından örneklenmiştir. Tüm örneklerin koleksiyonu kurumsal ve yerel yönergelere uygundu.

1. Bitki malzemesi koleksiyonu

Karşılaştırmalı analiz için sağlıklı yapraklar seçin. Mevcut deney için, zıt stoma dağılımına sahip iki dikot türün sağlıklı, güneşe maruz kalmış olgun yaprakları seçildi: yalnızca alt yaprak yüzeyinde stoma bulunan hipo stomatlı ağaç F. excelsior ve amfistomatöz çok yıllık otlu T. officinale.
Her örnek türü/konum için 3-5 kopya yaprak alın.
Yaprağı temiz makas veya jilet ile ayırın. Kesilen yaprağı hemen suya koyarak susuz kalmayı önleyin.
Toplandıktan sonra, yaprak sapını tamamen suya batırın ve 4°C sıcaklıkta saklayın.
Protokol bölümleri 2 veya 3'ü 48 saat içinde uygula.

2. Stoma izi soyulmalarının hazırlanması ve görüntülenmesi

NOT: Temizleme protokolü sırasında oluşan tüm kimyasal atıklar, kurumsal ve yerel güvenlik düzenlemelerine uygun şekilde işlenmiştir. Glutaraldehit içeren çözeltiler ayrı ayrı toplanarak tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edilmiştir. Sodyum hidroksit (NaOH) çözeltileri, izin verildiğinde bertaraf edilmeden önce pH 6-8'e nötralize edilmiştir. Sulandırılmış çamaşır suyu ve etanol çözeltisi, kurumsal ve belediye düzenlemeleriyle izin verilen yerlerde bol miktarda soğuk su ile gidere atıldı. TBO çözeltileri yerel yönergelere göre toplanıp kimyasal atık olarak bertaraf edildi. Kullanıcılar, onaylanmış bertaraf prosedürleri için kurumsal güvenlik ofislerine danışmalıdır.

Gerekirse, seçilen yaprak yüzeyini suyla nazikçe durulayarak toz veya kalıntıları temizleyin. Yaprak yüzeyini hemen filtre kağıdı veya yumuşak bir kağıt havlu kullanarak kurutarak fazla nemi giderin. Hava ile kurutmayın, çünkü bu dokunun küçülmesine ve stoma ile epidermal hücrelerin yanlış boyut ölçümlerine yol açabilir.
Mikroskop slaytı, numune detaylarıyla (örneğin, tür, yaprak tarafı ve hazırlanma tarihi) etiketleyin; böylece her örnek görüntüleme, analiz ve veri yorumu sırasında izlenebilir hale getirilebilir ve gelecekteki kullanım için uygun şekilde saklanabilir.
Bez dışı (tüylü) trikomlara sahip türler için, trikomları yaprak yüzeyinden tıraş bıçağıyla çıkarın; çünkü varlıkları hücre sınırlarını gizleyebilir ve görüntü kalitesini düşürebilir (Şekil 1).
Küçük bir fırça kullanarak, hedef bölgeye ince, eşit ve düz bir şeffaf, uzanamaz tırnak ojesi ("esneme" veya "soyulabilir" formüllerden kaçının) uygulayın. Kabuk hazırlığı için her zaman yaprak kısmının orta kısmını seçin, ucu ve tabandan kaçının.
Oje oda sıcaklığında genellikle 2-5 dakika boyunca tamamen kurumasına izin verin. Uzun süreli maruz kalma, doku renk değişikliğine (örneğin, yumuşak yapraklarda kırmızı ton) neden olabilir; bu renk son peelingde görülebilir ve düzgün renk gerektiren sonraki analizleri engelleyebilir.
Kuruduktan sonra, kaplanmış alana şeffaf bir bant şeridi uygulayın. Ojenin bir kenarından başlayın ve bandı yavaşça yüzeye serin, iyi yapışma sağlamak ve hava kabarcıkları ya da kırışıklıkları önlemek için hafifçe bastırın. Parmak izlerinden kaçınmak için nitril eldiven takın.
Bandı dikkatlice ve oje filmi (epidermal iz) soyun.
Bandı (yapışkan yüzü aşağı) temiz bir mikroskop slaytına yerleştirin, katlanma veya örtüşmeleri önleyin.
Hazırlanmış slaytları oda sıcaklığında, toz ve doğrudan güneş ışığından korunarak saklayın.
Slaytı 400x büyütme ile bileşik ışık mikroskobu altında inceleyin. Yazılım rehberine göre ve ilgili ölçekle birlikte görüntüleri kaydedin.

3. Temizlenmiş bölümlerin hazırlanması ve görüntülenmesi

Yaklaşık 1 cm² boyutunda yaprak parçalarını kesin. Tüm adımları nitril eldiven takarak ve bir duman kapüşonunun altında çalışarak yapın.
Örnekleri etiketli bir şişeye aktarın, üzerlerini sabitleyici çözeltiyle (%4 glutarik aldehit 0,1 M fosfat tamponunda %4, pH = 6,9) ile kaplayın (DİKMET) ve 4°C'de 24 saat boyunca saklayın (Fiksasyon çözeltisi hazırlamak için Tablo 1).
Sabitleyici çözeltiyi pipetle çıkarın ve örnekleri distile suyla kaplayın. 30 dakika bırakın. Üç kez tekrarlayın (Şekil 2A-C).
Suyu çıkarın ve örnekleri 1 M NaOH çözeltisiyle örtün (20 g NaOH'u 0,5 L damıtılmış suda çözün).
Yaprak temizleme sırasında NaOH çözeltisi yeşile döner. NaOH çözümünü günde bir kez taze çözeltiyle değiştirin. 3 ila 4 gün veya örnekler soluk sarıya dönene kadar devam edin ve NaOH çözeltisi berrak kalana kadar (Şekil 2D-F).
NaOH çözeltisini çıkarın ve örnekleri çamaşır suyu (%5 NaClO) ile kaplayın. Bu konsantrasyona sahip ticari ev çamaşır suyu uygundur.
Örnekleri çamaşır suyu içinde 1-2 dakika kuluçka edin. Örnekler beyaz ve saydam olacak (Şekil 2G-I).
Önceki çözeltiyi çıkarın ve örnekleri 2 dakika boyunca damıtılmış su ile kaplayın. Numuneleri aşağıdaki şekilde derecelendirilmiş damıtılmış su-etanol serisi ile kurutun: 75:25, 50:50, 25:75 ve %100 etanol.
Etanolü çıkarın ve örnekleri %3 alkollü toluidin mavi O çözeltisiyle kaplayın (TBO, 3 g TBO'yu 100 mL 100 mL etanolde çözünür). Gece boyunca ayrıl.
Boyama çözeltisini çıkarın ve örnekleri %100 etanol ile 2 dakika boyunca kaplayın. Bu adımı derecelendirilmiş damıtılmış su-etanol serisi kullanarak aşağıdaki şekilde tekrarlayın: 25:75, 50:50, 75:25 ve son olarak damıtılmış su (Şekil 2J-L). Temizleme süreciyle ilgili yaygın hatalar ve sorun giderme adımları için Şekil 3'e bakınız.
Numuneleri izlemeye kadar 4°C sıcaklıkta damıtılmış suda tutun.
Örnekleri cam slayta aktarın, bir damla damıtılmış su ekleyin ve mikroskobik görüntüleme ve görüntüleme için cam bir kapak kıvırıyla örtün.
Slaytı 400x büyütme ile bileşik ışık mikroskobu altında inceleyin. Yazılım rehberine göre ve ilgili ölçekle birlikte görüntüleri kaydedin. Daha fazla bilgi için materyaller tablosuna bakınız.

4. Görüntü analizi ve ölçümler

Görüntü işleme ve analiz için Fiji²³ (ImageJ dağıtımı, sürüm 1.54p) kullanın.
Çizgi aracını kullanarak ölçek çubuğunun üzerine bir çizgi çizin, ardından Ölçeği Analiz > Ayarlan'ı seçin, bilinen mesafeyi ölçek çubuğunun uzunluğuna göre değiştirin ve uzunluk birimini μm olarak değiştirin.
Analiz > set ölçümlerini analiz edin. Alan ve Feret'in çapı seçeneklerinin kontrol edildiğinden emin olun.
İlgilendiğiniz nesneyi belirlemek için Çokgen Seçim Aracı'nı kullanın. M tuşuna basarak ölçümü kaydedin.
Fiji'de aşağıdaki stomatal ve epidermal özellikleri ölçün ve hem temizlenmiş örnekler hem de stoma peeling'leri hesaplayın (Şekil 3).
Stoma sayısını (Ns) hesaplayın.
1. Ortalama stoma alanını (As) belirleyin.
2. Ortalama stoma genişliğini (Ws) belirleyin: Feret'in minimum çapı kullanılarak.
3. Stoma yoğunluğunu (SD) aşağıdaki formülle hesaplayın:
  
  ; Birim Ia başına (ölçüm için seçilen yaprak alanı, mm²).
4. Ortalama epidermal hücre alanını (Ae) belirleyin.
5. Epidermal hücre yoğunluğunu (ECD) aşağıdaki formülle belirleyin:

5. İstatistikler

Örnek grupları arasındaki farkları test etmek için ANOVA ve Tukey'nin HSD post-hoc testini kullanın.
R^21'deki tüm istatistiksel analizleri yapın.
Her tür için toplam 3 çoğaltılmış yaprak analiz edin ve her yapraktan 3 kabuk görüntüleyin.

6. Yapay Zeka destekli analiz

Segmentasyon için makine öğrenimi araçlarını seçin.
1. Hedef yapıya (stomata veya epidermal hücreler), görüntü kalitesine ve analiz hedeflerine göre uygun makine öğrenimi tabanlı segmentasyon araçlarını seçin.
2. Stomalara özgü derin öğrenme modeli kullanarak stomalara özgü bir derin öğrenme modeli kullanın ve epidermal hücre segmentasyonu için genel derin öğrenme veya piksel tabanlı segmentasyon araçları kullanın.
3. Belirli yazılım uygulamaları için Makine Öğrenimi Araçları ve Yazılım bölümüne (Ek dosya) bakabilirsiniz.
4. Segmentasyon performansını değerlendirmek ve yanlış pozitif potansiyel kaynaklarını belirlemek için büyük ölçekli analizden önce bir alt küme görüntü üzerinde pilot test gerçekleştirin.
Hesaplama ortamını hazırlayın.
1. 8-12 çekirdekli işlemci, en az 32 GB RAM ve en az 24 GB VRAM olan NVIDIA CUDA destekli GPU ile donatılmış bir iş istasyonu kullanın.
2. Açıklama ve görsel incelemeyi kolaylaştırmak için yüksek çözünürlüklü bir ekran (tercihen 4K) kullanın.
3. Seçilmiş tüm yazılım araçlarını geliştiricilerin talimatlarına göre kurun ve tekrarlanabilirliği sağlamak için yazılım sürümlerini kaydedin.
Makine öğrenimi analizi için görüntüler hazırlayın.
1. Mikroskopik görüntüleri TIFF veya PNG formatında içe aktarın, mümkün olduğunda 8 veya 16 bit gri tonlu görüntüler kullanın.
2. Her görüntünün görünür bir ölçek çubuğu içerdiğinden veya analizden önce mekansal olarak kalibre edilmiş olduğundan emin olun.
3. Minimum kalıntı, kıvrım veya hava kabarcıkları, hatta aydınlatma ve net tanımlanmış hücre sınırları olan ilgi çekici bölgeleri seçin.
4. Kenarları bulanık, güçlü gölgeli veya düşük kontrastlı görüntüleri hariç tutun, çünkü bunlar segmentasyon doğruluğunu azaltır.
Stoma segmentasyonu yapın.
1. Stomataya özgü derin öğrenme modeline görüntüleri yükleyin (Ek dosya bölüm 1).
2. Tür ve görüntü çözünürlüğüne göre nesne boyutu sınırları ve güven eşikleri dahil olmak üzere tespit parametrelerini yapılandırın.
3. Stoma komplekslerini segmentlere ayırmak ve stoma sayısı, alan ve Feret çapları gibi çıktı metriklerini çıkarmak için otomatik tespit çalıştırın.
4. Aşağı akış analizi için dışa aktarma segmentasyon maskeleri ve ölçüm tabloları. Segmentasyon örtülerini görsel olarak inceleyin ve gerekirse yanlış algılanan nesneleri manuel olarak dışlayın.
Epidermal hücre segmentasyonu yapın.
1. Görüntüleri genel derin öğrenme segmentasyon aracına veya piksel tabanlı bir sınıflandırıcıya yükleyin (Ek dosya bölüm 2 - 4).
2. Modeli, epidermal hücreler, hücre sınırları ve arka plan ile manuel olarak notlanmış örneklerle temsil görseller kullanarak eğitin veya ince ayarlayın.
3. Segmentasyon çalıştırmak için nesne maskeleri oluşturulabilir ve maskeleri ImageJ/Fiji veya eşdeğer görüntü analiz yazılımında post-processing için dışa aktarın.
4. Küçük yanlış pozitif nesneleri çıkarmak için boyut tabanlı veya kantil tabanlı filtreleme uygulayın ve hücre alanı ve hücre yoğunluğu gibi epidermal hücre metriklerini çıkarmadan önce görsel incelemeyle segmentasyon doğruluğunu doğrulayın.
Parametreleri belgeleyin ve kalite kontrolünü gerçekleştirin.
1. Analiz sırasında kullanılan tüm yazılım sürümlerini, parametre ayarlarını, filtreleme eşiklerini ve donanım özelliklerini kaydedin.
2. Segmentasyon kalitesini belgelemek için temsilci segmentasyon örtülerini koruyun.
3. İstatistiksel analiz veya veri raporlamadan önce otomatik segmentasyon çıktılarını görsel olarak doğrulayın.
Tüm ML işlemleri için görüntü hazırlığı
1. Örnek görüntüleme
  NOT: ML tabanlı segmentasyon, biyolojik bağlamdan ziyade yoğunluk gradyanlarına, kenar sürekliliğine ve tutarlı nesne geometrisine dayandığından, görüntü ön işleme ve bölge seçimi model performansını ve hata yapısını kritik bir şekilde belirler.
  1. Temizlenmiş veya soyulmuş yaprak yüzeylerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini bir ölçek çubuğu görünerek yakalayın. İyi makine öğrenimi iş akışları için, ölçülebilir nesnelerin görüntü boyunca keskin, sürekli ve yüksek kontrastlı olduğundan emin olun.
2. Bölge seçimi ve görüntü kalitesi
  NOT: Bölüm 6.7.1'de görüntü alındıktan sonra, görüntüler görsel olarak incelenir ve görüntü ölçeği izin verirse, artefaktsız ilgi alanları manuel olarak aşağı akış segmentasyonu için seçilir. Minimum artefaktlara sahip ilgi çekici bölgeleri seçin (örneğin, enkaz parçaları, kıvrımlar, hava kabarcıkları, düzensiz aydınlatma). Stomatal modeller için (örneğin, StoManager1), net gözenek görünürlüğüne ve iyi tanımlanmış bir koruyucu hücre siluetine öncelik verin. Epidermal modeller için (örneğin, Cellpose, ilastik), hücre konturları boyunca kararlı yoğunluk gradyanları sağlanır; Süreksiz veya düşük kontrastlı kenarlar, segmentasyon performansını önemli ölçüde azaltır. Sınırları zayıf tanımlanmış görüntüler, segmentasyondan önce dışlanmalı veya yeniden işlenmelidir.
3. Dosya formatı
  Dosyaları TIFF veya PNG formatında kaydedin (segmentasyon için 8 veya 16 bit gri tonlama önerilir).
4. İsteğe bağlı görüntü geliştirme
  1. Sınırlar zayıfsa ImageJ/Fiji'de kontrastı artırın veya arka planı çıkarın.
  2. Kenar geometrisine odaklanın, çünkü bunlar hücre sınırları olarak yorumlanan sahte gradyanlar oluşturabilir.
  3. Bu tür ayarlamaları veri setindeki tüm görsellere tutarlı şekilde uygulayın.
    NOT: Özellikle kenar geometrisine dikkat edilmelidir; çünkü gölgeler, halolar veya düzensiz arka plan gradyanları, ML modellerinin hücre sınırları olarak yanlış yorumlayabileceği yapay yoğunluk geçişleri yaratabilir.
StoManager1 (v1.0.0 GUI sürümü)
NOT: StoManager1, konvolüsyon sinir ağları (YOLOv8-seg-x) kullanılarak bitki yaprağı stomalarının otomatik, yüksek verimli tespiti, ölçümü ve analizini mümkün kılar. Araç, çeşitli görüntü türlerinden temel stomatal metrikleri (alan, yoğunluk, gözenek/koruyucu hücre oranı, toplama indeksleri vb.) nicelikle ölçüyor, manuel çabayı ve yanlılığı azaltıyor ve büyük ölçekli ekolojik ve fizyolojik çalışmaları kolaylaştırıyor. Kullanıcı dostu bir Windows uygulaması mevcuttur ve kodlama becerisi gerektirmeyen, isteğe bağlı post-processing (Ek dosya Bölüm 1)²³.
1. StoManager1 çalıştırmak: kur ve yapılandırma
  1. GitHub (https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1) veya bağımsız Windows uygulaması ((Ek dosya bölümü 1)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)²³ üzerinden erişim sağlanabilir.
  2. Uyumlu kütüphane sürümlerini (Python bağımlılıkları) emin edin; Başka bir ML/görüntü yazılımı yüklüyorsa çakışmalar oluşabilir.
2. StoManager1'i GUI veya komut satırı arayüzü üzerinden başlatın.
3. Yaprak görselleri içeren giriş dizininizi seçin.
4. Model seçimi; Segmentasyona dayalı ve daha ayrıntılı metrikler için YOLOv8-seg-x modeline göz atın. Sınırlı kutu modeli (YOLOv3) için işaretsiz tutun, daha az metrik.
5. Parametre ayarı; Görüntüleme modalite/türü için tespit eşiklerini, görüntü çözünürlüğünü, maske genişlemesini ve nesne boyutu sınırlarını ayarlamak için ihtiyacın olduğunda ayarlayın. Bazı stoma nesneleri tespit edilmediğinde varsayılan parametreleri kullanın, özellikle (1) yanlış pozitif tespit için daha fazla gerçek stomaları kurtarmak için tespit güven eşiğini düşürün; ve (2) görüntü çözünürlüğünü artırır; çünkü daha büyük değer, küçük stomaların tespitini artırabilir ve bunun bedeli daha yüksek hesaplama talabına yol açabilir.
6. Koşu segmentasyonu:
  1. " Süreci Başlat" seçeneğine tıklayarak stomaları ve tüm stomaları tespit edin, segmente alın ve ölçün.
  2. Grup düzeyinde istatistikleri işlemek için " İstatistiksel Analiz" tuşuna tıklayın.
7. Sonuçları toplayın. Çıkış YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/ (segmentasyon modu) veya doğrudan YOUR_OUTPUT_PATH (sınırlayıcı kutu modu) olarak kaydedilir. CSV dosyaları, nesne başına ve özet metrikleri içerir; Maskeler ve sonuç görüntüleri de üretilir.
8. Fırlatma parti işleme.
9. Tamamlandığında, çıktıyı toplayın: segmentasyon maskeleri ve görüntü başına CSV sonuç dosyaları. Görüntü başına sonuçlar şunları içerir: Stoma sayısı ve stoma alanı, Feret çapı (maksimum/min), koruma hücresi metrikleri, toplanma/eşitlik/ayrışma indeksleri ve gözenek/koruyucu hücre oranları.
10. Daha fazla istatistik ve görselleştirme için Excel, R veya Python kullanarak çıktıları inceleyin.
11. kalite kontrolü; Maskeleri ve üst üstleri görsel olarak inceleyin. Gerekirse boyut, şekil veya manuel küratlama ile dışarı çıkacak nesneleri kaldırın (aşağıya bakınız).
  NOT: Cellpose ve ilastik için ayrıntılı protokoller ve sonradan işleme adımları Ek dosyada sunulmaktadır. Büyük veri setleri ve karmaşık görüntülerle en iyi performans için, 8-12 çekirdekli işlemci, en az 32 GB RAM ve en az 24 GB VRAM olan NVIDIA CUDA özellikli GPU içeren bir sistem öneriyoruz. Etkili notlama ve görselleştirme için büyük, yüksek çözünürlüklü bir ekran (tercihen 4K) da şiddetle tavsiye edilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Soyma ile temizleme arasındaki sonuçların karşılaştırılması

Hem T. officinale hem de F. excelsior, örneklerin temizlenmesine veya soyulmasına bağlı olarak stomatal ve epidermal özelliklerde değişkenlik göstermiştir (Şekil 4). Temizlenmiş örnekler genellikle daha keskin hücre sınırları ve koruyucu hücre şekli ile gözenek açıklığının daha net görselleştirilmesini sağladı, ancak örtüşen doku katmanları zaman zaman daha küçük stomaları ve yukarıya doğru önyargılı boyut tahminlerini gizledi. F. excelsior'da, ortalama stoma alanı ve stoma genişliği temizlenmiş örneklerde peelinglere göre belirgin şekilde daha yüksekken, T. officinale'de anlamlı fark gözlemlenmemiştir. F. excelsior'un soyulmuş örneklerinde stoma yoğunluğu anlamlı şekilde daha yüksekken, T. officinale'de yöntem etkisi tespit edilmedi. Her iki türde de epidermal hücre alanı yöntemler arasında farklılık göstermemiş, ancak F. excelsior'un soyulmuş örneklerinde epidermal hücre yoğunluğu biraz daha yüksekti.

Genel olarak, yönteme bağlı farklılıklar özellik ve türe özbürünmüştü; bu da soyulmanın stomaların boyut olarak değiştiğinde (örneğin, gelişen yapraklarda) stoma ölçümleri için güvenilir bir seçenek sağladığını, epidermal özelliklerin ise büyük ölçüde etkilenmediğini göstermektedir (Şekil 5).

Yapay zeka sonuçları ve bunların soyulma ve temizleme yöntemleriyle nasıl uyum sağladığı

Stomataya özgü model StoManager1, soyulmuş görüntülerde stomaları daha güvenilir şekilde tespit etti (Şekil 6), temizlenmiş örneklerde performans belirgin şekilde düştü (Şekil 7). StoManager1'in hazırlık yöntemlerindeki performansını daha iyi değerlendirmek için, hem peelingler hem de temizlenmiş görüntülerle T. officinale ve F. excelsior'da stoma özellik tespitini karşılaştırdık (Şekil 8). T. officinale'de model, hazırlık yöntemlerinde stomaların varlığını ve yoğunluğunu güvenilir şekilde tespit etti. Ancak, elde edilen değerler manuel ölçümlerden (Tablo 2 ve Şekil 5 ile 8) önemli ölçüde farklıydı. Çoğu stomatal özellik, soyulmuş ve temizlenmiş örnekler arasında önemli ölçüde farklılık gösterdi (p < 0.05) (Şekil 8), bu da yapay zeka tespit hatlarının hazırlık yöntemlerine karşı son derece hassas olduğunu ve büyük ölçekli uygulamadan önce dikkatli doğrulama gerektirdiğini gösterir. Buna karşılık, F. excelsior'da adaksiyal stomatların olmaması nedeniyle tespit abaxial yüzeyle sınırlıydı ve temizlenmiş örneklerde tespit tutarsızdı ve sık sık yanlış pozitifler çıktı (Şekil 8). Bu sonuçlar, türe özgü anatomik özelliklerin ve görüntü kalitesinin yapay zeka tabanlı analizlerin etkinliği üzerindeki güçlü etkisini ortaya koymaktadır. Cellpose (Şekil 9A) ve Ilastik (Şekil 9B) gibi genel makine öğrenimi araçları, peeled üzerinde epidermal hücreleri temizlenmiş görüntülere göre daha etkili segmentli yapar. Ancak, her iki araç da özellikle düşük kontrastlı koşullarda veya hücre konturları bulanıklaştığında, her iki hazırlık tekniğinde (soyma ve temizleme) çok sayıda yanlış pozitif üretti. Bu tür durumlarda, belirsiz stomatal veya epidermal konturlar genellikle birden fazla küçük cisme bölünmüş ve yanlış bireysel epidermal hücre olarak sınıflandırılmıştır ( bkz. Şekil 10). Sonuç olarak, sadece dışnamaların çıkarılması değil, aynı zamanda güvenilir şekilde tanımlanmış hücrelerin korunması için üst kantitlerle filtreleme de gereklidir.

Şekil 1: F. carica yapraklarının stomatal kabukları, trikomların jilet kullanılarak çıkarılmasından önce ve sonra. Büyük trikomlar kabukta izler bırakabilir, bu da düzensiz yüzeylere yol açan hava cepleri oluşturabilir ve tutarlı odaklanmayı engelleyebilir (büyük gri noktalar olarak görünür). F. carica ise protokolü tüylü yapraklara genişletmek için istisna olarak dahil edilmiştir. (A) 200x büyütmede, trikrom çıkarmadan önceki görüntü trikrom izleriyle kısmen engellenmiştir. (B) Trikrom kaldırıldıktan sonra görüntü kalitesi iyileştirilir. (C) Trikrom çıkarmadan önceki 400x büyütme görüntüsünde, trikrom izleri büyük ölçüde engellenir. (D) Tıraş bıçağıyla trikrom çıkardıktan sonra görüntüde tıkanıklık minimumdur. Ölçek çubukları 100 μm (A, B) ve 50 μm (C, D). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Temizleme protokolünün ardışık adımları. T. officinale, F. excelsior ve F. carica'nın temsilci görüntüleri, temizleme protokolünün ardışık aşamalarını gösterir. (A-C) Taze yapraklar. (D-F) NaOH ile anlaşmadan sonra ayrılıyor. (G-I) NaClO ile ağarttıktan sonra ayrılıyor. (J-L) toluidin mavisi O ile boyadıktan sonra yaprak değiştirir. Bu görsel yardım, bir sonraki adıma geçmeden önce beklenen örnek görünümünü gösterir ve türler arasındaki protokol değişkenliğini vurgular. F. carica, daha geniş bir yaprak ve venasyon morfolojisi yelpazesinde protokol uygulanabilirliğini göstermek için istisna tür olarak dahil edilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Stoma ve epidermal özelliklerin örnek ölçümleri. Ölçülen özellikler görüntüde şu şekilde gösterilmiştir: As = stoma alanı; Ls = stoma uzunluğu; Ws = stoma genişliği; Ae = epidermal hücre alanı. Protokolde tanımlandığı gibi, işaretlenen alan içinde stoma yoğunluğu ve epidermal hücre yoğunluğu hesaplandı. 400x büyütme ile görüntü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Temizleme protokolü ve soyulma protokolü ile elde edilen görüntülerin karşılaştırılması. T. officinale ve F. excelsior'un temsil görüntüleri, boşalma ve stoma peel görüntülerini karşılaştırarak stoma ve epidermis hücre büyüklüğü ve yoğunluğunun görünürlüğünü ve değişkenliğini göstermektedir. Ölçek çubuğu 50 μm ve görüntüler 400x büyütmede çekilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Temizleme ve soyma protokolü arasındaki manuel özellik ölçüm sonuçlarındaki farklılıklar. T. officinale ve F. excelsior'da temizleme ve epidermal peeling yöntemleri arasındaki stomatal ve epidermal özelliklerdeki farklılıkları gösteren kutu grafikleri. (A) Ortalama stoma alanı, (B), ortalama stoma genişliği, (C), stoma yoğunluğu, (D), ortalama epidermal hücre alanı ve (E) epidermal hücre yoğunluğu. Yıldız işaretleri istatistiksel anlamlılık seviyelerini gösterir (P < 0.05; *P < 0.01; **P < 0.001). İstatistiksel anlamlılık tek yönlü ANOVA kullanılarak değerlendirildi ve ardından Tukey'nin HSD post-hoc testi yapıldı. Grup başına örneklem büyüklüğü: n = 3-5. Kısaltmalar: As = stoma alanı; Ws = stoma genişliği; SD = stoma yoğunluğu; Ae = epidermal hücre alanı; ECD = epidermal hücre yoğunluğu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Kabuk örneği üzerinde stoma tespit modeli kullanılarak segmentasyon sonuçlarına örnek. T . officinale'nin soyulmuş bir örneği için StoManager1 segmentasyon sonucu (olgun gölgeye maruz kalmış bir yaprağın alt tarafı) iyi tespit doğruluğu gösterdi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Temizlenmiş örnekte stoma tespit modeli kullanılarak segmentasyon sonucu örneği. T . officinale (olgun gölgeye maruz kalmış bir yaprakın alt tarafı) temizlenmiş bir örnek için StoManager1 segmentasyon sonuçları, soyulmuş örneklere kıyasla daha düşük tespit doğruluğunu göstermiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Temizleme ve soyma protokolü arasındaki yapay zeka destekli özellik ölçüm sonuçlarındaki farklılıklar. StoManager1 tarafından T. officinale ve F. excelsior'da işlenen görüntülerden yapay zeka kaynaklı stoma anatomik özelliklerinin ölçümlerini gösteren kutu grafikleri. Özellikler arasında stoma alanı (As), stoma genişliği (Ws), stoma uzunluğu (Ls) ve stoma yoğunluğu (Ds) bulunur. Birimler Şekil 5'teki gibidir. İstatistiksel anlamlılık tek yönlü ANOVA kullanılarak değerlendirildi ve ardından Tukey'nin HSD post-hoc testi yapıldı. Yıldız işaretleri istatistiksel anlamlılık seviyelerini gösterir (P < 0.05; *P < 0.01; **P < 0.001). Grup başına örneklem büyüklüğü: n = 3-5. Kısaltmalar: As = stoma alanı; Ws = stoma genişliği; Ls = stoma uzunluğu; Ds = stomatal yoğunluk. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Genel derin öğrenme aracı ve piksel tabanlı sınıflandırıcı ile segmentasyonu gösteren ekran görüntüleri. (A) genelci derin öğrenme aracı (Cellpose (cyto2)) ve (B) piksel tabanlı sınıflandırıcı (ilastik) ile soyulmuş F. excelsior örnek (abaxial yaprak yüzeyi) segmentasyonları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: F. excelsior'un soyulmuş bir örneği için ilastik segmentasyon maskesi (yaprak abaxial tarafı), çok sayıda yanlış pozitif gösteriliyor. Küçük noktalar yanlış olarak ayrı epidermal hücreler olarak sınıflandırılır. Sonra-işleme sırasında, yanlış pozitifleri etkili bir şekilde filtrelemek için boyut bazlı eşikler belirlemek için manuel (görsel) inceleme gereklidir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Çözüm	Hazırlık	Son cilt
Buffer 1 için temel	200 mL dist. H₂O	200 mL
Buffer 2 için temel	7.12 g Na₂_{HPO 4} *2H₂O) 200 mL dist. H₂O	200 mL
Fosfat tamponu	36 mL taban 1, 14 mL baz 2 + 50 mL dist karıştırın. H₂O	100 mL
Fiksatif çözüm	9,25 mL %5 glutaraldehit ile 12,5 mL fosfat tamponu ve 28,25 mL dist karıştırın. H₂O	50 mL

Tablo 1: Çözüm 24'ü sabitleme tarifi. Bu çalışmada kullanılan çözeltilerin bileşimi.

Türler	Yan Takım	Yöntem	Man (As)	Yapay Zeka (As)	Adam (K)	Yapay Zeka (Zek)	Adam (Ls)	Yapay Zeka (Ls)
Fraxinus	Abaxial	Peel	177.43	9.32	12.71	2.85	17.58	3.58
Taraxacum	Abaxial	Temizlendi	408.09	18.84	20.1	4.19	26.14	5.39
Taraxacum	Abaxial	Peel	262.54	13.93	15.18	3.47	22.2	4.68
Taraxacum	Adaxial	Temizlendi	414.48	14.91	20.11	3.44	26.09	5.71
Taraxacum	Adaxial	Peel	258.72	11.37	15.72	3.3	21.15	4.08

Tablo 2: Manuel ölçümler ve yapay zeka üzerine gösterge karşılaştırmaları. ML (StoManager1) sonuçları ölçeklendirdi. İnsan ve yapay zeka, buna karşılık manuel ve yapay zeka (StoManager1) sonuçlarını gösterir. Birimler Şekil 5'teki gibidir. Manuel ve yapay zeka ölçümleri önemli ölçüde farklılık gösterir. Bazı karşılaştırmalar çeşitli nedenlerle mevcut değildir; örneğin, eksik stomalar (örneğin, adaxial F. excelsior) veya başarısız tespit (örneğin, stomataların temizlenmiş örneklerde bulanık hücre konturları nedeniyle tespit edilmesi daha zordu).

Ek şekil 1: Yaprak temizleme sırasında ortaya çıkan ve sonuçları etkileyen yaygın hatalara örnekler. Sorun giderme amacıyla gösterilen görseller: (A) 3.10. bölüm sırasında numunenin eksik rehidrasyonu nedeniyle düzensiz boyama; (B) kimyasal olarak işlenmiş çok hassas numunenin yanlış işlenmesinden kaynaklanan mekanik hasar; (C) 3.5. bölüm sırasında klorofilin tam olarak alınmaması nedeniyle numunenin ortasında yeşil ton. Bu şekliği indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek şekil 2: StoManager1 kullanıcı arayüzü örneği. StoManager1 kullanıcı arayüzünün ekran görüntüsü, giriş kurulumu ve sonuçlar tablosu (solda) ve orijinal görüntülerle mikrograf görünümleri (sağ üst) ve stoma tespit üst katmanı (sağda altta, T. officinale soyulmuş örneğinin adaksiyal yüzeyi). Bu şekliği indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek şekil 3: Cellpose kullanıcı arayüzü örneği. Ayarlanabilir parametrelerle (örneğin, model seçimi - önerilen önceden eğitilmiş cyto2 modeli veya özel eğitimli model, eşikler ve hücre çapı kalibrasyonu) GUI üzerinden devam eden Cellpose segmentasyonunun ekran görüntüsü. Epidermal hücrelerin denetimli manuel notasyonu, model kalibrasyonunu yönlendirmek için her hücreyi benzersiz bir renkte vurgular. Üst üst, F. excelsior abaxial epidermal kabuğunun segmentasyonunu gösterir. Bu şekliği indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek şekil 4: Ilastik segmentasyon süreci. Overlay, F. excelsior abaxial epidermal peel görüntüsünde piksel tabanlı sınıflandırmayı gösterir. (A) Manuel etiketlenmiş sınıflarla denetimli eğitimi gösteren ilastik segmentasyonun ekran görüntüsü: epidermal hücreler (sarı), hücre konturları (mavi) ve trikomlar (kırmızı) gibi epidermal olmayan arka plan gösteriliyor. (B) Sadece epidermis sınıfını (sarı) gösteren ekran görüntüsü, sınıflandırıcının bireysel epidermal hücreleri nasıl izole ettiğini gösterir. Özellikle düşük kontrastlı veya düzensiz aydınlatma bölgelerinde, birden fazla yanlış pozitif "minik" algılama varlığına dikkat edin. (C) Sadece kontur sınıfını (mavi) gösteren ekran görüntüsü, sınıflandırıcının hücre sınırlarını çevredeki epidermal dokudan nasıl izole ettiğini gösterir. Bazı konturların kesintili olduğunu ve özellikle düşük kontrastlı veya düzensiz aydınlatma bölgelerinde birden fazla yanlış pozitif "küçük" algılamanın gerçekleştiğini unutmayın. (D) Arka plan sınıfını gösteren ekran görüntüsü. Maske, stoma komplekslerini, bez trikomlarını ve çeşitli kalıntıları (kırmızı) vurgularken, epidermal hücre gövdelerini hariç tutar. Epidermal bölgelerde, gri tonlu artefaktlar ve doku temelli yanlış sınıflandırmadan kaynaklanan çok sayıda küçük yanlış pozitif "minik" tespiti görülür. Bu şekliği indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek şekil 5: Cellpose eğitim ayarları. Temizlenmiş bir T. officinale örneği için (her iki yaprak yüzeyi) için Cellpose eğitim ayarları (GUI) örneği, ayarlamadan önce varsayılan model parametrelerini gösteriyor. Önceden eğitilmiş cyto2 modeli seçilir; öğrenme oranı 0.1 ve 100 eğitim epoşu (varsayılan değerler) olarak belirlenir; bu modeller model ağırlıklarının güncellenme hızını ve eğitim geçiş sayısını belirler. Bu varsayılan değerler genellikle değiştirilir (örneğin, öğrenme hızı = 0.15; epochs = 12) ve böylece eğitim süresini kısaltmak ve modeli bitki epidermal morfolojisine uyarlamak için kullanılır; Ancak, daha düşük dönem sayıları tespit performansını düşürebilir ve yanlış pozitifleri artırabilir. Bu şekliği indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek şekil 6: Cellpose "etiketleri" maskesi. Soyulmuş bir F. excelsior örneği (abaxial yaprak yüzeyi) için Cellpose "etiketleri" maskesi uygulanır; bu yöntem, her segmentli nesneye benzersiz bir tanımlayıcı atandığı denetimli eğitimin sonucunu gösterir. Epidermal hücreler (e işareti) baskındır, stoma koruyucu hücre çiftleri (g işareti) de tespit edilir. Yanlış pozitifler, trikromların epidermal hücreler (üst sol) veya stoma (alt merkez) olarak yanlış sınıflandırıldığı durumlarda, ayrıca epidermal hücrelerin görüntünün bazı bölümlerinde etiketlenmemiş kaldığı yanlış negatifler de görülür. Bu maske tipi, denetli modellerin aşağı akış niceliği ve iyileştirmesi için kullanılır. Bu şekliği indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek şekil 7: ImageJ/Fiji'de segmentli epidermal hücrelerin nicelendirilmesi. Soyutulmuş bir F. excelsior örneği (abaxial yaprak yüzeyi) için ilastik piksel sınıflandırması sonrası segmentli epidermal hücre niceliklerini gösteren ekran görüntüleri. (A) Dışa aktarılan maskede, tespit edilen her piksel kümesi tek bir parçacığı temsil eder ve böylece nesne düzeyindeki metriklerin (örneğin, alan, çevre, Feret çapları) otomatik olarak çıkarılmasını sağlar. Sonuçlar penceresi (altta) binlerce nesne için ham ölçümleri gösterir; "minik" nokta gürültüsü ve parçalı konturlardan kaynaklanan olağanüstü sayıda küçük parçacığı not edin; bu da çok sayıda yanlış pozitif varlığını gösterir. Bu eserler, gerçek epidermal hücreleri izole etmek için sonraki biyolojik olarak bilgilendirilmiş filtreleme gerektirir, böylece sonraki istatistiksel analiz yapılır. (B) ImageJ/Fiji'de ilastik-segmentli epidermal nesnelerin alan bazlı filtrelenmesi. Küçük parçalar ve gürültü, minimum alan eşiği 150-350 μm² uygulanarak hariç tutulur; bu da tespit edilen parçacık sayısını, panel A'daki filtrelenmemiş maskeye göre yaklaşık bir büyüklük mertebesi (on katı) azaltır. Bu filtreleme adımı küçük yanlış pozitifleri önemli ölçüde ortadan kaldırsa da, kusurlu sınıflandırma devam ediyor: parçalanmış konturlar ve kalıntı epidermal olmayan unsurlar kalıyor ve dairesellik eşikleri veya biyolojik olarak bilgilendirilmiş post-tarama gibi ek iyileştirmeler gerektiriyor. Bu şekliği indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek şekil 8: ImageJ/Fiji'de bir Cellpose "etiket" maskesinin sonradan işlemesi. Soyulmuş bir F. excelsior örneği (abaxial yaprak yüzeyi) için Labels to ROIs eklentisi kullanılarak, maskedeki her segmentli nesne ilgi alanına (ROI) dönüştürülür; böylece epidermal hücreler ve stoma koruma hücre komplekslerinin bireysel incelenmesi ve ölçülmesi mümkün olur. Yatırım getirisi orijinal mikrografın (solda) üzerine bindirilirken, Sonuçlar penceresi (alt sağda) hücre düzeyindeki metrikleri (örneğin, alan, Feret çapları, çevre) gösterir. Bu adım, biyolojik olarak bilgilendirilmiş kürasyon sağlar; kullanıcıların her ROI'nin gerçek bir epidermal hücreye karşılık gelip etmediğini doğrulamasını ve eşik filtrelemeden sonra kalan trikomlar veya yanlış segmentlenmiş stomalar gibi artefaktları atarak sonraki analiz adımlarını bilgilendirir. Bu şekliği indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutarlı stoma ölçümleri için standart sonuçlar için merkezi laminadan peelingler alınmalıdır; büyük damarlardan kaçınılmalıdır; çünkü stoma yoğunluğu yaprak içi güçlü bir varyasyon gösterir ve yaprak tabanı, ucu ve kenarlara^{doğru azalır 25,26}. Taze yapraklar, bozulma veya parçalanma önlemek için küçülmeyen, şeffaf oje ve yüksek kaliteli şeffaf bant kullanıldığı sürece en güvenilir peelingleri sağlar. ~12 saatin üzerindeki gecikmeler, dehidrasyon yoluyla kontur berraklığını azaltır. Peelingler geçici olarak monte edildiği ve havayı hapseyebildiği için erken görüntüleme önerilir, ancak kalite bir ay sonra da kabul edilebilir kalır.

Belirli doku tipleri, görüntüleme hedefleri ve güvenlik nitelikleri için çeşitli temizleme yöntemleri^mevcuttur 13,14,15. Kimyasal temizleme, erişilebilirliği, düşük toksisitesi ve yaprak türleri arasında geniş uygulanabilirliği nedeniyle sulu NaOH tabanlı bir protokol kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Doku yanıtları türler arasında değişiklik gösterdiği için test ve optimizasyon gereklidir. Sklerofillöz yapraklar ≥2 hafta sürebilir ve kalan yeşil doku boyamaya engel olabilir ve anatomik özellikleri gizleyebilir (Ek şekil 1C). Daha hızlı temizlenme için NaOH konsantrasyonu 2,5 M veya 5 M'ye çıkarılabilir. Yumuşak yapraklar ağartmadan sonra kırılgan hale gelir (Bölüm 3.7; Ek şekil 1B) ve sodyum hipoklorit'e (NaClO) aşırı maruz kalma dokuyu bozabilir veya epidermal tabaka ayrılmasına neden olabilir. Çoğu yumuşak yaprak için 30 saniye ile 2 dakika ağartma yeterli olsa da, daha dayanıklı türler 1 saat²⁷ saniyeye kadar sürebilir. Temizleme, kabuk hazırlığından daha yavaştır, ~5 gün gerektirir ve özel bir eğitim gerektirmez, ancak çeşitli türlere göre ayarlanabilir. Temizlenmiş ve boyalı örnekler, damıtılmış suda 4°C sıcaklıkta saklanabilir; uzun süreli koruma için kalıcı montaj önerilir^15,27.

Stomata'ya özgü StoManager1, çoğu görüntü tipinde stoma komplekslerini güvenilir şekilde tespit etti (Ek şekil 2), tespit sonuçları genellikle peeling tabanlı yöntemler için manuel notlama ile tutarlıdır. Ancak, stoma alan ölçümleri manuel ölçümlerden sistematik olarak farklıydı (Tablo 2), bu da büyük ölçekli analizden önce küçük bir elle ölçülen alt küme (örneğin, tür başına 10-20 stoma) temel kalibrasyon gerektiriyordu. StoManager1, standart olmayan durumlarda manuel doğrulama gerektirdiğinde veri verimliliğini önemli ölçüde artırır.

Eşzamanlı stoma-epidermis segmentasyonu zordur çünkü optimal keskinlik farklıdır ve morfoloji ile membran berraklığındaki heterojenlik segmentasyon hatasına yol açar. Büyük görüntü setlerinde (örneğin, adaksial/abaxial yüzeyler, soyulmuş/temizlenmiş) eğitim de özgüllüğünü kaybeder. Bitki epidermisi için önceden eğitilmiş bir Cellpose modeli yoktur; Standart "Cyto" ve "Cyto2" modelleri, ağırlıklı olarak hayvan hücrelerine eğitilmiş, epidermal görüntülerde düşük performans gösterir. Bu nedenle güvenilirlik için özel eğitim gereklidir (Ek bölüm 2). Eğitimden sonra bile, aşırı segmentasyon ve yanlış pozitifler özellikle düşük kontrastlı veya temizlenmemiş görüntülerde yaygın kalır (Ek Şekil 3).

ilastik'te (Ek bölüm 3, ek şekil 4), hedef hücre sınıfları için nesne maskeleri oluşturulmalıdır (örneğin, epidermis için sınıf 1), sınıf maskeleri ise denetim ve manuel düzeltme için korunmalıdır. Toplu işleme ve ardından gelen ImageJ/Fiji iş akışları, zaman kazandırabilir ve manuel hataları azaltabilir. Alan, standart sapma veya kuantillere göre tutarlı filtreleme, gürültü ve sahte tespitleri bastırmak için gereklidir. Filtreleme sonrası, medyan hücre alanı ve hücre sayıları manuel değerlere yaklaşır. Manuel ölçümler ve alternatif makine öğrenimi araçları (Weka, RootPainter) ile karşılaştırma, parametrelerin ayarlanması ve segmentasyon kalitesinin değerlendirilmesi için hayati olmaya devam ediyor. ML toplu işleme kaynak yoğun bir süreçtir. Kararlı eğitim ve büyük ölçekli toplu segmentasyon, NVIDIA CUDA özellikli GPU ve ≥32 GB RAM gerektirir. Orta seviye sistemlerde (örneğin, entegre grafikli 16 GB RAM), denetimli eğitim genellikle <10 görüntü için ~5-10 dakika gerektirir ve birden fazla annotasyon sınıfı veya heterojen görüntü türü kullanıldığında sık sık çöker. CUDA, işlem hızını CPU veya entegre GPU çalıştırmaya göre ~10-20 kat artırdı.

Cellpose, ilastik ve StoManager1 arasındaki performans farklılıkları, onların farklı özellik temsillerinden kaynaklanır. Cellpose, nesne merkezlerine doğru vektör akış alanlarını öngörür ve akışı bozan ve temizlenmiş F. excelsior'da yanlış pozitif kümeleri oluşturan optik halolar ile ani kırılma sınırlarına karşı duyarlıdır. Ilastik, insan rehberliğinde bir piksel sınıflandırıcı olarak, arka plan olarak açıkça etiketlenmedikçe yüksek rölyefli kaldırım hücre duvarlarını veya halelerini aşırı segmentlere ayırır. StoManager1, nesne düzeyinde şekil desenleri (merkezi gözenekli koruyucu hücreler eşleştirilmiş) kullanarak stoma komplekslerini tespit eder ve F. excelsior²⁸; ancak halo kaynaklı bulanıklaşma, temizlikte gözenek görünürlüğünü etkiler ve yanlış sınıflandırma yerine yanlış negatifler üretir (Ek dosyabölüm 1 ve 3). Buna göre, Cellpose ve StoManager1 otomatik segmentlerci olarak çalışırken, ilastik insan yönlendirilen bir sınıflandırıcı olarak işlev görür (Ek dosyabölüm 1-3)^28,28^.

Türe özgü hücre mimarisi, yapay zeka performansını modüle eder. T. officinale'de, pürüzsüz, eliptik koruma hücresi marjları StoManager1 eğitim dağılımıyla eşleşerek soyulmuş örneklerde tespit yapılmasını mümkün kılmıştır (Ek şekil 2), oysa genel araçlar genellikle koruma ve kaldırım hücrelerini karıştırmıştır. F. excelsior'da, geri çekilmiş stomalar ve yüksek kabartma kaplama hücreleri temizlenmiş görüntülerde yanlış negatiflere yol açar. Bu tutarsızlıklar, tür ve hazırlık bağımlısı görüntüleme geometrisini yansıtır. Manuel ve yapay zeka kaynaklı ölçümler arasındaki sistematik farklılıklar iki kaynaktan kaynaklanır: yapay zeka tarafından görüntüden ölçek kodlamasının olmaması ve hazırlık kaynaklı optik eserler. Azaltma stratejileri arasında doku hazırlığından elde edilen bulanıklık ve haloların görsel triyajı, yukarıda açıklanan koşullarda peelingin tercihli kullanımı, küçük bir stoma alt kümesinde doğrusal düzeltme ile manuel kalibrasyon (manuel = a + b × AI) yer alır. Ek stratejiler arasında taksona özgü artırma ve yardımcı sınıf tasarımı (ancak kendi eğitimi büyük ve çeşitli veri setlerinde önceden eğitilmiş modellerden daha düşük kalabilir) ve segmentasyon sonrası üst kuantiller filtrelenmesi yer alır.

Yapay zeka segmentasyon hataları sistematik ve rastgele olmadığı için, sonradan işleme gereklidir. Görüntü kalitesi tanılaması basit bir karar ağacını takip edebilir. Epidermal kontrast ve keskinliği kontrol ederek başlayın: keskinse, yanlış pozitiflere geçin; bulanıksa, küçük yüksek frekanslı artefaktlar bekleyin ve filtreleri ayarlayın. Yanlış pozitifler (örneğin, noktalar, döküntü) minimumsa, ±2-3 SD outlier filtreleme genellikle yeterlidir. Küçük eserler baskınsa, quantil tabanlı filtreleme kullanın. Sonra özellik dağılımlarını (örneğin, medyan Ae) biyolojik beklentiler veya manuel verilerle karşılaştırın. Eşikleri gerektiğinde iyileştirin - eser açısından zengin veri setlerinde yalnızca üst %10-50 kuantilleri tutmak anlamlı çıktılar sağlar (Ekşekiller 7 ve 8). Epidermal ML araçlarının yüksek yanlış pozitif oranları nedeniyle, güvenilir stoma yoğunluk tahminleri otomatik olarak türetilemezken, StoManager1 sınırlar netleştiğinde kesin stomatal^{ölçümler 28} sağlamıştır ( bkz. Şekil 6 ve 7). Epidermal medyan için Ae sağlam çıktı; küçük yanlış pozitiflere ortalamadan daha az duyarlıdır.

Yöntem seçimi özellik tespitini etkiledi. Soyulma, stoma yoğunluğu açısından temizlemeyi tamamen açığa çıkararak (Şekil 3) daha iyi performans gösterirken, temizleme genellikle katmanlı veya pigmentli dokularda daha küçük stomaları gizlemiştir, ancak bazen stoma şeklini daha iyi^{korurdu 27}. Yapay zeka araçları arasında, StoManager1 özellikle peel preparatlarında minimum kürasyonla sağlam stoma^{ölçümleri sağladı 23} ve peeling, doğru tanımlanmış hücreleri ve görüntü kapsamını artırarak epidermal ölçümleri^{iyileştirdi 2}. Gelecekteki kazanımlar, ekofizyoloji ve ürün iyileştirmesi için otomatik görüntüleme boru hatlarına entegre edilecek büyük, taksonomik olarak çeşitli önceden eğitilmiş modellerden kaynaklanacaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Avrupa Birliği H2020 Programını (proje GAIN4CROPS, GA no. 862087) kabul etmektedir. AgroCropFuture Agroekoloji ve gelecekteki iklimlerde yeni ürünler (Estonya Eğitim ve Araştırma Bakanlığı), Estonya Araştırma Konseyi (PRG 3201 ve PRG 2207 ve TARISTU24-TK28).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dezenfektan sıvı temizleyici NaClO < 5%	Domestos, GB	H000023244	Cilt yanıkları
Disodyum hidrojen fosfat dihidrat (Na₂HPO₄^. 2H₂O)	PENTA, CZ	10028-24-7	NA
Etanol, abs. %100 a.r.	Chem-Lab NV, BE	CL00.0505.1000	Son derece yanıcı ve bpsp;
Cam şişe 2 mL	VWR Yaşam Bilimleri, ABD	548-0045
Glutaraldehit %50 çözeltisi	VWR Yaşam Bilimleri, ABD	23H2856331	Solulursa ölümcül. Yutulduğunda toksiktir. Koruyucu eldiven takın, vb. giyim, gözlükler.
Mikroskop slaytları	Normax, PT	5470308A	NA
Tırnak bakım üst kat hızlı kuruyan	BK (INEZA), TEĞMEN	LT-02244	NA
Nikon Eclipse E600 ve Nikon DS0Fi1 5 MP	Nikon Corporation, JP	https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600	NA
Pipet ve pipet uçları	Termo Bilim, FI	KJ16047	NA
Tek kenarlı çelik bıçaklar	Oxford enstrümanları	51-1625-0182	NA
Sodyum dihidrojen fosfat dihidrat (NaH₂PO₄^. 2H₂O) saf	PENTA, CZ	13472-35-0	NA
Sodyum hidroksit peletleri (NaOH) saf	Merck KGaA, DE	1310-73-2	Şiddetli yanıklar.
Kırtasiye şeffaf bant	FOROFIS, LV	91231	NA
Toluidin mavisi, genel amaçlı kalite	ThermoFisher Scientific, GB	2045836	NA