PI3K/Akt/Nrf2 yolunun modülasyonu yoluyla kalseolarioside A ile gliomada ferroptoz indüksiyonu

Özet

Bu çalışma, Calceolarioside A'nın gliomada terapötik potansiyelini inceleyerek PI3K/Akt sinyalini inhibe etme ve Nrf2 bozulmasını teşvik etme yeteneğini göstererek, ferroptoz indükte ve tümör ilerlemesini hem in vitro hem de in vivo baskıladığını göstermektedir.

Özet

Bu protokol, glioma modellerinde Fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K)/Protein Kinaz B (Akt)/Nükleer faktör eritroid 2-ilişkili faktör 2 (Nrf2) yolunun ferroptoz indüksiyonu ve modülasyonu üzerindeki Kalseolariosid A'nın (CaA) etkilerini incelemek için kullanılan deneysel iş akışını göstermektedir. Bu işlemler, CaA tedavisi sonrası hücre canlılığı, proliferasyon ve kemosensitivliği değerlendirmek için U251 ve U87 insan glioma hatlarında hücre tabanlı bir dizi testleri içermektedir. Ferropatoz ile ilişkili değişiklikler, reaktif oksijen türleri (ROS), glutatyon (GSH), malondialdehit (MDA) ve labile demir seviyeleri ölçülerek, glutatyon peroksidaz 4 (GPX4), sistein/glutamat antiporter alt birimi (xCT) ve ferritin gibi ferroptozla ilişkili proteinlerin western blot yoluyla ifade edilmesi ile değerlendirilir. Yol katılımını değerlendirmek için protokol, Nrf2 ekspresyonu ve ubiquitinasyonu için qRT-PCR, western blot ve immünopresipitasyona dayalı testleri detaylandırmaktadır. Feroptoz düzenlemesindeki rolünü doğrulamak için Nrf2 aşırı ekspresyon deneyleri dahil edilmiştir. Protokol ayrıca, U87 hücrelerinin deri altı olarak implante edildiği ve ardından in vivo tümör büyümesi ve toksisitesini değerlendirmek için intraperitoneal CaA uygulamasının uygulandığı bir fare xenograft modelinin kullanımını da göstermektedir. Sistemik güvenliği değerlendirmek için ana organların histolojik analizi yapılır. Ayrıca, moleküler kenetleme CaA ile PI3K p110α alt birimi (PIK3CA) arasındaki doğrudan bağlanmayı tahmin etmek için kullanılır. Bu prosedürler birlikte, ferroptoz mekanizmalarını ve glioma araştırmalarında doğal bileşiklerin terapötik etkinliğini incelemek için tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar.

Giriş

Gliomalar, özellikle yüksek dereceli glioblastomalar, hızlı çoğalma, tedaviye direnç ve kötü^{prognoz 1} ile karakterize edilen en ölümcül beyin tümör türlerinden biridir. Son yıllarda, temozolomid gibi geleneksel kemoterapötikler ve^{kurkumin 2}, resveratrol³ ile epigallocatechin^{gallate 4} gibi çeşitli doğal bileşikler dahil olmak üzere çeşitli anti-glioma ajanları araştırılmıştır. Bu ajanlar, apoptozun indüksiyonu, anjiyogenezin inhibisyonu ve oksidatif stres yollarının modülasyonu gibi birçok mekanizma yoluyla etkilerini gösterir. Ancak, bu bileşiklerin çoğu, zayıf biyoyararlanım veya eksik mekanik karakterizasyon gibi sınırlamalarla karşı karşıyadır. Bu, sadece anti-tümör aktivitesini doğrulamakla kalmayıp, aynı zamanda altta yatan farmakolojik mekanizmaları sistematik olarak analiz eden kapsamlı metodolojilere olan kritik ihtiyacı vurgular. Böyle mekanik iş akışlarının oluşturulması, yeni anti-glioma bileşiklerinin keşfinden preklinik doğrulamaya kadar geliştirilmesini hızlandırmak için özellikle önemlidir.

Bu hedefi desteklemek için, giderek artan sayıda çalışma artık mekanik çözünürlüğü artırmak için gelişmiş hesaplamalı ve deneysel araçları^{entegre etmektedir 5,6}. AlphaFold3 ve moleküler kenetlenme gibi yapı tabanlı ilaç tasarımı ve yapay zeka (AI) modelleri, benzeri görülmemiş hız ve doğrulukla umut vadeden uyuşturucu-hedef etkileşimlerinin tanımlanmasını^{kolaylaştırıyor 7,8}. Bu araçlar, laboratuvar doğrulamasından önce bağlanma eğilimlerini tahmin ederek ve potansiyel moleküler hedefleri belirleyerek deneysel yöntemleri tamamlar. Aynı zamanda, yol tabanlı fonksiyonel testler, canlı hücre görüntüleme ve yüksek çözünürlüklü proteomik tekniklerin ortaya çıkışı, araştırmacıların oksidatif stres yanıtları, sinyal iletim zincirleri ve ferroptoz ^9,10,11 gibi hücre ölüm modaliteleri dahil olmak üzere birden fazla düzenleyici eksen boyunca yeni bileşiklerin hücresel etkisini değerlendirmelerini sağlar.

Glioma biyolojisinde yer alan sinyal yolları arasında, Fosfatidilinizozit 3-kinaz (PI3K)/Protein Kinaz B (Akt) ve nükleer faktör eritroid 2-ilişkili faktör 2 (Nrf2) yolları, tümör büyümesi, redoks homeostazı ve tedavi direncindeki rolleri nedeniyle özellikle ilgi ^çekicidir. PI3K/Akt sinyalizasyonu, glioma hücrelerinde hayatta kalma, proliferasyon ve metabolik adaptasyonu desteklerken, Nrf2 antioksidan yanıtının ana düzenleyicisi olarak ferroptotik hücre ölümünü^bastırır14. Bu yolların sürekli aktivasyonu tedaviden kaçınmaya katkıda bulunur ve farmakolojik müdahale için cazip hedefler^{haline getirir 15}. Yol sorgulama için geleneksel yöntemler arasında toplam ve fosforile proteinler için western blotlama ile gen ifade analizi için qRT-PCR bulunur. Ancak, Nrf2 sinyalinin derinlemesine analizi, protein stabilitesi, nükleer translokasyon ve ubiquitinasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonları değerlendiren ek testler gerektirir. Bu çok yönlü tespit stratejileri, belirli bileşiklerin redoks regülasyonu ve ferroptotik kontrolü nasıl bozduğunu veya pekiştirdiğini anlamak için gereklidir.

Kalseolariosid A (CaA), hidroksisinamik asit türevi olarak, aynı anda PI3K/Akt sinyalini inhibe ederek ve Nrf2'nin proteazomal bozulmasını teşvik ederek ferroptotik duyarlılığı artırarak çift bir mekanizma sunar. Bu çift hedefli strateji, antioksidan savunmaların aşağısında etkili olan erastin veya RSL3 gibi mevcut ajanlara göre tekrarlanabilirliği ve mekanistik derinliği artırabilir. Bu protokol, CaA'nın farmakolojik mekanizmasını incelemek için entegre bir deneysel yaklaşım sunar; PI3K bağlanma noktalarını belirlemek için moleküler kenetleme, Nrf2 ekspresyonu ve ubiquitinasyonunu tespit etmek için imimünoblotlama ve imimmünopresipitasyon, ayrıca reaktif oksijen türleri (ROS), glutatyon (GSH) ve malondialdehit (MDA) gibi ferroptoz belirteçleri içerir. Ayrıca, CaA'nın terapötik etkinliği ve sistemik güvenliği değerlendirilmek için bir xenograft fare modeli kullanılır. Bu kapsamlı iş akışı, kanser karşıtı ajanların etki mekanizmasını incelemek için tekrarlanabilir ve bilgilendirici bir platform sunar; özellikle sinyal yolu modülasyonu ve hücre ölümünün düzenlenmesini entegre eder.

Protokol

Hücre kültürü ve tedavisi
Murine HT22 nöronal hücreleri ve insan glioma U87 ile U251 hücre hatları, Dulbecco'nun Modified Eagle Ortamında, %10 fetal sığır serumu ve 4 mM L-glutamin takviyesi altında, nemlendirilmiş koşullarda, 37 °C ve %5 CO₂ ile kültürlendi. Deneysel tutarlılığı kolaylaştırmak için tüm hücre tedavileri standartlaştırılmış ve burada tanımlanmıştır. Bu bölüm, her tedavi grubunda kullanılan özel koşulları ve ilgili sonraki analizleri özetlemektedir.

CaA tedavisi:
HT22 hücreleri, 72 saat boyunca artan CaA konsantrasyonlarıyla (0, 0.1, 0.5, 1, 10, 50, 100, 250 ve 500 μM) işlendi. U87 ve U251 glioma hücreleri, çoğu deney için 24 saat boyunca 5, 20 veya 50 μM konsantrasyonlarda CaA ile tedavi edildi; zaman akışı çalışmaları için ise 0, 6, 12 veya 18 saat için 50 μM ile işlendi. Bu tedaviler şu analizlerde kullanıldı: sistein/glutamat antiporter alt birimi (xCT) için western blotlama, glutation peroksidaz 4 (GPX4), ferritin (FTH1), glutaminaz ve PI3K/Akt/memeli hedefi Rapamisin (mTOR)/ ökaryot Başlatma Faktörü 4B (EIF4B) (toplam ve fosforile seviyeler); Nrf2 ve Kelch benzeri ECH-ilişkili protein 1 (Keap1) için gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR); 2′,7′-diklorodihidroflorescein diasetat (DCFH-DA) kullanılarak ROS ölçümü; GSH ve MDA nicelikleri; FerroOrange tabanlı Fe²⁺ tespiti; 5-etinil-2′-deoksiyuridin (EdU) proliferasyon testi; Koloni oluşumu testi; 3-(4,5-dimetilttiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) hücre canlılık testi.

Liproksstatin-1 (Lip1) ortak tedavisi:
Hücreler, 50 μM CaA eklenmeden önce 2 saat boyunca 50 nM Lip1 ile önceden işlendi. Bu koşullar MTT testinde (0, 24, 48, 72 saat) kullanıldı; koloni oluşumu testi; EdU testi; Annexin V/PI apoptoz testi (20 nM sisplatin ile veya olmadan).

MG132 ortak tedavisi:
Hücreler yalnızca 10 μM MG132 ile veya 50 μM CaA ile birlikte 24 saat boyunca tedavi edildi. Bu, Nrf2 protein stabilizasyonu (tam ve nükleer) için western blotting'e uygulandı; Ubiquitinated Nrf2 ve Keap1 için immünopresipitasyon (IP) testleri.

Sisplatin ortak tedavisi:
Hücreler yalnızca 20 nM sisplatin veya 20 μM CaA ile birlikte 24 saat boyunca tedavi edildi. Bu tedaviler Annexin V/propidium iyodid (PI) apoptoz testinde kullanıldı.

Nrf2 aşırı ifadesi:
Hücreler, transfeksiyon ajanı kullanılarak 2,5 μg Nrf2 aşırı ekspresyon plazmidi veya boş vektörle 18 saat transfeksiyon yapıldı, ardından 24 saat boyunca 50 μM CaA ile işlendi. Bu durum, xCT, GPX4, FTH1 ve glutaminaz için western blotting'de kullanıldı; ROS, MDA, GSH testleri; FerroHücre içi demir için turuncu boyama.

Bir iş akışı diyagramı (Ek Şekil S1), yukarıdaki deneysel koşulları ve ilgili analizleri özetler. Bu şekil, her tedavi protokolünü daha iyi netlik ve tekrarlanabilirlik için belirli aşağı akış testleriyle görsel olarak bağlar.

Hücre yaşamlılığının değerlendirilmesi
Hücre yaşamalılığı, daha önce tanımlandığı gibi geleneksel MTT kolorimetrik yöntemle^{değerlendirildi 16}. HT22, U251 ve U87 hücreleri 96 kuyruklu kültür plakalarına yerleştirildi ve yapışma sağlanması için gece boyunca kuluçka edildi. İşlem süresi tamamlandıktan sonra, her kuyuya 15 μL MTT çözeltisi eklendi ve plakalar 37 °C'de 4 saat kuluçka edildi. Daha sonra ortam atıldı ve formaz kristallerini çözünürmek için 150 μL dimetil sülfoksit (DMSO) eklendi. Emilim, mikroplaka okuyucu kullanılarak 490 nm'de kaydedildi. Daha yüksek emilim değerleri daha yüksek hücre canlılığını gösterirken, emilimdeki azalma sitotoksik etkileri gösterir.

EdU şirket testi
DNA sentezi ve hücre çoğalmasını değerlendirmek için, daha önce açıklandığı gibi EdU görüntüleme kiti kullanılarak EdU inkorporasyon testleri^yapıldı. Kısa bir süreliğine, U251 ve U87 glioma hücreleri 24 kuyu levhalarına tohumlanmıştır. Tedaviden sonra, hücreler EdU (10 μM nihai konsantrasyon) ile kuluçka yapıldı ve ek 24 saat kültürlendi. İnkubasyon aşamasının ardından, hücreler %4 paraformaldehit kullanılarak sabitlenmiş, ardından %0,5 Triton X-100 ile permeabilize edilmiş ve kit talimatlarına göre boyanmıştır. EdU-pozitif hücrelerin (çoğalan hücrelerin) yüzdesi floresan mikroskopisi ile nicelendirildi ve toplam 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyalı çekirdeklere normalleştirildi.

Koloni oluşumu testi
Koloni oluşumu testi için, U251 ve U87 glioma hücreleri, düşük yoğunlukta (her tabak başına 500 hücre) 3,5 cm kaplarda kaplandı. Tedaviden sonra, kültür ortamı taze, ilaçsız ortamla değiştirildi ve hücreler koloni oluşumuna izin vermek için 14 gün daha korundu; her üç günde bir ortam değişimi yapıldı. Ortaya çıkan koloniler daha sonra %4 paraformaldehit kullanılarak sabitlenmiş, %0,1 kristal menekşe ile boyanmış ve mikroskop altında manuel olarak sayılmıştır. 75 μm çapı üzerindeki kümeler koloni olarak puanlandı. Her deney üç kez yapıldı ve üç kez tekrarlandı. Bu test, uzun vadeli proliferatif kapasitenin değerlendirilmesi için yaygın kabul edilen^{protokollere uydu 18}. Koloniler yoğun, dairesel kümeler halinde görünmelidir; Daha az ve küçük koloniler azalmış çoğalma kapasitesini gösteriyor.

Hücre apoptozunun değerlendirilmesi
Apoptotik hücre ölümü, daha önce tanımlandığı gibi FITC-Annexin V apoptoz tespit kiti kullanılarak^{değerlendirildi 16}. U87 ve U251 glioma hücreleri, boyamadan önce 24 saat boyunca 20 μM CaA varlığı veya yokluğunda 20 nM sisplatin ile tedavi edildi. Feroptoz inhibisyonunu içeren deneyler için, hücreler 2 saat boyunca 50 nM Lip1 ile önceden tedavi edildi, ardından 20 μM CaA ve 20 nM sisplatin ile ek 24 saat birlikte tedavi edildi. Belirtilen işlemlerden sonra, hücreler (300 × g, 5 dakika) toplandı ve üreticinin talimatlarına göre Annexin V-FITC ve PI ile boyandı. Etiketlemeden sonra örnekler akış sitometresinde incelendi. Veri toplama, spektral örtüşmeyi en aza indirmek için tazminat ayarları uygulanarak FL1 (FITC) ve FL2 (PI) kanalları kullanılarak gerçekleştirildi. Annexin V-pozitif hücrelerin oranı daha sonra apoptozun derecesi belirlenmek için hesaplandı.

Western Blot analizi
Western blotting, yerleşik^{prosedürlere göre yapıldı 19,20}. Kısa bir süreliğine, belirtilen tedavilerden sonra, hücreler proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren RIPA tamponunda lizize edildi ve protein seviyeleri Bradford testi kullanılarak belirlendi. Nrf2 subhücre dağılımını değerlendiren deneyler için, üreticinin talimatlarına göre ticari nükleer ekstraksiyon kiti kullanılarak nükleer ve sitoplazmik proteinler çıkarıldı.

Her örnekten toplam 40 μg protein %10 SDS-PAGE jel üzerinde çözüldü ve ardından PVDF membranlarına aktarıldı. Zarlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBST'de hazırlanan %5 yağsız sütle (%0,1 Tween-20 içeren PBS) tıkandı, ardından 4 °C'de primer antikorlarla gece boyunca kuluçka yapıldı. Yıkamadan sonra, HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikorlar (1:5.000) 37 °C'de 1 saat uygulandı ve sinyaller geliştirilmiş kemilyünlüminesans (ECL) sistemi kullanılarak tespit edildi.

xCT, glutaminaz, GPX4 ve FTH1 ifade seviyeleri, yük kontrolü olarak gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) kullanılarak ölçüldü. Fosforile proteinler (p-PI3K, p-Akt, p-mTOR ve p-EIF4B) ilgili toplam protein seviyelerine göre nicelendirilirken, toplam proteinler GAPDH'ye göre normalleştirildi. Nükleer Nrf2 Lamin B'ye normalize edildi. Beklenen sonuçlar arasında Nrf2 ve p-PI3K/Akt/mTOR/EIF4B'de doz ve zamana bağlı azalma ile CaA ile tedavi edilen hücrelerde ferroptoz ile ilgili belirteçlerin aşağı regulasyonu yer almaktadır.

Ubiquitinasyon testleri için, hücreler 24 saat boyunca MG132 (10 μM) ile CaA veya CaA olmadan (50 μM) ile işlendi. Liziden sonra, protein kompleksleri anti-Nrf2 veya anti-Keap1 antikorları kullanılarak immunüstürüpsiyon edildi; normal tavşan IgG negatif kontrol olarak kullanıldı. İmmünopresipitatlar daha sonra anti-ubiquitin antikorlarıyla incelenerek ubiquitinated formları tespit edildi, ayrıca toplam lizatlar da Nrf2 ve Kelch benzeri ECH-ilişkili protein 1 (Keap1) seviyeleri için inandı olarak incelendi.

RNA çıkarımı ve nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR)
RNA çıkarımı ve qRT-PCR standart^{protokoller 21} uyarınca gerçekleştirildi. Kısaca, U87 ve U251 glioma hücreleri farklı sürelerde (6 ve 18 saat) 50 μM CaA ile veya olmadan tedavi edildi. Toplam RNA izole edilip ters transkripsiyon yoluyla cDNA'ya dönüştürüldü. Nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR), gerçek zamanlı PCR platformunda SYBR Green qPCR Master Mix kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Göreli gen ifadesi 2-ΔΔCt hesaplaması kullanılarak belirlendi. Nrf2, Keap1 ve ev genleri GAPDH için kullanılan primer diziler şunlardır:

Nrf2 önde, 5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′;
Nrf2 reverse, 5′-GGAATGTCTGCGCCAAAAGCTG-3′

Keap1 ileri, 5′-CAACTTCGGCTGAGCAGATTGGC-3′;
Keap1 reverse, 5′-TGATGAGGGTCACCAGTTGGCA-3′

GAPDH forvet, 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′;
GAPDH tersi, 5′-AGCCTTCTACATGGTGGTGAAGAC-3′

Nrf2 transdüksiyonu
U251 ve U87 glioma hücreleri, lipid tabanlı transfeksiyon reaktifi kullanılarak ya bir Nrf2 aşırı ekspresyon plazmidi ya da karşılık gelen boş kontrol vektörüyle geçici olarak transfekte edildi; Prosedür, geleneksel geçici transfeksiyon^{yöntemlerine dayanıyordu 22}. Kısa süreliğine, hücreler 6 delikli plakalara 3 × 10⁵ hücre yoğunluğunda tohumlanarak transfeksiyon anında yaklaşık %70-80 birleşme elde edilerek gece boyunca kültürlendi. Her kuyu için, 2,5 μg plazmid DNA'sı 125 μL Indirgenmiş Serum Ortamında seyreltildi ve 5 μL transfeksiyon reaktifiyle karıştırıldı. Ayrıca, transfeksiyon reaktifinden 3,75 μL daha indirgenmiş serum ortamında 125 μL daha seyreltilmiştir. Sulandırılmış DNA ve transfeksiyon reaktif karışımları daha sonra birleştirilip nazikçe karıştırılmış ve oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçka edilerek kompleks oluşumu sağlanmıştır. Ortaya çıkan transfeksiyon kompleksleri (toplam hacim 250 μL) her hücre içeren her kuyuya taze tam ortamda damla olarak eklendi.

CO₂ kuluçka makinesinde 37 °C'de 18 saat kuluçka sonrası, transfeksiyon ortamı taze kültür ortamı ile değiştirildi. Hücreler daha sonra western blotting, ROS analizi, MDA/GSH nicelti ve demir birikimi çalışmaları dahil olmak üzere sonraki testler yapıldı. Bu protokol, yaygın olarak kabul gören geçici gen ifade prosedürlerini takip eder ve transfeksiyondan 24-48 saat sonra sağlam Nrf2 ifadesine olanak tanır.

Hücre içi demirin ölçümü
Hücre içi Fe²⁺ seviyeleri, floresan gösterge FerroOrange kullanılarak ölçüldü. Kısaca, U251 ve U87 glioma hücreleri 24 kuyruklu plakalara tohumlanarak farklı konsantrasyonlarda CaA (5, 20 ve 50 μM) işlendi. Nrf2 aşırı ekspresyonunun ferroptoz üzerindeki etkisini değerlendirmek için U87 ve U251 hücreleri bir Nrf2 ekspresyon plazmidi veya boş vektörle transfekte edildi. 18 saat sonra ortam değiştirildi ve hücreler 24 saat boyunca 50 μM CaA ile işlendi. Daha sonra, hücreler serumsuz ortamda 1 μM FerroOrange ile maruz kaldı ve analiz öncesinde 37 °C'de 30 dakika kuluçka edildi. Kuluçkadan sonra, hücreler durulmuş ve TRITC filtre seti (uyarılma ~543 nm, emisyon 560-600 nm) kullanılarak floresan mikroskobu altında durulmuş ve gözlemlenmiştir; burada artan turuncu floresan yoğunluğu genellikle sitoplazmada lokalize olan daha yüksek labile Fe²⁺ seviyelerini gösterir. Bu yöntem, yerleşik floresan prob tabanlı demir^{testlerinden uyarlanmıştır 23}.

GSH ve MDA'nın Ölçümü
Hücre içi GSH ve MDA seviyeleri, oksidatif stres²⁴ değerlendirmesi için standart değerlendirme protokolleriyle belirlenmiştir. Kısaca, U251 ve U87 glioma hücreleri 24 kuyruklu plakalara tohumlanarak farklı konsantrasyonlarda CaA (5, 20 ve 50 μM) işlendi. Nrf2 aşırı ekspresyonunun ferroptoz üzerindeki etkisini değerlendirmek için U87 ve U251 hücreleri bir Nrf2 ekspresyon plazmidi veya boş vektörle transfekte edildi. 18 saat sonra ortam değiştirildi ve hücreler 24 saat boyunca 50 μM CaA ile işlendi. Daha sonra, hücreler RIPA tamponunda lizize edildi ve toplam protein konsantrasyonları BCA protein niceleme kiti kullanılarak ölçüldü. GSH ve MDA içerikleri, üreticilerin protokollerine uygun olarak ticari tespit kitleri kullanılarak analiz edildi.

ROS testi
Hücre içi ROS üretimi, belirlenmiş protokollere uygun olarak floresan prob DCFH-DA kullanılarak^{değerlendirildi 25}. Kısaca, U251 ve U87 glioma hücreleri 24 kuyruklu plakalara tohumlanarak farklı konsantrasyonlarda CaA (5, 20 ve 50 μM) işlendi. Nrf2 aşırı ekspresyonunun ferroptoz üzerindeki etkisini değerlendirmek için U87 ve U251 hücreleri bir Nrf2 ekspresyon plazmidi veya boş vektörle transfekte edildi. 18 saat sonra ortam değiştirildi ve hücreler 24 saat boyunca 50 μM CaA ile işlendi. Daha sonra, hücreler 37 °C'de 5 μM DCFH-DA ile 1 saat işlendi, ardından fazla boya giderilmesi için PBS yıkamaları yapıldı. Floresans sinyalleri, FITC filtresi (uyarılma 488 nm, emisyon 525 nm) ile donatılmış ters floresans mikroskobu kullanılarak görselleştirildi ve analiz için görüntüler alındı. Artan yeşil floresans yoğunluğu, hücre içi ROS seviyelerinin yükselmesine karşılık gelir.

Hayvan deneyleri
Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ndeki tavsiyelere sıkı sıkıya uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Protokol, Weifang Halk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından [2025SDL579] onay numarasıyla onaylanmıştır. Glioma ksenograft modelini oluşturmak için, 2 × 10⁶ U87 hücresi 0.2 mL PBS içinde yeniden süspansiyona getirildi ve 4 haftalık erkek BALB/c çıplak farelerin sol yanağına deri altı aşılandı. Tümörlerin 7 gün boyunca gelişmesine izin verildikten sonra, fareler rastgele üç gruba (her grup başına n = 8) ayrıldı: tedavi edilmemiş kontrol, CaA ile tedavi edilen (2,5 mg/kg) ve CaA (2,5 mg/kg) ile Lip1 (10 mg/kg) kombinasyonlu. Tedaviler 14 gün ardışık olarak günlük intraperitoneal enjeksiyonla uygulandı. Tümör boyutları her 3 günde bir kaliperlerle ölçüldü ve hacimler şu formülle hesaplandı: hacim = (uzunluk × genişlik²) / 2. 21. günde, tüm fareler ötenazi edildi, tümörler çıkarılıp daha fazla analiz için fotoğraflandı.

RNA dizileme ve KEGG yol analizi
RNA dizilemesi, CaA maruziyetinden sonra transkripsiyonel değişiklikleri profillemek için gerçekleştirildi. RNA bütünlüğü, Illumina platformunda dizilemeden önce mikrohacimli UV-VIS spektrofotometresi ve kapiller tabanlı elektroforez sistemi kullanılarak doğrulandı. Temiz okumalar, HISAT2 ile insan referans genomuna (GRCh38) eşlendi ve gen ifadesi FPKM olarak nicele edildi. Farklı şekilde eksprese edilen genler DESeq2 kullanılarak tanımlandı (FDR < 0.05, |log₂FC| ≥ 1) ve fonksiyonel zenginleştirme KEGG yol analiziyle (ayarlanmış P < 0.05) değerlendirildi.

Moleküler kenetlenme analizi
CaA ile PI3K/Akt yolu arasındaki etkileşimi tahmin etmek için moleküler kenetlenme kullanıldı. İnsan PI3K katalitik alt birimi p110α'nin (PIK3CA) kristal yapısı, Protein Veri Bankası'ndan (PDB ID: 8BFU) elde edilmiştir. CaA'nın yapısı PubChem'den alındı ve moleküler modelleme yazılımı kullanılarak enerji minimize edildi. Moleküler kenetlenme hazırlık yazılımı kullanılarak, PIK3CA yapısından tüm su molekülleri ve temel olmayan ligandlar çıkarıldı ve hidrojen atomları eklendi. PIK3CA'nın aktif bölgesi etrafında (bilinen bağlanma sitesi koordinatlarına dayanarak) bir kenetlenme ızgarası tanımlandı ve kenetlenmeyi gerçekleştirmek için bir kenetlenme algoritması kullanıldı. CaA'nın en yüksek puan alan bağlanma pozları, bağlanma afinitesine (kcal/mol) göre seçildi ve ana etkileşimler açısından incelendi. Hidrojen bağları ve hidrofobik temaslar gibi protein-ligand etkileşimleri, moleküler görselleştirme yazılımı ve 2D etkileşim haritalama aracıyla görselleştirildi.

Güvenlik ve atık bertarafı
DMSO, floresan boyalar (DCFH-DA, FerroOrange) ve fiksatifler gibi kimyasal reaktiflerle ilgili tüm deneyler, uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) ile birlikte eldiven ve güvenlik gözlüğü dahil bir duman davlumbonunda gerçekleştirildi. DMSO ve floresan problar, deriye nüfuz edebilme yetenekleri ve potansiyel sitotoksisite nedeniyle temkinli şekilde ele alındı. Pipet uçları, kültür plakaları ve eldivenler gibi kirlenmiş maddeler belirlenmiş tehlikeli atık konteynerlerine atıldı. Hayvan dokuları ve leşleri biyotehlike atıkları olarak muamele edildi ve kurumsal biyogüvenlik düzenlemeleri ile yerel çevre yönergelerine göre yakıldı veya otoklavlandı.

İstatistiksel analiz
Tüm sonuçlar ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. İki grup arasındaki farklar, iki kuyruklu Öğrenci t-testi kullanılarak değerlendirildi. Birden fazla grubu içeren analizler için, tek yönlü ANOVA ve ardından uygun sonradan karşılaştırmalar (örneğin Tukey testi) uygulandı. 0.05'in altında olan p-değeri istatistiksel anlamlılık göstergesi olarak kabul edildi.

Sonuçlar

CaA ile in vitro olarak U251 ve U87 hücrelerinin proliferasyon baskılanması ve kemosensitivliği artırıldı
Şekil 1A , CaA'nın yapısını göstermektedir. İlk olarak, normal fare HT22 nöronal hücreleri ve insan glioma U251 ve U87 hücreleri üzerinde MTT testi kullanarak CaA'nın sitotoksik etkilerini değerlendirdik. Tedavi edilmemiş hücrelerle (0 μM CaA) karşılaştırıldığında, CaA, 72 saat boyunca 100 μM'in altındaki konsantrasyonlarda ...

Tartışma

CaA, glioblastomada iki kritik hayatta kalma eksenini benzersiz şekilde modüle ederek etkileyici bir antitümör etkisi sergiler: PI3K/Akt/mTOR yolu ve Nrf2-ferroptoz savunma mekanizması. PI3K/Akt yolu, glioblastoma multiforme'de (GBM, vakaların ~%88-90'ına kadar değişir) PTEN kaybı veya RTK aktivasyonu nedeniyle sıklıkla hiperaktive olur; bu da proliferasyon ve tedavi direncine yol^{açar 26}. Ancak, sadece bu yolu hedeflemek, tümörlerin sıklıkla PI3K inhibitisyonundan...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agilent 2100 Bioanalyzer			kapiller bazlı elektroforez sistemi
Annexin V-FITC Apoptosis Kit	Roche Diagnostics	11858777001	N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)			moleküler doklama hazırlama yazılımı (doklama algoritması)
Calceolarioside A (CaA)	Sigma-Aldrich	SMB00246	N/A
Chem3D			moleküler modelleme yazılımı
cDNA Synthesis Kit	Vazyme Biotech	R223	N/A
DCFH-DA	Sigma-Aldrich	D6883	N/A
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	N/A
DMSO	Merck	D8418	N/A
FerroOrange probu	Dojindo	F374	N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442	N/A
Akış sitometrisi	BD Biosciences	FACSAriaIII Akış Sitometrisi	Annexin V boyalı hücreleri analiz etmek için alet
Floresan mikroskop	Olympus	IX73	FerroOrange ve DCFH-DA floresansını gözlemlemek için alet
FTH1 antikoru	Abcam	ab75973	AB_1310150
GAPDH antikoru	Abcam	ab8245	AB_2107448
GLS antikoru	Abcam	ab93434	AB_10563527
GPX4 antikoru	Abcam	ab125066	AB_10972289
HT22 murin nöronal hücre hattı	AddexBio	C0011008	CVCL_0321
jetPRIME transfeksiyon reaktifi	Polyplus-transfeksiyon	114-07	polimer bazlı transfeksiyon reaktifi
Keap1 antikoru	Abcam	ab139729	AB_2732852
L-Glutamin (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	N/A
LigPlot+			2D etkileşim haritalama aracı
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific		lipid bazlı transfeksiyon reaktifi
Liproxstatin-1	Selleck	S7699	N/A
MG132	Selleck	S2619	N/A
Mikroplak okuyucu	Thermo Fisher Scientific	H1M	MTT analizinde (490 nm'de) absorbans ölçümü için alet
MTT	Sigma-Aldrich	M5655	N/A
NanoDrop			mikro hacim UV-Vis spektrofotometre
Nrf2 antikoru	Abcam	ab62352	AB_945626
Nude BALB/c fareleri	Vital River, Çin	N/A	IMSR_CRL:028
OptiMeM azaltılmış serum ortamı
PyMOL			moleküler görselleştirme yazılımı
QuantStudio 5 Real-Time PCR Sistemi
SYBR Green Master Mix	Vazyme Biotech	Q711	N/A
TRIzol Reaktifi	Thermo Fisher	15596026	N/A
U251 insan glioma hücre hattı	CLS Cell Lines Service	300385	CVCL_0021
U87 insan glioma hücre hattı	ATCC	HTB-14	CVCL_0022
Ubiquitin antikoru	Abcam	ab7780	AB_306981
xCT/SLC7A11 antikoru	Abcam	ab175186	AB_2715513