Yöntem makalesi

Eşeysiz Amfibi Brassicaceae Türü, Rorippa aquatica'nın Verimli Rejenerasyon Temelli Agrobakteriya Aracılı Dönüşümü

DOI:

10.3791/69672

⸱

16 Ocak 2026

 ,  , 
1Howard Hughes Medical Institute and Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agrobakteriya aracılı bir Brassicaceae türü olan Rorippa aquatica'nın Agrobakteriya aracılı dönüşümü için, kaynak yoğun steril doku kültürü prosedürleri olmadan verimli ve optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Görsel dönüşüm işaretleyicisi ve sürgün yenileme boru hattı kullanılarak yakın klonal transformantlar başarıyla üretildi ve böylece bitkinin su altı ortamına uyum sağlama çalışmalarını ilerletti.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agrobacterium tumefaciens aracılığı altında bitkilerin istikrarlı genetik dönüşümü, temel bitki biyolojisi araştırmaları ve bitki biyoteknolojileri için doğrudan ürün iyileştirmesini etkileyen güçlü bir araç olmuştur. Arabidopsis için çiçek daldırma yöntemi gibi basit ve etkili dönüşüm boru hatları, gen fonksiyonunun büyük ölçekli analizlerini büyük ölçüde ilerletmiştir. Ancak, böyle bir boru hattı cinsel üremeye uğramayan bitki türlerine uygulanamaz. Rorippa aquatica, karasal veya su altı ortamlarında yaprak ve bitki formunda heterofil, yani keskin değişiklikler gösteren yeni bir amfibi Brassicaceae model türüdür. R. aquatica yalnızca vejetatif olarak üreler. Burada sunulan optimize edilmiş hattı, steril doku kültürü gerektirmeyen verimli ve güvenilir Agrobacterium aracılı R. aquatica dönüşümü sağlar. Yaprak kesimleri, yapısal promotor altında görsel bir işaretleyici olan RUBYyi ifade eden ikili bir vektör içeren dönüşüm tamponu içinde askıya alınmış Agrobakteriya'ya kısa süreliğine batırılır. Daha sonra, aşılamalar suyla ıslatılmış bir filtre kağıdı üzerinde büyüme odasında yetiştirilir. Daha sonra, RUBY kırmızı pigmentasyona sahip yenilenen bitki yetikleri ayrılır ve toprakta saksıya yerleştirilir. O ilk T1 rejeneratları (R1-T1) kırmızı sektörleri ifade eder. Kırmızı sektörün kesilip rejenerasyon adımlarının tekrarlanmasıyla, bir sonraki R2-T1 nesilinde çok sayıda transgenik kardeş üretilir; bunların bazıları neredeyse eşit şekilde kırmızıdır; bu, RUBY'nin ifadesinin göstergesi. Bu basit dönüşüm hattı, R. aquatica ve muhtemelen diğer vejetatif olarak çoğalan bitki türleri için, kara ile adaptasyondaki işlevlerini incelemek amacıyla ilgi çekici genleri tanıtmak amacıyla benimsenebilir. sucul ortamlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kararlı genetik dönüşüm, yani belirli bir bitki türüne ilgi duyan genlerin tanıtımı ve ifade edilmesi, temel bitki bilimi ve bitki biyoteknolojisi için merkezi bir yerdir. Agrobacterium tumefaciens-aracılı dönüşüm, stabil transformantların güvenilir üretimi nedeniyle bitki gen mühendisliğinin açık ara en yaygın yoludur. T-DNA klonlama vektörü ve etkisizleştirilmiş vir yardımcı plazmidinin iki varlığa ayrıldığı ikili vektör sisteminin geliştirilmesi, Agrobakteriya aracılı dönüşüm 1,2'yi devrim niteliğinde değiştirdi. Model bitki Arabidopsis thaliana için, basit ve maliyet etkin bir çiçek daldırma dönüşüm prosedürü, fonksiyonel genetik ve genomik için klonal (hemizigozu) transformantların yüksek verimli üretimini mümkünkılmıştır 3,4. Ancak, bu yaklaşım, ağırlıklı olarak veya yalnızca vejetatif olarak çoğalan bitki türleri için mümkün değildir.

Amfibi bitkiler, hem karasal hem de suculu (su alttı) ortamlarda gelişme konusunda benzersiz bir yeteneksergiler. Rorippa aquatica, heterofil gösteren amfibi bir Brassicaceae türüdür. Karasal bir ortamda, R. aquatica, zemin hücreleri ve stomalardan oluşan epidermisli yuvarlak yapraklar geliştirir. Buna karşılık, su yaprakları su altı ortamına iyi uyum sağlamış morfolojiler sergiler: çok kesilmiş iğne benzeri yapraklar, kesilmiş kaldırım hücreleri veya stomalardan yoksunepidermisle 6,7. Filogenetik olarak, R. aquatica Arabidopsis thaliana ile yakından akrabadır;ikisi de aynı aileye, Brassicaceae6'ya aittir. Tüm genom dizisi verilerinin bulunabilirliği ve R. aquatica ile A. thaliana arasında kodlayan genlerin yüksek dizi korumasıyla birlikte, R. aquatica, kara ve suya uyumun moleküler temelini incelemek için gelişmekte olan bir amfibi modelbitki olarak hizmet vermektedir 8. Gerçekten de, son fizyolojik ve gen ifade çalışmaları, ışık ve hormon sinyal yollarının yeniden kablolanmasının R. aquatica 7,8'in heterofil için kritik olduğunu göstermektedir.

Aday genlerin ve yolların moleküler fonksiyonlarını test etmek için genetik dönüşüm kesinlikle gereklidir. R. aquatica, doğada vejetatif olaraküremek 8,9. Bu nedenle, A. thaliana'nın aksine, Agrobacterium çiçek dip dönüşümü R. aquatica'ya uygulanamaz. İlginç bir şekilde, R. aquatica, dışsal fitohormon takviyesi olmadan kopmuş yapraklardan tüm bitki yetişiklerini kolayca yeniler. Kısa bir süreliğinde, yaprak segmenti ayrıldıktan birkaç gün sonra, kesik yüzeyin proksimal ucundaki damar dokusunda hücre çoğalması aktif hale gelir. Bir hafta içinde hem kökler hem de sürgünler yenilenir ve sonunda genç bitkiçikler (rozet bitkileri) üretir. Bireysel bitkiler ayrılıpolgunluğa kadar yetiştirilebilir 10. Bu kendiliğinden gerçekleşen tüm bitkicik rejenerasyon süreci, R. aquatica'nın genetik dönüşümü için kolayca kullanılabilir.

Burada bildirilen optimize edilmiş hattı, yaprak ayrıldıktan sonra kendiliğinden yenilenme yeteneğinden yararlanarak R. aquatica'nın Agrobacterium aracılı verimli ve güvenilir dönüşümünü sağlar. Maliyetli steril kültür süreçlerine ihtiyaç duymadan transformantların kolay seçimi için, betalain11'in biyosentezine yol açan üç genli sentetik vektör olan invaziv olmayan görsel seçim belirteci RUBY'yi benimsedi. Bakteriyel kültür koşulları, aşılama adımları ve yaprak kesimlerinin yenilenmesi için kuluçka süreçleri optimize edilerek, güvenilir şekilde transgenik R. aquatica bitkileri olgunlaşana kadar üretilmiştir. R1-T1 neslindeki ilk dönüştürücülerin neredeyse tamamı kırmızı sektörler gösterir; bu da bunların heterojen, genetik mozaikler olduğunu gösterir. RUBY+ kırmızı yaprak sektörlerini kesip rejenerasyon süreçleri tekrarlanarak, sonraki R2-T1 neslinde tamamen kırmızı rozet bitkileri, yani neredeyse klonal R. aquatica dönüştürücüleri üretilebilir. Bu dönüşüm hattı, R. aquatica'ya ilgi duyan yabancı genlerin tanıtılması/ekspreslenmesi için kolayca uygulanabilir; böylece heterofil moleküler genetik çalışmaları ve bitki uyumu aşırı ortamlara adaptasyon sürecini hızlandırır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Bitki materyallerinin hazırlanması

  1. İki aylık, olgun ana bitkilerden 1-2 cm uzunluğunda sağlıklı yaprakları kesin ve kesin, tamamen loblu, olgun yapraklar için 1-2 cm boyutunda parçalara ayırın (Şekil 1A).
  2. Bitki çoğaltma tepsisini (20 x 30 cm Perma Yuva Tepsileri) iki kat otoklavlı katlanmış kağıt havlu ile kaplayın. Kağıt havluları steril suyla doyurur, böylece üzerinde ince bir su tabakası olur.
  3. Çelikleri adaksial yüzü üst üste koyun, her eksplantasyonun etrafına boşluk olacak şekilde yerleştirin (Şekil 1A).
  4. Kesimleri hafifçe süzün ve tepsiyi plastik filmle sıkıca örtün.
  5. Tepsileri büyüme odasına 25 °C-28 °C sıcaklıklarında, nemli koşullarda 16 saat ışık ve 8 saat karanlık dönemde, 50 μmol/m 2/s ışık yoğunluğunda yerleştirin.
  6. Haftada 2-3 kez temiz, nemli çoğaltma tepsilerini kontrol edin ve bakıma devam edin.
    1. Doygun kağıt havluların üzerine ince bir su tabakası tutmak için steril su ekleyin.
    2. Yapışmasını kaybetmiş ve/veya kirlenme belirtileri gösteren (örneğin, görünür su bulanıklığı) plastik sargıyı değiştirin.
  7. Mikromakas veya bistüri kullanılarak, yerleştikten 14-21 gün sonra hem bir sürgün hem de kök taşıyan, yenilenmiş, bireysel sağlıklı rozet bitkilerini dikkatlice alıp alın (Şekil 1B).
    NOT: Bir rozet bitkisi, sürgün ve kökü sağlam olmak için dikkatli bir çıkarma gereklidir. Rorippa rozet bitkileri, yaprak eksaptalının ve orta kaburganın kesişim noktasında yoğun şekilde çoğalır ve bu da bireysel rozet bitkilerinin tanımlanmasını zorlaştırır. Rozet bitkisinin filizi adaksial olarak büyürken, kökler yaprak yüzeyinin altında büyür ve tüm rozet bitkisinin görünürlüğünü zorlaştırır (Şekil 1B).
  8. Bireysel rozet bitkilerini, nemli toprak ortamı (saksı karışımı oranı 2:1:1 oranında: Vermilkülit: Perlit) içeren saksılara dikin ve yavaş salınan bir gübre ile desteklenin (Şekil 1B).
  9. Musluk suyu ile su, 0,25 g/L granül NPK gübre ile değiştirilir ve nemli koşulları korumak için nem kubbesi veya plastik örtüyle örtülür.
  10. Tepsileri büyüme odasına önceki koşullarda (25 °C-28 °C, nemli koşullarda 16 saat ışık ve 8 saat karanlık dönem ve ışık yoğunluğu 50 μmol/m 2/s olarak) yerleştirin.
    NOT: Nemli toprak koşullarını korumak kritik öneme sahiptir. Saksı ekimlerinin altında ince bir su tabakası bulundurun.

2. Dönüşüm için agrobakteriyel kültürler

  1. Streak A. tumefaciens , GV3101 süzü, Ti-plazmid pMP90 (pTiC58DT-DNA) içerir; bu suş, rifampisin (0,03 mg/mL), gentamisin (0,025 mg/mL) ve spectinomycin (0,05 mg/mL) içeren 30 mL LB plakasında RUBY vektörünü içerir ve tek kolonileri belirginleşene kadar 28° C'de 48-72 saat boyunca büyür.
  2. Tek bir koloni seçin, 5 mL MG/L suyu biotin ve önceden seçici antibiyotiklerle (Tablo 1) aşılayın ve 200 rpm'de 28 °C döner bir silkeleyicide 16 saat kuluçka yapın.
  3. Aşıyı 250 MG/L su suyu olan konik bir şişeye aktarın ve 28 °C sıcaklığında 200 rpm'de 16 saat boyunca inkübe yapın.
  4. Sıvı kültürün en az OD600 değerinin 1.2 olduğundan bir spektrofotometre kullanılarak emin olun. Bakterileri oda sıcaklığında (yaklaşık 22 °C) 10 dakika boyunca 3396 x g santrifüjle geçirin. Aşı suyu 200 μM Asetosyringon (AS) ile değiştirilir.
    NOT: Filtre steril AS Aliquotları DMSO'da 100 mM çalışma konsantrasyonunda hazırlanır ve -20 °C'de saklanır. Aşılama suyu taze yapılmalıdır. AS, bozulmayı en aza indirmek için santrifüj aşamasından hemen önce eklenir. Medya tanımları ve bileşenleri Tablo 1'de listelenmiştir.
  5. Bakteriyel pelletin doğrudan bozulmasından kaçınarak, üst tabakayı atıp pelleti inokulum çorbasına yeniden yerleştirin.
  6. Termosunu elle çevirin ve çözeltinin yaklaşık 0.8 OD600 olmasını sağlayın.
  7. Aşıyı 90 rpm'de bir shaker üzerinde 2,5 saat boyunca ortam sıcaklığında (yaklaşık 22 °C) kuluçka edin.
  8. İlgili koşulları kaydedin (Kültür ve AşıOD 600, AS konsantrasyonu ve yüzeyaktif miktarı, aşılama süresi ve dönüşüm verimliliği için gerekli deneysel birim sayısı).
    NOT: Optimal bakteriyel ve yeniden süspansiyon kültürü konsantrasyonları, aşırı bakteri büyümesini en aza indirirken dönüşüm verimliliğini maksimize etmek için gereklidir. Santrifüjlemeden önce, bakteriyel kültürün en az OD600 değerinin 1.2 olduğundan emin olun; 0.8 inokulum OD600'e yeniden askıya alın. İndüksiyon suyu üzerindeki değişiklikler, rejeneratör yaşamını tehlikeye atmadan dönüşümü hızlandırmak için optimize edilmiştir. Önerilen konsantrasyonlar AS için 150-225 μM, yüzeyaktif madde için ise %0,005 arasındadır.
    DIKKAT: Tüm transjenik bakterileri ve bitkileri belirlenmiş biyotehlike atık konteynerlerine atın.

3. R. aquatica yaprak kesimlerinin dönüşümü

  1. Aşı yeniden süspansiyon kültürü kuluçkaya girerken, sağlıklı yaprakları olan ve tüm kenarları olan birkaç 2 aylık stok bitkisini seçin.
  2. 2 kat otoklavlı kağıt havlu ile bitki çoğaltma tepsisi (20 x 30 cm Perma Yuva Tepsileri) hazırlayın. Kağıt havluları katlayın. Kağıt havluları steril suyla doyurur, böylece üzerinde ince bir su tabakası olur.
    NOT: Aşılanmamış explantların aynı çevresel koşullara maruz kaldığı negatif kontrol tepsisi oluşturun.
  3. Laboratuvar tezgahının 100-500 mL ddH2O, beklenen askılanmış inokulum hacmine uygun steril kaplar, mikropipet ve uçlarla donatıldığından emin olun.
  4. İnkubasyon aşamasının sona ermesinden önce, seçilen stok bitkilerinden yaprak sapı tabanındaki on yaprak hızla çıkarılır. Explantları steril suyla bir Petri kabına yerleştirin.
    NOT: Yaprak aşısı için yeni çıkarılmış doku kullanmak kritik öneme sahiptir, böylece yaprak kurumasını önler.
  5. 2,5 saat sonra, 50 μL yüzeyaktif maddeyi 1 L resüspansiyon çözeltisine (%0,005 yüzeyaktif madde konsantrasyonu) pipet yapın ve mataşa nazikçe karıştırarak karıştırın (Şekil 2A). Aşılamadan sonra ekzplantların yerleştirilmesi için bir çoğaltma tepsisinin erişilebilir olmasını sağlamak (Şekil 2B).
  6. Yaprak abaksial tarafı yukarı yerleştirilin ve orta kaburga boyunca dik olarak 1 cm uzunluğunda parçalara kesin (Şekil 2C).
  7. Hemen taze kesilen yaprakları döner tüp mikseri için uygun olan 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve aşılama eksplantı olarak kullanılsın.
  8. Inokulumu eksplant tüpüne bir hacimde dökerek tüm malzemeyi doyuracak şekilde doldurun ve ardından oda sıcaklığında döner mikserde 10 dakika boyunca karıştırarak aşılama işlemi yapılır (Şekil 2D,E).
  9. Aşılanmış tüm yaprakları çözeltiden forseps ile çıkarın ve doğrudan hazırlanan yayılma tepsisine yerleştirin.
  10. Islatılmış explant'ları ayırıp yayarak doygun kağıt havluların üzerindeki ince su tabakasına kısmen ama tamamen batırılmamış hale getirin (Şekil 2F).
    DIKKAT: Aseptik koşulları koruyun ve dezenfeksiyondan önce Agrobacterium işlemleri sırasında kullanılan yüzeyler veya aletlerle temas etmekten kaçının.
  11. Her tepsiyi plastik sargıyla kapatın ve üç gün boyunca ortam (22°C) sıcaklığında karanlıkta kuluçka yapın.
  12. Karanlık dönem tamamlandığında, tepsilerin şeffaf plastik sargıyla kapatıldığından emin olun ve nem seviyesini korumak için tepsileri ddH2Oile değiştirin.
  13. Aşılama tepsilerini vejetatif üreme koşullarında büyüme odasına taşıyın.
    DIKKAT: Aşı atıklarını bir atık konteynerinde birleştirin, %10 çamaşır suyu çözeltisi ile tedavi edin ve biyolojik güvenlik yönergelerine uygun olarak bertaraf edin.

4. Rozet otlarının yenilenmesi ve R1-T1 kuşağının kurulması

  1. Temiz ve nemli koşullar için haftada 2-3 kez aşılama tepsilerini kontrol edin.
    1. Sıkıştırma şişesi kullanarak ddH2Oekleyin. Mümkünse, tepsileri tekrar kapatmadan önce bir sprey şişesiyle sürün.
    2. Yapışmasını kaybetmiş veya kirlenme belirtileri gösteren (örneğin, görünür su bulanıklığı) plastik sargıyı değiştirerek yüksek nemi koruyun.
  2. Yenilenmiş rozet bitkilerini nakil uygunluk özellikleri açısından görsel olarak inceleyin. İdeal rejeneratörler, en az 2-3 mm uzunluğunda çok sayıda yaprak ve köke sahip sağlam bir sürgün sergilerdir (Şekil 2G).
    NOT: Transjenik rozet bitkileri genellikle daha yavaş yenilenir ve genellikle büyüme odasına yerleştirildikten 21-28 gün sonra nakil uygunluğuna ulaşır.
  3. Tüketim ve nakil olarak sağlam transjenik rozet bitkileri WT klonal yenileyicileriyle aynı koşullarda elde edilir.
  4. (İsteğe bağlı) Yenilenen dönüştürücülerin sayısını kaydedin ve dönüşüm koşullarıyla korelasyon yapın; böylece verimlilik değerlendirilsin.
    NOT: Seçim sırasında ekstra dikkatli olun. Transgenik rejeneratörler genellikle küçük ve kolayca gözden kaçanlardır. Hem adaxial hem de abaxial yaprak yüzeylerini penslerle dikkatlice inceleyin, verimi maksimize etmek ve hasarı en aza indirmek için.
  5. Rozet bitkisini alçaltın, ancak transgenik yapraklara dokunmaktan kaçının. Transgenik yaprağın hemen çevresindeki fazla yaprakları kesin. Her saksıda bir bitki dik.
  6. Her bitkiyi hızlıca gübreleyin, sulayin ve suğulayın ve nemi korumak için plastik bir kubbe altına yerleştirin (Şekil 2G,H).
  7. Her transgenik fidanı etiketle ve kaydet.
  8. Sürgüleri, kökleri olmayan veya sürekli tarama için ekim edilemeyecek kadar küçük görünen transformantlar içeren explantları geri gönderin. Büyüme yeterli olduğunda ek dönüştürücüler nakledilir.
  9. İlk hafta boyunca her gün sis ve su nakli. Tepside her zaman su olduğundan emin olun.
  10. RUBY pigment ekspresyonunu göstermeyen veya artık yaşlanmış olan nakilleri çıkarın ve bertaraf edin.
    DIKKAT: Tüm transgenik malzemeleri kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak bertaraf edin.

5. Sonraki yenilenme ve neredeyse klonal R2-T1 neslinin oluşması

  1. Rozet bitkileri büyük ve sağlıklı bitkilere dönüştükten sonra (2 ay), tek bir fideden genişlemiş YAKUT ifade eden yaprakları çıkarır (Şekil 2H).
    NOT: YAKUT ifa eden yapraklar eşit şekilde kırmızı görünse de, daha yaygın olarak kimeriktir. Her iki fenotip de çoğalma için uygundur. Sonraki adımlarda standart bitki örtülü çoğaltma yöntemlerine devam edin.
  2. Dönüştürülmüş yaprak parçalarını ayırın ve onları bir çoğaltma tepsisine yerleştirin. Her çoğaltma tepsisini ilgili fide donör kimliğiyle açıkça işaretleyin.
    DIKKAT: Aynı tepside birden fazla fidanın yapraklarını karıştırmayın. Her fidan, benzersiz bir transgenik olayı temsil eder ve ayrı bir nesil olarak takip edilmelidir.
  3. Ekim yenilenmiş R2-T1 bitkileri (çoğaltmadan 14-28 gün sonra). Her bitkiye ikinci durumunu yansıtan yeni bir tanımlayıcı atayın. Daha önce açıklandığı gibi nakil sonrası standart bakıma devam edin (Şekil 2I,J).

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. tumefaciens dönüşümünün parametreleri, sterilite temelli sınırlamaları aşarak hızlı eşeysiz rejenerasyon hızından faydalanarak RUBY-ekspresyon eden transgenik R. aquatica bitkilerini başarılı bir şekilde üretmek için optimize edilmiştir (Şekil 1 ve Şekil 2). Yaprak parçası ekplantları aşılanıp 72 saat koyu bir tedaviye maruz kaldıktan sonra, yeniden oluşturulmuş bitki yetikleri tarif edilen koşullarda 2 hafta içinde büyümeye başladı. Nakil için yeterince büyük olan kimerik RUBY sektörleri gösteren yeniden oluşturulmuş bitki yetikleri aşılamadan 3-5 hafta sonra bulundu (Şekil 3) ve bu ekspresyonsuz rozet bitkiciğinden biraz daha küçüktü. Kontrol tipi tepsilerde RUBY yenilenmiş bitki kütüğü bulunmamış, bu da bu olgunun R. aquatica fizyolojisinden farklı olduğunu doğrulamaktadır. Bakteriyel kültür suyu türü, yeniden süspansiyon inokulum suyu türü, infiltrasyon yöntemi ve aşılama süresi, dönüştürücü üretme yeteneği veya oranı açısından anlamlı bir şekilde farklılık göstermemiştir (Tablo 2 ve Tablo 3). Dönüşüm verimliliğini olumlu etkileyen tedavi faktörleri arasında yaprak eksplantasyonu aşısından önce artan AS konsantrasyonu ve oksin maruziyeti uygulaması yer aldı. Artan yüzeyaktif madde konsantrasyonu verimi olumsuz etkiledi ve uygun bulunmadı.

R versiyonu 4.4.212,13,14,15, rozet bitki sayısı verilerinin Poisson Genel Lineer Karışık Modeli (Poisson GLMM) analizini yapmak için kullanılmıştır. Ancak, Ruby ile eksprese edilen rejeneratların 15 dakikalık aşı için incelendiği Deney D'de (Tablo 2D), 150 μM AS veya 225 μM AS ile değiştirilmiş 15 dakikalık aşı için model düşük dispersiye nedeniyle varsayımları ihlal etti ve bunun yerine Negatif Binomial GLMM uygulandı.

Farklı bakteriyel et suyu ve kültür koşullarının dönüşüm verimliliği üzerindeki etkileri dikkatle incelenmiştir. Beş deneysel replikasyon arasında, Miller'ın LB suyu veya dönüşüme özgü MG/L çorbasının kullanımı, neredeyse aynı parametreler altında RUBY'yi ifade eden dönüştürücülerin ortaya çıkmasına yol açtı ve etkilerinde anlamlı bir fark yaratmadı (Tablo 2A). RUBY'nin bireysel yaprak parçalarından yeniden oluşturulmuş rozet bitkileri yöntemleri, her işlem için 15-60 explant'tan oluşan, LB ve MS bazlı olmayan kültür resüspansiyon suyu (Kontrol İndüksiyon Sçorbası, Tablo 1) kullanılarak elde edilen deneylerden elde edilen 1,61 ±ile 0,71 rejeneratan arasında değişiyordu (Kontrol İndüksiyon Suyu, Tablo 1) ve MG/L ile Optimize Edilmiş Endüksiyon Suyu içeren deneylerden elde edilen 3,23 ± 1,13 rejeneratan. Önemli bir fark olmamasına rağmen, öznel gözlemler nedeniyle, gelecekteki optimizasyon deneyleri için MG/L kültürü ve Optimize Edilmiş Indüksiyon Suyu (Tablo 1) seçildi.

Sonrasında bakteriyel yükü ve meristematik bitki dokusuna erişim yeteneğini etkileyen faktörleri test ettik. Sekiz replikasyon arasında (Tablo 2B), %0,01 artan yüzeyaktif madde konsantrasyonuyla aşılanmış eksplantlar bir ay sonra aşırı stres gösterdi ve bu da küçük, büyük ölçüde yaşatıcı olmayan rejeneratantlara yol açtı. Bu replikalar arasında yenilenmiş dönüştürücü yok gibi görünüyordu, ancak explantların stresli rejeneratör fenotipi bordo, kahverengi ve sarı pigmentasyondu, bu yüzden potansiyel dönüştürücüler de olabilir. Her neyse, rejeneratörlerin uygulanamazlığı %0,005 yüzeyaktif madde konsantrasyonunun korunmasını doğruladı.

İstenen DNA'yı konak bitkiye sokmak için iki mekanik teknik, çaltlama veya vakum infiltrasyonu, etkisi açısından karşılaştırıldı. Explant'ların 50 mL resüspansiyonlu inokuluma batırılıp tüp mikserinde döndürülmesi ve kontrol infiltrasyon yöntemi, listelenen uygulamalar boyunca RUBY-ekspres rejeneratantların üretilmesinde başarılı oldu. Uygulanan vakum sızması da RUBY-eksprese rejeneratörler üretti, ancak dönüşüm verimliliği kontrol yöntemine göre farklı olmadı (p = 0.478, Tablo 2D). Yayılma tepsisinde yaklaşık 2-5 RUBY-ekspresyon rejeneratan gözlemlendi; bunlar vakum infiltrasyonu veya fiziksel çalkalama yoluyla aşılanmış olsun.

Değiştirilmiş Acetosyringone (AS) bakteriyel inokulum konsantrasyonu, dönüşüm verimliliği üzerindeki etkisi açısından açıkça farklıydı. AS konsantrasyonunun 150 μM'den 225 μM'ye yükseltilmesi, transjenik eksplantları ifade eden RUBY'nin üretimini önemli ölçüde iyileştirdi (p = 0.000309, 0.000458; Tablo 3C,D). Dört deney arasında, her tedavide 40 adet aynı şekilde aşılanmış bir tepsi vardı. Daha yüksek konsantrasyonda aşılananlar, kontrol AS tepsisi başına 1 dönüştürücü yerine ortalama 5 RUBY ekspres rejeneratantı aldı (Tablo 3C). Ayrıca, AS etkisi aşılama sürelerinden ayrı görünüyordu.

15 dakikalık aşılama süresine sahip üç deneyde, 225 μM AS ile değiştirilmiş eksplantları içeren üç deneyde, ortalama 7,28 ± 4,13 RUBY-eksprese edilen rejeneratan bulundu; bu, 150 μM'lik tedavilerden açıkça daha fazlaydı; burada 2,03 ± 1,32 rejenerasyon oranıydı (Tablo 3D). 150 μM AS kontrol tedavilerinde (p = 0,676) zaman aralığı üzerinde net bir etki görünmedi; bu tedavilerde ortalama 10 dakikalık aşılama oranı 1,48 ± 0,954 iken, 15 dakikalık aşılarda 1,84 ± 1,230 rejeneratan bulunuyordu (Tablo 3B). Benzer şekilde, 10 dakika, 225 μM ile işlenmiş inokulantlar, her işlem başına yaklaşık 5 RUBY eksprese rozet bitkisini yeniledi; bu, tedavi tepsisi için 6-7 rejeneratan belirtilen 15 dakikalık inokulant tedavilerden belirgin bir şekilde farklı değildi (Tablo 3A).

Ayrıca, genel olarak bitki yenilenmesine yardımcı olan bitki hormonu auxin test edildi. Taze çıkarılmış yaprak parçalarının aşıdan önce baklı oksin tedavisine maruz kalmak, ddH2O ile karşılaştırıldığında (p = 0.00969, Tablo 2C) RUBY rejenerasyonunun artması üzerinde açık bir olumlu etki yaratmıştır. 285 μM indol-3-asetik asit (IAA) ile değiştirilmiş ddH20'a yerleştirildiğinde, eksplantlar her işlem başına ortalama 6,67 ± 1,490 dönüşüm oranı gösterdi; oksinsiz tedaviye kıyasla ortalama 2,00 ± 0,816 rejenerasyon oranı vardı.

Hemen yenilenen transgenik hat, R1-T1 nesli olarak adlandırıldı (Şekil 2), bireysel rejeneratörler ise çizgiler olarak kullanıldı. Tüm ilk R1-T1 rozet bitkileri, çeşitli kimerik desenlere sahip kimerik yapraklar şeklinde RUBY ifadesi sergilemiştir. En yaygın olarak 1-3 bitki parçası yaprağı, RUBY-ekspresyonlu ve ekspreslenen olmayan dokunun orta kaburgada ayrıldığı belirgin kimeralar ifade ederdi. Bir aylık R1-T1 fidelerinin çoğu kimerik ifadeyi korudu (Şekil 3A), ancak tamamen RUBY-eksprese eden az sayıda fide bulundu.

R1-T1 fide yaprak parçalarından (Şekil 3B) aseksen olarak çoğaltılan RUBY-pigmentli kimerik segmentler, eksizyondan 2-4 hafta içinde tamamen RUBY veya kimerik R1-T1 rozet bitkileri yeniden üretmiştir (Şekil 3C). Bir ay sonra, çoğu R2-T1 fidesi ağırlıklı olarak RUBY yaprakları gösterdi, bazılarında ise küçük ifade edilmemiş kimerik bölgeler vardı (Şekil 3D,E).

figure-results-1
Şekil 1: Vejetatif yayılma protokolü ve zaman çizelgesi. Temsil eden görüntüler, eşeysiz rozet bitkiciği yenilemek için kullanılan üretim hattını göstermektedir. (A) Yerleşik ana bitkilerden olgun, sağlıklı, tam loblu yaprakları kesip 2-3 parçaya kesmek. (B) Explant'ları bir çoğaltma tepsisine yerleştirmek ve belirli koşullar altında saklamak. 3 hafta sonra, rozet bitkileri explantlardan çıkarılıp toprak ortamına dikildi. Aşağıda, ana yaprak kesimine hâlâ bağlı olan yenilenmiş rozetlerin (pembe oklar) gerçek bir fotoğrafı bulunmaktadır. Bu bitkiler nakil için en uygun aşamada. Ölçek çubuğu: 10 mm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: R. aquatica yaprak kesimlerinin dönüşümü ve RUBY transkriptlerini ifade eden transformantların rejenerasyonu. Dönüştürülmüş rejeneratların dönüşüm süreci ve üretiminin grafiksel özeti. (A) Bakteriyel aşı edinmek. (B) Steril filtre kağıdı ve suyla bir yayılım tepsisi hazırlamak. (C) Yaprakları eksplant parçalara ayırmak. (D) Explant'ları aşıya batırmak. (E) Döner mikserde 20r/1 dakika boyunca 10 dakika karıştırılır. (F) Doygun ekplantların tepsiye yayılması, plastik kubbe ile örtülmesi ve karanlık koşullarda 72 saat kuluçka halinde. (G,H) 1 ay sonra, Agrobakteriyel eksplantasyonlardan sağlam dönüşümlü rejeneratörlerin çıkarılıp olgun bitkiler oluşturmak için ekim edilmesi. (I,J) Yayılma adımı (G,H) tekrarlanarak neredeyse klonal bir R2-T1 üretimi elde edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: RUBY transgenik hattının cinsiyetsiz olarak çoğaltılan nesilleri. (A) YUBİYİ ifadesi taşıyan kimerik yapraklar sergileyen olgun R1-T1 fidesi. Ölçek çubuğu: 1 cm. (B) (A)'da gösterilen 3 aylık fidandan oluşan yirmi explant'tan ikisi ürgetme tepsisine taze yerleştirilir. Explantlar, orta kaburga bölgesinde ayrılmış bir RUBY'nin kimerik bir deseni gösterir. Ölçek çubuğu: 1 cm. (C) Nakil öncesi, çıkarılmadan bir ay sonra, farklı derecelerde kimerik RUBY ifadesine sahip yeniden oluşturulmuş R2-T1 rozet bitkileri. Yeniden oluşturulmuş RUBY pozitif kökler (marron oku). Pulluk çubuğu: 2 cm. (D) Ekim sonrası 1 ay sonra gösterilen R2-T1 fidesi, RUBY ifadesi göstermektedir. Pulluk çubuğu: 2 cm. (E) Ekimden 3 ay sonra olgun R2-T1 fidesi, küçük sektörler (yeşil oklar) gösterir. Ölçek çubuğu: 2 cm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Optimize edilmiş boru hattının akış şeması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Medya Formülasyonları Lütfen bu tabloyu indirmek için buraya tıklayın.

Tablo 2: Dört optimizasyon parametresinin R. aquatica'nın dönüşüm verimliliği üzerindeki etkisi. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Inokulum asetosyringon konsantrasyonununR. aquatica'nın dönüşüm etkinliği üzerindeki etkisi. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, yalnızca cinselsiz olarak üreyen Brassicaceae amfibi bitkisi R. aquatica'nın basit, doğrudan rejenerasyon temelli Agrobakteriya aracılı stabil bir dönüşümünüoluşturduk 10,16. Vejetatif olarak çoğaltılan amfibi bitkilerin kapsamlı bir dönüşüm hattı kurulmamış ve R. aquatica'nın pratik dönüşüm yeteneği görsel bir işaretleyici ile kullanılmamıştır. Özellikle, bu boru hattı zahmetli, steril bitki dokusu kültürü süreci veya özel bitki büyüme kuluçka makineleri gerektirmez. Bu nedenle, bu protokol bilimsel araştırma laboratuvarlarından sınıfa kadar çeşitli deneysel ortamlarda yaygın olarak benimsenebilir.

Test edilen farklı aşılama ve kuluçka koşulları arasında, dönüşüm verimliliğinde önemli bir iyileşme sağlayan birkaç faktör var. Özellikle, biraz daha yüksek asetosyringon (AS) konsantrasyonu ile indol-3-asetik asit (IAA) konsantrasyonu dönüşüm verimliliğini olumlu etkilemiştir (Tablo 1 ve Tablo 2). AS, Agrobakteriyanı çeken fenolik bir bileşiktir veArabidopsis 17'de bitki dönüşüm verimliliğini artırdığı gösterilmiştir. Fitohormon oksin, bitki hücresi yeniden programlamasında merkezi bir rol oynar. Yara kaynaklı rejenerasyon sırasında oksin ile ilişkili gen ekspresyonunda hızlı bir artışgözlemlenmiştir 10. Bu nedenle, explant aşılama sırasında dışsal olarak uygulanan oksin (IAA) yenilenme verimliliğini artırdığı varsayılabilir. Ancak, üç denemede gözlemlenen yenilenmiş bitkiçik sayısındaki farklar gözlemlenmedi (kontrol ve tedavi için 57 7,55 vs. 59,67, 5,51). Bu nedenle, auxin tedavisi, rejenerasyonun kendisinden ziyade dönüşüm sürecine yardımcı olabilir.

İyonik olmayan bir yüzeyaktif madde olan Alkoxylated trisilan (Silwet L-77 olarak bilinir), Arabidopsis'in dönüşüm verimliliğini çiçek daldırma yöntemi 3 ile büyük ölçüde artırır ve bu nedenle bitki biyolojisi topluluğunda yaygın olarak kullanılmaktadır. Silwet L-77 ile modifiye edilmiş explantlar arasında %0,005 (çiçek daldırması için önerilen konsantrasyon) minimum bitki stresi gözlemlenmiştir. Bu doz iki katına çıkarıldığında (%0,01 ), R. aquatica yaprak kesimleri ciddi şekilde zarar görmüş ve neredeyse hiç dönüştürücü bulunmamış (Tablo 2B). Arabidopsis çiçek daldırması sırasında, yüzey aktif maddelerin kullanımı aşılanmanın yüzey gerilimini azaltır ve çiçek tomurcuklarına erişimi artırır. Buna karşılık, amfibi bir bitki türü olarak R. aquatica , trikomlar veya kalın tırnak kütiküllerinden yoksun pürüzsüz yapraklargeliştirir. Artan yüzeyaktif madde yaprak dokusu hasarına yol açtı ve bu da tüylü olmayan yaprak dokularında dönüşüm verimliliği için yüzey aktif madde dışındaki faktörlerin önceliklendirilmesi gerektiğini gösteriyor. Suraktif madde, doku nüfuzunu kolaylaştıran ergli fenotip için daha önemlidir. Tüm test edilen parametreler entegre edildikten sonra, en optimal koşullara sahip bir boru hattı akış şeması olarak sağlanır (Şekil 4).

Görsel bir işaretleyici olan RUBY'nin kullanılması bu dönüşüm hattı için çok önemlidir. RUBY, parlak kırmızı pigment olan betalain11'i sentezleyen üç kodlayıcı geni (CYP76AD1, DODA ve Glukozil transferaz) kodlayan sentetik bir raporlayıcıdır. RUBY ifadesi R1-T1 rejeneratlarında gözlemlendiğinde, kırmızı sektörler olarak ifade edildi ve bu da bunların büyük ihtimalle kimerik olduğunu gösterir (Şekil 2 ve Şekil 3). Önceki bir çalışma, R. aquatica'nın rejenerasyonunun kesilen bir yaprakkesitinin damarlı kambiyumundan kaynaklandığını ortaya koymuştur 10. Dikkat çekici bir şekilde, R1-T1 rejeneratörleri zaman zaman orta damar boyunca kimerik bir sınır gösterir; yaprak bıçağının yarısı kırmızı, diğer yarısı yeşildir (Şekil 3A,B). RUBY sektörlerinden yeniden rejenerasyon sırasında zaman zaman kırmızı köklü tamamen kırmızı bitki parçaları elde edilmiştir (Şekil 3C, bordo ok), ardından bunlar tekiz kırmızı R2-T1 bitkilerine dönüştürülür (Şekil 3D). RUBY'nin aşırı ekspresyonunun R. aquatica'nın büyüme ve gelişimi üzerinde olumsuz etkileri gözlemlenmedi (Şekil 3). Destek olarak, RUBY sektörleri olan R1-T1 rozet yapraklarının boyut ve şeklinde belirgin bir fark gözlemlenmedi (ör. Şekil 3B). Herhangi bir güçlü, yapıcı promotor odaklı transgenin normal bitki büyümesi ve fizyolojik tepkiye müdahale etmesi mümkündür.

Bazı durumlarda, bu 'neredeyse klonal' RUBY bitkileri yeşil sektörler geliştirmiştir (Şekil 3E, yeşil oklar), bu da geri dönüş veya transgen susturulmasını işaret eder. Bu, RUBY gibi görünür bir belirteçin gelecekteki moleküler ve mekanistik çalışmalar için ilgilenilen bir genin ektopik ifadesi veya susturulması (örneğin, RNAi) için vazgeçilmez olduğunu göstermektedir. RUBY kasetine ilgi çekici bir transgen eklenebilir ve kırmızı RUBY sektörlerindeki fenotipleri gözlemleyebiliriz. Sonuç olarak, yaprak kesme kaynaklı doğrudan yeniden programlama ve invaziv olmayan görünür bir işaretleyici kullanılarak basit ve verimli bir dönüşüm hattı R. aquatica için optimize edilmiştir; bu, vejetatif olarak çoğalan bir Brassicaceae türü olarak tasarlanmıştır. Bu protokolün kapsamı dışında olsa da, dönüştürülmüş R. aquatica'nın rejenerasyonunun tam kökenini gelecekte anlamak, bitkilerde hücresel yeniden programlama hakkında içgörü sağlayabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışmamız olmadığını ilan ediyoruz.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut RUBY plazmidlerini değiştirmek için vektör tasarımı konusundaki tavsiyeleri için Prof. Yunde Zhao'ya teşekkür ederiz; Dr. Shuka Ikematsu ve Prof. Seisuke Kimura'dan R. aquatica yönetimiyle ilgili tavsiye için; Grafik konusunda yardım için Dr. Issey Takahashi'ye. Bu çalışma, Texas Üniversitesi Austin'den Johnson & Johnson Yüzüncü Yıl Bitki Hücre Biyolojisi Kürsüsü ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden K.U.T.'ye yönelik başlangıç fonları ve bağışlarıyla desteklenmektedir. Şekil 1 ve Şekil 2 , P.E.G. tarafından BioRender ile oluşturulmuş ve Adobe Illustrator'da K.U.T. tarafından modifiye edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1000 µ L Düşük Tutmalı LTS Filtreli Pipet UçlarıRainin30389213
AsetosiringonSigma-AldrichD134406-1G
Bacto Maya Ekstraktı, TeknikFisher ScientificDF0886-17-0
BD Bacto AgarFisher Scientific214030
BD Difco LB Broth, MillerMidland ScientificDIFCO 244610
BD Bacto Dehidratlı TriptonFisher ScientificDF0123-17-3
Biotin liyofilize tozSigma-AldrichB4501-100MG
PermaNest Tepsileri için Şeffaf KubbelerYetiştiricinin ÇözümüGD221
Şeffaf Plastik AmbalajThomas Scientific22-305654
Kabaca VermikülitBectine
di-Potasyum hidrojen fosfat susuzSigma-Aldrich105109
Tek kullanımlık Petri Kabları 100 x 15 mmVWR International25384-342
D-MannitolSigma-AldrichM9546-250G
Etanol, 200 kanıtFisher Scientific04-355-720
Falcon 50 mL Konik Santrifüj TüpleriFisher Scientific14-432-22
Katlanmış kağıt havlular 9.3" x 10.5"Kimberly-Clark2920
GENESYS 30 Görünür SpektrofotometreTermo Bilimsel840-277000
Gentamisin çözeltisiSigma-AldrichG1272-100ML
L-Glutamik asit monosodyum tuz hidratSigma-AldrichG1626-100G
Magnezyum klorürSigma-AldrichM8266-100G
Magnezyum sülfat, heptahidratSigma-AldrichM9546-250G
MaxQ 6000 Kuluçka Kuluçka MakinesiTermo BilimselSHKE6000
MES hidratıSigma-AldrichM8250-100G
Murashige ve Skoog Bazal Tuz Karışımı (MS), tozSigma-AldrichM5524-50L
MX-RL-pro: Rotisserie Tüp RotatoruScilogex824222019999
Myo-InositolSigma-AldrichI7508-100G
Percival Büyüme OdasıPercivalAR36L3
Perlit Ekim Toprağı KatkısıPVP EndüstrileriPVP105408
Kalıcı Yuva Bitki Tepsileri 8''x12''VWR International470150-476
pH ölçer Yedi Kompakt 5220Mettler Toledo30019028
Korunan SsmalıFisher Scientific02-688-79
RifampisinSigma-AldrichR3501-5G
Akıllı Salınımlı Gübre Bitkisi GıdasıOsmocoteB0071CZTBA
Sodyum klorürFisher ScientificS271-3
Spectinomycin dihidroklorür pentahidratSigma-AldrichS4014-5G
Pompalı Buharlaştırıcı Sprey ŞişeleriThomas Scientific1141V43
Kare 3.5" GAGE potYetiştiriciler Fidanlık Tedarik A.Ş.03GA-0350S
SucroseSigma-AldrichS0389-5KG
Sunshine #4 Profesyonel Yetiştirme Karışık ToprağıSun GRO Bahçecilik1341CFL0028P S
Yüzey aktif madde - Silwet L-77Fisher ScientificNC1791615
Vakum KurutucuLaboratuvar Deposu55207
Suda Çözüneýän Çok Amaçlı Bitkisel BesinlerMiracle-Gro160101

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), 16-37 (2003).
  2. Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. Technical Focus: A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci. 5 (10), 446-451 (2000).
  3. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
  4. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
  5. Koga, H., Ikematsu, S., Kimura, S. Diving into the water: Amphibious plants as a model for investigating plant adaptations to aquatic environments. Annu Rev Plant Biol. 75 (1), 579-604 (2024).
  6. Nakayama, H., et al. Regulation of the KNOX-GA gene module induces heterophyllic alteration in North American lake cress. Plant Cell. 26 (12), 4733-4748 (2014).
  7. Ikematsu, S., et al. Rewiring of hormones and light response pathways underlies the inhibition of stomatal development in an amphibious plant Rorippa aquatica underwater. Curr Biol. 33 (3), 543-556.e4 (2023).
  8. Sakamoto, T., et al. A chromosome-level genome assembly for the amphibious plant Rorippa aquatica reveals its allotetraploid origin and mechanisms of heterophylly upon submergence. Commun Biol. 7 (1), 431(2024).
  9. Flora of North America: Volume 7: Magnoliophyta: Dilleniidae, Part 2. , Oxford University Press Inc. 493-506 (2010).
  10. Amano, R., et al. Molecular basis for natural vegetative propagation via regeneration in North American Lake Cress, Rorippa aquatica (Brassicaceae). Plant Cell Physiol. 61 (2), 353-369 (2020).
  11. He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Hortic Res. 7 (1), 152(2020).
  12. Hartig, F. DHARMa: Residual Diagnostics for Hierarchical (Multi-Level / Mixed) Regression Models. R package version 0.4.7. , (2024).
  13. Lenth, R. emmeans: Estimated Marginal Means, aka Least-Squares. R package version 1.10.7. , (2025).
  14. McGillycuddy, M., Bolker, B. M., Popovic, G., Warton, D. I. Parsimoniously fitting large multivariate random effects in glmmTMB. J Stat Software. 112 (1), 1-19 (2025).
  15. Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. J Stat Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  16. Nakayama, H., Sinha, N. R., Kimura, S. How do plants and phytohormones accomplish heterophylly, leaf phenotypic plasticity, in response to environmental cues. Front Plant Sci. 8, 1717(2017).
  17. Sheikholeslam, S. N., Weeks, D. P. Acetosyringone promotes high efficiency transformation of Arabidopsis thaliana explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol Biol. 8 (4), 291-298 (1987).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Agrobacterium TransformasyonuVejetatif retimRejenerasyon HattYaprak Eksplant nok lasyonuRUBY Mark rE eysiz Bitki TransformasyonuBatma TepkisiBitki Genetik M hendisli i

İlgili makaleler