LC-mate kullanarak otomatik HPLC Ayrımı: Mikro Ölçekli Arıtma İçin Entegre Tekrarlayan Otomatik Numune Alan ve Fraksiyon Toplayıcı

Özet

Tekrarlayan HPLC ayrımlarını otomatikleştirmek için entegre bir otomatik örnekleyici ve fraksiyon toplayıcı (LC-mate) geliştirildi. Analog sinyal üreten HPLC dedektörleriyle uyumlu olan LC-mate, manuel olarak çalışan sistemlerin performansını artırır ve yüksek performanslı sıvı kromatografiye bağlı araştırma iş akışlarını hızlandırır.

Özet

Yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC), yüksek değerli bileşiklerin saflaştırılmasında kritik bir rol oynar ve hem akademik hem de endüstriyel ortamlarda kimya ve biyoloji disiplinlerinin artan taleplerini karşılar. Ancak, mikro ölçekli arıtma sırasında tekrar tekrar elle enjeksiyon ve fraksiyon toplama, verimliliği ve tekrarlanabilirliği önemli ölçüde sınırlar. Bu darboğazı aşmak için, HPLC dedektöründen gelen analog sinyallere doğrudan yanıt vererek tekrarlayan ayrımları otomatik olarak otomatikleştiren geçici olarak LC-mate adlandırılan entegre bir otosampler ve fraksiyon toplayıcı sistemi geliştirdik. Cihaz, örnek enjeksiyonu için yüksek basınçlı altı portlu anahtarlama valfi ve fraksiyon toplama için seçici valf etrafında inşa edilmiştir; operasyonel parametreler sezgisel bir dokunmatik ekran arayüzü aracılığıyla kontrol edilir. LC-mate, analog çıkış yapabilen ticari HPLC dedektörleriyle uyumludur ve senkron sinyal tetikleme yoluyla gradyan elusyonunun tekrarlayan ayrımını da sağlayabilir. Gösteri deneyleri, doğal ürün arıtımı için stabil çalışma ve tekrarlanabilir ayrımlar doğruladı ve manuel işlem süresinin net bir azaldığını gösterdi. Sistem, geleneksel HPLC iş akışlarında otomasyonu geliştirmek için pratik ve erişilebilir bir çözüm sunar; manuel ile tam otomatik arıtma sistemleri arasındaki boşluğu kapatır.

Giriş

20. yüzyılın başlarında M.S. Tswett tarafından öncülük edilen kromatografi, 1960'larda enstrümantasyon 1,2,3'teki gelişmelerle modern yüksek performanslı sıvı kromatografiye (HPLC) evrildi.

Günümüzde HPLC, biyomedisi, kimya ve biyoloji alanlarının akademik ve endüstriyel alanlarında artan taleplerini karşılayarak yüksek değerli bileşiklerin arındırılmasında kritik bir rol oynamaktadır. Akademik araştırmalarda, doğal ürünlerin mikro ölçekli saflaştırılması ve kiral moleküllerin çözünürlüğü, yarı-preparatif HPLC ^{tekniklerine kritik şekilde bağlıdır} 4,5,6,7,8. Çoğu pratik durumda, araştırmacılar örnek çözümünün bir kısmını HPLC kolonuna bir anda enjekte ederler; bu da öngörülemeyen örnek kaybını önlemek veya kolon boyutunun kısıtlanması nedeniyle tekrarlanan örnek enjeksiyonu ve fraksiyon toplama kaçınılmaz hale gelir. Olağanüstü ayırma yeteneğine rağmen, HPLC'nin numune arıtımı için kullanımı, mevcut enstrümantasyon ve iş akışlarındaki doğal kısıtlamalar nedeniyle sınırlı kalıyor. Başlıca bir darboğaz, özellikle numune enjeksiyonu ve fraksiyon toplama süreçlerinde manuel müdahaleye yoğun bağımlılıktır. Bu süreçler sadece zaman alıcı ve emek yoğun olmakla kalmaz, aynı zamanda insan hatasına da açıktır; bu da üretkenlik, tekrarlanabilirlik ve genel operasyonel verimliliği tehlikeye^{düşürür 9,10}.

Agilent, Shimadzu ve Waters gibi büyük HPLC üreticilerinin ticari otomatik numune makineleri ve fraksiyon toplayıcıları güvenilir ve hassas otomasyon sağlar, ancak genellikle özel donanım ve yazılım ekosistemleri içinde kısıtlanır. Örneğin, Agilent 1260 Infinity II otomatik örnekleyicisi ve G1364F fraksiyon toplayıcısı, Agilent'in HPLC sistemlerine sorunsuz entegre olup, mükemmel tekrarlanabilirlik sağlar ancak platformlar arası uyumluluk sınırlıdır. Benzer şekilde, Shimadzu'nun SIL-20A/40C otomatik örnekleyicileri ve FRC-40/FRC-10A fraksiyon toplayıcıları yüksek verimlilik ve mükemmel mekanik hassasiyet sunarken, Shimadzu'nun LC-20 ve Nexera kontrol mimarilerine dayanır. Waters Alliance HPLC otomatik numune cihazı ve fraksiyon toplayıcı III modülleri de sağlam performans ve esnek toplama formatları (300 mL/dakika'ya kadar) sunar, ancak Waters'ın özel UHPLC ve LC-MS ortamlarına uyarlanmıştır. Ayrıca, enjeksiyon iğnelerine dayanan geleneksel otosamplerlar numune geri kazanımı azaltabilir ve tüp tabanlı fraksiyon toplayıcılar büyük eluent hacimlerini işlemek için zahmetli olabilir. Çoğu diğer HPLC cihazında yarı-hazırlıklı ayrım hâlâ sıkıcı ve tekrarlayan manuel kullanıma bağlıdır.

Bu zorluklar, HPLC iş akışlarında örnek arıtmasını otomatikleştirmek için yenilikçi bir yaklaşıma olan ihtiyacı vurgulamaktadır. Bu ihtiyacı karşılamak için, otomatik sampler ve kesirli toplama modüllerini tek bir platformda entegre eden kompakt ve çok yönlü bir cihaz olan LC-mate'i geliştirdik. LC-mate'nin akışkan çekirdeği iki ana bileşenden oluşur: 0,4 mm akış yoluna sahip, SUS 316 paslanmaz çelikten yapılmış yüksek basınçlı altı portlu anahtar valfi (SKVA-3130-S), hassas örnek enjeksiyon kontrolü için derecelendirilen 45 MPa'ya kadar çalışma basıncını destekleyen ve minimal ölü hacme sahip 10 kanallı çok pozisyonlu seçici valf (27,5 μL port-port, 5 μL rotor oluğu) ve verimli fraksiyon toplama için 1,2 mm akış kanalı çapına sahiptir. Bu konfigürasyon, ölü hacmi en aza indirir ve çapraz kontaminasyon riskini azaltır. Detaylı cihaz özellikleri için lütfen Tablo 1'e bakınız. LC-mate, HPLC dedektörlerinden analog çıktı alabilir ve HPLC cihazını senkron sinyalle tetikleyebilir, böylece hem örnek enjeksiyonu hem de fraksiyon toplamanın bağımsız kontrolünü sağlar.

Tablo 1: LC-mate ile ilgili enstrüman parametreleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Cihaz, kullanıcı dostu kontrol yazılımı ve analog kromatografik sinyallerin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayan sezgisel dokunmatik ekran arayüzüyle donatılmıştır. LC-mate, hem izokratik hem de gradyan ayırma modlarını destekler; kullanıcıların enjeksiyon hacmi, tekrar süresi, her enjeksiyonun aralık süresi ve toplama modu [eşik bazlı, zaman bazlı veya Collect All (eşik üzerindeki ve altındaki kesirleri toplama)] dahil olmak üzere temel parametreleri yapılandırmasına ve tek bir komutla tam otomatik işlemi başlatmasına olanak tanır. Bu, tekrarlayan manuel müdahaleye olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve HPLC arıtmasının verimliliğini önemli ölçüde artırır.

Şekil 1 , LC-mate'nin HPLC sistemiyle entegre edilmiş genel görünüşü, çalışma prensibini ve konfigürasyonunu göstermektedir.

Şekil 1: LC-mate sisteminin tasarımı ve kurulumu. (A) Şematik düzen. (B) Alet diyagramı. (C) Pratik kurulum fotoğrafı. (D) UV dedektörü ile LC-mate arasındaki sinyal iletim hattının bağlantısı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

1. Bağlantıyı kontrol etmek

1. HPLC, LC-mate ve kromatografik kolon arasındaki çözücü tesisat bağlantılarını doğru akış yollarının sağlanması için doğrulayın (Şekil 1A).
2. UV dedektörü ile LC-mate arasındaki sinyal iletim hattının bağlantısını Şekil 1D'de gösterildiği gibi kontrol edin.
   1. Siyah tebloyu kırmızı terminale, beyaz tebloyu ise siyah terminale bağlayarak analog sinyal çıkışının polaritesini eşleştirin.
   2. LC-mate ekranını gözlemleyin. Analog sinyal dalga formu belirirse, bağlantı doğrudur.
      NOT: Eğer hiçbir dalga formu görünmüyorsa, bağlantıları tersine çevirin: siyah teli siyah terminale, beyaz tebloyu ise kırmızı terminale bağlayın.
3. UV dedektörü ile LC-mate arasındaki tetikleyici bağlantısını kontrol edin.
   1. Veri kablosunun tek ucunu UV dedektörünün çıkış portuna takın.
   2. Diğer uçtaki siyah ve beyaz kabloları, sırasıyla LC-mate'deki mavi ve siyah tetik terminallerine bağlayın.
   3. Terminal ve tetiki sıkı sıkın ve sağlam bir bağlantı sağlansın.

2. Entegre ayırma sisteminin başlatılması

1. HPLC'nin doğru şekilde açılmasını sağla.
2. LC-mate'in doğru şekilde açılmasını sağla.
   1. LC-mate sistemi başlatıldığında, arayüzdeki LC-mate simgesine tıklayarak sistemin kendi kendini test programını otomatik olarak çalıştırabilir ve ana donanım modüllerini başlatır.
   2. Kısa Di isteği sesi (yaklaşık 0,5 saniye) ve kendi kendine test tamamlandıktan sonra ekranda "Kendi Kendini Test" komutunun kaybolmasını bekleyin, çünkü bunlar başlatmanın tamamlandığını gösterir.

3. Koşul optimizasyonu

1. HPLC ayrılma koşulunu yapılandırın ve sütun dengesini gerçekleştirmek için elülasyona başlayın.
2. LC-mate ekran solunda bulunan Test simgesine tıklayın, ekranda aşağıdaki arayüz görünecektir (Şekil 2A). Input Injection Volume, Elution Time ve Repetition Times parametrelerini seçin ve Start simgesine basın; otomatik örnekleyici, fraksiyon toplayıcı ve HPLC çalışması başlatılır. Bu durumda, eluent yalnızca seçici valfin 10. portundan dışarı akar ve manuel olarak toplanabilir veya atılabilir.
3. Uygun modlarda sonraki ayırma ve fraksiyon toplamayı kolaylaştırmak için çözünürlük, çalışma süresi, tutma süresi, enjeksiyon hacmi ve UV dalga boyu gibi mümkün ayrım koşullarını belirleyin.

4. Otomatik çalışma

NOT: Mümkün ayırma koşullarının kromatogramına dayanarak, arayüzün sol tarafındaki Threshold, Timing Collection ve Collect All seçeneklerinden uygun bir fraksiyon toplama yöntemi seçilebilir.

1. Eşik değerine dayalı kesir toplama
   1. Arayüzün sol tarafındaki Eşik fonksiyon modülünü seçin, sistem Şekil 2B'de gösterildiği gibi parametre ayarı arayüzünü gösterecektir.
   2. Enjeksiyon Serekti, Tekrar Süreleri, Eşik ve Elution Süresini girin ve Başlat'a basın; HPLC ve LC-mate otomatik olarak çalışır. Eşiği aşan kromatografik zirvelere sahip fraksiyonlar farklı toplama şişelerinde toplanacaktır.
   3. Ekranda dikey olarak düzenlenmiş durum göstergelerini izleyin: Örnek tanıtımının başlatıldığını doğrulamak için Enjeksiyonun Devam Ettiğini İzleyin. Kromatografik ayrımın devam ettiğini doğrulamak için Devam Eden Ayrımı kontrol edin. "Şırınganın ne zaman artık sıvıyı boşalttığını anlamak için şırıngaya boşaldıyor" diye not edin. Hangi operasyonel durumun aktif olduğunu doğrulamak için ilgili metnin mavi vurgulanmasına dikkat edin.
      NOT: Ayırma işlemi sırasında, "Chromatogram" simgesine basıldığında, yeni bir arayüzde kromatogram ve eşik çizgisi görüntülenir ve kromatogram, HPLC'yi kontrol eden bilgisayarın ekranında gösterilenle aynıdır.
2. Zaman dilimine göre kesirlik toplama
   1. Parametre ayarı menüsünü açmak için arayüzün sol tarafından Zamanlama Toplama modülünü seçin (Şekil 2C).
   2. Gerekli parametreleri girin: Enjeksiyon Hacmı, Tekrar Süreleri, Elution Zamanı ve gerekli Toplama Süresi serisi.
   3. Otomatik diziyi başlatmak için Start butonuna basın, ardından HPLC sistemi ve LC-mate ayarlanan parametrelere göre tekrar tekrar çalışır.
3. "Hepsini Topla" moduyla kesirlik toplama
   1. Arayüzün sol tarafındaki Collect All fonksiyon modülünü seçin, sistem Şekil 2D'de gösterildiği gibi parametre ayarı arayüzünü gösterecektir.
   2. Bir toplama eşik değeri belirlerseniz, eşiğin üstünde veya altında olan kromatografik zirveler ayrı ayrı toplanır; bu da karışımdaki hiçbir bileşiğin kaybolmayacağını garanti edebilir.
      NOT: Asetonitrile yanıcı ve toksik bir çözücüdür. Asetonitril veya diğer organik çözücülerle ilgili tüm işlemler iyi havalandırılmış bir laboratuvar alanında yapılmalıdır. Personel, her zaman kimyasal sıçrama gözlüğü ve çözücüye dayanıklı eldiven dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giymelidir. Atık asetonitril ve diğer organik çözücüler, tehlikeli kimyasal atıklar için belirlenmiş, uygun şekilde etiketlenmiş kaplarda toplanmalıdır. Bu atık akışları, kurumumuzun çevre sağlığı ve güvenliği protokolüne uygun olarak lisanslı bir bertaraf hizmeti tarafından ele alınmıştır.

5. Boru hattı temizliği

NOT: Boru hattının temizlenmesi, otomatik örnekleyici bir dahaki sefere kullanıldığında pipehatta hiçbir örnek kalmamasını sağlar.

1. Temiz çözücü için küçük bir şişe hazırlayın ve otomatik numune alıcısının enjeksiyon boru hattını çözücüye yerleştirin.
2. Parametre ayarı menüsünü açmak için sol taraftaki arayüzden Temizleme modülünü seçin (Şekil 2E).
3. Enjektör boru hattının temizlenmesi
   1. Enjeksiyon Volume'u 0-1000 arasında ayarlayın ve Tekrar Sürelerini (sınır yok) ayarlayın.
   2. "Cleansing Completed" altındaki Cleansing (Temizlik Tamamlandı) kısmına tıklayarak enjektör boru hattının temizlenmesini başlatın.
   3. "Döngü" sayını takip ederek tamamlanan yıkama döngülerinin sayısını takip edin.
4. Toplama boru hattının temizlenmesi
   1. Temizleme Süresini belirleyin (sınır yok).
   2. "Mevcut Boru Hattı"nın altındaki Temizleme bölümine tıklayarak toplama boru hattının temizlenmesini başlatabilirsiniz.
   3. Mevcut Boru Hattı ekranını izleyerek hangi boru hattının temizlendiğini doğrulayın; sistem sıralı olarak 0 boru hattı 0'dan 10 boru hattına kadar işlem yapar.

Şekil 2: Metod kullanımı için LC-mate dokunmatik ekran arayüzü. (A) Optimizasyon ekranı. (B) Eşik modu. (C) Zamanlama modu. (D) Hepsini toplama modu. (E) Boru hattı temizliği. (F) Ayarlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Veri kaydetme talimatları

1. Otomatik kaydı etkinleştirin. Sistem, her elusiyon döngüsü tamamlandıktan sonra kromatogramı otomatik olarak kaydeder.
2. Manuel kaydetme yap. Elution tamamlandıktan sonra Kaydet butonuna tıklayın. Dosyayı kaydetmek için gerekli meta verileri diyalog kutusuna girin.
3. Depolama yerini seçin. Dosyaları cihazın yerel deposuna, SD karta veya harici USB sürücüye kaydetmeyi seçin.
   NOT: Tüm veri depolama için kapasite sınırlamalarını önlemek ve kolay veri erişimini sağlamak için harici bir USB sürücü kullanın.

Sonuçlar

2"-O-galloyl-hiperozidin arındırılması
2"-O-Galloyl-hyperoside (2-GH), balgam ve nemi çözmek için uzun bir geçmişe sahip geleneksel Çin tıbbı olan Euphorbia helioscopia L.'nin önemli suda çözünür^{bileşenidir 11}. Kimyasal yapısı Şekil 3'te gösterilmiştir. 2-GH'nin yakın zamanda bir hayvan^{modeli 12'de} anti-fibrotik bir etkiye sahip ol...

Tartışma

Bu sonuçlar, LC-mate sisteminin belirlenen parametrelere uygun olarak sürekli numune enjeksiyonu ve fraksiyon toplama işlemlerini otonom olarak gerçekleştirebileceğini, böylece manuel müdahaleyi önemli ölçüde azalttığını ve ayırma verimliliğini artırdığını göstermektedir. Sistem, kullanıcı dostu bir arayüze sahiptir; sadece ilk donanım kurulumu ve ardından sezgisel dokunmatik ekran kullanımı gerektirir.

Deneysel başarıyı sağlamak için üç kritik unsur dikkat ge...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yüksek performanslı sıvı kromatografi-EasySep-1050	Şanghay Tongwei Analiz Teknolojisi A., Ltd.. EasySep®-1050 enstrümanının web sayfası https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100522/C140238.htm	1009992	Protokolde kullanılan modüler bir hazırlık HPLC sistemi. Bir çözücü dağıtım pompası, UV/VIS dedektörü ve manuel enjeksiyon valfi içerir. Bu sistem, LC-mate'in otomatikleştirdiği çekirdek ayırma ünitesini oluşturur.
(Sıvı kromatografik kolon) Sharpsil-U C18 150 mm (L) & Zamanları; 30 mm (Kimlik Doğrulama) S-10 µ m, 100A	Şanghay Xuanmei Sanayi Kalkınma Şirketi, Ltd.	U180110-300150	Ters - 10 &mu parçacık boyutuna sahip faz C18 kromatografik kolon; m ve gözenek boyutu 100 Å. Küçük moleküllerin (ilaçlar, organik bileşikler gibi) ayrılması için tasarlanmıştır ve iyi bir tekrarlanabilirlik ve stabiliteye sahiptir. Kolon boyutları (150 mm uzunluk, 30 mm iç çap), onu hazırlık veya yarı hazırlıklı kromatografi için uygun kılar.
LC-mate	Şanghay Betterren Tıbbi Teknoloji A., Ltd.. Herhangi bir sorgu için  enstrümanı LC-mate, lütfen ilgili yazarla iletişime geçin: E-posta: wmzhao@simm.ac.cn	GD202200337	Sıvı kromatografi sistemleri için yardımcı ekipman, muhtemelen örnek enjeksiyonu, mobil faz yönetimi veya veri toplama için kullanılır. HPLC sistemleriyle entegre edilip deneysel süreçlerin otomasyonunu ve verimliliğini artırabilir