Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Osthole, miR-34a/BCL-2 ekseninde sıçan artritini iyileştirir

96 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69624

⸱

15 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, and Public Experimental Research Center, Xuzhou Medical University, 2Department of Joint Surgery, Shuyang Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Osthole (OST), yoğun farmakolojik etkilere sahip doğal bir bileşiktir. Bu çalışma, OST'nin miR-34a/Bcl-2 ekseni üzerinden Diz Osteoartrit'inin (KOA) etkilerini hafiflettiğini, in vivo ve in vitro sıçanlarda gösterildiği gibi göstermektedir ve patent tıp ile klinik uygulamaları için yeni fikirler ve yönler sunmaktadır.

Özet

Diz osteoartriti (KOA), hipertrofik veya dejeneratif artrit olarak da adlandırılır, yaygın bir eklem rahatsızlığıdır. Mevcut klinik yönetim stratejileri arasında farmakolojik tedavi, fiziksel müdahale, cerrahi işlemler ve yardımcı tedaviler yer almaktadır. Bu yaklaşımlar KOA semptomlarını bir ölçüde hafifletebilirken, genellikle yan etkiler, sınırlı etkinlik veya invazivlik gibi sınırlamalar getirmektedir. Osthole (OST), doğal bir kumarin türevi olup, özellikle eklem ağrısını hafifletmek ve eklem fonksiyonunu iyileştirmek için tıbbi özellikleri nedeniyle geniş çapta incelenmiştir. Bu çalışmada, CCK8 testi, iletim elektron mikroskopisi (TEM), H&E boyama ve serum biyokimyasal analizi kullanılarak OST'nin hem in vitro hem de in vivo kondrositler üzerinde koruyucu etkiler yarattığı gösterildi ve belirgin toksisite gözlemlenmedi. TEM, akridin portakal boyama, akış sitometrisi ve western blotting kullanılarak yapılan sonraki araştırmalar, OST'nin otofajiyi teşvik ettiğini ve kondrositlerde apoptozu bastırdığını ortaya koydu. qRT-PCR ve lusiferaz raporlayıcı testleriyle yapılan daha fazla mekanik çalışmalar, OST'nin miR-34a'yı aşağı regule ettiğini, böylece Bcl-2 ekspresyonunu artırdığını ve miR-34a/Bcl-2 yolu üzerinden apoptozu inhibe ettiğini göstermiştir. Özetle, bu bulgular OST'nin hem hücresel hem de hayvan modellerinde kondrositleri koruduğunu göstermektedir; LPS kaynaklı stresi azaltır ve KOA sıçanlarında iltihap ile apoptozu azaltır. miR-34a'nın aşağı regulasyonu ve ardından Bcl-2 ifadesinin artması, anti-apoptotik etkisine katkıda bulunur. Bu sonuçlar, OST tabanlı patentli ilaçların geliştirilmesi ve bunların KOA tedavisinde potansiyel klinik dönüşümü için teorik bir temel sağlar.

Giriş

Diz Osteoartriti (KOA), hipertrofik, hipertrofik veya yaşlılık diz artriti olarak da bilinen yaygın bir eklem hastalığıdır. Artiküler kıkırdak dejenerasyonu ve eklem çevresindeki yapıdaki değişikliklerden kaynaklanır. Epidemiyolojik çalışmalara göre, diz osteoartriti özellikle yaşlılarda yaygın birhastalıktır 1. Görülme oranı yaş, kilo, genetik, eklem yaralanması gibi faktörlerle yakından ilişkilidir. Fizyolojik işlevler de etkilenebilir; sınırlı eklem hareketi, kas gücü azalması ve anormal yürüyüş gibi. Şu anda diz osteoartritinin tedavisinde yaygın kullanılan yöntemler arasında ilaç tedavisi, fizyoterapi, cerrahi ve adjuvan tedaviyer almaktadır. İlaçlar genellikle ağrıyı azaltmak ve iltihabı kontrol etmek için ağrı albezleyiciler, steroid olmayan anti-enflamatuar ilaçlar ve kronik artrit ilaçlarını içerir. Fizik tedavi, sıcak kompresler, soğuk kompresler, masaj ve eklem motor fonksiyonunu geliştirmek ve ağrıyı azaltmak için özel rehabilitasyon egzersizlerini içerir. Cerrahi tedavi, artroskopik cerrahi, yapay eklem değişimi veya eklem yapısını ve işlevini yeniden kazandırmak için eklem kemiği morfolojik onarımı içerebilir. Ayrıca, akupunktur, fizyoterapi ve geleneksel Çin tıbbı gibi tamamlayıcı tedaviler de yaygın olarak kullanılmaktadır.

Ancak, bu tedaviler diz osteoartritinin semptomlarından ve durumundan biraz rahatlama sağlasa da, hâlâ sınırlamalar vardır. İlaç tedavisi olumsuz reaksiyonlar ve bağımlılık sorunları içerebilir; Fizik tedavi sürekli bir rehabilitasyon süreci gerektirir ve sonuçlar bireysel farklılıklara göre değişir; Cerrahi tedavi risklidir, iyileşme süreci uzun ve dikkatlice değerlendirilmesi gerekir; Adjuvan tedavi geniş çapta ilgi ve uygulama almış olsa da, etkinliğine dair bilimsel destekler sınırlıdır; adjuvan tedavinin düzenleyici mekanizmasını derinlemesine incelemek gerekir. Adjuvant tedavide, diz osteoartriti tedavisinde geleneksel Çin ilaçları birçok alanda yaygın olarak kullanılmış ve faydalı olduğu kanıtlanmıştır. Geleneksel Çin tıbbının henüz iyi bilinmemiş ama uzun vadeli uygulama ve takip çalışmalarıyla kanıtlanmış bazı bileşenleri olmalıdır. Şu anda, Cibotium barometz3, Ligusticum wallichii Franchat4, Angelica pubescens5 ve diğerleri gibi birçok Çin ilacı, diz osteoartritini tedavi etme konusunda zengin deneyim biriktirmiştir. Bu bitkiler, ağrıyı etkili bir şekilde hafifletmeye ve iltihabı azaltmaya yardımcı olan analjezik ve anti-enflamatuar etkilere sahiptir.

OST, tıpta doğal bitkisel özet olarak yaygın olarak kullanılan kumarin benzeri birbileşiktir. Birçok farmakolojik aktiviteye sahiptir ve çok sayıda çalışmayla desteklenmektedir. Çalışmalar, cnidium'un anti-tümör, anti-iltihab, hiperglisemi, anti-trombosit agregasyonu ve nörokoruma dahil olmak üzere birçok farmakolojik etkiye sahip olduğunu ve birçok başka hastalıkta potansiyel terapötik etkileri olduğunugöstermiştir 7. OST'nin, OST'nin LC3 aracılı otofaji ve GSDME'ye bağlı piroptoz yoluyla yumurtalık karsinom hücrelerinin apoptozunu inhibe ettiği otofajiyi düzenleyerek kanser hücrelerinin apoptozunu teşvik edebildiğibildirilmiştir 8; OST, endoplazmik retikülum stresi ve hücre otofaji yoluyla HT-29 hücrelerinin apoptozunuindükler 9; OST, AMPK/Akt sinyalini baskılayarak kolorektal kanserin apoptozunu teşvik eder, hücre otofajisi, ROS'u veferroptoz 10'u tetikler; OST, otofaji ve mitokondri aracılı sinyal iletimi düzenleyerek kolorektal kanserin büyümesiniengelleyebilir. Aynı zamanda, OST, eklem ağrısını hafifletmek ve eklem fonksiyonunu iyileştirmek için özellikle önemlidir; özellikle iltihap yanıtı azaltarak ve eklem ağrısını hafifleterek. Ve aktif bileşenleri, iltihap maddelerin salınımını azaltabilir ve artritin neden olduğu eklem kıkırdak dejenerasyonunu engelleyebilir. Yaygın batı ilaçlarına kıyasla OST daha güvenlidir ve düşük toksisiteye sahiptir; uzun süreli kullanım ilaç direnci oluşturmaz. Osthole'un, in vitro ve in vivo12 ile cAMP/CREB sinyalizasyonu yoluyla transkripsiyon faktörü osterix'i yükselterek osteoblastlarda osteogenezi artırdığı bildirilmiştir; OST, AMPK/ULK1 yolu13 aracılığıyla aktive edilen otofajini artırarak diz osteoartritini bastırır; Knidyum laktonu, p38 MAPK ve PI3K-Akt ile c-Fos/NFATc1 sinyal yolu14 aracılığıyla osteoklast farklılaşmasını inhibe eder; Knidyum laktoni, ovarektomize edilmiş bir fare modelinde östrojen-α/BMP-2/Smad sinyal yolu15 aracılığıyla kemik kaybını önler; OST, mezenkimal kök hücrelerin otofajisini artırarak osteoporozuiyileştirir 16. Ancak gözlem ve analizler, çoğu çalışmanın fenotipte kaldığını veya moleküler düzeyde ilaç katılımının sinyal yolu düzenleme mekanizmasını ortaya koyamadığını gösterdi; bu da geleneksel Çin tıbbından çıkarılan bileşiklerin yaygın olarak kabul edilmesinin zor olmasının nedenlerinden biriydi. Bu nedenle, patent tıp ve klinik uygulama için Osthole'un moleküler düzeyde biyolojik düzenleme mekanizmasının daha fazla incelenmesi büyük öneme sahiptir.

miRNA, hedef genlerin ekspresyonunu engelleyerek biyolojik işlevi düzenleyen küçük bir RNA'dır. Birçok geleneksel Çin tıbbının miRNA'yı düzenleyerek biyolojik etkilerini gösterdiği bilinmektedir. Benzer şekilde, OST'nin miRNA ifadesini etkilediği de bildirilmiştir. Birincisi, OST, miRNA aracılığıyla anti-tümör biyolojik bir rol oynar. OST'nin, endometriyal karsinom 17'de miR-424'ü yükselterek CPEB2 ekspresyonunu azaltarak hücre çoğalmasını inhibe ettiği ve hücre apoptozunu indüklediğibildirilmiştir; OST, miR-16'nın yukarı regülasyonu ve MMP-918'in aşağı regulasyonu yoluyla insan glioma hücrelerinin proliferasyonunu bastırır ve apoptozunu hızlandırır; OST, retinoblastomda PI3K/AKT/mTOR yolunu inhibiye ederek ve hsa_circ_0007534/miR-214-3p eksenini düzenleyerek anti-tümöretkisi gösterir 19. İkincisi, OST, miRNA'nın düzenlenmesi yoluyla vücut organlarının fizyolojik süreçlerini de etkileyebilir; miRNA, OST, miR-22–3p aracılı lipid metabolik yeniden programlamayı modüle ederek akciğer damar yenidenmodellenmesini hafifletmektedir 20; OST, miyokardiyal iskemi/reperfüzyon yaralanmasına karşı miR-30a'yı aşağı düzenleyerek ve otofaji21'i teşvik ederek fareleri korur; OST, H9c2 kardiyomiyositlerini trastuzumab kaynaklı hasara karşı koruyarak p38MAPK/mTOR sinyal yolu22 üzerinden otofajini artırıyor. Üçüncü olarak, OST, miRNA aracılığıyla nöroprotektif bir rol oynayabilir; OST, Alzheimer hastalığı hücre modelinde sinir kök hücrelerinin nöronlara farklılaşmasını miR-9'un yukarı regulasyonu yoluyla uyardı ve APP/PS1 transgenik farelerde hipokampal nöronların fonksiyonel bozulmasınıkurtardı 23; OST, Alzheimer hastalığında miR-107'nin yukarı regulasyonu yoluyla beta amiloid seviyelerini düşürür 24. Ancak, miRNA'nın diz osteoartritini tedavi etmek için OST ile düzenlenebileceği bildirilmemiştir. Literatür, miR-34a'nın kondrosit apoptozunu artırdığını ve DLL1'i hedefleyerek PI3K/AKTyolu 25'i düzenleyerek osteoartrit gelişimini kolaylaştırdığını göstermiştir. Uzun kodlamayan RNA MEG3, miR-34a/Klothoeksenini 26 düzenleyerek osteoartritin ilerlemesini düzenler; miR-34a'nın aşağı regülasyonu, PI3K/Akt yolu27'yi aktive ederek sıçan osteoartritik kıkırdak hücrelerinin apoptozunu inhibe eder ve proliferasyonu destekler. Dolayısıyla, KOA miR-34a düzenlemesiyle OST ile tedavi edilebilir mi? Bu nedenle, OST'nin miRNA'yı düzenleyerek diz osteoartritini tedavi edebileceği varsayımlanmaktadır.

Özetle, OST, yaygın farmakolojik aktivitelere sahip doğal birbileşiktir 28. Daha önce, araştırma grubu OST'nin farelerde diz osteoartritini iyileştirebileceğini doğruladı, ancak bu biyolojik etkinin altında yatan hücresel sinyal iletimi ve moleküler mekanizmalar tam olarak netleşmedi. Bu makalede, OST'nin miRNA, otofaji ve apoptoz sinyal yollarını daha fazla inceleyerek, diz osteoartritinin tedavisindeki OST'nin mekanizmasını netleştirmek ve patent tıbbı ile klinik uygulaması için yeni fikirler ve yönler sunmayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm çalışmalar Xuzhou Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Tedavi Komitesi tarafından onaylandı. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hayvan modeli

250–300 g ağırlığında yetişkin erkek ve dişi Sprague-Dawley (SD) fareleri Xuzhou Tıp Üniversitesi Deneysel Hayvan Merkezi'nden satın alındı. Fareler özel patojensiz bir odada yetiştirildi. Tedavi, bakım ve son nokta seçimi dahil olmak üzere hayvan deneysel prosedürleri, "Hayvan Araştırmaları: Canlı Deneylerin Raporlanması" yönergelerine uygun şekilde yürütülmüştür. Hayvan deneyleri rastgele yapıldı. SD fareleri dört gruba ayrıldı (n = her grup başına 8): Normal grup (ameliyatsız, normal beslenme) (Normal grup), Sham grubu (sahte cerrahi: ön çapraz bağ kesimi olmadan cilt ve kas kesisi [ACLT], ardından salin gavaja), KOA/NC grubu (ACLT ameliyatı+salin gavaja), KOA/OST grubu (ACLT ameliyatı+OST garaj). Fare dizinin KOA modeli, daha önce açıklandığı gibi ön çapraz bağ kesimi (ACLT) yöntemiyleoluşturulmuştur 29. Salin grubuna gavaj yoluyla tuzlu su verildi, OST grubuna ise 4 hafta boyunca gavaj yoluyla OST verildi. OST dozu vücut ağırlığı 50 mg/kg (PEG 400 içinde çözünür ve fizyolojik salinle seyreltir), Rats alt bölümünde ise 4 hafta boyunca günde bir kez uygulanır. Daha sonra, sıçanlar analiz için ötenazi edildi (kurumsal onaylı protokollere doğru). Dokular ya hemen sıvı azotta dondurulur ya da %4 paraformaldehit ile sabitlenirdi.

2. Hücre kültürü

İnsan kondrosit hücre hattı (C28/I2), Amerikan Tip Kültürü Koleksiyonu'ndan (ATCC, Manassas, VA) alınmıştır. Hücreler ATCC yönergelerine göre kültürlendi ve 6 ay içinde kullanıldı.

Kültür koşulları: %10 fetal sığır serumu ve %1 penisillin-streptomisin takviyeli DMEM/F-12 ortamı, %5CO2 nemlendirilmiş kuluçka içinde 37 °C'de inkübe edilmiş.

Tedaviler: Hücreler 1 ×10 6 hücre/kuyu aralığında 6 kuyu plakalarında tohumlanmıştı; 24 saat yapışma sonrası sadece LPS (1 μg/mL) veya OST (100 μM) ile 24 saat tedavi edildi.

3. Hücre yaşamlılığı için testler

Kondrosit hücreleri, 96 kuyu plakalarında farklı konsantrasyonlarda OST veya LPS ile birlikte kübe edildi. CCK8 testi, mikroplaka okuyucu kullanarak emilimi (OD450 nm) tespit ederek hücre canlılığını yansıtır; daha yüksek OD değerleri daha canlı hücreleri gösterir.

OST konsantrasyon gradyantı: 0, 25, 50, 100, 200, 400 μM (24 saat kuluçka içinde). CCK8 testi, tüm konsantrasyonlarda %>90 hücre canlılığı gösterdi ve bileşiğin toksik olmadığını doğruladı.

LPS konsantrasyon gradyantı: 0, 0.1, 0.5, 1, 2 μg/mL (24 saat kuluçka içinde). 1 μg/mL LPS grubu hücre canlılığı %%50'ye sahipti (Ctrl grubuna kıyasla), bu yüzden sonraki deneyler için bu konsantrasyon seçildi.

4. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama ile Safanin O boyama

Dokular parafinle gömülüp, mumdan arındırıldı, yeniden nemlendirildi ve üreticinin talimatlarına göre H&E ile Safranin O/Fast Green reaktifleriyle boyandı. Boyama koşulları: AO çalışma konsantrasyonu 1 μg/mL; hücreler 37 °C'de karanlıkta 5 dakika kuluçka altına alındı.

Nicel yöntem: AVO pozitiflik oranı, ImageJ yazılımı kullanılarak her örneklemde 5 rastgele alanda (×400 büyütme) turuncu nokta içeren hücreler sayılır hesaplandı. Daha sonra, bölümler BX43 mikroskobu altında (büyütme ×400) görüntülendi.

5. Akış sitometrisi

Hücreler apoptoz analizi için Annexin-V FITC/PI çözeltisinde toplanıp yeniden süspansiyon edildi. Kuluçka koşulları: Hücreler, Annexin-V FITC/PI çözeltisinde (KeyGEN) 1 ×10 6 hücre/mL olarak yeniden süspansiyona getirildi ve oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçka edildi.

Kapı stratejisi: İleri dağılma (FSC ) vs. yan saçılma (SSC) kapıları hücre kalıntısını dışlamak için kullanıldı; Annexin-V FITC⁺/PI⁻ hücreleri erken apoptotik olarak, Annexin-V FITC⁺/PI⁺ hücreleri ise geç apoptotik olarak tanımlanmıştır. Kapı grafiki, Ek Dosya 1'e (ham akış sitometri verileri) dahil edilmiştir. Hücreler bir akış sitometresi ile toplandı. Veriler Flow Jo yazılımı kullanılarak analiz edildi.

6. Plazmidlerin transfeksiyonu ve taklit

MiR-34a taklitleri (34a-taklit), spesifik olmayan kontrol-taklit (NC) ticari bir kaynaktan elde edilmiştir. Hücreler, üreticinin talimatlarına göre LipofectamineTM 3000 kullanılarak plazmidlerle transfekte edildi.

7. Keskin turuncu lekelenme

Otofaji genellikle hücrelerde Acridine turuncu boyama ile değerlendirilirdi. Hücreler 24 saat boyunca belirli konsantrasyonlarda LPS veya OST ile tedavi edildikten sonra, 37 °C'de AO (1 μg/mL) ile karanlıkta 5 dakika boyunca kuluçka altına alındılar. Görüntüler lazer konfokal mikroskop kullanılarak çekildi. AVO pozitiflik oranı, ImageJ yazılımı kullanılarak her örneklemde 5 rastgele alanda (×400 büyütme) turuncu nokta içeren hücreler sayılırken hesaplandı. Veriler, üç bağımsız deneyden ortalama ± SD olarak rapor edilmiştir.

8. Geçirim elektron mikroskobu gözlemi

Örnekler %2,5 glutaraldehit ve %1 osmiyum tetrooksit ile sabitlendi, ardından kurutuldu, durulandı ve emdirildi. Polimerizasyondan sonra, örnekler ultramikrotom kullanılarak 70 nm kalınlığında kesimlere ayrıldı. Hücrelerin ultrayapısı iletim elektron mikroskopisiyle gözlemlendi.

9. İmmunoblotasyon

Bcl-2'ye karşı fare monoklonal antikor (Abs) (#68103), LC3'e karşı tavşan poliklonal antikor (#14600-1-AP), IL-6 (21865-1-AP) ve β-Aktine karşı fare monoklonal antikoru (#66009-1-lg) Proteintech'ten satın alındı. IRDye 800CW Keçi (poliklonal) anti-Tavşan IgG (H+L) veya IRDye 800CW Keçi (poliklonal) anti-Fare IgG (H+L) ile konjuge edilmiş ikincil abs'lar ticari olarak elde edilmiştir. Hücreler, SDS-poliakrilamid jel elektroforezi üzerinde elektroforez ile ayrılan tam hücre liz testinde lizize edildi. Proteinler birincil Abs ve karşılık gelen ikincil Abs kullanılarak tespit edildi. Protein yükü şerit başına 30 μg idi; birincil antikor sulandırmaları: Bcl-2 (1:1000), LC3 (1:1500), β-tubulin (1:5000); ikincil antikorlar (IRDye 800CW) 1:10.000 oranında, IL-6 (1:800) olarak kullanıldı. Daha sonra, protein bantları geliştirilmiş kemilyüminesans lazer görüntüleme tarama sistemi ile yakalanmıştır. Protein bantları ImageJ yazılımı tarafından nicelendirildi.

10. Nicel Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR)

Hücrelerden toplam RNA'lar Trizol reaktifi kullanılarak izole edildi. Toplam RNA'lardan türetilen cDNA'lar, cDNA regent kiti kullanılarak sentezlendi ve SYBR Green yöntemleriyle analiz edildi. miRNA'lardan türetilen cDNA'lar, miRcute ve miRNA birinci zincirli cDNA kiti kullanılarak sentezlendi ve miRcute plus miRNA qPCR kiti ile analiz edildi. Tüm prosedürler üreticinin protokolüne göre gerçekleştirildi. Hedef transkriptin ifadesi 2-△△CT yöntemiyle hesaplandı. GADPH ve U6, sırasıyla mRNA ve miRNA için yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Primer dizisi Tablo 1'de listelenmiştir.

11. Luciferase muhabir testleri

Vahşi tip psiCHECK2-Bcl-2-3′UTR raporlayıcı plazmidi (WT) ve psiCHECK2- Bcl-2-3′UTR raporlayıcı plazmidi miR-34a bağlanma bölgesinde mutantla birlikte (Mut). Raporörler ve miR-34a taklitçisi, LipofectamineTM 3000 kullanılarak kondrosit hücrelerine birlikte transfekte edildi. Hücreler 24 saatlik transfeksiyondan sonra toplanıp lizediliyordu. Luciferase yoğunluğu, üreticinin talimatlarına göre Dual-LumiTM Luciferase Reporter Gen Assay kiti kullanılarak ölçüldü.

12. Yürüyüş analizi testleri

MGT-PR sistemi, her gruptaki farelerin koşan uzuv hareketlerini gözlemlemek için kullanıldı. Testlerden önce, farelerin pist ortamına uyum sağlamalarına izin verildi. Serbest yürüyüş sırasında yürüyüş verileri kaydedildi ve her sıçan için ardışık üç geçerli yürüme denemesi kaydedildi. Analiz edilen parametreler arasında adım uzunluğu, sallanma süresi ve sağ ile sol arka uzuvlar arasındaki koordinasyon yer alıyordu.

13. İstatistiksel analiz

Deneyler üçlü olarak yapıldı ve bağımsız olarak en az üç kez tekrarlandı. İstatistiksel analizler GraphPad Prism 9 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler ortalama ± SD olarak gösterildi. İstatistiksel farklılıklar, çoklu karşılaştırmalar için tek yönlü ANOVA (Tukey's post hoc testi) ile veya iki deneysel grup karşılaştırması için iki kuyruklu Student's t testi ile değerlendirildi. Farklar p 0.05

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

OST korumalı kondrosit hücreleri hem in vitro hem de in vivo
Doğal bir ürün olarak, OST'nin güvenlik profili kapsamlı bir inceleme gerektirir. Bu çalışmada ilk olarak kondrositler üzerindeki sitotoksisitesi in vitro CCK8 testi kullanılarak değerlendirildi. Sonuçlar, OST'nin kondrositlere karşı 400 μM konsantrasyonda bile toksisite göstermediğini göstermiştir (Şekil 1A). OST'nin kondrositler üzerindek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Her şeyden önce, OST, kondrositleri in vitro LPS kaynaklı stresten korudu ve in vivo KOA sıçanlarında iltihap ve apoptozu hafifletti. Bu koruyucu etkiler, miR-34a'nın aşağı regülasyonu ve bunun sonucunda Bcl-2 ekspresyonunda artışla ilişkilendirildi; bu, miR-34a/Bcl-2 ekseninin OST etkisini aracı etmedeki önerilen rolüyle uyumludur.

Bu çalışmada, OST'nin kondrosit hücrelerinin otofajisini teşvik ettiği ve hem in vitro hem de in

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların finansal çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, Jiangsu Üniversitesi Yeni İlaçlar ve Klinik Tıp Ana Laboratuvarı (XZSYSKF2021037) tarafından finanse edilmiştir. Bu makaledeki deneylerin kısmen Xuzhou Tıp Üniversitesi'nin Kamu Deneysel Araştırma Merkezi ve Laboratuvar Hayvan Merkezi'nde gerçekleştirilmiştir. Fuxing Dong, Kejia Zhang, Jinxia Kuai ve Min Zhang'a coşkulu yardımları için teşekkürler iletilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%1 osmiyum tetroksitRuixin Teknolojisi
%2,5 glutaraldehitZhongjingkeyi Teknolojisi
Acridine orangeSigmaAmresco 0360
Annexin-V FITC/PI çözümüKeyGENKGA107
BCL-2Proteintech#68103
Hücre Sayma Kiti-8VICMED39.VC5001L
KemilyünevsansOdyssey CLX
Konfokal mikroskopLeicaSTELLARIS 5
DMEM/F-12HyClone12.SH30023-01
Dual-LumiTM Luciferase Reporter Gen Test KitiBeyotimeRG088
FastKing cDNA regent kitiTIANGENKR116-03
Akış sitometresiBDFACS İkinci Şarkı
İnsan kondrosit hücre hattıAmerikan Tip Kültürü KoleksiyonuYTLK280144
LC3Proteintech#14600-1-AP
LipofektaminTM 3000InvitrogenL3000015
LipopolisakkaridlerSigma29.L2880
Liz testiKeyGENKGP704-100
mikroplaka okuyucuBioTekSinerji 2
miRcute ve miRNA birinci zincirli cDNA kitiTIANGENKR211-02‌
miRcute plus miRNA qPCR kitiTIANGENFP411-02
OstholeMedchemexpressO815127-25g
SDS-poliakrilamid jel elektroforeziNCM BiyoteknolojiP2012
SerumClark BioscienceFB15015
SYBR YeşilTIANGENFP217-01‌
Geçirimli elektron mikroskopisiFEITecnai G2
Ultra-mikrotomLeciaUC7
Dik floresans mikroskobuOlympusBX43
β-AktinProteintech#66009-1-lg

Kaynaklar

  1. Kan, H. S., et al. Non-surgical treatment of knee osteoarthritis. Hong Kong Med J. 25 (2), 127-133 (2019).
  2. Dantas, L. O., Salvini, T. F., McAlindon, T. E. Knee osteoarthritis: Key treatments and implications for physical therapy. Braz J Phys Ther. 25 (2), 135-146 (2021).
  3. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1-15 (2022).
  4. Li, H., et al. Intra-articular injection of a nanosuspension of tetramethylpyrazine dihydroxynaphthalenate for stronger and longer-lasting effects against osteoarthritis. J Biomed Nanotechnol. 17 (6), 1199-1207 (2021).
  5. Qiang, R., et al. Carbon quantum dots derived from herbal medicine as therapeutic nanoagents for rheumatoid arthritis with ultrahigh lubrication and anti-inflammation. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (32), 38653-38664 (2023).
  6. Sun, M., Sun, M., Zhang, J. Osthole: An overview of its sources, biological activities, and modification development. Med Chem Res. 30 (10), 1767-1794 (2021).
  7. Yang, S., et al. Osthole: An up-to-date review of its anticancer potential and mechanisms of action. Front Pharmacol. 13, 945627(2022).
  8. Liang, J., et al. Osthole inhibits ovarian carcinoma cells through LC3-mediated autophagy and GSDME-dependent pyroptosis except for apoptosis. Eur J Pharmacol. 874, 172990(2020).
  9. Zhou, X. H., Kang, J., Zhong, Z. D., Cheng, Y. Osthole induces apoptosis of HT-29 cells via endoplasmic reticulum stress and autophagy. Oncol Lett. 22 (4), 726(2021).
  10. Zhou, X., Kang, J., Zhang, L., Cheng, Y. Osthole inhibits malignant phenotypes and induces ferroptosis in KRAS-mutant colorectal cancer cells via suppressing AMPK/Akt signaling. Cancer Chemother Pharmacol. 92 (2), 119-134 (2023).
  11. Song, J., et al. Osthole impairs mitochondrial metabolism and the autophagic flux in colorectal cancer. Phytomedicine. 125, 155383(2024).
  12. Zhang, Z. R., et al. Osthole enhances osteogenesis in osteoblasts by elevating transcription factor Osterix via cAMP/CREB signaling in vitro and in vivo. Nutrients. 9 (6), 588(2017).
  13. Ma, T., et al. Osthole suppresses knee osteoarthritis development by enhancing autophagy activated via the AMPK/ULK1 pathway. Molecules. 27 (23), 8624(2022).
  14. Liang, J. Y., Wu, W. L., Chen, Y. X., Liu, H. The efficacy and potential mechanism of cnidium lactone to inhibit osteoclast differentiation. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 3087-3093 (2019).
  15. Wang, Z., Bao, H. W., Xu, Y. J. Cnidium lactone prevents bone loss in an ovariectomized rat model through the estrogen-α/BMP-2/Smad signaling pathway. J Cell Biochem. 121 (10), 4567-4576 (2020).
  16. Zheng, X., et al. Osthole improves therapy for osteoporosis through increasing autophagy of mesenchymal stem cells. Exp Anim. 68 (4), 347-355 (2019).
  17. Lu, K., Lin, J., Jiang, J. Osthole inhibits cell proliferation and induces apoptosis through decreasing CPEB2 expression via upregulating miR-424 in endometrial carcinoma. J Recept Signal Transduct. 40 (1), 89-96 (2020).
  18. Lin, K. A. I., et al. Osthole suppresses proliferation and accelerates apoptosis of human glioma cells via upregulation of microRNA-16 and downregulation of MMP-9. Mol Med Rep. 12 (3), 4592-4597 (2015).
  19. Lv, X., et al. Osthole exhibits an anti-tumor effect in retinoblastoma through inhibiting the PI3K/AKT/mTOR pathway via regulating the hsa_circ_0007534/miR-214-3p axis. Pharm Biol. 60 (1), 417-426 (2022).
  20. Niu, Z., et al. Osthole alleviates pulmonary vascular remodeling by modulating microRNA-22-3p mediated lipid metabolic reprogramming. Phytomedicine. 96, 153840(2022).
  21. Lu, W. Osthole down-regulates miR-30a and promotes autophagy to protect rats against myocardial ischemia/reperfusion injury. Turk J Thorac Cardiovasc Surg. 27 (2), 178-184 (2019).
  22. Hou, H., Yang, Y., Chen, R., Guo, Z. Osthole protects H9c2 cardiomyocytes against trastuzumab-induced damage by enhancing autophagy through the p38MAPK/mTOR signaling pathway. Toxicol In Vitro. 93, 105704(2023).
  23. Li, S. H., et al. Osthole stimulated neural stem cells differentiation into neurons in an Alzheimer’s disease cell model via upregulation of microRNA-9 and rescued functional impairment of hippocampal neurons in APP/PS1 transgenic mice. Front Neurosci. 11, 340(2017).
  24. Jiao, Y., et al. Osthole decreases beta amyloid levels through upregulation of miR-107 in Alzheimer’s disease. Neuropharmacology. 108, 332-344 (2016).
  25. Zhang, W., et al. miR-34a enhances chondrocyte apoptosis, senescence and facilitates development of osteoarthritis by targeting DLL1 and regulating PI3K/AKT pathway. Cell Physiol Biochem. 48 (3), 1304-1316 (2018).
  26. Xiong, G., et al. Long non-coding RNA MEG3 regulates the progress of osteoarthritis by regulating the miR-34a/Klotho axis. Ann Transl Med. 10 (8), 454(2022).
  27. Tao, H., Cheng, L., Yang, R. Downregulation of miR-34a promotes proliferation and inhibits apoptosis of rat osteoarthritic cartilage cells by activating PI3K/Akt pathway. Clin Interv Aging. 15, 373-385 (2020).
  28. Zafar, S., et al. Osthole: A multifunctional natural compound with potential anticancer, antioxidant and anti-inflammatory activities. Mini Rev Med Chem. 21 (18), 2747-2763 (2021).
  29. Zhang, H., Zheng, W., Li, D., Zheng, J. miR-146a-5p promotes chondrocyte apoptosis and inhibits autophagy of osteoarthritis by targeting NUMB. Cartilage. 12 (10), 1467S-1477S (2021).
  30. Lu, R., et al. Oroxin B alleviates osteoarthritis through anti-inflammation and inhibition of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and enhancement of autophagy. Front Endocrinol. 13, 1060721(2022).
  31. Lv, X., et al. miR-34a-5p was involved in chronic intermittent hypoxia-induced autophagy of human coronary artery endothelial cells via Bcl-2/beclin 1 signal transduction pathway. J Cell Biochem. 120 (11), 18871-18882 (2019).
  32. Ma, L., et al. Knee osteoarthritis therapy: Recent advances in intra-articular drug delivery systems. Drug Des Devel Ther. 16, 1311-1347 (2022).
  33. Zhang, W., et al. GelMA hydrogel as a promising delivery system for osthole in the treatment of rheumatoid arthritis: targeting the miR-1224-3p/AGO1 axis. Int J Mol Sci. 24 (17), 13210(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Osthole TedavisiDiz OsteoartritiKondrosit KorumasOtofaji nd ksiyonuApoptozun Bask lanmasTransmisyon Elektron MikroskobuAk SitometrisiWestern BlotqRT PCR
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.