Yöntem makalesi

Drosophila melanogaster için Xenon Anestezi ile Hiperbarik Basınç Sisteminin Doğrulanması

DOI:

10.3791/69671

⸱

20 Şubat 2026

 , 
1Clore Laboratory, University of Buckingham

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atmosfer basıncında zararsız görünen gazlar, hiperbarik koşullarda narkoz gibi davranışlara yol açabilir. Geleneksel hiperbarik basınç odaları maliyetli ve emek yoğundur. Bu çalışma, ksenonun Drosophila melanogaster üzerindeki etkilerini, 4 atm'nin altındaki orta basınçlarda incelemek için basit ve düşük maliyetli bir yöntem sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiperbarik koşullarda, ortam gazlarının yüksek konsantrasyonları çeşitli hayvanlarda çeşitli davranışsal tepkiler ortaya çıkarabilir. Bu davranışların önemli bir kısmı, henüz yeterince anlaşılmamış bilişsel durum değişikliklerini temsil eder. Dikkat çekici bir örnek genel anestezidir. Genel anestezi veya narkozda hiperbarik koşullarda birkaç gazın davranışsal etkisi, ilaçların tıpta aşırı sık kullanılmasına rağmen uzun süreli bilimsel bir araştırma olmuştur. Ksenon, asil gaz ve anestezik olarak sınıflandırılır ve insanlarda genel anestezi için en güvenli seçeneklerden biri olarak kabul edilir. Ancak, normobarik koşullarda sinekleri anestezi etmez. Burada, ortam basıncını ~3 atm'ye kadar artıran ve en popüler model organizmalardan biri olan Drosophila melanogaster'de ksenon anestezisinin incelenmesine olanak tanıyan basit bir deneysel kurulum oluşturduk.Bu deneysel düzenleme, diğer gazların ve bunların hiperbarik koşullarda etkilerinin incelenmesini daha da kolaylaştırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlarda hiperbarik koşullarda gözlemlenen davranışsal etkilerin iki uç ucu oksijenle yapılan kasılma ve azot 1,2 tarafından narkozdur. İlginç bir şekilde, bilinçsizlik seviyesinden önce azot ve hidrojen basınç değerlerinde halüsinasyonlar ve hafıza bozuklukları gibi bilişsel bozukluklar bildirilmiştir. Ksenon, kripton ve azot oksit tarafından hiperbarik koşullarda indüklenen anestezi 5,6'dan önce bildirilmiştir.

Genel anestezi, hem tıbbın temel taşlarından biri hem de bilimsel olarak önemli bir olgudur. Uzun ve yaygın kullanımına rağmen, bazı kimyasalların hareket, hafıza, ağrı ve bilinç eksikliğini tam olarak nasıl tetiklediği konusunda anlayışımızsınırlıdır. Xenon, asil bir gaz olduğundan, anestezik ajanlar arasında en tuhaf üye olarak atanabilir. Anestezi için güvenli bir seçenek olarak kabul edilir; hızlı indüksiyon ve iyileşme, minimum fizyolojik bozukluk ve sadece ameliyat sonrası bulantı gibi hafif yan etkilersunar 8,9.

Anestezinin tıbbi önemi ve ksenonun alışılmadık kimyasal özellikleri göz önüne alındığında, bu çalışma basit hayvan modeli Drosophila melanogaster kullanılarak ksenon kaynaklı anesteziyi araştırmayı amaçlamaktadır. Genel anestezi üzerinde meyve sinekleri kullanılarak çeşitli araştırmalar yapılmıştır; birçok önerilen düzenleme ve çeşitli uçucuanestezikler 10,11,12,13 kullanılmaktadır. Ancak, Drosophila'da ksenon anestezisi ile ilgili herhangi bir rapor bulunmamıştır. Normobarik koşullarda, ksenon Drosophila melanogaster'de, yaygın olarak meyve sineği olarak bilinir, anestezi oluşturmaz. Bu sınırlamayı gidermek için, bu çalışma 1 atm ile yaklaşık 4 atm arasında ortam basıncının kontrollü manipülasyonuna olanak tanıyan hiperbarik bir sistem sunmaktadır. Benzer meraklara cevap vermek için hiperbarik odalar kullanılarakyapılan birkaç çalışma yapılmıştır 14,15. Ancak, çoğu ticari hiperbarik oda, dayanıklı ve sızdırmaz malzemelerden faydalanır, ancak hacmi yüksek (~3 L) ve sistematik olarak karmaşık ve pahalıdır. Bunun yerine, bu makalede açıklanan yöntem basit ve ucuzdur; çeşitli gazların ve kombinasyonlarının etkilerinin keşfedilmesine olanak tanır. D. melanogaster ve C. elegans gibi küçük hayvan modelleri için uygun bir kurulum sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Drosophila melanogaster preparatı

  1. CO2 kullanılarak her deney için 1-3 günlük 20 dişi ve 20 erkek sinek toplayın.
  2. Seçilen sinekleri deneyden önce en az 24 saat boyunca yiyecekli bir şişede ~22 °C sıcaklıkta dinlendirin.

2. Anestezi teslimatı

  1. Gazları konteyner gaz tüpünlerinden sızdırmaz gaz torbalarına aktararak deneysel kullanım için kullanın. Gazın kaptan poşetlere doğrudan transferi için silikon boru kullanın.
  2. 25 mm (3,4 mm çapında) silikon boru polipropilen şırıngaya takın. Sonra polipropilen şırıngayı gaz torbalarına ve üç yollu musluğa bağlayın. Açıklık için, polipropilen şırınga, metnin geri kalanında şırınga #1 olarak anılacaktır.

3. Hiperbarik kurulumun montajı (Şekil 1)

  1. LED ışık tablosunu masanın üzerinde yatay konumda konumlandırın (uzun kenar masa yüzeyine yatay olarak).
  2. Enjeksiyon pompasını LED ışık masasının kısa kenarlarından birine yakın konumlandırın; böylece pompanın yönü deneysel şırınganın arka ışığın üzerinden uzanmasına izin vermesini sağlar.
  3. Kamerayı deneysel şırınganın bulunduğu bölgeyi kapsayacak şekilde kurulumun üstüne yerleştirin.
  4. 75 mm uzunluğunda bir silikon tüp (3,4 mm çapında) kesin. Üç yollu musluğu, merkezi nozuldan gelen silikon boru kullanarak manometreye bağlayın.
  5. Manometrenin yanından ve üç yönlü musluktan nozul üzerine hortum yaylı kelepçeler kullanarak borunun sıkı olduğundan emin olun.
  6. Enjeksiyon pompasının kontrol ünitesinde çift okla işaretlenen düğmeyi kullanarak, pistonun otomatik sıkıştırılması veya dekompresyonu için hızı 80 mm/m, süresini ise 38 saniyeye ayarlayın.

4. Xenon anestezisi prosedürü

  1. Deney odasındaki ortam ışığını sınırlayın, LED ışık masasını açın ve parlaklığı seviye 3'e ayarlayın. Bu, videodaki kontrastı artırmaya yardımcı olur.
  2. Polikarbonat şırtinganın pistonu çıkarın. Sineklerin kaçmasını önlemek için şırınganın meme ucuna az miktarda pamuk yerleştirin. Açıklık için, polikarbonat şırınga metnin geri kalanında şırınga #2 olarak adlandırılacaktır.
  3. 40 sineği şişeden şırınga #2'ye aktarmak için önce şişenin kapağını çıkarın ve şırınganın namlusunu dikey olarak şişenin üstüne yerleştirin. Namlu flanşı, sineklerin şırınga namlusuna girmesine izin vermek için şişenin üst kısmıyla birleşmelidir. Yapıyı 180° çevir ve dokun. Bu, sineklerin şırınga namlusunun dibine yerleştirilmesini sağlar. Pistonu tekrar takın. Sineklerle birlikte şırıngayı enjeksiyon pompasının içine yerleştirin.
  4. Kameranın bakış açısından sinekleri daha iyi görebilmek için şırınganın namlu izlerini yan tarafa yönlendirin.
  5. Şırıngayı namludan ve piston başlığından ayarlanabilir vidalarla enjeksiyon pompasına sabitleyin.
  6. Pamuk şırıngası #2'nin ucundan çıkarın ve 3 yollu muslukla bağlayın.
  7. Video kaydını başlatın. Manometreyi aç. Manometreyi şırınga #2 ile bağlamak için musunu çevirin ve manometre ile şırıngadaki 0 kPa basıncını doğrulayın.
  8. Deneyden önce şırıngayla hava alışverişi sağlamak için 3 yönlü musluğu yan pozisyona çevirin.
  9. En hızlı seçeneği sağlamak için tasarlanmış enjeksiyon pompasının manuel kontrol seçeneğiyle pistonu 20 mL'den 2 mL'ye taşıyabilirsiniz.
  10. Gaz torbasından enjekter #1'e 18 ml anestezik gazı aspire edin. Şırınga #1'i lateral luer kilitli portundan gelen üç yönlü muslukla bağlayın. Doğru hacmi değerlendirmek için, toplam 20 mL karışımda 18 mL anestezik gaz gaz oranının %90'ını sağlar. Bu, istenen nihai gaz oranına göre değiştirilebilir.
  11. Enjeksiyon pompasının manuel seçeneğiyle pistonu 20 mL hattına geri getirin.
  12. Manometreyi şırınga #2 ile bağlamak için stop musunu çevirin. Genellikle, manometre anestezik doldurulduktan sonra ~-3 kPa basınç gösterir.
  13. Pistonu otomatik olarak hareket ettirin, hız ve zaman ayarları 80 mm/s ve 38 saniye olarak ayarlandı. Pompanın namludaki 5 mL barına 38 saniyede ulaşması bekleniyor. Piston durduğunda, maksimum basınç ~200 kPa olmalıdır.
  14. Pistonu 5 mL pozisyonunda 20 saniye boyunca bırakın. Tepe basınca dikkat edin.
  15. Şırıngaya dokunarak pistona tutunan sinekleri yerinden çıkar, böylece alt kısımda hareketsiz oturacaklar.
  16. 20 saniyenin sonunda otomatik dekompresyona başlayın. Piston tekrar 20 mL barına döndüğünde deneyi sonlandırın. Sızıntı kontrolü için son basıncı not edin.

5. Veri analizi

NOT: Bu deneyde, anestezik ortaya çıkış noktası olarak kullanıldı. Sinek hareketleri, piston dekompresyonunun başlangıç zamanından itibaren ölçüldü. İki farklı analiz yöntemi geliştirildi: piksel analizi ve sinek takibi. Her analiz yönteminin dezavantajları vardı ve bunlar tartışmada aktarıldı.

  1. Piksel analizi
    1. Videoları düzenlemek için ScreenFlow kullanın. Her videoyu ilgi alanına (ROI), yani şırınge namlusunun ilk 5 mL'sine kırpın.
    2. Videoyu şırınga dekompresyonundan sonraki ilk 20 saniyeye kadar kısalt. Düzenlenen videoları GIF olarak dışa aktarın. GIF'i çoğaltın.
    3. Fiji kullanarak, bir kopyadan ilk kareyi çıkar, diğer kopyadan son kareyi çıkar. Bunu başarmak için Görüntü > Video Düzenleme > Kareleri Sil seçeneğini seçin.
    4. Fiji'deki her GIF'i ikili yapın ki sinekler siyah bir zeminde beyaz gibi görünsün. Bunu başarmak için Process > Binary > Make binary seçin.
    5. Fiji'de her iki GIF'i de açın. GIF'ler arasındaki piksel farkını hesaplayın. Bunu başarmak için Process > Image Calculator'ı seçin. Bu işlem piksel farkı GIF'i oluşturacak.
    6. Piksel farkı GIF'ini kaydet. Farklı GIF'lerdeki parçacığı analiz edin. Bunu yapmak için, Fiji'deki parçacıkları analiz > Analiz et. Sinyal-gürültü oranını artırmak için piksel boyutu eşiklerini ayarlayın.
    7. Parçacıkları analiz ettikten sonra, Fiji kare başına piksel farklarıyla bir CSV çıkarır. CSV'yi sakla. CSV verileri, kare başına hareketi çizmek için kullanılabilir. Deneyler arasında istatistiksel farklılıkları atamak için çerçeveler arasında kümülatif hareket kullanın.
  2. Sinek takibi
    NOT: Sinek takip yöntemi için, deney videolarında her sineğin kütle merkezini tespit etmek ve takip etmek için yapay zeka teknolojisi kullanılmıştır. Bunun için iki model birleştirildi: YOLO (You Only Look Once) tespit için ve MASA (Matching Anything by Segmenting Anything) takip için. Modeller, Tesla T4 GPU kullanılarak Google Colab üzerinde yürütüldü.
    1. Colab'a Ultralytics YOLO kütüphanesini kurun, ardından yolo11n.pt modelini yükleyin. CVAT (Computer Vision Annotation Tool) kullanarak videolardan çıkarılan karelerde sinekleri not yapın, ardından veri setini eğitim için YOLO formatında dışa aktarın. Detaylı kurulum ve eğitim prosedürleri çevrimiçi depoda açıklanmıştır.
    2. Google Colab'a MASA deposunu kurun ve ardışık kareler boyunca nesne takibi yapmak için Kalman filtresi ekleyin. Eğitilmiş YOLO tespit modelini MASA takip çerçevesiyle entegre edin.
    3. FixTrack kullanarak birleşik MASA+YOLO boru hattı tarafından oluşturulan tracklet'leri manuel olarak inceleyin. Yanlış parçalanmış izleri tespit edip birleştirin veya kimlik uyumsuzluklarını düzelterek bireysel sinekler için sürekli yörüngalar elde edin. Detaylı kurulum ve eğitim prosedürleri FixTrack deposunda açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede açıklanan yöntem, hiperbarik koşullarda sineklerde hem zamanlamanın hem de lokomotor aktivitenin kapsamının izlenmesine olanak tanır. Bu konfigürasyon, normal koşullarda anestezik özellikleri olmayan ksenon ve azot oksit gibi gazların Drosophila melanogaster'da anestezi üretmesine olanak tanır. Bunu göstermek için farklı ksenon ve hava konsantrasyonlarıyla denemeler yaptık. Süreci %90 ksenon ve %10 hava ile kurmaya başladık. Daha sonra anestezik gaz miktarı %5 artırı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu basit ve düşük maliyetli kurulum, Drosophila'daki hiperbarik davranışsal testleri geniş çapta erişilebilir kılarak özel basınç kapları olmadan hızlı, tekrarlanabilir deneyler yapılmasını sağlar. Ancak, bazı sınırlamalar da vardır. Önemli uzlaşmalarından biri, mevcut kurulumlara göre daha düşük maksimum basınçtır. Bu kurulumla indükleyebileceğimiz en yüksek basınç ~4 atm'dir, oysa Drosophila için kullanılan basınç kaplarının bunun yaklaşık iki katına ulaştığı bildiril...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, TBD (Tiny Blue Dot) Vakfı tarafından maddi olarak desteklendi. Google DeepMind'den Jennifer Sun ve Ting Liu'ya takip konusundaki yardımları ve rehberlikleri için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hava geçirmez gaz torbaları (0.5 L)Techinstro7440440
KameraAppleIphone 15
Çift telli yaylı hortum kelepçeleriKaynak Haritasıa24120200ux2109
Drosophila yiyecek karışımıİleri HayvancılıkDM900
Drosophila melanogasterDarwin BiyolojikLZ-210
Enjeksiyon borusuAitoserleaB09M8G5BQ8
LED ışık masasıLairiM1-3878368
ManometreDwyeromega477AV-8
Metal üç yollu sıkıştırma somutu stopcock Sigma Aldrich Z182184
Polikarbonat şırınga (20 mL)DMC MedicalFD-1031NS
polipropilen şırınga (20 mL)BD301031
Silikon boru
Xenon GazChengdu Taiyu Endüstriyel Gazları

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bert, P. Barometric Pressure: Researches in Experimental Physiology. , College Book Company. Columbus, Ohio. (1943).
  2. Grover, C. A., Grover, D. H. Albert Behnke: nitrogen narcosis. J Emerg Med. 46, 225-227 (2014).
  3. Rostain, J. C., Lavoute, C., Risso, J. J., Vallée, N., Weiss, M. A review of recent neurochemical data on inert gas narcosis. Undersea Hyperb Med. 38, 49-59 (2011).
  4. Clark, J. E. Moving in extreme environments: inert gas narcosis and underwater activities. Extrem Physiol Med. 4, 1(2015).
  5. Lawrence, J. H., Loomis, W. F., Tobias, C. A., Turpin, F. H. Preliminary observations on the narcotic effect of xenon with a review of values for solubilities of gases in water and oils. J Physiol. 105, 197-204 (1946).
  6. Miller, K. W., Paton, W. D., Smith, E. B., Smith, R. A. Physicochemical approaches to the mode of action of general anesthetics. Anesthesiology. 36, 339-351 (1972).
  7. Mashour, G. A., Forman, S. A., Campagna, J. A. Mechanisms of general anesthesia: from molecules to mind. Best Pract Res Clin Anaesthesiol. 19, 349-364 (2005).
  8. Sanders, R. D., Franks, N. P., Maze, M. Xenon: no stranger to anaesthesia. Br J Anaesth. 91, 709-717 (2003).
  9. Law, L. S. C., Lo, E. A. G., Gan, T. J. Xenon anesthesia: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Anesth Analg. 122, 678-697 (2016).
  10. Krishnan, K. S., Nash, H. A. A genetic study of the anesthetic response: mutants of Drosophila melanogaster altered in sensitivity to halothane. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (21), 8632-8636 (1990).
  11. Zalucki, O., Day, R., Kottler, B., Karunanithi, S., van Swinderen, B. Behavioral and electrophysiological analysis of general anesthesia in 3 background strains of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 9, 7-15 (2015).
  12. Daplan, E., Turin, L., Skoulakis, E. M. C. Measuring the anesthetic response to chloroform and isoflurane in general anesthesia mutants in Drosophila melanogaster. Anesthesia Res. 2, 12(2025).
  13. Rodriguez, E., Peng, B., Lane, N. Anaesthetics disrupt complex I-linked respiration and reverse the ATP synthase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1866, 149511(2025).
  14. Wlodarczyk, A., McMillan, P. F., Greenfield, S. A. High pressure effects in anaesthesia and narcosis. Chem Soc Rev. 35, 890-898 (2006).
  15. Koblin, D. D., et al. Minimum alveolar concentrations of noble gases, nitrogen, and sulfur hexafluoride in rats: helium and neon as nonimmobilizers (nonanesthetics). Anesth Analg. 87, 419-424 (1998).
  16. Thomas, J. J., Baxter, R. C., Fenn, W. O. Interactions of oxygen at high pressure and radiation in Drosophila. J Gen Physiol. 49, 537-549 (1966).
  17. Kent, D. W., Halsey, M. J., Eger, E. I. 2nd, Kent, B. Isoflurane anesthesia and pressure antagonism in mice. Anesth Analg. 56, 97-101 (1977).
  18. Gunning, C. FixtrackV2 at SingleVid. , Github. (2025).
  19. Allada, R., Nash, H. A. Drosophila melanogaster as a model for study of general anesthesia: the quantitative response to clinical anesthetics and alkanes. Anesth Analg. 77, 19-26 (1993).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hyperbaric PressureXenon AnesthesiaDrosophila MelanogasterAnesthetic GasesBehavioral ResponsePressure ChamberVideo AnalysisPixel DifferenceFly MovementModel Organisms

İlgili makaleler