Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Birincil mikrogliada glikolizin ekstraselüler akı testi kullanılarak araştırılması

253 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69638

⸱

10 Nisan 2026

 , 
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University of Newfoundland

Bu makalede

Özet

Bu protokol, birincil fare mikrogliasında metabolik yeniden programlamayı niceliklendirmek için glikoliz stres testi yapmanın maliyet etkin bir yolunu tanımlar. İzolasyon ve inflamatuar uyarımdan sonra, taze hazırlanmış, pH-ayarlanmış reaktiflerle hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) ölçülür, ardından protein normalizasyonu uygulanarak glikolitik değişimlerin doğru ve tekrarlanabilir değerlendirilmesini sağlar.

Özet

Merkezi sinir sisteminin yerleşik makrofaj hücreleri olan mikroglia, fizyolojik ve patolojik ipuçlarına yanıt olarak metabolik programlarını dinamik olarak değiştirir. Bu metabolik değişimleri anlamak, iltihaplanmadaki rollerini aydınlatmak için çok önemlidir. Burada, neonatal fare beyin korteklerinden izole edilen primer mikrogliaların glikolitik profilini, ekstrasellüler akı analizöründe glikoliz stres testi kullanılarak değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu test, laktat gibi düşük pH ile ilişkili glikolitik aktivite göstergesi olan ECAR'ın gerçek zamanlı ölçümüne olanak tanır. Yaklaşımımız, farklı koşullarda kültürlenmiş mikrogliaların tedavisini ve metabolik yolların çeşitli uyaranlara, özellikle pro-inflamatuar uyaranlara yanıt olarak nasıl değiştiğini incelemeyi içerir. Benzersiz bir şekilde, laboratuvarımız glikoz, oligomisin ve 2-deoksiglukoz (2DG) dahil olmak üzere farklı reaktiflerin taze stok çözeltilerini hazırlayarak, yolun farklı yönlerini hedefliyor ve her reaktif için pH dikkatlice ayarlanarak deneysel doğruluk ve tekrarlanabilirlik sağlanıyor. Bu yöntem, primer mikroglialarda glilizin incelenmesi için sağlam bir platform sağlar ve inflamatuar veya hastalıkla ilgili koşullarda fonksiyonel durumları hakkında içgörü sunar.

Giriş

Merkezi sinir sistemindeki hücreler, normal ve hastalık koşullarına yanıt olarak enerji üretme biçimlerinideğiştirir 1,2. Ana metabolik yollar arasında, glikoliz ve oksidatif fosforilasyon (OXPHOS), bağışıklık hücresi fonksiyonlarını düzenleyen anahtar yollardır - bunlar sırasıyla pro-inflamatuar ve anti-enflamatuar durumlara karşı sağlam ve anında bir reaksiyon gerçekleştirmek içinolurlar 3,4. Böylece, bağışıklık hücreleri inflamatuar sinyallere yanıt olarak metabolik yollar ile fonksiyonel durumlar arasında geçiş yapabilir5. Mikroglia, miyeloid muadilleri gibi, işlevlerine metabolik olarak bağlıdır ve alternatif bir metabolik yakıt olarak farklı yollara hızla uyum sağlar; bu da metabolik esneklikgösterir 6,7. Mikroglia, iltihap sırasında hızlı metabolik yeniden programlanmaya geçirilir; gelişmiş glikoliz, pro-inflamatuar durumların anahtar metabolik imzasıolarak hizmet eder 8. Bu nedenle, metabolik fenotipe hücresel bağımlılığı tespit eden testler, çeşitli koşullar altında fonksiyonel durumlarını incelememize olanak tanır. Mevcut protokolde, primer mikrogliaların pro-inflamatuar durumlarda artan glikolize bağlı olup olmadığını belirlemeyi hedefliyoruz. Bunun için rutin olarak glikoliz stres testi testleri yapıyoruz. Seahorse XFe24 analizörü (ekstraselüler akı analizörü), ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarında ve dönüştürülmüş hücrelerde ECAR ölçümü için yaygın olarak kullanılsa da, birincil mikroglia sınırlı hücre verimleri, değişken yapışma özellikleri ve kültür koşullarına yüksek hassasiyet gibi benzersiz teknik zorluklar yaratır; bu da metabolik ölçümleri karıştırabilir. Ayrıca, ECAR'ın gerçek zamanlı ölçümü sağlar ve laktat kaynaklı glikolizin birden fazla zaman noktasında hassas değerlendirilmesini sağlar; bu da yalnızca son nokta laktat testleriyle yakalanabilir. Hücre dışı akış tabanlı metabolik profilleme, metabolizma araştırmalarında hücre biyoenerjisini karakterize etmek için yaygın olarak benimsenmiştir; bu da bu protokolü, aktivasyon, hastalık modelleme veya ilaç testi sırasında hücrelerdeki metabolik değişimleri araştıran çalışmalar için oldukça uygundur. Okuyucular, birincil hücrelerde dinamik, yüksek çözünürlüklü glikolitik ölçümlere olan ihtiyaçlarına göre uygunluğu belirleyebilirler.

Glikoz, glikoliz yoluyla piruvaya metabolize edilir ve ardından sitoplazmada laktata veya mitokondride CO₂ ve suya dönüştürülür. Glikozun laktata dönüşümü, protonların hücre dışı boşluğa salınmasına yol açar ve bu da ortam asitlenmesine yol açar. Ekstraselüler akı analizörü, bu asitleşmeyi ECAR9 olarak nicelleştirir. Glikoliz stres testinde, hücreler önce glikoz ve piruvat içermeyen bir ortamda kuluçka yapılır ve temel ECAR kaydedilir. İlk enjeksiyon, hücrelerin glikoliz yoluyla metabolize ederek piruvasyona dönüşerek ATP, NADH, su ve protonlar üreten doygunluk miktarında glukoz sağlar. Artan proton salınımı, ECAR'ı yükseltir ve bu da 'glikoliz'i yansıtır. Sonra, oligomisin mitokondriyal ATP sentezini engellemek için eklenir ve hücreler yalnızca glikolize dayanmaya zorlar. Proton gradyanındaki bu değişim ECAR'ı daha da artırır ve hücrenin maksimum glikolitik kapasitesi olarak ölçülür. Son olarak, bir glukoz analoji olan 2DG tanıtılır. Heklookinazı rekabetçi şekilde inhibe eder, glikolizi engeller ve ECAR'ı azaltır. Bu düşüş, önceki ECAR'ın glikolize bağımlı olduğunu doğrular. Maksimum glikolit kapasite ile glikoliz seviyesi arasındaki fark, glikolitik rezervi tanımlar. Glukoz eklemeden önceki ilk ECAR, diğer hücresel süreçlerden kaynaklanan glikolitik olmayan asitleşmeyi temsil eder (Şekil 1).

Ekstraselüler akı analizörü kullanarak bir glikoliz stres testi yaptık. Ham ECAR değerleri analiz için Excel'e aktarıldı. Her durum için, bazal ECAR (glikoz eklenmeden önce), glikoliz (glikoz enjeksiyonundan sonra) ve glikolit kapasiteye (oligomisin tedavisinden sonra) karşılık gelen zaman noktalarını belirledik. Her fazda ve dört teknik kopya boyunca ilgili zaman noktalarından ECAR değerleri ortalansa alındı ve glikoliz, glikoz eklendikten sonra ECAR artışı olarak hesaplandı. Glikolitik kapasite, oligomisin eklendikten sonra ECAR artışı olarak hesaplandı. Glikolitik rezerv, 2DG enjeksiyonu sonrası ECAR'da azalma olarak hesaplandı. Bu ortalama değerler daha sonra gruplar arasındaki metabolik yanıtları karşılaştırmak için kullanıldı.

Öte yandan, oksijen tüketim oranını (OCR) değerlendirmek ve mitokondriyal fonksiyonları değerlendirmek için mitokondriyal stres testi (Agilent) standart yaklaşımdır ve temel solunum, ATP bağlantılı solunum, proton sızıntısı, maksimum solunum, yedek solunum kapasitesi ve mitokondriyal olmayan solunum gibi parametreleri ölçer. Bu ölçümler, belirli mitokondriyal inhibitörler, oligomisin (ATP sendaz inhibitörü), FCCP (Karbonil siyanid-4 (trifluorometoksi) fenilhidrazon), maksimum solunumu yönlendiren bir ayrıcı ve rotenon/antimisin A (karmaşık I/III inhibitörleri) sıralı enjekte edilerek elde edilir; böylece mitokondriyal sağlık ve biyoenerjiklerin nicel olarakdeğerlendirilmesine olanak tanır 10,11,12,13 . Bu nedenle ECAR testleri ve OCR testleri farklı koşullar altında yapılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve Memorial University of Newfoundland Hayvan Bakım Komitesi'nden protokol numarası 22-01-DK kapsamında onay almıştır.

1. Deneylerin başlamasından önceki hazırlıklar

  1. Diseksiyon çözeltisi hazırlamak için 1x HBSS'ye 10 mM HEPES ekleyerekCa 2+ veMg 2+ olmadan hazırlanın.
  2. 2–3 beyin başına sindirim çözeltisi hazırlanır; 1 mL %2,5 tripsin (10x stok, seyreltilmemiş), 2 mL diseksiyon çözeltisi ve 200 μL DNaz I (1 mg/mL) birleştirilir.
  3. Karışık glia ortamını %10 FBS, 1x Glutamax ve 1x antibiyotik/antimikotik takviyesi ile DMEM ile hazırlayın.
  4. DMEM'i %10 FBS, 1x Glutamax, 1x MEM NEAA, 1x sodyum piruvat ve 1x penisillin/streptomisin ile takviye ederek mikroglia ortamı hazırlayın.

2. Karma glia kültürleri için kaplama (Şekil 2A)

  1. 1. gün:
    1. C57BL/6C farelerinden doğum sonrası gün (P0)-P2 yavrularını toplayın, korteksleri stereo mikroskopla çıkarın ve meningeleri çıkarın. Sonra, korteksleri diseksiyon çözeltisinde küçük parçalara ayırın ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Dokuların tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
    2. Diseksiyon çözeltisini dekant edin ve yerine 2–3 beyin başına 3 mL sindirim çözeltisi verin. 2 mL serolojik pipet kullanarak dokunun ayrılması için nazikçe tritüre yapın.
    3. Tüpleri 37 °C'de bir kuluçka makinesindeki bir rotora yerleştirin ve her 8 dakikada bir 2 mL serolojik pipet kullanarak tritürasyon yaparak toplamda yaklaşık 24 dakika boyunca karıştırın.
    4. Doku sindirimlerinin ardından, hücreleri 300 x g ile oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Sonra, süpernatantı atın ve pelleti 5 mL karışık glia ortamında tekrar askıya alın.
    5. 18 G'lik bir iğneyi 5 mL'lik bir enşiringede kullanarak hücreleri tritüre ile geçirin, ardından 70 μm naylon hücre süzgecinden geçirin. Toplanan hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 300 x g ile tekrar santrifüj yapın.
    6. Pelleti başlangıçta 1 mL karışık glia ortamında yeniden süzülün ve hücre topaklanmasını gidermek için birkaç kez tritürat yapın, ardından daha yüksek hacimde tekrar süzülerek her T75 şişesinde 12 mL'ye kadar süzülün (her şişe için 2–3 beyin korteksi önerilmektedir)
      NOT: Termosa Poly-D-Lizin veya başka bir reaktifle kaplamak zorunlu değildir.
  2. 2. günde, tüm medya maddesini değiştirin ve taze karışık glia ortamı ekleyin.
  3. 3. günde, medyanın yaklaşık üçte ikisini taze karışık glia ile değiştirin. Hücrelerin yedi gün daha büyümesine izin verin, toplamda 10 gün boyunca.
    NOT: Bu noktada bir astrosit tabakası gözlemlenebilir.
  4. 6. günde, medyanın üçte 2'sini taze karışık glia malzemesiyle değiştirin. Birleşen bir astrosit tabakasının varlığını doğrulayın.

3. Saf birincil mikroglia elde edilmesi (Şekil 2A)

NOT: Yaklaşık 10. günde, astrosit tabakasının üstünde yüzen küçük, yuvarlak hücreler görünür; bunlar ağırlıklı olarak mikrogliyadır (Şekil 2B).

  1. Termosunu 250 rpm'de 37 °C'de 2 saat boyunca sallayın. Yüzen hücreleri içeren tüm ortamı 15 mL'lik konik bir tüpe halinde topla ve 300 x g hassasiyetinde 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
  2. Pellet, hücre kültürü mikroplakalarında mikroglia ortamında yeniden askıya alın ve hücre kültürü mikroplakalarında hücre kültürü mikroplakalarında yaklaşık 250.000 hücre plakası ile örtün.
    NOT: Üç T75 şişesinden mL'de yaklaşık 3–4 milyon hücre elde edilir; hücre kültür plakalarının poli-D-lizin veya diğer reaktiflerle kaplaması zorunlu değildir.
  3. Mikroplakayı %5CO2 ile 30–45 dakika boyunca kuluçka edin. Bundan sonra, ortamı tekrar değiştirerek saf bir mikroglia kültürü elde edin ve hala yüzen oligodendrositleri çıkarın. Hücreler ertesi gün tedaviye hazırdır (Şekil 2C).
  4. Hücre tohumlamasında 'arka plan' kontrolü olarak belirlenen dört kuyu hariç tutuluyor: her satırda bir tane (Şekil 3C). Bu kuyular analiz medyası alır.
    NOT: Kullanılmayan kuyular ortam buharlaşmasını önlemek için steril su veya PBS ile doldurulsun ve hücreleri sabit satırlar veya sütunlar yerine rastgele bir desenle kaplamak için plaka bazlı değişkenliği en aza indirin.

4. Primer mikroglia'nın pro-inflamatuar uyarıcıyla tedavisi

  1. 11. günde, hücreleri 24 saat boyunca 100 ng/mL lipopolisakkarit (LPS) ile tedavi edin. Konumsal etkileri elemek için kontrol ve LPS ile işlenmiş kuyuları rastgele yapın.
    NOT: Tedavi süreleri deneysel koşullara bağlı olarak değişebilir ve önceden optimizasyon gerektirir.

5. Deneyi yürütmeden bir gün önce ekstraselüler akı testi için hazırlık

  1. 11. günde, tüm kuyulardan kalibrasyon plakasına (24-kuyu formatı; hücre dışı akı test kiti) 1 mL kalibrasyon tamponu ekleyin. Plakayı gece boyunca CO2 olmadan 37 °C'de tutun.
    NOT: Kalibrasyon plakası 4 enjeksiyon kuyusundan oluşur. Glikoliz stres testi için Port A'ya glikoz, Port B'ye oligomisin eklenir ve 2DG Port C'ye enjekte edilir (bkz. Şekil 4A).
  2. Glukoz ve 2DG stok çözeltileri hazırlayın
    1. Glikoz – 90 mg glikozu 2mL ekstraselüler akı analiz ortamında çözündürür (Malzeme Tablosu). Başlangıçta, ertesi gün pH 1N NaOH ile ayarlandığında nihai hacmin 2 mL'yi geçmemesi için yaklaşık 1,9 mL içinde çözündürün; bu molalariteyi korumak için kritiktir.
    2. 2DG – 328 mg'yi 2 mL ekstraselüler akı analiz ortamında çözüp çöz.
      NOT: Hem glikozu hem de 2DG'yi gece boyunca 4 °C'de sakla
  3. Aliquot 30-40 mL test ortamını 50mL konik bir tüpte saklayıp ertesi gün testleri yapmak üzere 4 °C'de saklayın.

6. Ekstraselüler Akış Testi (12. Gün)

  1. 12. günde, önceden oluşturulmuş glikoz, 2DG ve alitasyon testi ortamını 37 °C'de ısıtın. Glikoz ve 2DG'nin pH'ını ve alikotlanan analiz ortamının pH'ını 7.4'e ayarlayın; 1N NaOH'u kademeli adımlarla (örneğin, 5 μL, ardından 10 μL) ekleyin.
  2. pH 7'nin üzerine çıkana kadar düzen karıştırmak için kısa bir girdap kullanın.
    NOT: Tutarlı pH izleme için pH göstergesi şeritleri önerilir.
  3. 2 mL pH ayarlanmış test ortamına 2 μL 10mM oligomisin stok çözeltisi ekleyin.
    1. 10mM oligomisin stok çözelti hazırlanması: 10 mg oligomisin şişesini 1mL steril DMSO'da yeniden yapılandırın, 10 mg/mL konsantrasyon elde edin ve -80 °C'de depolayın, daha fazla kullanıma kadar.
  4. Hücreleri inkübatörden (4. adımdan) çıkarın ve ortamı 1,5 mL mikro santrifüj tüplerinde toplayıp 300 x g sıcaklıkta 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  5. Süpernatantı topla (hücreleri/kalıntıları temizlemek için pelleti at) ve 8. Adımda belirtilen laktat ölçümleri için -80 °C'de sakla.
  6. Hücreleri 1 mL pH ayarlanmış test ortamıyla çok nazikçe yıkayarak hücrelerden kalkmamayı önleyin.
  7. Test ortamını atıp 500 μL pH ayarlanmış analiz ortamı ekleyin ve 37 °C'de (CO2 olmadan) 45 dakika ile 1 saat inkübe yapın.
  8. Bu arada, gerekli tüm inhibitörleri hücre dışı akı analizörünün kalibrasyon plakasına kendi portlarındaki dahil edin - tüm kuyulardan sol üstteki port A'ya 55 μL glikoz, sağ üst kuyulardan port B'de 60 μL oligomisin ve sol alt alt kuyulara (arka plan kuyuları dahil) port C'de 65 μL 2DG (bkz. Şekil 4A).
    NOT: Her adımda hacim artışı, molariteyi korumak için gereklidir; çünkü önceden glikoz ve oligomisin eklendiğinde hacim artar.
  9. İnhibitörü ekledikten sonra, Agilent Seahorse Wave yazılımını kullanarak bir glikoliz stres testi kurun (bkz. Şekil 3). Sonra, uyarıldıktan sonra kalibrasyon plakasını çalıştırın.
    NOT: Kalibrasyon plakasını makineye yerleştirmeden önce plakanın üst kapağını ve plakalar arasındaki pembe kapağı çıkarın. Bu aşamada, pH ve O2 sensörleri test edilecek ve kalite kontrol edilecektir.
  10. Kalibrasyon bittikten sonra, makine kalibrasyon plakasını boşaltmayı ve kültür plakasını yüklemeyi önerir.
    1. Adım I: Analiz Şablonunu Seç (Şekil 3A)
      1. Wave yazılımını açın ve Şablonlar bölümünden deney için uygun test şablonunu seçin.
      2. Bu durumda, ekstrasellüler akı analizöründe "XF Glycolysis Stress Test" i seçin.
    2. Adım II: Grupları ve enjeksiyon stratejilerini tanımlayın (Şekil 3B)
      1. Grup Tanımları sekmesine gidin ve deneysel gruplar oluşturun (örneğin, Arka Plan, Kontrol ve LPS).
      2. Her porta enjekte edilecek bileşikleri seçerek Enjeksiyon Stratejisini tanımlayın (örneğin, glikoz, oligomisin, glikoliz stres testi için 2DG; bu ayarlar yazılım tarafından varsayılan olarak önceden ayarlanmıştır, buna göre kontrol edin).
    3. Adım III: Grupları Levha Haritasına Atama (Şekil 3C)
      1. Plaka Haritası görünümünü açın ve grup isimlerini (örneğin, Arka plan = siyah, Kontrol = yeşil, LPS = kırmızı) levha düzenine sürükleerek her gruba kuyular atayın.
      2. Doğru normalleştirme için boş/arka plan kuyruklarının belirlendiğinden emin olun.
    4. Adım IV: Protokolü Kurun (Şekil 3D)
      1. Protokol sekmesi altında, ölçüm döngülerini ve enjeksiyonları programlayın. Glikoliz stres testinin tipik dizisi arasında glikolitik olmayan asitleşme, glikolizi ölçen → Port A, glikoliz kapasitesini ölçen Oligomisin (Port B) enjeksiyonu, glikolitik kapasiteyi →ölçen 2-DG (Port C) enjeksiyonu → glikolitik rezervi ölçer yer alır
      2. Her enjeksiyondan sonra ölçüm döngülerinin sayısını belirleyin ve zamanlamayı ayarlayın (örneğin, 3 dakika karışım, 2 dakika bekleme, 3 dakika ölçüm).
        NOT: Deneylerimizde yazılımın varsayılan ayarlarını kullanıyoruz.
      3. Testi yapmadan önce toplam test süresini gözden geçirin.
    5. Adım V: Normalizasyon (Şekil 3E)
      1. Verileri Wave yazılımında bicinchoninic acid (BCA) testinden elde edilen protein konsantrasyon değerleriyle normalize edin, yerleşik normalizasyon seçeneği kullanılarak (örneğin, protein içeriği, hücre numarası veya diğer mevcut yöntemlerle). Protein konsantrasyon ölçümleri Tablo 1'de gösterilmiştir.
        NOT: ECAR ölçümü sonrası BCA testi için proteinin izole edilmesi protokolü aşağıdaki Adım 7'de açıklanmıştır.

7. Verilerin nicelendirilmesi ve normalizasyonu için hücrelerin toplanması

  1. Hücre dışı akı testi tamamlandıktan sonra, kültür plakasını çıkarın ve ya hemen protein ekstraksiyonuna geçin ya da plakayı protein çıkarımı için hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Protein testleri, farklı tedavi koşullarında değerleri normalleştirmemize olanak tanır (verileri normalleştirmek için kullanılan yöntemlerden biridir, tek yöntem değildir).
  2. Hemen protein izolyasyonu için, analiz ortamını kuyulardan çıkarın ve bir kez 500 μL RT PBS (1x) ile yıkayın (hücre monotabakasının bozulmasını en aza indirmek için nazik bir yıkama önerilir).
  3. Bu süreçte ayrılabilecek hücreleri toplamak için, plakayı 300 × g ile 5 dakika boyunca bir kez santrifüjlenin, PBS'yi atın ve ortaya çıkan pelleti RIPA tamponunda tekrar askıya alınarak doğru toplam protein ölçümleri sağlanır.
  4. Her kuyuya yaklaşık 75–100 μL RIPA tamponu ekleyin ve plakayı 30 dakika (RT) boyunca bir sallayıcıya (düşük-orta dönüş) yerleştirin. Sonra, içeriği taze 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: RIPA tamponunu 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüpüne aktarmadan önce kuyularda iyi karıştırın ve tritüre yapın.
  5. Hücrelerin doğru lizisi için mikrosantrifüj tüpünü bir rotator üzerinde yaklaşık 30 dakika RT'de kuluçka edin. Bu süre zarfında, santrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutabilirsiniz.
  6. Hücre lizatını 16.000 x g ile 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Pelleti atın çünkü hücresel kalıntılar içerecektir.
  7. BCA testi (veya başka bir tercih edilen yöntem) kullanılarak protein niceliği için üst katmanı toplayın. Ya hemen hareket edin ya da tüm analiz ortamlarını çıkardıktan sonra lizatları -20 °C'de (kısa süreli depolama için) veya -80 °C'de (uzun süreli depolama için) depolayın.
  8. Numuneleri -20 °C veya -80 °C'de depoladıktan sonra yeniden başlatırken, onları buzda yaklaşık 20–30 dakika eritin, kısa bir girdap/spin yapın ve standart BCA protokolüne devam edin.
  9. Alternatif olarak, hücreleri bir hemositometre veya akış sitometresi aracılığıyla sayarak normalizasyon stratejilerine entegre edin. Bu durumda, test tamamlandıktan ve analiz ortamı çıkarıldıktan hemen sonra yaklaşık 100–200 μL tripsin (önceden 37 °C'ye ısıtılmış) eklenin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın. Hücreleri topla, tripsin etkilerini nötralize etmek için %10 FBS 100–200 μL ekleyebilirsiniz.
    1. Hücreleri 300 x g ile 5 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı çıkarın ve pelleti yaklaşık 1 mL %10 FBS ile tekrar süzülerek hemositometre ile saymaya devam edin. Alternatif olarak, hücreler 15 dakika boyunca %4 PFA ile sabitlenebilir ve ardından akış sitometrisine dayalı hücre sayımı yapılabilir.
      NOT: Hücre sayımı hemen devam edilirse, PFA tabanlı fiksasyon zorunlu değildir.
  10. Her kuyudaki 7.8. Adım protein konsantrasyonu veya 7.9.1 Adım hücre sayısı ile ECAR değerlerini Dalga yazılımı ile normalleştirin; Dalga yazılımı gibi, Adım 6.10.5.1'de olduğu gibi. Ortaya çıkan değerler, glikoliz stres testi için normalleştirilmiş değerlerdir.
  11. Sonuçları ve grafiği, her veri noktası değeri için "Dışa Aktar" seçeneği, ardından "Grafik Pad Prizması" seçeneği ve "Excel tablosu" ile oluşturun.
    NOT: Hücre kültür plakasında, dört belirlenmiş boş kuyunun seçimi esnektir ve deneyci tarafından ayarlanabilir. Varsayılan boş düzen Şekil 3C'de gösterilmiştir.

8. Kültür süpernatantlarından laktat ölçümleri

  1. 12. günde toplanan ve 6.5. Adımdan itibaren −80 °C'de depolanan süpernatant aliquotları buz üzerinde yavaşça çözülür.
  2. Üreticinin protokolüne uygun olarak florometrik modda L-laktat analiz kiti kullanılarak L-laktat konsantrasyonlarını belirleyin.
    Not: Florometrik mod, kolorimetrik testten çok daha hassastır.
  3. Sunulan laktat standardının seri seyreltilmesiyle standartlar hazırlanarak 0 ile 0,1 nmol/well arasında bir kalibrasyon eğrisi oluşturulur.
  4. Örnekleri ve standartları berrak 96 kuyruklu bir mikroplakaya ekleyin, ardından laktat enzim karışımı ve floresan probu içeren reaksiyon karışımını her kuyuya ekleyin.
  5. RT'de ışıktan korunarak 30 dakika kuluçka yapın. Floresans yoğunluğunu, uyarılma/emisyon dalga boyları 535/587 nm olarak ayarlanmış bir floresans mikroplaka okuyucu ile ölçün.
  6. Standart eğriden örneklerdeki laktat konsantrasyonlarını hesaplayın ve bunları pM olarak ifade edin. Tedavi edilmemiş (kontrol) ve LPS ile işlenmiş primer mikrogliaların süpernatantlarından elde edilen laktat seviyeleri Tablo 2'de sunulmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hücre dışı akış tabanlı glikoliz stres testi, primer mikroglia'nın glikolitik profilini başarıyla ölçer. Test, bazal glikoliz, yani glikoz enjeksiyonu sonrası glikoliz, oligomisin enjeksiyonundan sonra glikoliz kapasitesi ve 2DG enjeksiyonu sırasında glikolizin inhibisyonunu ölçür. Deneyimizde, kontrol (tedavi edilmemiş) ve LPS ile tedavi edilen primer mikroglia karşılaştırdık. 24 saat sonra kontrol ve LPS ile işlenmiş mikroglia arasında hafif morfolojik değişiklikler gözlemledik (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Nöroinflamasyon sırasında mikroglial yanıt, bu hücrelerin fonksiyonel durumlarının enerjik ve biyosentetik gereksinimlerini karşılamasını sağlayan derin metabolik yeniden yapılandırmayla birlikte gelir. Hücre dışı akı tabanlı glikoliz stres testi, glikolitik akının ölçülmesi için hassas ve gerçek zamanlı bir yöntem sunar ve primer mikrogliaların pro-inflamatuar koşullarda metabolizmalarını nasıl adapte ettiğini incelememizi sağlar. Bu çalışmada, primer fare mikroglialarını kullandık ve k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ilan edecek bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Çalışma, DKK'ya CIHR proje hibesi aracılığıyla finanse edilmektedir. Seahorse testi XFe24 analizörü için Dr. Craig Moore'a yapılan RTI büyük takdir edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1M HEPES çözümüSigma AldrichH0887
1X HBSSGibco   14175-079
%2,5 TripsinGibco   15090-046
2DGMillipore sigma D6134
Antibiyotik/Antimikotik Gibco15240-062
D – (+)Glikoz, susuz  Termoscientif   A16828.36
DMEMGibco  11965-092
DNase IMillipore sigma 11284932001- Roche
FBSFisherbrandFB12999102
GlutamaxGibco   35050-061
L-Laktat KitiAbcamAB65330
LPS Sigma Aldrich  L4391
MEM NEAA Gibco   11140-050
Oligomisin AMillipore sigma 495455
Penisilin/StreptomisinGibco   15240-062
pH gösterge şeritleriFisherbrand13-640-516
Seahorse XFe24Agilent TeknolojileriYokGenel adı: Ekstraselülük akı analizörü
Seahorse 24 V7 PS hücre kültürü mikroplakalarıÇevik Deniz Atı100777-004Genel adı: Ekstraselülük akı hücre kültürü mikroplakaları
Deniz atı testi XF Kalibrant tamponu (pH 7.4)Agilent Seahorse   100840-000Genel adı: Hücre dışı akı kalibrant tamponu
Deniz atı testi XF DMEM ortamı (pH 7.4)Agilent Seahorse     103575-100Genel adı: Ekstraselülör akı testi ortamı
Deniz atı ekstraselüler akı test kitiAgilent Seahorse 102342-100Genel adı: Ekstraselülük akı kalibrasyon plakası 
Sodyum piruvat Gibco   11360-070

Kaynaklar

  1. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179, 292-311 (2019).
  2. Tay, T. L., et al. Unique microglia recovery population revealed by single-cell RNAseq following neurodegeneration. Acta Neuropathol. Commun. 6, 87(2018).
  3. Wang, Z., et al. Glycolysis and oxidative phosphorylation play critical roles in natural killer cell receptor-mediated natural killer cell functions. Front. Immunol. 11, 202(2020).
  4. Soto-Heredero, G., Gómezde Las Heras, M. M., Gabandé-Rodríguez, E., Oller, J., Mittelbrunn, M. Glycolysis-a key player in the inflammatory response. FEBS J. 287, 3350-3369 (2020).
  5. O'Neill, L. A., Kishton, R. J., Rathmell, J. A guide to immunometabolism for immunologists. Nat. Rev. Immunol. 16, 553-565 (2016).
  6. Bernier, L. P., et al. Microglial metabolic flexibility supports immune surveillance of the brain parenchyma. Nat. Commun. 11, 1559(2020).
  7. Bernier, L. P., York, E. M., MacVicar, B. A. Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function. Trends Neurosci. 43, 854-869 (2020).
  8. Geric, I., et al. Metabolic reprogramming during microglia activation. Immunometabolism. 1, e190002(2019).
  9. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol. Cells. 47, 100095(2024).
  10. Zhang, Z., et al. Glutamine metabolism modulates microglial NLRP3 inflammasome activity through mitophagy in Alzheimer’s disease. J. Neuroinflammation. 21, 261(2024).
  11. Wang, L., et al. Glucose transporter 1 critically controls microglial activation through facilitating glycolysis. Mol. Neurodegener. 14, 2(2019).
  12. Lu, J., Zhou, W., Dou, F., Wang, C., Yu, Z. TRPV1 sustains microglial metabolic reprogramming in Alzheimer's disease. EMBO Rep. 22, e52013(2021).
  13. Orihuela, R., McPherson, C. A., Harry, G. J. Microglial M1/M2 polarization and metabolic states. Br. J. Pharmacol. 173, 649-665 (2016).
  14. Cheng, J., et al. Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation. J. Neuroinflammation. 18, 129(2021).
  15. Kaushik, D. K., et al. Enhanced glycolytic metabolism supports transmigration of brain-infiltrating macrophages in multiple sclerosis. J. Clin. Invest. 129, 3277-3292 (2019).
  16. Hu, Y., et al. mTOR-mediated metabolic reprogramming shapes distinct microglia functions in response to lipopolysaccharide and. Glia. 68, 1031-1045 (2020).
  17. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Front. Cell. Neurosci. 14, 22(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Glikoliz MikrogliaGlikoliz Stres TestiMikroglia MetabolizmasECAR l mNeonatal Fare BeyniPro nflamatuar Stim lasyonlarGlikoz MetabolizmasMetabolik Yolaklar
Birincil mikrogliada glikolizin ekstraselüler akı testi kullanılarak araştırılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.