Research Article

İnsan yağından türetilen kök hücrelerin yaşa bağlı elektrotaksisinin doğrudan akım elektrik alanları altında görselleştirilmesi

DOI:

10.3791/69666

⸱

December 19th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic Surgery, The First Affiliated Hospital of China Medical University, 2Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 3Department of Ophthalmology and Vision Science, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük bir kadın bağışçı grubunda, yaşlanma hADSC'lerin elektrotaktik göçünü azalttı. DCEF, gen ifadesini değiştirdi (747 yukarı, 624 aşağı), sodyum taşıma/kanal GO terimlerini ve PI3K-Akt KEGG yollarını zenginleştirerek, yaşa bağlı elektrotaksisle ilişki olduğunu düşündürdü, ancak nedensellik kanıtlamadan.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan yağ kök hücreleri (hADSC'ler), doku yenilenmesi ve yara iyileşmesi için çok önemlidir ve yönlendirilmiş göçleri, bu terapötik etkilerin uygulanması için ön koşuldur. Elektrik alanları (EF'ler), yara onarımı sırasında hücre göçünü yönlendiren temel ipuçları olarak iyi tanınır, ancak hADSC'lerin elektrotaktik davranışı — özellikle donör özelliklerinin (örneğin yaş) bu davranışı ve altında yatan moleküler mekanizmaları nasıl düzenlediği — hâlâ yeterince anlaşılmamıştır. Bu bilgi boşluğu, rejeneratif tıpta hADSC'lerin optimize edilmiş uygulamasını sınırlar. Bu çalışmada önce hADSC'lerde elektrotaksisin varlığını doğruladık ve gerilim bağımlılığını doğruladık: 100-200 mV/mm doğruakım elektrik alanları (DCEF) altında, hADSC'ler anoda doğru yönlü olarak hareket etti ve daha güçlü EF yoğunlukları hem göç yönünü hem de hızı artırdı (0 mV/mm kontrolüne göre). Daha sonra genç kadın donörlerin (27,00 ± 4,58 yaş) ve yaşlı kadın donörlerin (62,33 ± 4,04 yıl) hADSC'lerini 200 mV/mm DCEF uyarısından sonra RNA dizileme (RNA-dizi) kullanarak karşılaştırdık. Transkriptomik analiz, yaşlı hADSC'lerde 747 yukarı regülasyon ve 624 aşağı regülasyona edilmiş gen tespit etti; farklı şekilde ekspreslenen genler (DEG) elektrotaksis için kritik biyolojik süreçler/yollarla zenginleşmiştir — bunlar arasında sodyum iyon transmembran taşını, voltaj kapılı sodyum kanalı aktivitesi (GO terimleri) ve PI3K-Akt sinyal yolu (KEGG yolu) bulunmaktadır. Fonksiyonel olarak, yaşlı hADSC'ler, DCEF uyarısı altındaki genç hADSC'lere kıyasla anod göçünün (birikmiş mesafenin azalması, Öklid mesafesi ve doğrudanlık) anlamlı şekilde azalmıştır. Bu çalışma, hADSC'lerde yaşa bağlı elektrotaksisin ilk kanıtını sunar ve donör yaşının bozulmuş elektrotaktik kapasiteyle ilişkili olduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu yaşa bağlı azalmanın altında düzensiz sodyum kanalı aktivitesi ve PI3K-Akt sinyalizasyonunun etkili olabileceğini ortaya koyuyor. Bu bulgular, hADSC elektrotaksisinin potansiyel düzenleyici mekanizmalarına işaret ediyor ve hADSC tabanlı tedavilerin (örneğin, optimal bağışçıların seçilmesi veya sodyum/PI3K-Akt yollarını hedeflemek) doku yenilenmesi ve yara iyileşme sonuçlarını iyileştirmek için yeni içgörüler sunuyor.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağ kök hücreleri (ADSC), güçlü kendini yenileme kapasitesine ve önemli yenileme potansiyeline sahiptir. Uygun indüksiyon koşullarında, osteoblastlar, kondrositler ve adipositler gibi yerlere ayrılabilirler1. Parakrin sinyal yoluyla ADSC ayrıca kan damarları ve lenfatik damarların oluşumunudestekleyebilir 2,3, yara oluşumunu engelleyebilirve bağışıklık düzenleyici etkilergösterebilir 5. Bu nedenle, ADSC, rejeneratif tıpta hücre tabanlı tedaviler için ideal bir tohum hücresi olarak kabul edilir.

ADSC'nin işlevi, donör yaşı, vücut kitle indeksi, cinsiyet ve diğerleri gibi hücre tedavilerindeki potansiyel etkinliğini etkileyebilecek çeşitli donör özelliklerindenetkilenir 6. Yaşlı donörlerden elde edilen ADSC, daha belirgin yaşlanma özellikleri gösterir; adipojenik farklılaşma potansiyeli, osteojenik farklılaşma potansiyeli ve göç kapasitesi 7,8,9 azalmıştır. Ayrıca, keratinosit çoğalmasını teşvik etme ve vücudun kendi kendini onarma mekanizmalarını uyarma yeteneğiazalmıştır 10.

Hücre yönlendirilmiş göç, yara iyileşmesi ve doku yenilenmesinde önemli bir fizyolojik mekanizmadır; elektrik alanları (EF'ler) hücre göçünü yönlendirmede ve yara onarımını teşvik etmede önemli bir roloynar 11. Örneğin, epitel bariyeri zarar gördüğünde, endozen elektrik alanlar hemen oluşur ve yara iyileşene ve epitel bariyer fonksiyonu geri getirilene kadar devameder 12,13,14. Yöneltilmiş hücre göçünü yönlendiren sinyallerden biri olarak, elektrik sinyallerinin temas inhibisyonu, mekanik kuvvetler ve kemotaktik faktörler gibi diğer eşzamanlı sinyallere göre daha yüksek önceliğe sahipolduğu gösterilmiştir 15,16. Yara iyileşmesini ve doku yenilenmesini teşvik etmek için, insan vücudundaki endojen elektrik alanlarını güçlendiren veya taklit eden ilaçlar ve harici elektrik uyarım cihazları gibi çeşitli yöntemler geliştirilmiştir17,18. Hücrelerin elektrik alan gradyanına göre hareket etme yeteneği elektrotaksis olarak bilinir. In vitro çalışmalar, birçok farklı hücre türünün elektrik alanlarında yönlendirilmiş göç yapabildiğini göstermiştir. Bazı hücreler anoda doğru göç eder; örneğin memeli kafatası sinir kret hücreleri, insan astrositleri ve insan meme kanserihücreleri 19,20,21. Diğer hücreler ise katota doğru göç eder; örneğin insan böbrek tübüler epitel hücreleri, insan dermal fibroblastları ve insan nötrofilleri 22,23,24. ADSC, doğrudan akım (DC) elektrik alanlarında anoda doğru yönlendirilebilir ve uzun süreli kültür koşullarında, dıştan darbeli elektrik akımının ADSC'nin anota doğru yönlü göçünü etkili bir şekilde teşvik ederken hücrecanlılığını 25 korurken gösterilmiştir. Bugüne kadar, insan yağ kaynaklı kök hücrelerinin elektrotaksis özellikleri üzerine yapılan çalışmalar hâlâ az ve elektrotaktik davranışlarını düzenleyen temel mekanizmalar hâlâ tam olarak anlaşılmamıştır.

Gradyent ve yaşlı kadın donörler arasında gradient doğrudan akım elektrik alanları (DCEF) altında hADSC'lerde yaşa bağlı elektrotaktik farklılıkları sistematik olarak inceleyen ve transkriptomik analiz kullanarak temel mekanizmaları (sodyum kanalı aktivitesi ve PI3K-Akt sinyalizasyonu dahil) daha ayrıntılı olarak ortaya çıkaran ilk kişiyiz. Bu çalışmada, DCEF'in hADSC'ler üzerindeki etkilerini inceledik. RNA dizileme ve diferansiyel gen zenginleştirme analizi kullanarak, DCEF uyarısını takip eden genç ve yaşlı kadın bağışçılardan türetilen iki hADSC grubu arasındaki gen ifade profillerini karşılaştırarak yaşa bağlı transkripsiyon farklılıklarını tespit ettik. Donör yaşlanmasının hADSC'lerin elektrotaktik yanıtlılığını bozduğunu ve bu yaşa bağlı düşüşün sodyum kanalı aktivitesinin değişmesi ve PI3K-Akt sinyalizasyonu ile bağlantılı olduğunu öne sürdük.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm katılımcılardan doku toplamadan önce bilgilendirilmiş onay alındı. Bu çalışma, Çin Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No.: [2018]2018-110-2). Tüm katılımcılardan doku toplamadan önce yazılı bilgilendirilmiş onay alındı

hADSC izolasyonu ve kültürü
Doku koleksiyonu: Çin Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Plastik Cerrahi Bölümü'nde yapılan rutin seçmeli liposuction işlemleri sırasında insan karın yağ dokusu örnekleri alınmıştır. Tüm donörler, kozmetik abdominal liposuction geçiren sağlıklı kadın gönüllülerdi ve araştırma amaçlı ek cerrahi müdahaleler yapılmadı. Doku örnekleri, aspirasyondan hemen sonra ameliyat cerrahı tarafından steril koşullarda toplandı ve 30 dakika içinde buz üzerinde steril kaplarda laboratuvara nakledildi.

Örneklem büyüklüğü: Bu çalışmaya toplam 6 donör dahil edildi; bunlar 3 genç donör (yaş: 27,00 ± 4,58 yaş) ve 3 yaşlı donör (yaş: 62,33 ± 4,04 yaş) idi.

Doku işleme: Yağ dokusu parçalarını 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın, 1.800 x g hassasiyetinde 3 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın ve üst yağ fazını dikkatlice aspirasyon yapın (fazla lipidleri çıkarmak için). Doku pelletine %0,2 kollagenaz Tip IV (son hacim: 1 g yağ dokusu başına 5-10 mL) ekleyin, ardından tüpü 37 °C su banyosu veya kuluçka makinesine 45 dakika yerleştirin. Sindirim sırasında tüpü her 10-15 dakikada bir nazikçe karıştırarak kollajenaz ile doku arasında eşit bir temas sağlanır. Sindirimden sonra, %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin takviyesi içeren düşük glikozlu DMEM eklenerek reaksiyonu sonlandırın (nötralizasyon ortamının kollagenaz çözeltisi ile hacmi oranı = 1:1).

DIKKAT: Kolajenazla çalışırken, cilt ve göz teması önlemek için tek kullanımlık eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takın, aerosol kontaminasyonunu önlemek için reaktifi biyolojik güvenlik dolabında (BSC) hazırlayın ve kullanın; dökülme durumunda hemen %75 etanol ile silin ve kirlenmiş maddeleri biyolojik atık olarak bertaraf edin.

Hücre izolasyonu: Nötralize edilmiş sindirim karışımını 1.200 x g ile 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlenerek hücreleri pellet hale getirin. Süpernatantı atıp ardından pelleti eritrosit lizin tamponu içinde (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA; pH 7.4; hacim: pelet başına 2-3 mL) tekrar kümüğe alın ve oda sıcaklığında (22-25 °C) 5 dakika kuluçka geçirerek kalan kırmızı kan hücrelerini parçalayın. Hücre süspansiyonu, sindirilmemiş doku kalıntılarını çıkarmak için 200 μm süzgeçlerden sıralı olarak filtreleyin ve tek hücreli süspansiyon elde edilir.

Hücre sayma: Tohumlamadan önce, hücre sayıları hemositometre kullanılarak nicelendirildi. Kısa bir süreliğine, hADSC'ler %0,25 tripsin-EDTA ile ayrılmış, büyüme ortamında yeniden süspansiyona alınmış ve %0,4 tripan mavisi çözeltisi ile 1:1 karıştırılmıştır. Canlı hücreler (boyalanmamış) Neubauer hemositometresi kullanılarak ışık mikroskobu altında manuel olarak sayıldı ve toplam canlı hücre sayıları şu şekilde hesaplandı: hücre sayısı/mL = (ortalama sayılan hücreler x seyreltme faktörü x 104).

Hücre kültürü: Filtrelenmiş hücreleri 5 x 103 hücre/cm2 yoğunlukta büyüme ortamında (düşük glikozlu DMEM + %10 FBS + %1 penisilin/streptomisin) tohumlayın ve %5CO2 ile 37 °C'de kuluçka yapın. Yapıştırıcı olmayan hücreleri çıkarmak ve optimal kültür koşullarını korumak için ortamı her 2-3 günde bir değiştirin. Sonraki deneylerde kullanılan tüm hADSC'ler — hücre karakterizasyonu (yüzey işaretleyici tespiti, trilineage farklılaşma testleri), DCEF uyarımı, göç ve morfoloji analizi, yaşlanma/proliferasyon testleri ve RNA dizileme gibi — 3. geçişten 5. geçişe kadar olan aşamalardaydı.

hADSC karakterizasyonu
Hücre yüzeyi belirteçlerinin ifadesi: Kültür hücreleri %70 birleşimine getirin, ardından %0,25 tripsin-EDTA ile yapışkan hücreleri ayırın (37 °C'de 3 dakika kuluçka yapın). Hücre süspansiyonunu 300 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin, süpernatantı atın ve hücre pelletini 1x PBS (hacim: 1-2 mL) içinde yeniden askıya alın. Her örnek başına 1 x 105 hücre (100 μL 1x PBS ile yeniden süspansiyonlu) aliquot ve belirtilen seyreltmelerde floresan konjuge antikorlar ekleyin: anti-CD44 (1:50), anti-CD90 (1:100), anti-CD29 (1:50), anti-CD73 (1:50) ve anti-CD105 (1:20)1,4,7. Antikor-hücre karışımını 4 °C'de 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin, böylece florofor söndürülmesini önleyin. İnkubasyondan sonra, 1.000 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın ve süpernatantı tamamen aspire edin. Pelleti 1-2 ml 1x PBS ile tekrar askıya alın, tekrar 1.000 x g ile 3 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın, üst yüzeyi atın ve bu yıkama işlemini 2 kez tekrarlayarak bağlanmamış antikorları çıkarabilirsiniz. Son olarak, hücre peletini 200 μL taze 1x PBS ile yeniden askıya alın, bir akış sitometresi kullanarak floresan verilerini alın ve FlowJo yazılımı (v10) ile nicel analiz yapın. Kapı akışı standart MSC fenotipleme prosedürlerini takip etti: FSC-SSC kapısı kullanılarak dartı dışlanmış ve ana hücre popülasyonunu büyüklük ve granülarlığa göre seçti; ardından FSC-A ile FSC-H ile SSC-H grafikleri kullanılarak çift hariç tutulma ile tek hücreli olaylar sağlandı. Daha sonra, tripan mavi-pozitif veya PI-pozitif ölü hücreleri dışlamak için canlı hücre kapıtımı yapıldı. Tek boyalı kontroller için floresans kapıtma yapıldı ve lekensiz kontroller kullanılarak CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 (pozitif belirteçler) ve CD34, CD45 (negatif belirteçler) için eşikler belirlendi. Temsilci kapı grafikleri, hADSC'lerin kimliğini doğrulamak için ihraç edilip analiz edildi.

Farklılaşma potansiyeli
Adipojenik farklılaşma: P3 nesil hADSC'leri %85 birleşimde %0,25 tripsin-EDTA ile hasat edin, ardından 24 kuyu plakalarına 1 x 10⁵ hücre yoğunluğunda (tam DMEM ortamı kullanılarak) tohumlayın ve hücreler tekrar %85 birleşime ulaşana kadar %5CO2 ile 37 °C'de kuluçka yapın. İndüksiyon için, kılavuza göre bileşen A (Adipogenik indüktör) ve bileşen B (Adipogenik koruyucu) yeniden oluşturan adipogenez farklılaşma kiti kullanabilirsiniz ve bileşen A'yı ilk 3 gün kullandıktan sonra 1 gün boyunca bileşen B'ye geçin. Bu döngü 3 hafta boyunca tekrarlan. Boyama için, indüksiyon ortamını aspire edin, hücreleri 3 mL 1x PBS ile nazikçe yıkayın (hücre katmanlarını bozmadan), hücreleri oda sıcaklığında %4 paraformaldehit (PFA) ile 20 dakika sabitleyin, ardından %0,3 Yağlı Kırmızı O çözeltisiyle (%60 izopropanol içinde hazırlanmış) oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın. Hücreleri 1x PBS ile 3 kez yıkayıp fazla lekeyi çıkarın, ardından ters ışık mikroskobu (20 kat) ile lipid damlacıklarını görüntüleyin.

Osteojenik Farklılaşma: 12 kuyu plakalarında 1 x 10⁵ hücre yoğunluğunda tohum hADSC'ler elde edilir ve hücreler %85 birleşmeye ulaştığında, osteogenezis farklılaşma kitini indüksiyon için kullanırlar -- bileşen A (Osteojenik indüktör) ve bileşen B (Osteojenik takviye) düşük glikozlu DMEM'de yeniden oluştururlar (nihai konsantrasyonlar: %10 FBS, %1 penisillin/streptomisin, 0,1 μM deksametazon, 10 mM β-gliserofosfat, 0.05 mM askorbin asit-2-fosfat) ve ortamı 3 hafta boyunca her 3 günde bir yenileyin. Boyama için, hücreleri %4 PFA ile oda sıcaklığında 15 dakika sabitleyin, 3 kez 1x PBS ile yıkayıp %2 Alizarin Red S çözeltisi (pH 4.2, deiyonize suyla hazırlanmış) oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın. Hücreleri 3 kez 1x PBS ile yıkarak bağlanmamış lekeyi çıkarın, ardından kalsiyum biriktirilmiş nodülleri faz kontrast mikroskopu altında (20 kat) görüntüleyin ve ImageJ yazılımıyla Alizarin Kırmızı S-pozitif nodüllerin alanını ölçerek mineralizasyonu nicelikle ölçün.

Kondrojenik Farklılaşma: 250.000 hADSC'yi 500 x g ile 500 x g'de 4 °C'de 15 mL konik bir tüpte santrifüjle geçirerek hücre pelleti oluşturun, tüpe 500 μL tam DMEM ortamı ekleyin ve pelleti stabilize etmek için gece boyunca %5CO2 ile 37 °C'de kuluçka yapın. Ertesi gün, indüksiyon için kondrogenez farklılaşma kitini kullanın -- CO2-bağımsız ortamda (nihai konsantrasyonlar: %1 penisilin/streptomisin, 10 ng/mL TGF-β3, 50 μg/mL askorbin asit-2-fosfat, 100 μg/mL sodyum piruvat) ve ortamı her 3 günde bir nazikçe yenileyin (peleti rahatsız etmekten kaçının). 3 haftalık indüksiyondan sonra, hücre pelletini %4 PFA ile oda sıcaklığında 30 dakika sabitleyin, fiksörü aspire edin, %0,1 (w/v) Toluidin Blue O çözeltisi (0,1 M sodyum asetat tamponunda hazırlanmış, pH 4,0) ile oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın, lekeni aspire edin, pelleti deiyonize suyla 3 kez durulayarak fazla boyayı giderin, ardından parlak alan mikroskobu altında (20x) görüntüleme yapılır ve ImageJ yazılımı kullanılarak Toluidin Mavi O boyamanın ortalama optik yoğunluğunu (OD) ölçerek sülfütlenmiş proteoglikan birikimini nicelikle ölçür.

DIKKAT: %4 PFA (toksik ve aşındırıcı bir reaktif) kullanırken, buhar solumaktan veya cilt ile gözlerle temas etmemek için tek kullanımlık eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takarak sadece buhar kapasonu içinde çalışın — temas olursa hemen 15 dakika boyunca akan suyla duruyun ve tıbbi yardım alın. Tehlikeli atık bertaraf için, kullanılan PFA ve PFA ile kirlenmiş malzemeleri (örneğin, pipet uçları, plakalar) PFA Atığı etiketli özel kimyasal atık konteynerinde toplayın ve biyolojik atıklarla karışmamaya dikkat ederek kurumsal tehlikeli atık protokolleriyle bertaraf edin.

Elektrotaksi odası montajı: Merkez hattının karşı uçlarında, 10 cm uzunluğunda bir Petri kapağı üzerinde, tabak kenarından 1 cm mesafede yerleştirilmiş iki delik (0,75 cm çapında) delin (agar-tuz köprülerini barındırmak için). Petri kabının tabanına orta çizgi boyunca her kenardan 4 cm mesafede, ≤ 2 cm uzunluğunda ≤ 1 cm genişlikte) ince bir vakumlu yağ tabakası uygulayın (Şekil 1A). Steril ince uçlu forseps kullanarak, her yağ yamasına steril 1 cm x 2 cm ölçümlerindeki cam kapak yapıştırın ve sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için nazikçe basın (örtü kaymasının kırılmasını önlemek için; Şekil 1B-C). Her bağlı kapak örtüsünün üzerine ince bir tabaka daha vakum yağı uygulayın, ardından yağın üzerine doğrudan steril 1 cm x 2 cm cam kaplama koyun, böylece çift kaplama yığını oluşturun. İki kaplama arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için nazikçe basın (orta kaçağı önlemek; Şekil 1D). Bir coverslip yığınının sol üst köşesini en yakın çanak kenarına ve karşı yığının alt-sağ köşesini en yakın kenarına bağlayan çapraz hat boyunca, sürekli bir bariyer duvarı oluşturmak için vakum yağı uygulanır. Duvar, çanak tabanına sıkıca yapışmış olmalı (boşluk olmadan) ve yaklaşık 2 cm yükseklik, 0,5 cm genişlikte olmalıdır (Şekil 1E). Monte edilen odayı UV ışığı altında 20 dakika sterilize edin (mikrobiyal kontaminasyonu ortadan kaldırmak için), ardından oda sıcaklığında steril koşullarda saklanın ve kullanıma kadar kullanın (Şekil 1F).

DCEF uyarımı: Steril cam slaytları (hücre tohumlaması için) 10 cm Petri kabına yerleştirin ve gece boyunca %5CO2 ile 37 °C'de kuluçka yapın; böylece slaytlar önceden koşullandırılır (hücre yapışmasını teşvik eder). Steinberg çözeltisini, 10 mL 10x stok çözeltisi 90 mL ddH2O içinde seyreltirerek hazırlayın (steril; nihai konsantrasyonlar: 58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca(NO 3)24H2O, 0,83 mM MgSO47H2O, 10 mM HEPES; pH 7,4). Hazırlanan Steinberg çözeltisinin 20 mL'sine 0,3 g agar ekleyin, agar tamamen çözünene ve çözelti berrak olana kadar 20 saniye mikrodalgada pişirin, ardından hemen özel cam tuz köprülerini sıcak agar-Steinberg karışımıyla doldurun ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. Katığın ardından, tuz köprülerini UV ışığı altında 15 dakika sterilize edin ve iki bedekleri (her biri 30 mL Steinberg çözeltisi içeren) UV ışığı altında 15 dakika sterilize edin. Önceden koşullandırılmış steril slaytlarda 2 x 10⁴ hücre/cm² yoğunlukta 37 °C'de %5CO2 ile 24 saat kuluçka geçirerek hücre yapışmasını sağlaya, ardından hücre tohumlu kaymaları monte edilmiş elektrotaksi odasının pistine aktarın ve hareketi önlemek için steril yan kaydırmalarla sabitleyin. Pisti vakum yağının üzerine 3 cm x 2 cm ölçülerinde cam kapak örtüsü koyarak nazikçe bastırarak sıkı bir sızdırmazlık sağlayarak ve üst kapak kayağının kenarlarına ek vakum yağ uygulayarak bir bariyer oluşturun (orta buharlaşmayı önleyin). Odanın rezervuarlarınıCO2-bağımsız ortamla doldurun (%10 FBS ve %1 penisillin/streptomisin takviyesi; hacm: rezervuar başına 5-8 mL), sterilize edilmiş agar-tuz köprülerini Petri kabı kapağındaki deliklerden geçirin (bir ucu odanın ortam rezervuarında, diğer ucu ise Steinberg çözelti dolu bedeklerine daldırılmış şekilde) ve beakerleri Ag/AgCl elektrotları aracılığıyla güç kaynağına bağlayın (stabil bir doğru akım sağlamak için). 4 saat boyunca 2 V/cm DC elektrik alanı (DCEF) uygulayın, dijital multimetre ile her 15 dakikada bir voltajı izleyin (gerekirse sabit alan gücünü korumak için ayarlayın) ve yazılımla her 5 dakikada bir 4 rastgele alanda hücre göçünün zaman geçişli görüntülerini çekin (5x nesnel, parlak alan modu).

NOT: Elektrik ekipmanı kullanırsınızken, elektrik şokunu önlemek için güç kaynağı ve elektrotların kuru olduğundan ve iletken olmayan bir yüzeye yerleştirildiğinden emin olun. Elektrotları takıp çıkarırken yalıtımlı eldiven takın, kurulumu ayarlamadan önce gücü kapatın ve elektrik bileşenlerine orta sızıntı olursa gücü hemen kapatın ve %75 etanolle ıslatılmış emici kağıtla silin. Bu çalışmada, elektroforez odasının kalınlığını en aza indirerek yaklaşık 1 mm olarak tutularak ve odanın her iki ucunda çok noktalı voltaj ölçümleri yapılarak alan şiddetindeki değişim %10 içinde kontrol edildi. Bu koşullar altında, kültür alanındaki elektrik alan dağılımının esasen tekdüzeolduğu kabul edilir 26.

Göç ve morfoloji analizi
Canlı görüntüleme: DCEF uyarısı altındaki hADSC'ler için, zaman geçişli görüntü dizilerini (5 dakikalık aralıklarla) ImageJ yazılımına aktarın, Manuel Takip eklentisini kullanarak uyarımanın başlangıcından (t=0) sonuna (t=4 saat) 4 bağımsız alan boyunca 100 hücreyi manuel olarak takip edin ve ortalama göç hızı (μm/dq) ve yönlülüğü hesaplayın (D/T oranı, burada D = baştan sona doğru çizgi mesafesi, T = toplam yol uzunluğu) Chemotaxis Tool eklentisi (ImageJ) kullanılarak yapılır.

İzleme: Elektrotaktik davranışı nicelendirmek için aşağıdaki göç parametrelerini hesaplayın: Yönlendirilme (Σcosθi/n, burada θi, hücrenin yer değiştirme vektörü ile elektrik alanının (EF) yönü arasındaki açıdır ve n izlenen hücrelerin toplam sayısıdır; -1'den 1'e kadar değişir ve değerler daha güçlü anot yönlendirilmiş göçü gösterir), Birikmiş Mesafe (uyarılma döneminde her hücrenin toplam yol uzunluğu, μm cinsinden), İz Hızı (birikmiş mesafenin uyarım zamanına bölünmüş, μm/h cinsinden) ve Öklid Mesafesi (her hücrenin baştan sona doğru yer değiştirmesi, μm cinsinden, net göçü yansıtır).

Morfometri: DCEF uyarısından sonra, hücreleri oda sıcaklığında %4 PFA ile 20 dakika sabitleyin, 3 kez 1x PBS ile yıkayıp sitoskeleti Phalloidin-TRITC ile boyanacak (1x PBS'de 1:500 seyreltme; 24 kuyu plakalar için 200 μL) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (F-aktini etiketlemek için) ve çekirdekleri DAPI ile boya (1x PBS; hacim: 100 μL per well) 5 dakika boyunca. Hücreler, 20x büyütme ile floresan mikroskobu ile görüntülendi (temsil edici yüksek çözünürlüklü görüntüler 40x büyütüldü). Phalloidin-TRITC, 540-555 nm uyarılma dalga boyu ve 565-580 nm emisyon dalga boyu kullanılarak görselleştirilirken, DAPI 358-405 nm uyarım dalga boyu ve 420-480 nm emisyon dalga boyu kullanılarak görüntülendi. Sonra ImageJ'de aşağıdaki morfolojik parametreleri ölçün: Uzun eksen (maksimum Feret çapı, hücre çevresindeki herhangi iki nokta arasındaki en uzun mesafe), Dikey Uzunluk (hücrenin uzun eksene dik genişliği) ve Dikey (sinα, burada α hücrenin uzun ekseni ile EF yönü arasındaki açıdır, daha yüksek değerler EF ile daha yüksek hizalanmayı gösterir).

Yaşlanma ve proliferasyon testleri
SA-β-Gal boyama: Yaşlanma tespit kiti kullanarak yaşlanmış hücreleri (mavi lekeli hücreler) parlak alan mikroskopu altında (20x hedef) tanımlayın. P3 nesil hADSC'leri 6 kuyu başına 2 x 105 hücre yoğunluğunda 6 kuyu plakalarında tohumlayın, %80 birleşime kadar kültürleyin, ortamı aspire edin, hücreleri 3 kez 1x PBS ile nazikçe yıkayın, her kuyuya 1 mL Fiksatif Çözelti (kitte sağlanan) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın, hücreleri 3 kez 1x PBS ile yıkarak fiksasyondan sonra kalıntı fiksasyonu çıkarın, Her kuyu başına 0,5 mL SA-β-gal Boyama Çalışma Çözeltisi (kit kılavuzuna göre 50 μL SA-β-gal substrat ile 450 μL boyama tamponu karıştırarak hazırlanmış) ekleyin, plakayı buharlaşmayı önlemek için şeffaf film ile kapatın, gece boyunca (16-18 saat) 37 °C'de kuluçka yapın (CO2 maruziyetinden kaçının, çünkü pH değiştirir ve enzim aktivitesini engeller), Ertesi gün ≥10 rastgele alanın parlak alan görüntülerini (10x nesne) yakalayın, mavi lekeli (SA-β-gal+) hücrelerin ve toplam hücrelerin sayısını sayın ve yaşlanan hücrelerin yüzdesini (SA-β-gal+ hücre sayısı / Toplam hücre sayısı) x 100 olarak hesaplayın.

Ki67 immünboyama
SA-β-gal boyamadan sonra, boyama çözeltisi aspire edilir, hücreleri 1x PBS ile 2 kez yıkayabilir, hücre zarlarını %0,1 Triton X-100 ile (1x PBS; 1 mL kutu başına hazırlanır) ile oda sıcaklığında 10 dakika geçirebilir ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 BSA ile spesifik olmayan antikor bağlanmasını engeller (1x PBS; 1 mL her kuyuda). Hücreler daha sonra gece boyunca 4 °C'de Anti-Ki67 birincil antikor (%1 BSA/PBS'de 1:200 seyreltme; kuyuya başına 500 μL) inkübe edildi. Ertesi gün, hücreler 3 kez 1x PBS (her biri 5 dakika) ile yıkanmış, bağlanmamış birincil antikor çıkarılmış ve Alexa Fluor 488 488 ile konjuge ikincil antikor (%1 BSA/PBS içinde 1:500 seyreltme; her kuyuda 500 μL) oda sıcaklığında 1 saat karanlıkta kuluçka edilmişti. Hücreler tekrar 3 kez 1x PBS ile yıkanmış ve DAPI ile (1x PBS'de 1 μg/mL; her kuyu başına 200 μl) 5 dakika boyunca karşı boyama yapılmıştır. Floresans görüntüleri, 20x büyütme ile floresans mikroskobu kullanılarak (temsil edici yüksek çözünürlüklü görüntülerle 40x büyütmede alındı) alındı. Alexa Fluor 488 etiketli Ki67+ hücreleri, 485-495 nm uyarılma dalga boyu ve 515-545 nm emisyon dalga boyu kullanılarak görselleştirildi; DAPI boyalı çekirdekler ise 358-405 nm uyarılma dalga boyu ve 420-480 nm emisyon dalga boyu kullanılarak görüntülendi. Proliferatif hücrelerin yüzdesi şu şekilde hesaplandı: (Ki67+ hücre sayısı / DAPI+ çekirdek sayısı) x 100.

NOT: Birincil ve ikincil antikorları tutarken, kontaminasyonu önlemek için bir BSC ile çalışın, antikorları tek kullanımlık hacimlere dönüştürerek tekrar eden donma-çözülme döngülerini önleyin ve antikor ile kirlenmiş maddeleri (örneğin, pipet uçları, plakalar) özel bir otoklavlanabilir Biyolojik Atık torbasında toplayın ve bertaraf edilmeden önce otoklavlama ile sterilize edilsin.

hADSC'lerin yaşa bağlı elektrotaksis analizi: DC darbe güç kaynağı kullanarak üç yoğunlukta DCEF üretin: 0 mV/mm (kontrol), 100 mV/mm ve 200 mV/mm, hücre göçünü gerçek zamanlı gözlemlemek ve kaydetmek için canlı hücre iş istasyonu kullanın ve her EF yoğunluğu için, genç ve yaşlı kadın donörlerden hADSC'lerin anodal göç kapasitesini Birikmiş Mesafe ölçülerek nicel olarak karşılaştırın, Öklid Mesafesi, İz Hızı ve Yönlendirilme ile sonuç güvenilirliğini sağlamak için her grup başına üç bağımsız biyolojik kopya kullanılır. Elektrotaktik göç parametreleri, ImageJ (NIH)'deki Manuel İzleme ve Kemotaksis Aracı eklentileri kullanılarak nicelendirilmiştir. Bireysel hücreler, tüm 4 saatlik uyarı süresi boyunca manuel olarak takip edildi ve standart yöntemlere göre aşağıdaki parametreler hesaplandı: Birikmiş Mesafe: kayıt süresi boyunca her hücrenin toplam yol uzunluğu. Öklid Mesafesi: hücrenin başlangıç ve bitiş pozisyonları arasındaki düz çizgi mesafesi. Pist Hızı: birikmiş mesafenin toplam takip süresine (μm/s) bölünmesi. Yönlendirme: her yer değiştirme vektörü ile elektrik alan vektörü arasındaki açının (θ) ortalama kosinüsü olarak hesaplanır (değerler -1 ile 1 arasında değişir; 1'e yakın değerler güçlü anodal göçü gösterir).

RNA dizilemesi
RNA çıkarımı ve hazırlanması: Buzla dolu bir kabı UV ışığı altında 15 dakika sterilize edin (RNA stabilitesini korumak için) ve sonraki tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin. Elektrotaksi odasından hADSC tohumlu cam slaytları (1 cm x 2 cm) steril bir Petri kabına aktarın, hücreleri 3 kez 3 mL buz gibi soğuk 1x PBS ile yıkayın (PBS'yi nazikçe ekleyin, hafifçe karıştırın ve kalan ortamı tamamen amorize edin), ardından her slayta 1 mL TRIzol reaktifi ekleyin ve hücreleri tamamen lizize etmek için oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın (lizatın tüm hücre tabakasını kapladığından emin olun). Lizat RNazsız 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarılır, 0,2 mL kloroform eklenir, faz ayrımı için 15 saniye kuvvetli girdaba basın, tüpü buzda 15 dakika kuluçkaya geçirin, ardından 12.000 x g ile 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Bu, lizatı üç tabakaya ayırır: RNA içeren üst sulu faz, orta protein tabakası ve alt organik faz. Üst sulu fazı (≈ 0,5 mL) dikkatlice yeni bir RNase-içermeyen tüpe aktarın (orta tabakaya dokunmaktan kaçının), 0,5 mL izopropanol ekleyin, nazikçe girdabla çökeltin RNA'yı çökeltin, 10 dakika buzda kuluçka yapın, ardından 12.000 x g ile 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın; RNA, tüpün dibinde beyaz bir pelet oluşturur. Üst sıvıyı at, izopropanol çökelmesini bir kez tekrarlayarak RNA saflığını artırın, süpernatantı tamamen aspire edin, RNA pelletini oda sıcaklığında BSC'de 5-10 dakika hava ortamında kurutun (aşırı kurutmayın, çünkü bu çözünürlüğü azaltır), RNA pelletini 30 μL DEPC ile arıtılmış suya yeniden süstürün, 55 °C'de 10 dakika kuluçka yapın ki çözünmeyi kolaylaştırın, spektrofotometre kullanarak A260/A280 oranını (hedef: 1.8-2.0) ölçerek RNA saflığını nicelikle ölçmek, RNA Nano Çipi kullanarak RNA bütünlüğünü değerlendirmek; hedef: RNA Bütünlük Numarası [RIN] 8.0 > ve nitelikli RNA örneklerini dizilenliğe kadar -80 °C'de depolayın.

DIKKAT: Trizol ve kloroform toksik, uçucu ve kanserojendir, bu yüzden onları sadece duman başlıkta, nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takarak kullanın — buhar solumaktan kaçının, cilde dökülürse 10 dakika boyunca kağıt havluyla silin ve sabun ile suyla durulayın, çamaşır suyu veya diğer oksitleyici maddelerle karıştırmayın (çünkü bu toksik gaz üretebilir). RNA çıkarımı ile ilgili tehlikeli atık bertaraf için, karışımları, izopropanol süpernatantlarını ve kirlenmiş tüpleri kapalı, kimyasal olarak dirençli ve RNA Atığı (sulu atık veya biyolojik atıkla karıştırmayın) kapta toplayın ve kurumsal tehlikeli atık protokollerine uygun olarak, giderlere dökülmemeye dikkat edin.

Veri ön işleme ve kalite kontrolü: Üreticinin protokolünü takip ederek VAHTS mRNA-seq Library Prep Kit kullanarak dizileme kütüphanelerini hazırlayın -- oligo(dT) manyetik boncuklarla mRNA'yı zenginleştirin, mRNA'yı iki valent katyonlarla 200-300 bp fragmanlara ayırın, rastgele heksamerler ve ardından ikinci zincir cDNA ile birinci zincir cDNA'yı sentezleyin, son onarım yapın, A-kuyruk ekleyin, dizileme adaptörlerini ligatlayın, kütüphaneleri PCR ile güçlendirin ve boncuklarla arındırın. Kütüphaneleri bir dizileme platformunda (150 bp eşleştirilmiş uç okumalar) sıralayın, örnek başına yaklaşık 50 milyon ham okuma üretin, ardından düşük kaliteli okumaları (Phred kalite puanı <20) >%50 tabanlı okumaları kaldırın) ve adaptör dizilerini bir yazılım ile kırpın, yaklaşık 48 milyon temiz okumayı (Q30 > %90) kırpmadan sonra aşağı akış analizi için kullanabilirsiniz.

Biyoinformatik analiz: Temiz okumaları insan referans genomuna (GRCh38/hg38) Hisat2 v2.2.1 yazılımı kullanarak hizalamak ve hizalama sonuçlarını BAM dosyaları olarak kaydetmek, htseq-count v0.13.5 yazılımını kullanarak her gene eşlenen okuma sayısını saymak (Ensembl gen açıklamalarına dayanarak), DESeq (2012) R paketinden estimateSizeFactors fonksiyonunu kullanarak gen sayısı verilerini normalize etmek için parti etkilerini ve dizileme derinliğindeki farkları ortadan kaldırmak, ve nbinomTest fonksiyonu (DESeq paketi) kullanılarak diferansiyel ifade analizi yapar; katlanma değişimi (FC) eşikleri (FC) >2 ve ayarlanmış p-değeri (padj) < 0.05 kullanılarak farklı ekspresyon genleri (DEG) seçer. Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi (biyolojik süreç, moleküler fonksiyon, hücresel bileşen) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yol zenginleştirme analizini clusterProfiler v4.0 R paketi kullanarak hücre göçüyle ilgili zenginleştirmeler (örneğin, hücre yapışması, hücre göçü), iyon taşıması (örneğin, sodyum ion transmembran taşını) ve sinyal yolları (örneğin PI3K-Akt sinyal yolu) ile ilgili zenginleştirmelere odaklanmak. Pheatmap v1.0.12 R paketini kullanarak DEG'lerde denetimsiz hiyerarşik kümeleme gerçekleştirin ve örnekler genelinde gen ifade desenlerini bir ısı haritası (satır ölçekli z-puanları) ile görselleştirin.

İstatistiksel analiz: Tüm deneysel veriler, Ortalama ± Standart Hatası (Ortalama ± SEM olarak) olarak sunulur ve her grup başına en az 3 bağımsız biyolojik kopya bulunur (n ≥ 3). İki grup arasındaki farkları karşılaştırmak için Student's t-testini (örneğin, genç ve yaşlı bağışçılar) ve tek yönlü Varyans Analizi (ANOVA) ile karşılaştırın; ardından Tukey'nin post-hoc testini kullanarak üç veya daha fazla grup arasındaki farkları karşılaştırın (örneğin, farklı EF yoğunlukları), SPSS 23.0 yazılımı kullanılarak istatistiksel analizler yapın ve istatistiksel anlamlılığı şu şekilde tanımlayın: *p < 0.05, **p < 0.01, p < 0.001.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrik alanlarının uygulanması, hADSC'lerin yönsel göçünü yönlendirir ve göç kapasitesini artırır
Çıkarılan hADSC'ler tipik mezenkimal kök hücre yüzey belirteçleri (örneğin, CD29, CD44, CD90, CD73, CD105) ve trilineage farklılaşma potansiyeline (adipogenik, osteojenik, kondrojenik; Şekil 2A), hADSC tanımlama için standart kriterleri karşılıyor. HADSC'lerin elektrotaktik yanıtını incelemek için 0 mV/mm, 100 mV/mm ve 200 mV/mm yoğunluklarda doğru akım elektrik alanları (D...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku yaralanma onarım ve yenilenme sürecinin başlarında, elektrik alanlar mikro ortamda kurulan en erken fiziksel işaretlerden biri olarak ortaya çıkar. Yön özellikleri, hücrelerin yaralanmabölgesine 27 katılımıyla mekansal ve zamansal olarak ilişkilidir. Endojen elektrik alanları, epitel dokularında polarize iyon taşınımıyla üretilen transepitelyal potansiyelden kaynaklanır. Epitel bariyeri bozulduğunda veya yaşlandığında, potansiyel ikincil olarak değişirken, za...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çin Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi (Shenyang, Çin) Plastik Cerrahi Bölümü ve Kaliforniya Üniversitesi, Davis (CA, ABD) Rejeneratif Tedaviler Enstitüsü'nü, bu çalışmayı mümkün kılan kritik deneysel altyapı ve paylaşılan araştırma kaynakları için içtenlikle takdir ediyoruz. Ayrıca, RNA dizilemesi ve biyoinformatik analizlerdeki teknik desteği için Shanghai OE Biotech Co., Ltd.'ye teşekkürlerimizi sunuyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4& derece; C/-20 ve derece; C/-80&derece; C BuzdolabıHaier, ÇinHYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
AgarHUSHI, Çin10000561
Agilent 2100 BiyoanalizörüAgilent Technologies, Amerika Birleşik DevletleriG2939BA
Alizarin Red S Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriA5533
Biyogüvenlik Kabinesi Thermo Fisher Scientific, Amerika Birleşik Devletleri1300 A2 1,5 m
CaNO3· 4H2OHUSHI, Çin10013960
SantrifüjThermo Fisher Scientific, Amerika Birleşik DevletleriX4R Pro 
CO2 Kuluçka MakinesiThermo Fisher Scientific, Amerika Birleşik DevletleriForma Steri-Cycle 3307 
Kollagenaz Tip IVBiosharp, Çin BS076
Konfokal MikroskopZEISS, AlmanyaLSM 900
DC Darbe Güç Kaynağı Daedo Powertronics, KoreDDP-500
DeksametazonSigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriD4902
Dijital MultimetreFluke, Amerika Birleşik DevletleriFLUKE-175
DMSOSigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriD2650
Elektronik Denge & nbsp;Sartorius, Almanya BSA224S-CW
FBS Gibco, Amerika Birleşik Devletleri10270-106
Akış SitometresiThermo Fisher Scientific, Amerika Birleşik DevletleriA24858
IBMX (1-Metil-3-izobütilksantin)Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriI7018
Indometasin   Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriI7378
İnsülinSigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriI5500   
Ters MikroskopZEISS, AlmanyaAxio Gözlemci 7 / ACR
ITS-GSigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriI3146
KClHUSHI, Çin10019318
KH2PO4HUSHI, Çin10019320
Linoleik Asit Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriL1376
Canlı Hücre İstasyonuCanlı Hücre Enstrümanı, KoreChamlide TC 
Düşük glikozlu DMEMGibco, Amerika Birleşik Devletleri11885084
MgSO4· 7H2O HUSHI, Çin10019322
Na2HPO4· 12H2OHUSHI, Çin10019324
NaClHUSHI, Çin10019318
NanoDrop 2000 SpektrofotometresiThermo Fisher Scientific, Amerika Birleşik DevletleriND-2000
Yağlı Kırmızı OSigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriO0625
Penisilin/StreptomisinGibco, Amerika Birleşik Devletleri15140122
PipetlerEppendorf, Almanya 4920000061
SYBR Premix EX TaqTakara, Çin RR420A
Toluidin Mavisi O         Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriT3260
TrisHUSHI, Çin10019326
TRIzolBeyotime, ÇinR0016
Tripsin-EDTAGibco, Amerika Birleşik Devletleri25200056
Dik MikroskopZEISS, Almanya415200-0000-000 
Vakumlu YağDOW CORNING, Amerika Birleşik Devletleri1597418
C  vitamini;    Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriA4544
Su Arıtma SistemiThermo Fisher Scientific, Amerika Birleşik Devletleri  GenPure xCAD Plus UF-TOC
β-Gliserofosfat Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriG9422

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qin, Y., et al. An update on adipose-derived stem cells for regenerative medicine: Where challenge meets opportunity. Adv Sci. 10 (20), e2207334(2023).
  2. Biniazan, F., Stoian, A., Haykal, S. Adipose-derived stem cells: Angiogenetic potential and utility in tissue engineering. Int J Mol Sci. 25 (4), 2356(2024).
  3. Ahmadzadeh, N., et al. Human adipose-derived stem cells support lymphangiogenesis in vitro by secretion of lymphangiogenic factors. Exp Cell Res. 388 (2), 111816(2020).
  4. Xiu, X. W., Yan, M., Zhen, G., Jun, Y. Human adipose-derived stem cells inhibit bioactivity of keloid fibroblasts. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 40(2018).
  5. Alexandre, T. J. M., et al. Human adipose mesenchymal stem cells as potent anti-fibrosis therapy for systemic sclerosis. J Autoimmun. 70, 31-39 (2016).
  6. Xie, Y., et al. Transcriptome differences in adipose stromal cells derived from pre- and postmenopausal women. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 92(2020).
  7. Liu, M., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from the elderly exhibit decreased migration and differentiation abilities with senescent properties. Cell Transplant. 26 (9), 1505-1519 (2017).
  8. Foti, R., et al. Senescence in adipose-derived stem cells: Biological mechanisms and therapeutic challenges. Int J Mol Sci. 25 (15), 8390(2024).
  9. Jajini, V., Michelle, G., Afshin, M., Peter, B. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: Implications for regenerative therapy. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 45(2017).
  10. Ning, M., et al. Adipose-derived stem cells from younger donors, but not aging donors, inspire the host self-healing capability through their secretome. Exp Biol Med. 242 (1), 68-79 (2017).
  11. Wang, E. T., Zhao, M. Regulation of tissue repair and regeneration by electric fields. Chin J Traumatol. 13 (1), 55-61 (2010).
  12. Chiang, M. C., Cragoe, E. J., Vanable, J. W. Intrinsic electric fields promote epithelization of wounds in the newt Notophthalmus viridescens. Dev Biol. 146 (2), 377-385 (1991).
  13. Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. Wound healing in rat cornea: The role of electric currents. FASEB J. 19 (3), 379-386 (2005).
  14. Li, L., et al. Electric fields guide migration of epidermal stem cells and promote skin wound healing. Wound Repair Regen. 20 (6), 840-851 (2012).
  15. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-γ and PTEN. Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).
  16. Zhao, M. Electrical fields in wound healing: An overriding signal that directs cell migration. Semin Cell Dev Biol. 20 (6), 674-682 (2009).
  17. Pretteam, S., et al. Electrical stimulation: A novel therapeutic strategy to heal biological wounds. RSC Adv. 14 (44), 32142-32173 (2024).
  18. Reid, B., Ochoa-Gonzalez, E., McCaig, C. D., Zhao, M. Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds: A novel approach of bioelectric stimulation without electrodes. Cornea. 30 (3), 338-343 (2011).
  19. Mehta, A. S., et al. Physiological electric fields induce directional migration of mammalian cranial neural crest cells. Dev Biol. 471, 97-105 (2021).
  20. Yang, C., et al. Steered migration and changed morphology of human astrocytes by an applied electric field. Exp Cell Res. 374 (2), 282-289 (2019).
  21. Zhu, K., et al. Electric fields at breast cancer and cancer cell collective galvanotaxis. Sci Rep. 10 (1), 8712(2020).
  22. Guo, L., et al. Migration of human renal tubular epithelial cells in response to physiological electric signals. Front Cell Dev Biol. 9, 724012(2021).
  23. Kim, M. S., et al. Golgi polarization plays a role in the directional migration of neonatal dermal fibroblasts induced by direct current electric fields. Biochem Biophys Res Commun. 460 (2), 255-260 (2015).
  24. Moarefian, M., et al. Electrotaxis-on-chip to quantify neutrophil migration towards electrochemical gradients. Front Immunol. 12, 674727(2021).
  25. Lee, M. H., et al. Pulsed electrical stimulation enhances consistency of directional migration of adipose-derived stem cells. Cells. 10 (11), 2846(2021).
  26. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2 (6), 1479-1489 (2007).
  27. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85 (3), 943-978 (2005).
  28. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122 (23), 4267-4276 (2009).
  29. Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), eaav2501(2019).
  30. Huayllani, M. T., et al. Adipose-derived stem cells in wound healing of full-thickness skin defects: A review of the literature. J Plast Surg Hand Surg. 54 (5), 263-279 (2020).
  31. Hong, S. H., et al. Stem cell passage affects directional migration of stem cells in electrotaxis. Stem Cell Res. 38, 101475(2019).
  32. Jia, Q., Zhao, H., Wang, Y., Cen, Y., Zhang, Z. Mechanisms and applications of adipose-derived stem cell extracellular vesicles in the inflammation of wound healing. Front Immunol. 14, 1214757(2023).
  33. Hammerick, K. E., Longaker, M. T., Prinz, F. B. In vitro effects of direct current electric fields on adipose-derived stromal cells. Biochem Biophys Res Commun. 397 (1), 12-17 (2010).
  34. Banks, T. A., Luckman, P. S., Frith, J. E., Cooper-White, J. J. Effects of electric fields on human mesenchymal stem cell behaviour and morphology using a novel multichannel device. Integr Biol. 7 (6), 693-712 (2015).
  35. Zhao, M., et al. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117 (3), 397-405 (2004).
  36. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nat Protoc. 4 (2), 155-173 (2009).
  37. Kashimoto, R., et al. Lattice-patterned collagen fibers and their dynamics in axolotl skin regeneration. iScience. 25 (7), 104524(2022).
  38. Sarkar, A., Kobylkevich, B. M., Graham, D. M., Messerli, M. A. Electromigration of cell surface macromolecules in DC electric fields during cell polarization and galvanotaxis. J Theor Biol. 478, 58-73 (2019).
  39. Fang, K. S., et al. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J Cell Sci. 112 (12), 1967-1978 (1999).
  40. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. FASEB J. 16 (8), 857-859 (2002).
  41. Gorzkowska, J., et al. The dynamics of chemoattractant receptor redistribution in the electrotaxis of 3T3 fibroblasts. Cell Commun Signal. 23 (1), 173(2025).
  42. Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120 (19), 3395-3403 (2007).
  43. Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8 (8), e73418(2013).
  44. Zhu, K., et al. Expression of integrins to control migration direction of electrotaxis. FASEB J. 33 (8), 9131-9141 (2019).
  45. Zhao, M., et al. Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent. J Cell Sci. 109 (6), 1405-1414 (1996).
  46. Wan, P., et al. Guidance receptor promotes the asymmetric distribution of exocyst and recycling endosome during collective cell migration. Development. 140 (23), 4797-4806 (2013).
  47. Djamgoz, M. B. A., et al. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric fields: Involvement of voltage-gated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114 (14), 2697-2705 (2001).
  48. Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns Trauma. 6, 20(2018).
  49. Alt, E. U., et al. Aging alters tissue-resident mesenchymal stem cell properties. Stem Cell Res. 8 (2), 215-225 (2012).
  50. Antelo-Iglesias, L., et al. The role of cellular senescence in tissue repair and regeneration. Mech Ageing Dev. 198, 111528(2021).
  51. Aurelie, C., Cheng, C., Han, L. The crosstalk between cellular reprogramming and senescence in aging and regeneration. Mech Ageing Dev. 138, 111005(2020).
  52. Kammeyer, A., Luiten, R. M. Oxidation events and skin aging. Ageing Res Rev. 21, 16-29 (2015).
  53. Sun, J., et al. Tideglusib promotes wound healing in aged skin by activating the PI3K/Akt pathway. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 269(2022).
  54. Liu, S., et al. The PI3K-Akt pathway inhibits senescence and promotes self-renewal of human skin-derived precursors in vitro. Aging Cell. 10 (4), 661-674 (2011).
  55. Luo, R., Dai, J., Zhang, J., Li, Z. Accelerated skin wound healing by electrical stimulation. Adv Healthc Mater. 10 (16), e2100557(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Adipose Derived Stem CellsElectrotaxisElectric Field StimulationAge Dependent MigrationStem Cell MigrationRNA SequencingSodium Channel ActivityPI3K Akt SignalingTissue RegenerationWound Healing

Related Articles