Yöntem makalesi

Uzunlamasına Empedans Tabanlı Tümör Hücresi Yaşamlılık Ölçümü Kullanılarak Seri Öldürme Testi - T Hücresi Performansını Değerlendirmek İçin Faydalı Bir Yöntem

DOI:

10.3791/69623

⸱

30 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Clinical Pharmacology, LMU University Hospital, 2Department of General, Visceral and Transplantation Surgery, LMU University Hospital, 3German Cancer Consortium (DKTK), Partner Site Munich, a partnership between the DKFZ and the University Hospital of the LMU, 4German Center for Lung Research (DZL), 5Einheit für Klinische Pharmakologie (EKLiP), Helmholtz Zentrum München - German Research Center for Environmental Health Neuherberg

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, CAR T hücresinin seri öldürme kapasitesini ve kronik antijen uyarısı altında kalıcılığını niceleyen empedans tabanlı gerçek zamanlı bir test sunar ve test plakalarının maliyet etkin yeniden kullanımı için plaka yıkama yöntemini içerir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimerik antijen reseptörü (CAR) hücre terapisi, spesifik hematolojik malignitelerin tedavisinde devrim niteliğinde bir değişim yaratmıştır. Ancak, hastaların önemli bir kısmı antijen kaybı, antijen düşüşü veya T hücresi tükenmesi nedeniyle nüks yaşar. Bu zorluklar, kronik antijen uyarısı altında CAR T hücrelerinin öldürme kapasitesini ve kalıcılığını değerlendirebilen fonksiyonel testlere olan ihtiyacı vurgulamaktadır. CAR T hücrelerinin tümör hedeflerini tekrar tekrar ortadan kaldırma yeteneğini ölçen seri öldürme testleri, CAR T hücre yanıtlarının dayanıklılığı ve etkisi hakkında değerli bilgiler sunar.

Burada, CAR T hücresi aracılı seri öldürmeyi in vitro olarak niceleyen Gerçek Zamanlı Hücre Analizi (RTCA) sistemini kullanarak empedans tabanlı bir test sunuyoruz. Tümör hücreleri, CAR T hücrelerinin belirlenmiş efektör-hedef (E:T) oranlarında eklenmeden önce tekrar tekrar tohumlanır ve teste özgü E-plakalara yapışmasına izin verilir. Platform, tümör hücresinin canlılığını etiketsiz sürekli izleyerek yüksek zaman çözünürlüklü dinamik sitotoksisiteyi yakalıyor. Çekirdek okumalar arasında Hücre İndeksi (CI) kinetikleri, tümör hücre öldürme oranı ve hedefe geçiş süresi yer alır. Tekrarlayan tümör-hedef etkileşimlerinde gözlemlenen öldürme kapasitesindeki kademeli azalma, edinilmiş CAR T hücresi disfonksiyonunun bir göstergesi olarak hizmet eder; bu durum genellikle T hücresi tükenmesi olarak adlandırılır. Bu metrikler birlikte, CAR T hücresi fonksiyonunun çeşitli E:T oranlarında hassas değerlendirilmesini sağlar ve farklı CAR T hücre yapıları veya ortak tedavileri arasında zaman içinde doğrudan karşılaştırma yapılmasını sağlar.

Maliyet verimliliğini artırmak için, test E-plakalarının yeniden kullanılmasını mümkün kılan ve test performansından veya veri bütünlüğünden ödün vermeden bir plaka yıkama prosedürü geliştirdik. Optimize edilmiş iş akışı, analiz maliyetini azaltırken analitik dayanıklılığı korur. Bu yaklaşım, CAR T hücresi fonksiyonunun uygun fiyatlı ve ölçeklenebilir preklinik değerlendirmesini sağlar ve hücre terapisi tasarımında iyileştirmeleri kolaylaştırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücre tedavisi, kronik lenfoid lösemi, akut lenfoblastik lösemi, büyük B-hücreli lenfoma ve multipl miyelom 1,2,3,4,5 gibi birçok hematolojik malignite üzerinde olağanüstü klinik başarıyla kanser immünoterapisini devrim niteliğinde dönüştürmüştür. İlk düzenleyici onaylardan bu yana, CAR T hücresi ürünleri ve tedavi edilen hasta sayısı istikrarlı bir şekildearttı 6. Özel ürün ve klinik endikasyona bağlı olarak, tipik infüzyon dozları hasta başına yaklaşık 2 × 106ile 5 ×10 8 CAR+ T hücresi arasındadeğişir. Yüksek infüzyon dozları, etkili tümör temizleme ve uzun vadeli hastalık kontrolü için gereklidir, ancak klinik ve pratik zorluklarla ilişkilidir. Büyük hücre sayıları, sitokin salınım salgılama sendromu (CRS) ve bağışıklık etkileyici hücre ilişkili nörotoksisite sendromu (ICANS) gibi ciddi yan etkilerin riskini artırabilir; bunların her ikisi de doza bağlıolabilir 8. Ayrıca, yoğun şekilde tedavi edilen veya lenfos tüketilmiş hastalar için yeterli sayıda fonksiyonel CAR T hücresi üretmek, zordur ve süreç tedavi merkezleri için lojistik açıdan hem maliyetli hem de maliyetliolabilir 9.

Bu zorluklara rağmen, CD19 hedefli CAR T hücre tedavileri, nüks eden veya refrakter B-hücre maligniteleri olan hastalarda %70-%90 tam remisyon oranlarına ulaşır ve dönüştürücü bir klinik etkigösterir 10,11,12. Ancak, CAR T hücre tedavisi, uzun vadeli etkinliğini sınırlayan ilgili zorluklarla karşı karşıyadır. Temel engeller arasında antijen kaybı veya aşağı regulasyon, yetersiz CAR T hücresi kalıcılığı ve fonksiyonel tüketimyer alır9. CAR T hücresi tükenmesi - azalan proliferatif kapasite, anti-tümör aktivitesinin bozulması ve zayıf kalıcılıkla karakterize edilir - tepki vermeme ve nüks için hayati bir neden13. Tükenmiş CAR T hücreleri, azaltılmış efektör fonksiyonu, inhibitör reseptörlerin kalıcı ekspresyonu ve kronik antijen maruziyeti ile immünosupresif tümör mikroçevreleri nedeniyle kusurlu sitokin üretimi ile gelir14. Klinik çalışmalar, fonksiyonel CAR T hücresi kalıcılığının kaybının nüks riskinin artmasıyla ilişkiliolduğunu göstermiştir 11,15,16,17. Uzun süreli in vivo aktivite, terapötik başarının başlıca belirleyicisi olarak göründüğünden, CAR T hücre ürünlerinin dayanıklılığını ve kalıcı öldürme kapasitesini anlamak hem preklinik hem de translasyonel araştırmalarda önemli bir hedeftir. Özellikle ilgi çekici olan, CAR T hücrelerinin tümör hücrelerini uzun süreler boyunca tekrar tekrar tanıyıp lizleme yeteneğidir - buna 'seri öldürme' denir - çünkü bu özellik, işlevsel bir sürecilik ve yorgunluğa karşı dirençölçütünü sağlar 18.

Bu makale, xCELLigence Gerçek Zamanlı Hücre Analizi (RTCA) empedans platformu kullanılarak seri öldürme testlerinin gerçekleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunar; bu protokol, test plakalarının, yani E-plakaların, maliyet verimliliğini artırmaya olanak tanıyan isteğe bağlı bir yıkama prosedürü de içerir; böylece analiz performansını ödün vermeden maliyet verimliliğini artırır. Böyle bir protokolün geliştirilmesinin gerekçesi, genellikle sadece statik, uç nokta okumaları sunan geleneksel sitotoksisite testlerindeki sınırlamalardan kaynaklanır. Krom-51 salınımı, laktat dehidrojenaz (LDH) testleri veya akış sitometrisi tabanlı kullanılabilirlik testleri gibi yaygın yaklaşımlar etiket gerektirir, emek yoğun iş akışları içerir ve belirli zamannoktalarıyla sınırlıdır 18,19. Daha da önemlisi, uzun süreli uyarılma veya birden fazla antijen maruziyeti turunda dinamik öldürücü kinetikleri kolayca yakalayamıyorlar; bu durum doğrudan CAR T hücresinin davamlılığı ve fonksiyonel tükenme ilebağlantılıdır 18.

xCELLigence RTCA platformu, hedef hücre yaşamlılığının etiketsiz, gerçek zamanlı, kinetik izlenmesini elektrikselempedans 20 ile sağlayarak bu boşlukları kapatmaktadır. Yapışkan tümör hedef hücreleri, altın mikroelektrot kaplı E-plakalara yerleştirilir; burada tutunma ve çoğalma ölçülen empedansı artırır; bu durum Hücre İndeksi (CI)21 olarak bildirilir. CAR T aracılı öldürmede, hedef hücreler öldürülür ve ayrılır, bu daempedans 20'de hızlı bir düşüşe yol açar. Bu gerçek zamanlı okuma, ek etiket veya reaktif gerekmeden saatler veya günler boyunca sitotoksisitenin sürekli değerlendirilmesinisağlar 22. CAR T hücreleri yapışmaz olduğundan, empedans sinyaline katkıda bulunmaz, bu da efektör ve hedef okumalarının temiz bir ayrılığınaolanak tanır 23. Veriler sürekli kaydedildiği için, araştırmacılar CAR T hücrelerinin defalarca transfer edilip taze tümör hedef hücrelerine maruz kaldığı çok turlu uyarım protokolleri uygulayabilirler; böylece öldürme kapasitesinin zamanla nasıl evrildiğini doğrudanölçebilirler 24. Bu, CAR T hücrelerinin in vivo yaşadığı tekrarlanan antijen karşılaşmalarını taklit eder ve sitotoksik kapasitelerinin fonksiyonel bir okumasını sağlar.

Bu empedans tabanlı seri öldürme testi, CAR T hücresi fonksiyonunu preklinik ortamlarda değerlendiren araştırmacılar için ideal olarak uygundur; bunlara yapı optimizasyonu, fonksiyonel karşılaştırmalar ve güç testi dahildir. Bu protokol, xCELLigence RTCA sistemini ve E-Plate 96 kullanımını gerektirir. Yapışkan tümör modelleri için geniş çapta uygulanabilir olsa da, immobilizasyon veya tethering stratejileri olmadan süspansiyon kültürleri için doğrudan uygun değildir. Empedans ölçümleri yalnızca hedef-hücre tutunmasını ve canlılığını yansıttığından, CAR T hücresi aktivasyonu, proliferasyonu ve egzoz dinamiklerini tam olarak karakterize etmek için akış sitometrisi veya sitokin testleri gibi tamamlayıcı analizler önerilir. Protokol, bu ek okumalar için hücrelerin ve süpernatantların toplanmasına olanak tanıyan belirlenmiş adımlar içerir ve böylece CAR T hücresi işlevselliğinin daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol E-Plate 96 için optimize edilmiştir ve xCELLigence RTCA sistemini gerektirir. Yapışkan tümör hücreleri, CAR T hücresi eklendiğinde logaritmik büyüme aşamasına ulaşmak için gece boyunca önceden tohumlanır. Tümör hücre hattı ve tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak, bu aralık 6 - 9 saat olarak kısaltılabilir ve böylece aynı gün efektör ekleme yapılabilir. Eğer ikinci iş akışı uygulanırsa, protokolde tanımlanan nominal gün gün zaman çizelgesi değiştirilir ve kullanıcılar programı buna göre uyarlamalıdır. CAR T hücreleri taze kaplamalı tümör hücrelerine aktarılmadan önce 48 saat boyunca ko-kültürler tutulur; bu nedenle xCELLigence cihazında iki plaka pozisyonu ve tümör hücre plakası ile efektör ekleme her iki günde bir dönüşümlü olarak yapılır. CAR T hücreleri kurumsal SOP'lara veya yerleşik protokollere göre oluşturulmalıdır. Kısaca, periferik kan T hücreleri onaylanmış etik standartlar altında izole edilir, uygun biyogüvenlik koşullarında transdüksiyon edilir ve akış sitometrisi veya eşdeğer kalite kontrol yöntemleriyle transdüksiyon verimliliği ve canlılığı açısından değerlendirilir. CAR transdüksiyon verimliliği %20'nin altında olduğunda xCELLigence testleri yapılmamalıdır; çünkü daha düşük verimlilikler, transdüsyelenmemiş hücreler tarafından artan arka plan ve spesifik olmayan öldürmelere yol açabilir ve bu da tümör büyüme eğrilerini çarpıtabilir. Tüm hücre işlemesi steril koşullarda, laminar akış başlıkta yapılmalıdır. Medya laboratuvarın standardına göre veya tedarikçinin önerdiği şekilde kullanılabilir. Aksi belirtilmedikçe, hücreler %5 CO₂ içeren nemli bir atmosferde 37 °C'de kuluçka altına alınır. CAR T hücreleri için optimize edilmiş olsa da, bu yöntem diğer süspansiyon tabanlı efektör hücrelerine ve yapışkan hedeflere de uygulanabilir.

1. Hazırlık ve boşluk (1. Gün)

  1. Tabak hazırlığı
    1. E-plate 96'nın her kuyuğunun altına 50 μL tümör ortamı ekleyin.
      NOT: Kuyunun altını çizmemeye dikkat edin, bu plakaya zarar verebilir.
    2. E-plakayı inkubatöre yerleştirin, ölçümler için kullanılacak aynı makine yuvasına yerleştirin.
    3. E-Plakayı 37 °C'de 30 dakika kuluçka altına geçirerek uygun test sıcaklığı ve pH'ına getirin.
  2. Enstrüman kurulumu
    1. Bu arada, RTCA Software Pro'yu (Sürüm 2.6.1) başlatın ve deneyi kaydetmek için bir dosya yolu seçin.
    2. "RTCA Operatörü" alanına deney adını girin ve kaydedin.
    3. Ölçülecek kuyuları seçin.
    4. Hücre sekmesinin altında hücre isimlerini, Treatment sekmesinin altında ise tedavi türlerini atayın.
  3. Ölçüm takvimi
    1. Programı aşağıdaki adımlarla ayarlayın:
      Adım Adı = Boş ; Süpürmeler = 1 ; Aralık = 1 ; Süre = 0:00
      Adım Adı = Tümör Hücreleri ; Süpürmeler = 250-300 ; Aralık = 15 dakika; Süre = minimum 24 saat
      Step Name = Tedavi ; Süpürmeler = 2500'e kadar ; Aralık = 5 dakika; Süre = minimum 72 saat
    2. Uygula tuşuna basın ve herhangi bir adım için Otomatik seçilmediğinden emin olun.
  4. Boşluk basaması
    1. E-Plate'in 37 °C'de 30 dakikalık kuluçkasından sonra, boş adımı başlatmak için PLAY/RUN tuşuna basın.
    2. Yazılımın adımı BİTİLDİĞİN işaretini (yaklaşık 1-2 dakika) bekleyin.
    3. Beşiği açın ve E-plakayı sadece hücre tohumlamasına hazır olduğunda çıkarın.

2. 1. Tur: Tümör hücresi tohumlanması (1. Gün)

  1. Tümör hücrelerinin tohumlanması
    1. Her kuyu başına 50 μL uygun ortamda tümör hücrelerinin süspansiyonunu hazırlayın.
    2. E-plakayı kuluçka makinesinden çıkarın ve hücreleri üçlü olarak tohumlayın.
  2. Başlangıç ölçümü
    1. E-plakayı hemen makineye geri koyup beşiği kilitleyin.
    2. İlk ölçümden önce 5-10 dakika bekleyin, E-plaka sıcaklığı ve pH'ı dengeleyin, ardından PLAY/RUN butonuna tıklayarak ölçümü başlatın (Programın 2. adımı = Tümör Hücreleri).
    3. E-plakayı hücre yapışmasını sağlamak için gece boyunca kuluçkaya geçirin. Normalleşmemiş Hücre İndeksi (CI) izlenin. CI log-faz büyüme aşamasına geçtiğinde, bir sonraki adıma geçin. Bu aşama, kullanılan hücre hattına bağlıdır ve tohumlanan hücre sayısına göre değişebilir. BxPC3 hücreleri (ATCC CRL-1687) kuyu başına 20.000 hücre tohumlanmış, log-faz büyümesi genellikle 6-18 saat sonra sağlanmıştır.

3. Tur 1: CAR T hücresi tedavisi (2. Gün)

  1. T hücrelerinin hazırlanması ve tohumlanması
    1. İnsan T hücresi ortamında, genleşme sitokinleri olmadan (örneğin IL-2, IL-7, IL-15 vb.) 100 μL/kuyu içinde gerekli sayıda CAR T hücresi hazırlanır.
      NOT: CAR transdüksiyon verimliliği deneyin başında bir kez ölçülür. İstenen efektör-hedef (E:T) oranı, başlangıçta plakalanmış tümör hücrelerine göre CAR⁺ T hücrelerinin sayısına göre ayarlanır. Örneğin, %50 CAR⁺ T hücresi ve 20.000 BxPC3 tümör hücresi içeren 1:1 E:T oranı için, toplam 40.000 T hücresi kaplama yapılmalıdır. Bu nedenle E:T oranı, seri katil testinin başlangıcındaki başlangıç koşulu ifade eder; ek ölçümler yapılmadıkça, sonraki turlarda E:T'deki değişiklikler bilinmez. T hücresinin çoğalma veya hayatta kalma süresindeki değişiklikler, dolayısıyla E:T oranındaki değişiklikler, seri katil okumasının bir parçası olarak kabul edilir. T hücreleri turlar arasında bölünürse, E:T orantılı olarak yeniden hesaplanır (örneğin, 3. turdan sonra 1:1 bölünmesi, başlangıçtaki 2:1 E:T oranını 4. tur için 1:1'e düşürür). Turlar arasındaki E:T dinamiği ilgi çekiyorsa, CAR %'si veya efektör fonksiyonunun ara ölçümleri için isteğe bağlı ek kuyular kaplama yapılabilir. Anti-CD3/CD28 T hücre uyarı boncuklarının manyetik ayrımla çıkarılması, spesifik olmayan öldürmeyi azaltmaya yardımcı olabilir. Ayrıca, T hücrelerinin logaritmik büyüme aşamasında (genellikle uyarıdan 5 ila 20 gün sonra) kullanılması ve testten en az iki gün önce sitokinli hücrelerin genişletilmesi önerilir, bir gün öncesi değil.
    2. Transdüksiyon verimliliği analizine dayanarak, transdüksiyon verimliliği analizine dayanarak deneysel gruplar arasında en düşük ortak yüzdeye ayarlanın.
      NOT: Tüm gruplar eşit transdüksiyon verimliliğine sahipse, ayar gerekmez. CAR⁺ yüzdeleri farklıysa, plakaya alınacak T hücre sayısı hesaplanır ve her grup aynı etkili sayıda CAR⁺ hücresi ile başlar. Bu, istenen CAR⁺ hücre sayısının (E:T oranı ve tümör tohumlanmasına dayanarak) 100 ile çarpılması ve her grup için ölçülen CAR⁺ yüzdesine bölünerek yapılır, ardından gerekirse toplam T hücre sayısını eşleştirmek için aktarılmamış T hücreleri eklenir. Örneğin, bir grupta %50 CAR⁺ T hücresi varsa, 40.000 T hücresi kaplanır (20.000 CAR⁺ + 20.000 CAR-), %60 CAR⁺ T hücresi olan bir grup ise 33.333 T hücresi kaplayarak 20.000 CAR⁺ hücresi sağlar ve 6.667 dönüştürülmemiş T hücresi ekleyerek ilk grubun toplam T hücre sayısına (toplam 40.000) eşlik eder.
    3. Isteğe bağlı olarak, sitokin veya bileşik tedavisi incelenecekse, insan T hücresi ortamı ve istenen sitokin veya bileşik içeren bir çözeltinin 20 μL eklenmesi amaçlanan nihai konsantrasyonun 11 katı değerinde. Bu hacim, her kuyuda zaten bulunan standart 200 μL'nin üzerine eklenir (boşluk için 50 μL, tümör hücre tohumlaması için 50 μL ve T hücresi eklemesi için 100 μL'ye kadar). Üreticiye göre, E-Plate 96 maksimum 243 μL ± 5 μL hacmi destekliyor; bu da bu tür isteğe bağlı işlemler için toplam 220 μL hacmi kabul edilebilir kılıyor.
  2. T hücresi tohumlanması ve ölçümü
    1. E-plakayı sadece T hücreleri eklemeye hazır olduğunda beşiği açarak çıkarın.
    2. Tohum hazırlanan T hücrelerini doğrudan tümör hücrelerine yerleştirdi.
    3. Beşiği ölçüm cihazının içine kilitleyin ve RTCA yazılımında Step 2'yi iptal edin.
      NOT: Eğer 2. adım iptal edilmezse, sistem önceki adımı ölçmeye devam eder ve ancak o adım tamamlandığında durur, bu da veri puanlarının kaybına yol açar.
    4. Step 2'nin TAMAMLANDİ olarak işaretlenmesini bekle.
    5. 3. adımı (Tedavi) başlatmak için PLAY/RUN butonuna tıklayın ve Tamam'a tıklayarak isteği onaylayın.
      NOT: Bir sonraki ölçüm adımına (3.2.5 adımdan önce) başlamadan önce (örneğin, tohumlandıktan veya hücre transferinden sonra) 15-30 dakikalık bir denge süresi tanımak, büyüme eğrilerindeki sıcaklık veya pH dalgalanmalarından kaynaklanan başlangıç sapmasını en aza indirmeye yardımcı olur.

4. Tur 2: Tümör hücresi tohumlaması (3. Gün)

  1. 1.1 ve 1.4. adımlarda açıklandığı gibi yeni bir 96 kuyruklu xCELLigence E-Plakası hazırlayın.
  2. Taze tümör hücrelerini 2. adımda tarif edildiği gibi tohumlayın.
  3. E-plakayı hücre yapışmasını sağlamak için gece boyunca kuluçkaya geçirin.

5. Tur 2: CAR T hücresinin ikinci E-plakaya transferi (4. Gün)

  1. Her kuyunun içeriğini, çok kanallı pipet kullanarak U-bottom 96-kuyu plakasının karşılık gelen bir kuyusuna aktarın. E-plakanın altındaki elektrotlara dokunmamaya dikkat edin.
  2. Oda sıcaklığında, 400 × g 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  3. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve gerekirse enzimle bağlı immünosorbent testi (ELISA) için tutun.
  4. Hücre pelletini 100 μL taze ortamda genleşme sitokinleri olmadan yeniden süspansiyona bırakın.
    NOT (isteğe bağlı): T hücreleri artık bölünebilir (örneğin, 50 μL = 1:2 bölünme) ve akış sitometrisi gibi daha ileri analizler için kullanılabilir. T hücrelerinin bölünmesi, xCELLigence öldürme testi sırasında çoğalmaya uyum sağlar. Bu, yorgunluk ortaya çıkana kadar gerekli döngü sayısını azaltmaya yardımcı olur. 2 ile 4 arasında bölünme oranlarının test edilmesi önerilir.
  5. İkinci tur tümör E-plakasına 100 μL/well T hücresi eklenir (1:2 bölünürse 50 μL), böylece ortam ve varsa sitokin/bileşik tam yenilenir.

   

6. Seri cinayet testinin devamı (5. - 10. günler ve sonrası)

  1. 4. ve 5. adımları tekrar edin; gerektiğinde 48 saat aralıklarla ek öldürme turları yapılabilir.
  2. Her aşamada öldürme aktivitesini ve T hücresi kalıcılığını xCELLigence okumaları ve ELISA veya akış sitometrisi gibi ek testlerle izleyin.

7. Veri toplama ve E-plaka yönetimi

  1. İstenen ölçüm süresinden sonra, yazılımda STOP tuşuna basın.
  2. Veriler, efektör hücre toplama zaman noktasına normalleştirilmiş ve ortalamadan aktarılmadan analiz yazılımında (R, GraphPad Prism vb.) doğru ortalama ± SEM grafikini mümkün kılar. İsterseniz ortalamalı veri setini dışa aktarın.
  3. E-plakayı aç ve kilidini aç. Deneyi yazılımda yayınlayın.
  4. E-plakayı ek analizler için inkubatörde temizleyin veya depolayın (örneğin, ELISA için üst örtü veya akış sitometrisi için hücre hasamı).

8. Isteğe bağlı: Yeniden kullanım için E-plaka yıkama

NOT: Bu isteğe bağlı adım, deneysel maliyetleri azaltmak için xCELLigence E-plakalarının yeniden kullanılmasına olanak tanır. Yeniden kullanım yalnızca E-plakanın elektriksel özellikleri deneyler boyunca sabit kalırsa ve bireysel kuyular kabul edilebilir taban aralığına girene kadar önerilir. Tüm güvenlik prosedürlerine uyun, özellikle sodyum hidroksit (NaOH) ile çalışırken. Elektrotlarda potansiyel arızaları tespit etmek için yıkamadan sonra E-plakaları görsel olarak inceleyin.

  1. E-plakanın tüm içeriğini alt tabakaya dokunmadan atabilirsiniz.
  2. Her kuyuyu 200 μL deyonize suyla üç kez yıkayın.
  3. Her kuyuya 200 μL 0.1 M NaOH ekleyin.
    DIKKAT: NaOH aşındırıcıdır. Yerel güvenlik kurallarına uyulduğundan emin olun. Eldiven, kaban ve güvenlik gözlüğü takın. 1 M NaOH'yu bir güvenlik kabininde tutun. NaOH atıklarını lavaboya su akarak doğru seyreltme için atın. Konsantre asitleri ve bazları asla karıştırmayın. Aside su eklemeyin; sadece suya asit.
  4. E-plakayı oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka edin.
  5. Her kuyuyu en az üç kez deiyonize suyla yıkayarak kalan tüm NaOH'ların temizlenmesinden emin olun.
  6. E-plakayı bir mendil üzerinde hafifçe dokunarak kurutun, ardından hava ile kurutun.
  7. E-plakayı en az 1 saat boyunca bir biyogüvenlik kabinde UV ışığı altında veya bir UV ışınlama cihazıyla sterilize edin.
    NOT: E-plakayı kuyular doğrudan yukarıya bakacak şekilde konumlandırın. UV ışığı plastik kuyu tabanlarına nüfuz etmez.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün başarılı şekilde uygulanması, tümör hücresinin canlılığını ve CAR T hücresinin sitotoksisitesini zaman içinde yansıtan tekrarlanabilir empedans tabanlı okumalar sağlar. Hücre büyümesi ve sitotoksisite, ticari RTCA sistemi kullanılarak değerlendirildi. Veriler, normalleştirilmiş hücre indeksi (NCI) olarak ifade edildi ve her zaman noktasındaki CI'nin seçilen normalleşme zamanındaki CI'ye bölünmesiyle hesaplandı. Normalleşme süresi, efektör hücrelerin eklenmesinden hemen önce ayarlanır. Temizleme süresi, efektör...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, xCELLigence RTCA platformu kullanılarak antijen maruziyetinin çoklu turlarında CAR T hücresi aracılı sitotoksisitenin değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlar. Empedans yoluyla tümör hücresinin canlılığının uzunlamasına ölçümünü mümkün kılarak, bu yaklaşım tekrarlayan sitotoksik yanıtları - seri öldürme olarak adlandırılan - etiketsiz ve sürekli bir formatta yakalar. Protokol, T hücresi efektör fonksiyonunun ardışık tümör hücre yeniden meydan okumalarına yanıt olarak zaman...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SK, Plectonic, TCR2 Inc., Miltenyi, Galapagos, Cymab, Novartis, Regeneron, BMS ve GSK'dan onurlandırmalar aldı. SK, immünoonkoloji alanında birçok patentin mucitlerinden biridir. SK, TCR2 Inc ve Carina Biotech'ten lisans ücretleri aldı. SK, el yazmasıyla ilgili olmayan çalışmalar için TCR2 Inc., Tabby Therapeutics, Catalym GmbH, Plectonic GmbH ve Arcus Bioscience'dan araştırma desteği aldı. Diğer tüm yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TT, SM ve NTTN, Else-Kröner Fresenius Stiftung (IOLIN) tarafından hibe aldı. NTTN, Friedrich-Baur-Stiftung ve German Cancer Aid (AvantCAR.de)'dan ek hibeler aldı. MPT, Monika Kutzner Vakfı ve Avrupa Araştırma Konseyi (MSCA Bursu 101106951) tarafından desteklenmektedir. SK, uluslararası doktora programı 'i-Target: kanserin immunotargeting hedeflenmesi' (Bavyera Elite Network tarafından finanse edilen), Bavyera Kanser Araştırma Merkezi (BZKF) (TANGO'dan S.K.'ye), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, hibe numarası: KO5055-2-1 ve KO5055/3-1), Melanoma Research Alliance (hibe numarası 409510), Marie Sklodowska-Curie Kanserin Benimsenen T Hücre Tedavisinin Optimize Edilmesi Eğitim Ağı (Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen; hibe 955575) tarafından desteklenmektedir. Marie Sklodowska-Curie Eğitim Ağı, kanserde terapötik bağışıklık hücrelerini takip etmek ve kontrol etmek için (AB'nin Horizon Programı, hibe 101168810 tarafından finanse edilen), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (IOLIN), Alman Kanser Yardımı (AvantCAR.de), Wilhelm-Sander-Stiftung, Ernst Jung Stiftung, LMU Münih Kurumsal Stratejisi LMUexcellent (Almanya Mükemmeliyet Girişimi çerçevesinde), Go-Bio-Girişimi, Bavyera Ekonomik İşler Bakanlığı'nın m4-Ödülü, Bundesministerium für Bildung und Forschung, EUROSTAR-Programm, Avrupa Araştırma Konseyi (Başlangıç Hibe 756017, PoC Hibesi 101100460 ve CoG 101124203), SFB-TRR 338/1 2021-452881907 tarafından, Fritz-Bender Vakfı, Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung, Hector Vakfı, Bavyera Araştırma Vakfı (BAYCELLATOR), Monika-Kutzner Vakfı, Bruno ve Helene Jöster Vakfı (360° CAR), Dr. Rurainski Vakfı ve Brigitte ve Dr. Konstanze Wegener Vakfı

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BxPC3ATCCCRL-1687
E-Plaka 96Agilent 300600910
RTCA yazılımı Pro (Basic) Agilent YokSürüm 2.6.1
xCELLigence RTCA MP - (Çoklu Plakalar)Agilent Yok

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  2. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N Engl J Med. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  3. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  4. Brudno, J. N., et al. T cells genetically modified to express an anti-B-cell maturation antigen chimeric antigen receptor cause remissions of poor-prognosis relapsed multiple myeloma. J Clin Oncol. 36 (22), 2267-2280 (2018).
  5. Gauthier, J., et al. Phase 1 study of CD19 CAR T-cell therapy harboring a fully human scFv in CAR-naïve adult patients with B-ALL. Blood Adv. 9 (8), 1861-1872 (2025).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of CAR T-cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  7. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10 (12), e005678(2022).
  8. Foster, M., et al. Cross-study safety analysis of risk factors in CAR T-cell clinical trials: An FDA database pilot project. Mol Ther Oncolytics. 27, 182-194 (2022).
  9. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  10. Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B-cell ALL patients. J Clin Invest. 126 (6), 2123-2138 (2016).
  11. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).
  12. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  13. Zugasti, I., et al. cell therapy for cancer: Current challenges and future directions. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 210(2025).
  14. Tao, Z., et al. Impact of T-cell characteristics on CAR-T cell therapy in hematological malignancies. Blood Cancer J. 14 (1), 213(2024).
  15. Wittibschlager, V., et al. T-cell persistence correlates with improved outcome in patients with B-cell lymphoma. Int J Mol Sci. 24 (6), 5688(2023).
  16. Myers, R. M., et al. Humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR) T cells in CAR-naive and CAR-exposed children and young adults with relapsed or refractory acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol. 39 (27), 3044-3055 (2021).
  17. Gardner, R. A., et al. Intent-to-treat leukemia remission by CD19 CAR T cells of defined formulation and dose in children and young adults. Blood. 129 (25), 3322-3331 (2017).
  18. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  19. Peper, J. K., et al. An impedance-based cytotoxicity assay for real-time and label-free assessment of T-cell-mediated killing of adherent cells. J Immunol Methods. 405, 192-198 (2014).
  20. Cerignoli, F., et al. In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis. PLoS One. 13 (3), e0193498(2018).
  21. Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol In Vitro. 20 (6), 995-1004 (2006).
  22. Lee, E. H. J., et al. Antigen-dependent IL-12 signaling in CAR T cells promotes regional to systemic disease targeting. Nat Commun. 14 (1), 4737(2023).
  23. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Evaluation of CAR-T cell cytotoxicity: Real-time impedance-based analysis. Methods Cell Biol. 167, 81-98 (2022).
  24. Sahoo, P., et al. Mathematical deconvolution of CAR T-cell proliferation and exhaustion from real-time killing assay data. J R Soc Interface. 17 (162), 20190734(2020).
  25. Li, N., Zhang, W. Calculation principles of Agilent xCELLigence RTCA software. , Agilent Technologies. (2022).
  26. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. J Vis Exp. (157), e60400(2020).
  27. Brezinger-Dayan, K., et al. Impact of cryopreservation on CAR T production and clinical response. Front Oncol. 12, 1024362(2022).
  28. Foulke, J. G., et al. Optimizing ex vivo CAR-T-cell-mediated cytotoxicity assay through multimodality imaging. Cancers (Basel). 16 (14), (2024).
  29. Cadinanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33 (5), 2291-2309 (2025).
  30. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-Plate cell sensor arrays in the xCELLigence real-time cell analyzer. Biotechniques. 61 (3), 117-122 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Empedans Tabanl AnalizCAR T H creleriGer ek Zamanl H cre AnaliziT H cresi T kenmi li iSitotoksisite l mEfekt r Hedef OranE Plaka Yeniden Kullan mH cre ndeksi Kineti i

İlgili makaleler