Yöntem makalesi

MLV tabanlı psödovirüsler kullanılarak SARS-CoV-2 giriş inhibitörlerinin potansiyel antiviral olarak tanımlanması için prosedürler

DOI:

10.3791/69628

⸱

27 Şubat 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Biología Celular y Molecular de enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT AIP), 2Maestría en Ciencias Biomédicas, Universidad de Panama, 3Sistema Nacional de Investigación (SNI), SENACYT

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, luciferaz raporlayıcı sistemi kullanarak SARS-CoV-2 sahtetipli parçacıkların üretilmesi metodolojisini ve giriş inhibitörlerini tanımlamada kullanımını açıklamaktadır. Bu protokoller, rekombinant insan ACE2-Fc füzyon proteini ve küçük moleküllü bileşik arbidol olmak üzere iki farklı giriş inhibitörü kullanılarak gösterilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SARS-CoV-2 virüsü, 2019'da ortaya çıktığından bu yana dünyada büyük bir hastalık ve ölüm yüküne yol açan ortaya çıkan, zoonotik bir patojendir. Viral girişi ve potansiyel antiviral bileşikleri değerlendirmek için güvenli ve erişilebilir platformlar, yeni varyantlara karşı devam eden ilaç keşfi için hayati olmaya devam etmektedir. Bu makale, SARS-CoV-2 spike proteinini ifade eden ve lusiferaz raporlayıcı gen taşıyan, fare lösemi virüsü (MLV) tabanlı pseudotipli parçacıkların üretimi için son derece optimize edilmiş bir protokolü tanımlıyor; bu protokol, biyogüvenlik seviyesi 2 koşullarında viris girişinin incelenmesini mümkün kılmaktadır. Tanımlanan yöntemler, optimize edilmiş hücre hatlarının kullanımı, maliyet etkin reaktiflerle yüksek transfeksiyon verimliliği, yüksek etkili pseudovirüslerin üretimi ve enfektiflik titrasyonu ile tarama testleri için minimum viral girdisini belirlemeyi detaylandırmaktadır. Temsilci sonuçlar, enfekte olmayan kontrollere kıyasla enfekte hücrelerde güçlü lusiferaz aktivitesini gösterirken, kontrol spike-less ve VSV-G-psödovirüsler test özgüllüğünü doğrulamaktadır. Ayrıca, sistem, viral girişinde inhibitör etkileri niceleyerek ve MTT canlılık testi kullanarak sitotoksisiteyi değerlendirerek bileşik taramasını destekler. Genel olarak, bu tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir protokol, yeni viral giriş inhibitörlerinin orta ve yüksek verimli taraması için güvenilir bir platform sağlar; antiviral adayların belirlenmesine ve SARS-CoV-2 giriş mekanizmalarının ilerlemesine katkıda bulunur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2019 sonlarında Ağır Akut Solunum Sendromu Koronavirüs 2'nin (SARS-CoV-2) ortaya çıkması, dünya çapında milyonlarca ölüme yol açan küresel bir pandemiye yol açtı ve artan bulaşabilirlik ve bağışıklık kaçış potansiyeline sahip yeni varyantlarla tehdit oluşturmaya devamediyor 1. Coronaviridae ailesinden bir zarf RNA virüsü olarak, SARS-CoV-2, anjiyotensin dönüştüren enzim 2 (ACE2) reseptörüne bağlanarak ve TMPRSS2 ile diğer konakproteazlar 2,3 tarafından proteolitik aktivasyondan geçirerek konak hücre girişini aralayarak trimerik spike (S) glikoproteinini kullanır. COVID-19 semptomlarını yönetmek için çeşitli tedavi seçenekleri geliştirilmiş olsa da, viral varyantların sürekli evrimi ve hızlı gelişimi, viral girişi incelemek ve enfeksiyonun bu erken aşamasını hedefleyen yeni antiviral bileşikleri değerlendirmek için güvenli ve ölçeklenebilir sistemlere acil ihtiyaçolduğunu vurgulamaktadır 4.

SARS-CoV-2 virüsü, yüksek bulaşım potansiyeli nedeniyle bazı bölgelerde biyogüvenlik seviye 3 ajan5 olarak sınıflandırılmaya devam etmektedir. Bu nedenle, herhangi bir çoğaltıcı laboratuvar görevi yüksek kapsamlı BSL-3 tesisi gerektirir ve bu da çoğu laboratuvarın bu virüsle bilimsel araştırma yapmasını engeller. Pseudotipli virüs tabanlı sistemler, psödovirüsler (PV) olarak da bilinir, biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) laboratuvarlarında viral giriş çalışmalarına olanak tanıyan pratik bir alternatif sunar ve küresel araştırma çabaları için erişimigenişletir. SARS-CoV-2 spike proteinini taşıyan pseudotipli parçacıklar çoğaltıcı değildir, bu da onları virüs girişini değerlendirmek ve küçük molekül inhibitörleri için taramak için güvenli bir vekilyapar 7. Bu parçacıklar, enfekte hücrelerde raporlayıcı sinyalini ölçerek enfeksiyonun hızlı ve nicel tespitini mümkün kılan lusiferaz veya floresan raporlayıcı gen taşıyacak şekilde tasarlanabilir. Fare lösemi virüsü (MLV) veya lentivirüs omurgalarına dayalı sistemler, SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, Ebola virüsü gibi türlerin girişiniincelemek için yaygın olarak kullanılmıştır 8,9,10,11.

Bu protokollerde, Millet veWhittaker 8 tarafından bildirilen çalışmalara dayanarak üç plazmidli bir sistem kullanılarak MLV tabanlı PV üretimini tanımlıyoruz. Kullanılan plazmidler arasında, MLV çekirdek genleri gag-pol (pCMV-MLVgagpol) kodlayan bir paketleme plazmidi, raporlayıcı gen lusiferazı (pTG-Luc) kodlayan bir transfer vektörü ve orijinal Wuhan-Hu-1 varyantına karşılık gelen SARS-CoV-2 spike glikoproteinini ifade eden bir plazmid bulunur. Ayrıca, psödovirüsler, veziküler stomatit virüsünün (VSV-G) G-glikoproteini kullanılarak da üretilir ve bu da daha sonra potansiyel isabetlerin karşı taraması olarak kullanılır. Pseudovirüsler, HEK293 kaynaklı hücrelerde üretilir ve hACE2 ile TMPRSS2'i istikrarlı şekilde ifade eden yüksek hassaslı hücreleri enfekte etmek için kullanılır. Transfeksiyon verimliliği ilk olarak yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonu olan plazmid kullanılarak değerlendirilir. Daha sonra, optimize edilmiş transfeksiyon koşulları kullanılarak, PV'ler bu üç plazmid birlikte transfekte edilerek ve ardından ortaya çıkan virüslerin titrasyonu yapılır. Uygun miktarda PV kullanılarak, virüslerin girişini engelleyebilen bileşikler için 96 kuyulu plakalarda bir test yapılır. Bu protokol, dallanmış polietilen (PEI) yöntemini maliyet etkin bir transfeksiyon reaktifi olarak kullanır ve prosedürlerin daha kolay uygulanmasını sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dallanmış polietilenemin (PEI) kullanılarak HEK293T türemiş hücrelerin yüksek verimli transfeksiyonu

NOT: Bir biyogüvenlik kabininde tüm adımları standart aseptik teknik ve BSL-2 prosedürleriyle gerçekleştirin. Transfeksiyon ve pseudotipli virüslerin oluşumu için HEK293T türemiş hücreler kullanın. Bu yöntemde hücreler hücre kültürünle işlenmiş 6 iyi plakalarda transfeksiyon edilir. PEI hisse senedi çözümü, Yang ve meslektaşları (2017)12 tarafından daha önce tanımlandığı şekilde hazırlanmıştır. Pseudovirüsü üretmek için üçlü transfeksiyon yapmadan önce, yüksek transfeksiyon verimliliği (%70-80'den üzer) sağlamak için en iyi PEI-plazmid DNA oranını optimize etmek tavsiye edilir. Bu optimizasyon, yeşil floresan protein (GFP) ekspresyon plazmid transfeksiyonu ve ardından floresan hücrelerin oranını floresan mikroskobu kullanarak kontrol etmesiyle yapılmalıdır. Bu optimizasyon için, plazmid DNA'sını her kuyu başına 2,5 μg sabit tutun ve 1-20 μL aralığında birkaç miktar PEI test edin. İşte bu hücre ve PEI grubu için en iyi koşullar, 6 kuyruklu bir plakada her kuyu başına 5 μL PEI stok çözeltisi (1 mg/mL) ve 2,5 μg GFP ekspresyon eden plazmid içerir.

  1. Tam ortam için toplam 2 mL hacmde, tam ortamda (DMEM-C: Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı, %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 20 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 100 IU/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile takviye edilmiş kuyu başına 7,5 x 10,5 HEK293 türevli hücre, transfeksiyondan 24 saat önce.
    NOT: Hücreler tohumlanırken doku kültür plakasını dairesel hareketlerle hareket ettirmekten kaçının; çünkü bu, kuyunun merkezinde hücre toplanmasına neden olabilir, bu da düzensiz hücre dağılımına ve dönümüzdeki transfeksiyon verimliliğinin düşmesine yol açabilir. Bir deney için yeterli olan bir 6 delikli plaka, bir hücre kontrolü (transfekte edilmemiş) ve geri kalan plaka ise PEI-plazmid DNA'sının birkaç oranını test etmek için yeterlidir.
  2. Hücreleri gece boyunca %5 CO₂ ile 37 °C'de kuluçka yapın. Ertesi gün, hücrelerin yaklaşık %50-60 birleştiğinden emin olun.
  3. Transfeksiyon gününde, steril, 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde PEI-plazmid DNA kompleksleri hazırlanır.
    1. Her kuyu için, 50 μL indirgenmiş serum ortamında 5 μL PEI stoku (1 mg/mL) içeren bir PEI çözeltisi tüpü ve aynı ortamda 50 μL içinde 2,5 μg GFP eksprese eden plazmid içeren bir DNA çözeltisi tüpü hazırlanın.
    2. Birden fazla kuyu transfekte edilecekse, çözümler buna göre ölçeklendirilebilir. Her tüpü girdabla kısa bir süreliğine karıştırın ve 5 saniye boyunca aşağı döndürün. Tüpleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika kuluçka yapın.
  4. Bu kuluçka sürecinde, hücre monotabakasının bozulmasını önlemek için 6 kuyu plakasının her kuyasından ortamı dikkatlice çıkarın. Dikkatlice yerine 1 mL/well tam transfeksiyon ortamı (DMEM-T, DMEM-C ile aynı ama antibiyotiksiz) koyun.
  5. Transfeksiyon kompleksini hazırlayın. 10 dakikalık kuluçkadan sonra, DNA çözeltisi tüpünün 50 μl'sini PEI çözelti tüpüne ekleyin. Hızlıca karıştırın, altı kez yukarı ve aşağı pipetle yapın ve tam 3 dakika RT'de kuluçka yapın. Hemen her karşılık gelen kuyunun hücrelerine kompleks damla olarak eklemeye başlayın.
  6. Plakanın sınırlarını parafilm ve santrifüj ile 1.000 x g ile 30 dakika boyunca RT hızında, frensiz, salıncak rotor ve plaka kovası kullanarak sızdırın.
  7. Santrifüjlemeden sonra parafilmi nazikçe çıkarın ve plakayı 37 °C, %5 CO₂ sıcaklığında 3 saat kuluçka yapın.
  8. İnkubasyondan sonra, her kuyudan transfeksiyon ortamını nazikçe çıkarın ve yerine her kuyu başına 2 mL önceden ısıtılmış DMEM-C ile yavaşça değiştirin.
  9. Transfekte edilen hücreleri %5 CO₂ ile 37 °C'de 48 saat kuluçka yapın.
  10. Floresan mikroskopisi kullanarak GFP ekspresyonuyla transfeksiyon verimliliğini değerlendirin. Floresan hücrelerin sıklığı %70-80'den yüksek olmalıdır (Şekil 1). Bu, bölüm 2'deki bir sonraki yöntemin verimliliği için kritik öneme sahiptir.

2. SARS-CoV-2 spike- ve VSV-G psödotipli psödoviral parçacıkların oluşumu

NOT: Bu yöntem, bölüm 1 ile aynı prosedürü kullanır, ancak GFP plazmidi kullanılmak yerine, hücreler yüksek transfeksiyon verimliliği sağlamak için optimal transfeksiyon koşulları kullanılarak psödotipli virüsler üretmek için gereken üç plazmid ile birlikte transfekte edilir. Protokol ayrıca aşağıdaki üç gerekli koşul için yeterli olan 6-kuyu plakalarda HEK293T türemiş hücreler kullanır: a) transfekte edilmeyen hücreler (bir kuyruk), b) yalnızca MLV ambalaj plazmidi ve lusiferaz raporlayıcı transfer vektörü ile transfekte edilen hücreler (bir kuyruk; spike-less pseudovirüsler) ve c) bu iki plazmid ve spike ekspresyon plazmid ile transfekte edilen hücreler SARS-CoV-2 psödotipli virüsler (dört kuyruk). Burada kullanılan spike ekspresyon plazmid, SARS-CoV-2, Wuhan suşunun spike'ını kodlar ve proteinin PV'lerde verimli sunumunu sağlamak için dizi değişiklikleri içerir. Spike-less pseudovirüs, enfeksiyonlar sırasında daha sonra kontrol olarak kullanılacak, böylece izin veren hücrelerde spike-bağımlı girişi doğrulamak için kullanılacaktır. Benzer şekilde, VSV-G-PV'ler aynı deneysel tasarımla üretilir ve daha sonra potansiyel inhibitör bileşiklerin karşı taraması olarak kullanılır. Daha fazla psödovirüs hacmi gerekirse, protokol iki 6-kuyu plakaya ölçeklendirilebilir ve bu da plaka santrifüjleme aşaması için pratik olabilir.

  1. Transfeksiyondan bir gün önce, tohum HEK293T türemiş hücreleri bölüm 1'de açıklandığı gibi iki 6 kuyu plakaya dönüştürür. Spike-PV üretimi için bir plaka, diğerini ise VSV-G-PV'ler için kullanın.
  2. Transfeksiyon günü, transfeksiyon karışımlarını Tablo 1'de gösterildiği gibi hazırlayın; bu örnek 1.3. adımı takip eder.
    NOT: PEI çözümü daha önce bildirildiği gibihazırlanmıştır 12. PCMV-MLVgagpol ve pTG-Luc plazmidleri Millet veWhittaker 8'den alındı. PVSV-G, plazmid Gee ve ark. 202013'ten alınmıştır. Tüm plazmidler, endotoksinlerden arındırılmış kaliteli hazırlıklar olarak önceden hazırlanmalıdır. Ticari olarak mevcut olan maxiprep kitlerinin kullanılması önerilir; son aşamada düşük bağlayıcı, 0,2 μm şırınga filtresi ile steril filtreleme yapılır.
  3. Her tüpü bölüm 1'de tarif edildiği gibi karıştırın ve RT'de 10 dakika kuluçka yapın.
  4. Bu kuluçka sırasında, hücre monotabakasının bozulmasını önlemek için 6 kuyu plakalarının her kuyusundan ortamı dikkatlice çıkarın. Her kuyuya yavaş yavaş 1 mL önceden ısıtılmış DMEM-T ortamı koyun, böylece ortamın hücrelere doğrudan değil, kuyunun duvarından aşağı akmasını sağlar.
  5. Bölüm 1'de açıklandığı transfeksiyon komplekslerini hazırlayın ve daha önce tanımlanan protokolü kullanarak hücreleri transfekte edin.
  6. Transfeksiyon sonrası 48 saatlik kuluçkadan sonra, süpernatantları toplayın, 50 mL steril konik santrifüj tüplerine aktarın ve 290 x g hassasiyetinde 7 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Hücresiz süpernatantı toplayın ve poliviniliden florür (PVDF) ile filtreleyin, steril 0,45 μm üst şişe filtre ünitesi. 1 mL'lik alikotlar hazırlayın ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: Pseudotipli parçacıklar -80 °C'de birkaç ay boyunca stabil kalır. Bulaştırıcılığı korumak için tekrar eden donma-çözülme döngülerinden kaçının.
SARS-CoV-2 spike-PV'leri için (kuyu başı)VSV-G-PV'ler için (kuyu başı)Spike-less PV'ler için (kuyu başı)
PEI çözümü:
PEI (1 mg/ml)15 μL5 μL5 μL
İngengenç serum ortamı45 μL45 μL45 μL
Plazmid DNA çözeltisi:2
pCMV-MLVgagpol0.79 μg0.79 μg0.79 μg
pTG-luc0.92 μg0.92 μg0.92 μg
pUNO1-spike0.79 μg--
pVSV-G-0.79 μg-
İngengenç serum ortamı50 μL'ye50 μL'ye50 μL'ye

Tablo 1: PV üretimi için transfeksiyon karışımlarının hazırlanması.

3. SARS-CoV-2 ve VSV-G psödotipli parçacıkların titrasyonu

NOT: Bu adım, üretilen pseudotipli parçacıkların bulaşıcı olduğunu doğrulamak ve bileşik tarama gibi sonraki uygulamalar için gereken minimum etkili hacmi belirlemek için gereklidir. Her yeni psödovirüs partisi için titrasyon yapılmalıdır. Bu amaçla, SARS-CoV-2 (HSI hücreleri) ile enfeksiyona karşı yüksek hassaslığa sahip hücreler, azalan miktarda pseudotipli virüslerle enfekte edilir. Spike-insan ACE2 etkileşimi veya VSV-G ile diğer hücresel reseptörlerle aracılık edilen pseudovirüslerin girişi, lusiferaz aktivitesinin bir lüminesans testinde tespit edilmesiyle 72 saat sonra izlenir.

  1. Transdüksiyondan bir gün önce, 96 kuyu doku kültür plakasında 2,5 x 104 HSI hücresini, 50 μL tam ortamda (DMEM-C) tohumlayın. Test edilecek her miktarda psödovirüs için üç kuyu hazırlayın ve enfeksiyon için kuyular ekleyin; ayrıca sivri uçsuz psödovirüsler ve enfekte olmayan hücreler için de kuyular ekleyin. Plakayı gece boyunca %5 CO₂ ile 37 °C'de kuluçka yapın.
  2. Transdüksiyon günü, her psödovirüs partisinden bir aliquot eritin ve buzda test edilin ve nazikçe ters çevirerek karıştırın. Ayrıca spike-less kontrolünün bir aliquotunu da ekleyin. Her kuyuya doğrudan birkaç miktarda pseudovirus preparatı ekleyin (100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5 ve 0.8 μL). Tüm kuyrukların hacmini DMEM-C ile 150 μL'ye ayarlayın.
  3. Plakayı parafilm ve santrifüj ile 2.500 × g ile 45 dakika RT hızında, fren olmadan kapatın.
  4. Parafilm mühürünü çıkarın ve plakayı 37 °C, %5 CO₂'de 72 saat kuluçka yapın.
  5. İnkubasyondan sonra, üreticinin talimatlarını takip ederek lusiferaz testine hazırlanın. Lusiferaz substratını (-80 °C'de depolanmış) ve 5x lusiferaz testi liz tamponu (-20 °C'de depolanmış) eritme ve RT'de (10-15 dakika) dengelendirin.
  6. Lusiferaz testi lizin tamponunu steril suyla 1 kata kadar seyreltin. En az 3 ml hazırlayın.
  7. Her kuyunun üst yüzeyini çok kanallı pipet kullanarak yavaş ve dikkatlice aspire edin ve atın.
  8. Her kuyuya çok kanallı pipet kullanarak 30 μL 1x liz tamponu ekleyin. Plakayı 150 rpm'de 10 dakika boyunca RT hızında bir plaka silkeleyiciye yerleştirin. Tam lizisi ters mikroskop altında doğrulayın (tüm hücreler lizize olmalı ve görsel muayenede ayırt edilemez olmalıdır).
    NOT: Mikroplaka okuyucuyu önceden hazırlayın; substrat eklendikten hemen sonra luminesans algısı yapacak şekilde tutarlılığı sağlamak ve sinyal bozulmasını önlemek için.
  9. Lizatları opak, beyaz bir 96 kuyruklu plakaya aktarın.
  10. Her kuyuya 50 μL lusiferaz substratı ekleyin ve plakayı dairesel hareketlerle kısa süreliğine karıştırın. Plakayı luminometreye yerleştirin ve lüminesansı ölçün.
  11. Elde edilen verileri analiz edin.
    1. Kontrollerin beklenen lüminesans değerlerini verdiğini doğrulayın. Enfekte olmayan hücrelerin çok düşük arka plan lüminesans değerleri verdiğinden emin olun.
      NOT: Spike-less pseudovirüs ile enfekte olan hücreler, enfekte olmayan hücreler seviyesinde değerler vermelidir ve azalan miktarda spike sunan pseudovirüsle enfekte olan hücrelerde yüksek doz bağımlı lüminesans değerleri göstermelidir (Şekil 2). VSV-G-PV'lerin ürettiği lüminesans değerleri genellikle spike-PV'lerden çok daha yüksektir, yaklaşık bir veya iki büyüklük mertebesidir.
    2. Sonraki taramalar için, enfekte olmayan hücrelerin en az yüz ila bin katı kadar sinyal üreten pseudovirüs miktarını seçin.

4. Spike-PV'ler kullanılarak bileşiklerin psödoviral giriş inhibisyonu için taraması

  1. Bölüm 3'te açıklandığı gibi, 50 μL tam ortamda (DMEM-C) her kuyu başına 2,5 x 104 HSI hücresi tohumu 96 kuyuyla bir plakada inceleyin. Gece boyunca 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta kuluçka yapın.
    1. Bileşikler ve psödovirüs için 1'den 11'e kadar sütunlar ve kontrol için 12. sütun içeren bir plaka tasarımını düşünün. 12. sütunda, virüs kontrolü için dört kuyu (sadece psödovirüs) ve enfekte olmayan, tedavi edilmemiş hücreler için dört kuyu ayırın.
  2. Ertesi gün, test edilecek bileşiklerin seri seyreltmelerini (1:3) hazırlanın; 50 μM'den (enfeksiyon sırasında nihai konsantrasyonlar: 50, 16,6, 5,5, 1,8, 0,6, 0,2 ve 0,06 μM) başlayarak DMEM-C içinde %0,5 DMSO içermektedir.
    1. Kolaylık için, seri seyreltmelerin önce yapıldığı ve ardından hücrelerin bulunduğu plakaya (50 μL) aktarıldığı ayrı bir 96 kuyu "seyreltme plakası"nda sulandırılma yapılmasını sağlar.
    2. Bileşik sayısı çok büyükse, yüzlerce veya daha fazla, bu ilk seyreltme serisini yaklaşık 4 noktaya indirin, her seyreltme noktası için tek bir kuyu kullanın ve ön taramayı düşünün. Sonra, potansiyel isabetleri 7 noktalı seri seyreltmelerle, 1:3, üç replika ile yeniden test edin, aynı konsantrasyon 50 μM'den başlayarak.
  3. Bileşik seyreltmeleri hazır olduğunda, hücre ortamını çok kanallı pipet kullanarak nazikçe aspire edin ve ilgili kuyruklara 50 μL bileşik seyreltme ekleyin. 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta 1 saat kuluçka yapın. 12. sütundaki kontroller için sadece DMEM-C ekleyin.
  4. Bileşikleri çıkarmadan, her kuyuyuya aynı konsantrasyonlarda bileşikleri içeren 50 μL hacminde psödotipli SARS-CoV-2 psödovirüsü önceden belirlenmiş miktarda tam ortamda ekleyin. Plakaları parafilm ile mühürleyin.
  5. Plakayı 2.500 × g ile 45 dakika boyunca 45 dakika boyunca büksüz santrifüjle yapın, ardından parafilmi çıkarın ve 37 °C'de, %5CO2 sıcaklığında 72 saat kuluçka yapın.
  6. Bölüm 3'te açıklandığı gibi lusiferaz tabanlı enfektiflik niceliklendirmesine devam edin.
  7. Veri analizi yapın.
    1. Lüminesans değerlerini bir elektronik tabloya aktararak verileri daha sonra veri analizi ve grafik yazılımına aktarmak üzere formatlayın.
    2. Her yoğunlaşma noktasının ortalamasını gösteren çubuk grafikler hazırlayın; ortalama çubukların standart hatasını da dahil. Ayrıca pozitif (sadece PV'ler) ve negatif kontrollerden (enfekte olmayan hücreler) elde edilen değerleri de çizin.
      NOT: Testi sonuçları, 1) enfekte olmayan hücrelerin çok düşük değerleri göstermesi, 2) PV kontrollerinin yüksek değerleri göstermesi, 3) inhibisyonun pozitif kontrolü (örneğin, arbidol veya hACE2-Fc) enfeksiyonun doz bağımlı şekilde inhibisyonunu göstermesi durumunda geçerli sayılır (Şekil 3A, B).
    3. Sonra, bilinmeyen bileşiklerin ürettiği değerleri inceleyerek inhibisyon olup olmadığını ve doza bağlı bir etki olup olmadığını değerlendirin. Eğer öyleyse, bu bileşikleri daha fazla onaylayıcı analizlere tabi tutun.
      NOT: Olası isabetlerin daha fazla doğrulanması için sonraki adımları takip edin. İlk olarak, potansiyel isabet bileşiklerini 4.2. adımda önerildiği gibi yeniden test edin. Doz yanıt etkisi doğrulanırsa, aynı seyreltme serisi kullanılarak VSV-G-PV'lerle enfekte edilen bir karşı tarama yapılabilir. Bu test, giriş inhibisyonunun spike-ACE2 etkileşimine özgü olup olmadığını ve enfekte hücrelerde lusiferaz üretimi sırasında başka bir aşamada interferensiye bağlı olmadığını kontrol etmek için önemlidir (Şekil 3A, B). Burada, pozitif bileşik VSV-G-PV'lere karşı inhibitör bir etkinlik göstermemelidir. Eğer durum buysa, aynı konsantrasyon serisi hücre canlılık testi (MTT testi, bölüm 5'te gösterilmiştir) kullanılarak sitotoksisite açısından test edilmelidir. Özetle, potansiyel bir vuruş bileşiği SARS-CoV-2-spike-PV'lerin inhibisyonunu ve VSV-G-PV'lerin inhibisyonunu göstermemesi veya daha az inhibisyonu ve hücrelerin yaşamlılığının çok daha zayıf bir inhibisyonu olmamalıdır. Lüminesans verileriyle doz-yanıt eğrisinin ayarlanması, PV'lerin inhibisyonu için yarı-maksimum inhibitör konsantrasyonun (IC50) ve canlılık testinden alınan yarı-maksimum sitotoksik konsantrasyonun (CC50) tahmin edilmesine olanak tanır. CC50 / IC50 oranı, pozitif bileşiğin potansiyel faydalılığının önemli bir göstergesi olan seçicilik indeksini (SI) hesaplamak için kullanılır. Doz-yanıt eğrilerinin analizi ve IC50 ile CC50'nin tahmini için çok ayrıntılıprosedürler 14 tanımlanmıştır.

5. MTT tabanlı hücre canlılık testi

  1. 96 kuyu plakasında 50 μL DMEM-C içinde 2,5 x 104 HSI hücresi tohumlayın. Plakayı gece boyunca 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta inkübe edin. Ertesi gün hücrelerin yaklaşık %50 birleşimde olduğundan emin olun. Değerlendirilecek bileşiğin tüm farklı konsantrasyonlarını, işlenmemiş hücreleri ve sadece ortam içeren boş kuyuları üçlü halinde yeterince kuyu, hazır hale getirin. PV giriş inhibisyon testinde değerlendirilen aynı konsantrasyonlarda potansiyel hit bileşikleri test edin.
  2. İnkubasyondan sonra, ortamı dikkatlice çıkarın ve yerine farklı konsantrasyonlarda bileşik içeren 100 μL tam ortam ile değiştirin, değerlendirme için %0,5 DMSO'da değerlendirin.
  3. Plakayı 2.500 × g ile 45 dakika boyunca frensiz RT'de santrifüjle yapın ve 37 °C, %5 CO₂'de 72 saat inkübe yapın. Bu adım, hücreleri önceki bölümde yapıldığı gibi tam olarak yönetmek için dahil edilmiştir, ancak PV'lerin eklenmesi hariç.
  4. DMEM kullanarak 0.5 mg/mL MTT çözeltisi hazırlayın. 0.2 μm filtreleyerek sterilize edin ve karanlıkta kalın.
    NOT: 3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromid (MTT) ışığa hassastır. Karanlıkta donmuş halde tutulmalı.
  5. Her kuyidan ortamı dikkatlice çıkarın ve yerine 100 μL MTT çözeltisi verin. 37 °C'de, %5CO2'de 2 saat kuluçka yapın.
  6. Bu kuluçka sırasında, izopropil alkolde 40 mM HCl içeren bir çözünürme çözeltisi hazırlanır.
  7. MTT çözümünü çok kanallı pipet kullanarak dikkatlice çıkarın, her kuyunun altındaki formazan kristallerini rahatsız etmeden.
  8. Her kuyuya 100 μL çözünürme çözeltisi ekleyin. Plakayı alüminyum folyoya sarıp 150 rpm'de 15 dakika boyunca bir plaka çalkalayıcıya koyun.
  9. 570 nm ve 630 nm'de rekor soğurma oranı elde edildi.
  10. Veri analizi yapın.
    1. Optik yoğunluğun ham değerleri kullanılarak, her kuyu için 630 nm'de elde edilen değerleri 570 nm'de elde edilenlerden çıkarın. Sonra tedavi edilmemiş hücre kuyularının düzeltilmiş değerlerini ortala. Bu tedavi edilmemiş hücreleri %100 canlı olarak değerlendirin.
    2. Daha sonra işlenmiş hücrelerin değerlerini işlememiş hücrelerin kuyruklarına göre normalize ederek, şu formülü kullanır:
      Yaşamlılık (%) = figure-protocol-1
  11. Grafik yaşama yüzdeleri, ortalamanın standart hatasını temsil eden tekrarların ortalamasını temsil eden çubuklar ±± çiz. Veri analizi ve grafik yazılımında uygulanan prosedürler kullanılarak grupları karşılaştırmak için daha fazla istatistiksel analiz yaparak farklı konsantrasyonlarda canlılıkları tedavi edilmemiş hücre kontrolüyle karşılaştırın.
  12. Her konsantrasyon noktasının ortalamalarını, Dunn ile Dunn ile parametrik olmayan Kruskal-Wallis kullanan DMSO ile tedavi edilen hücrelerin ortalamalarıyla karşılaştırın (farklar p-değerleri < 0.05'te anlamlı kabul edilir). Doz-yanıt eğrisini çizmek ve ODdeğerlerinden CC 50'yi tahmin etmek için, bildirilen prosedürü inceleyinelsewere 14.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalsiyum fosfat15, lipid bazlıyöntemler 16 ve hem lineer hem dallanmış PEI gibi birkaç transfeksiyon yönteminin PV ürettiği bildirilmiştir. Bu makale, HEK293T türemiş hücrelerin dallanmış PEI ile transfeksiyonun, genellikle ticari olarak mevcut lipid bazlı transfeksiyon ajanları kullanılarak yapılan transfeksiyon yöntemlerine (veri gösterilmemiş) yüksek verimli transfeksiyon sağladığını göstermektedir (Şekil 1)...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MLV sisteminin diğer virüsler için sahte tipler üretme konusundaki bu çok yönlülüğü, Ebola virüsü18, MERS-CoV8, SARS-CoV19, La Crosse virüsü20, Hantavirus20, Visna virüsü21, Arenavirus22, Grip virüsü23 ve diğerleri gibi diğer önemli virüsler tarafından bildirilmiştir. Bu psödotipler, viral

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SENACYT No.031-2022 ve SNI sözleşmesi No.050-2023 kapsamında mali destek için Sistema Nacional de Investigación (SNI) ve Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT, Panamá) ile Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT, Panamá) ile teşekkür ediyoruz. Ayrıca pCMV-MLVgagpol ve pTG-Luc plazmidlerinin bağışlanması için Dr. Gary Whittaker'a çok minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 & mikro; m Düşük protein bağlayıcı şırınga filtreleri Termo Bilimsel720-1320Şırınga Filtreleri (0.2 μ m,13 mm, PES, steril)
%0,25 Tripsin-EDTA 1X çözeltisiGibco25200-056Tripsin-EDTA (%0,25), fenol kırmızı
0.45 & mikro; m PVDF Şişe Kapaklı Filtre Üniteleri Avantor514-1045Şişe Üstü Vakum Filtrasyon Sistemleri (PVDF, 250 ml, 50 mm, 0,45 µ m)
1.5 mL Steril Mikrosantrifüj TüpleriEppendorf30123611Safe-Lock  Tüpler
100 X Penisilin Streptomisin çözeltisiCorning30-002-CIPenisillin-Streptomisin Çözeltisi, 100x
5 X Luciferase testi lizin tamponu PromegaE2650Promega Bright-Glo Luciferase Test Sistemi'nin bir parçası
50 mL Steril Konik BorularCorning 35207050 mL Yüksek Berraklıkta PP Santrifüj Tüpü, Konik Taban, Steril
6-Well Doku Kültür PlakalarıTermo Bilimsel140675Hücre kültüründe işlenmiş çoklu yemekler
96 Kuyu Doku Kültürü PlakalarıTermo Bilimsel168055Nunc™ MicroWell™ 96-Well, Nunclon Delta ile Arıtılmış, Düz Tabanlı Mikroplaka
Arbidol hidroklorürSigma-AldrichSML0860
Dallanmış polietilenin, 25 kDaSigma-Aldrich408727
Konfokal lazer mikroskobu  (FV 3000)Olympus Co.SKU: FV3000
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD8418
DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) İçinden: Yüksek Glikoz, L-glutamin, Fenol Kırmızısı, Sodyum Piruvat)Gibco11995-065
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco26140-079Isı etkisiz (56 derece ve derece; C, 30 dk)
HEK293T türevli hücreler (Lenti-X 293T hücre hattı)Takara Biyografisi632180HEK293 hücre hattının yüksek derecede transfekte edilebilir alt klonudur ve yüksek düzeyde viral protein ekspresyonunu destekler
HEPES TamponuGibco15630-080
Enfeksiyona karşı yüksek duyarlı hücreler (293T-ACE2. TMPRSS2 (mCherry) Hücre Hattı)BEI KaynaklarıNR-55293HEK293T hücre hattı ACE2 ve TMPRSS2'yi istikrarlı şekilde ifade edecek şekilde değiştirilmiş
Hidroklorik asit Sigma-AldrichH1758-500ML
Ters faz kontrast mikroskobu Olympus Co. SKU: 2404040005
İzopropanolSigma-AldrichI9516-500ML
Lusiferaz substratıPromegaE2650Bright-Glo Luciferase Test Sistemi'nin bir parçası
Lüminesans algılamalı mikroplaka okuyucuAgilent BioTekBTH1MG
MTT [3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromid]Sigma-AldrichM2128
Opak Beyaz 96 Kuyu PlakalarıCorning391796 kuyuyla Solid White Flat Bottom polistiren TC ile işlenmiş mikroplakalar
ParafilmBemisPM999
pcDNA3-EGFP plazmidiAddgene13031pcDNA3-EGFP, Doug Golenbock'tan (Addgene plazmid #13031; http://n2t.net/addgene:13031 ; RRID:Addgene_13031)
pCMV-MLVgagpol plazmid--Dr. Gary Whittaker tarafından nazikçe bağışlanmıştır 
Ca2+ ve Mg2+ (PBS) olmadan fosfatla tamponlanmış tuzlu suCorning21-040-CVFosfatla tamponlu tuzlu sıvı, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1X
Promega PureYield plazmid Maxiprep SistemiPromegaA2393
pTG-Luc plazmidi--Dr. Gary Whittaker tarafından nazikçe bağışlanmıştır 
pUNO1-SARS-CoV-2 Spike (Wuhan) plazmidiInvivogenp1-spike
pVSV-G plazmidiAddgene138479pVSV-G, Akitsu Hotta (Addgene plazmid # 138479; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID:Addgene_138479)
Rekombinant İnsan ACE2-Fc füzyon proteiniInvivogenFC-hace2
İngengeleştirilmiş serum ortamı (Opti-MEM)Gibco31985-070Opti-MEM İndüksiyonlu Serum Ortamı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J., et al. SARS-CoV-2 and emerging variants: Unmasking structure, function, infection, and immune escape mechanisms. Front Cell Infect Microbiol. 12, 869832(2022).
  2. Jackson, C. B., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (1), 3-20 (2022).
  3. Le, K., Kannappan, S., Kim, T., Lee, J. H., Lee, H. -R., Kim, K. K. Structural understanding of SARS-CoV-2 virus entry to host cells. Front Mol Biosci. 10, 1288686(2023).
  4. Ayoub, P. G., et al. Improved SARS-CoV-2 spike glycoproteins for pseudotyping lentiviral vectors. Front Virol. 1, 793320(2021).
  5. Lippi, G., et al. Biosafety measures for preventing infection from COVID-19 in clinical laboratories:IFCC Taskforce Recommendations. Clin Chem Lab Med. 58 (7), 1053-1062 (2020).
  6. Cruz-Cardenas, J. A., et al. A pseudovirus-based platform to measure neutralizing antibodies in Mexico using SARS-CoV-2 as proof-of-concept. Sci Rep. 12 (1), 17966(2022).
  7. Rizatdinova, S. N., Ershova, A. E., Astrakhantseva, I. V. Pseudotyped viruses: A useful platform for pre-clinical studies conducted in a BSL-2 laboratory setting. Biomolecules. 15 (1), 135(2025).
  8. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Murine leukemia virus (MLV)-based coronavirus spike-pseudotyped particle production and infection. Bio Protoc. 6 (23), e2035(2016).
  9. Millet, J. K., et al. Production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting. J Vis Exp. (145), e59010(2019).
  10. Eichler, M., Aksi, E., Pfeilschifter, J., Imre, G. Application of pseudotyped virus particles to monitor Ebola virus and SARS-CoV-2 viral entry in human cell lines. STAR Protoc. 2 (4), 100818(2021).
  11. Thomas, J., et al. Development of a pseudo-typed virus particle based method to determine the efficacy of virucidal agents. Sci Rep. 14 (1), 2174(2024).
  12. Yang, S., Zhou, X., Li, R., Fu, X., Sun, P. Optimized PEI-based transfection method for transient transfection and lentiviral production:PEI-based transfection for lentiviral production. Curr Protoc Chem Biol. 9 (3), 147-157 (2017).
  13. Gee, P., et al. Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nat Commun. 11 (1), 1334(2020).
  14. Ferrara, F., Temperton, N. Pseudotype neutralization assays:From laboratory bench to data analysis. Methods Protoc. 1 (1), 8(2018).
  15. Soneoka, Y., et al. A transient three-plasmid expression system for the production of high titer retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 23 (4), 628-633 (1995).
  16. Chen, Y., Miller, W. M., Aiyar, A. Transduction efficiency of pantropic retroviral vectors is controlled by the envelope plasmid to vector plasmid ratio. Biotechnol Prog. 21 (1), 274-282 (2005).
  17. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  18. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses:Identification of receptor-deficient cell lines. J Virol. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  19. Giroglou, T., et al. Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein. J Virol. 78 (17), 9007-9015 (2004).
  20. Ma, M., Kersten, D. B., Kamrud, K. I., Wool-Lewis, R. J., Schmaljohn, C., González-Scarano, F. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan bunyaviruses:A system for analysis of cell tropism. Virus Res. 64 (1), 23-32 (1999).
  21. Bruett, L., Clements, J. E. Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism. J Virol. 75 (23), 11464-11473 (2001).
  22. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446 (7131), 92-96 (2007).
  23. Wang, W., et al. Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies. J Virol Methods. 153 (2), 111-119 (2008).
  24. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53(2021).
  25. Sholukh, A. M., et al. Evaluation of cell-based and surrogate SARS-CoV-2 neutralization assays. J Clin Microbiol. 59 (10), e0052721(2021).
  26. Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiol Res. 258, 126993(2022).
  27. Johnson, M. C., et al. Optimized pseudotyping conditions for the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. J Virol. 94 (21), e01062-e01120 (2020).
  28. Xiaojie, S., Yu, L., Lei, Y., Guang, Y., Min, Q. Neutralizing antibodies targeting SARS-CoV-2 spike protein. Stem Cell Res. 50, 102125(2021).
  29. Cao, L., et al. De novo design of picomolar SARS-CoV-2 miniprotein inhibitors. Science. 370 (6515), 426-431 (2020).
  30. Monteil, V., et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell. 181 (4), 905-913.e7 (2020).
  31. Ahmad, I., Pawara, R., Surana, S., Patel, H. The repurposed ACE2 inhibitors:SARS-CoV-2 entry blockers of COVID-19. Top Curr Chem. 379 (6), 40(2021).
  32. Alqaaf, M., et al. Discovering natural products as potential inhibitors of SARS-CoV-2 spike proteins. Sci Rep. 15 (1), 200(2025).
  33. Chan, C. C. -Y., et al. Identification of novel small-molecule inhibitors of SARS-CoV-2 by chemical genetics. Acta Pharm Sin B. 14 (9), 4028-4044 (2024).
  34. Lei, C., et al. Neutralization of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus by recombinant ACE2-Ig. Nat Commun. 11 (1), 2070(2020).
  35. Wang, X., et al. The anti-influenza virus drug, arbidol is an efficient inhibitor of SARS-CoV-2 in vitro. Cell Discov. 6 (1), 28(2020).
  36. Kang, Y., Shi, Y., Xu, S. Arbidol:The current demand, strategies, and antiviral mechanisms. Immun Inflamm Dis. 11 (8), e984(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ps dovir s DeneyiAntiviral TaramaMLV Ps dovir sleriSpike ProteiniLusiferaz ReporterY ksek Kapasiteli TaramaH cre TransfeksiyonuViral Giri Mekanizmalar

İlgili makaleler