Yöntem makalesi

Lokalize RNAi ve Tıbbi Sülük Ektopik Gen İfadesi

DOI:

10.3791/697

⸱

17 Nisan 2008

 ,  ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of California San Diego - UCSD, 2Department of Physics, University of California San Diego - UCSD

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu video, biz, bir roman minyatür gen tabancası ile canlı doku içine doğru bir Biyolistik reaktifler teslim için bir yordam gösterir. Ventral vücut duvarı ve tek segmentleri ganglionlar dsRNA molekülleri sunarak sülük embriyolar akson rehberlik molekül Netrin ifade aşağı vurma.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu video, canlı doku içine reaktiflerin doğru Biyolistik teslimat için pnömatik kılcal silah kullanımı göstermektedir. Biz, iç kontroller gibi tedavi edilmezse segmentleri bırakarak, sülük embriyoların seçilen segmentlerde karıştırmayı gen ekspresyonu yordamı kullanın.

Pnömatik kılcal silah geliştirmenin erken aşamalarında numune açmadan hücre iç katmanları ulaşmak için kullanılabilir. Maddelerin canlı dokulara lokalize giriş için bir yöntem olarak, tabanca ile Biyolistik teslimat, birçok avantajı vardır: hızlı, temas ve tahribatsız. Buna ek olarak, tek bir kılcal silah farklı maddelerin bağımsız teslimat için kullanılabilir. Teslim bölge ~ 50-150 mikron lateral boyutları var ve 0 ile 50 mm arasında ayarlanabilir ortalama penetrasyon derinliği, yaklaşık ~ 15 mikron üzerinde uzanır. Bu teslim ekstrasellüler enjeksiyonları ile mikroenjeksiyon ve sistemik demonte veya genetik yaklaşımlar yoluyla yıkmak tek hücre arasındaki ara seçilmiş bir yere hücrelerin sınırlı sayıda hedef olma avantajına sahiptir.

Aşağı vurma ya da doğal olarak bazı merkez nöronları ve ventral vücut duvarı ifade edilir akson rehberlik molekül Netrin, ama dorsal etki alanı ifade çalıyor, biz ve vücut duvarı içine dsRNA veya plazmid DNA molekülleri teslim merkezi ganglionlar. Tabanca içine kaplı partiküller yükleme (i) belirli bir tayini için deney düzeneği hazırlama (hızlanan basınç ayarlama), (ii) kaplama dsRNA ya da DNA molekülleri ile parçacıklar, (iii): Bu işlem aşağıdaki adımları içerir bir tahlil, (iv) iki reaktifler (parçacık teslim, (v) hedef dokuya (vücut duvar veya ganglionlar) kaplı parçacıkların teslim hayvanların hazırlanması, ve (vi) embriyoların işleme immün, immünhistokimya ve nöronal 2 ila 3 gün sonra teslim genellikle sonuçları görselleştirmek için) etiketleme.

Parçacıkları netrin dsRNA ile kaplanmış, açıkça sadece tanecikleri (genellikle 1-2 hücre başına parçacıklar) içeren hücrelerde meydana netrin ifade görünür knock-down neden oldu. Parçacıklar onların çekirdekleri durdu nöronal hücrelerin plazmid kodlama EGFP indüklenen floresan ile kaplanmıştır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parçacıklar dsRNA moleküller, DNA plazmid ya da boyalar gibi farklı reaktifler, ile kaplı olabilir. Parçacıkların tipi ve çapı, reaktif ve hedef doku hücrelerinin derinliği göre seçilir: Daha büyük parçacıklar daha fazla nüfuz, ancak doku bazı hasarlara neden olabilir.

1. DsRNA kaplı partiküller hazırlanması

  1. Buz üzerinde% 100 izopropanol yerleştirin.
  2. 100 ml bağlayıcı tampon; yeniden süspanse 5 mg altın parçacıkları (ortalama çapı 1.6 mm S1600ri, Seashell Technology, LLC). Çözüm hazır olduğunda, bir sonraki adıma devam edin.
  3. Bağlayıcı tampon, vorteks kısaca ve topaklanma engellemek için 1-2 dakika sonikasyon 100 ul ekleyerek parçacık çözümü sulandırınız.
  4. DsRNA / siRNA 5-10μg (dsRNAs / siRNA ~ 1μg/μl bir konsantrasyon için suda çözünmüş olmalıdır) ekleyin.
  5. 2 dakika süreyle vorteksleyin ve oda sıcaklığında bekletin. SiRNA Bu konsantrasyon ve zaman aralığı sonucu altın parçacıkları doymuş.
  6. Pelet ~ 15 sn için bir masa üstü santrifüj ~ 2500 rpm'de santrifüj siRNA / altın partikül kompleksleri.
  7. Süpernatantı ve yavaşça pelet minimal bozulma ile 750 ml soğuk izopropanol ekleyin. Kısaca Spin ve süpernatantı kaldırmak.
  8. 100 ul soğuk% 100 izopropanol altın parçacıkları yeniden süspanse edin, sonra parçacık aglomeralar break up (2-3 bakliyat), bir banyo sonikatör kısaca sonikasyon. Son asılı parçacıkların bir cam slayt üzerine dökün ve oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.

2. Belirli bir tayini için deney düzeneği hazırlama

  1. Her silah, en az 50μm ~ ~ 3mm arasında değişen, farklı bir meme diyafram çapı vardır. Bu nedenle silah için kullanılacak özel hedef doku alanına göre tercih edilir.
  2. O basınç genellikle ~ 100μm (yüksek basınçlar derin parçacıklar teslim), hedef hücrelerin doku derinliği ayarlanır. Embriyo ve meme ucu arasındaki mesafe de havada altın parçacıkları gevşek bir ivme olarak, penetrasyon derinliği etkiler.

3. Ön kaplı parçacıkları ile silah yükleme

Parçacıklar manifolduna bağlı Tygon boru parçacık enjeksiyon hatları içine bir kuru toz olarak yüklenmiş olması gerekir. Bu boru, 4 kuru bir ortamda saklanmalıdır ° C kullanımı değil, aynı reaktifleri ilave deneyler yeniden kullanılabilir zaman. Bizim deney düzeneği manifoldu ayrı bağlantı noktaları üzerinden tahlil başına iki farklı reaktifler kadar sunabilirsiniz.

  1. Tygon boru hattı içine yüklemeden önce, bir cam kapak slip ya da jilet kenarında kullanarak slaytlar, kurutulmuş cam kaplı parçacıkları Pençe. Bu Tygon boru çapraz kontaminasyonu engellemek için, sadece bu reaktif özel olacaktır.
  2. Parçacıkların yük olarak, tüm boru ve konsantre yakın konektörü boyunca yayılan parçacıkları tutmak için, konektörü yakın bir U şeklinde boru viraj. Küçük bir spatula veya bir parça, katlanmış tartmak kağıt parçacıkları Pick up ve bunların yaklaşık yarısı her serisi için embriyo tüp içine yüklemek. Parçacıklar eşit olarak yaymak için yükleme adım sırasında tüp dokunun.

4. Hayvan Hazırlık

Altın partikül teslim önce ve sonra, embriyoların oda sıcaklığında steril yapay gölet su tutulur.

  1. Düz bir silikon kauçuk (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI), 5 mm kalınlığında bir parça oyulmuş bir oluk, embriyolar, ventral tarafına yerleştirin ve (% 8 etanol steril yapay gölet su bir çözüm onları uyuşturan aşamalarında E6-E8 genç embriyoların) deney boyunca hiçbir etanol ile yapay gölet suyu kalır.
  2. Parçacıklar çekim hemen önce, çözümün bir parçası kaldırarak embriyoların ventral yüzeyinde ortaya çıkarmak için banyo düzeyi düşük. Stabilize etmek ve kurutma yüzeyinde tutmak için üst ortasında küçük bir delik kesilmiş bir kağıt mendil ile bir parça yerleştirin.

5. Hedef doku içine kaplı partikül Teslim

Bir parçacıkların yük genellikle, tek bir atış genellikle birkaç yüz parçacıkların sipariş üzerine teslim ile on çekimleri için kullanılan olabilir.

  1. Silahı haline gelen boru hattından parçacıkların bolus enjeksiyon neden 0.3 s için vanaları açarak bir çekim oluşturun.
  2. Çekim arasında boru duvardan parçacıklar yerinden ve böylece tabanca akışı içine enjeksiyon kolaylaştırmak için tüp hafifçe dokunun.
  3. Ilgi doku alanında karşılamak için, birden fazla çekim gerekebilir.
  4. Parçacık Doğumdan sonra, çok iyi bir plaka suni gölet su, tercihen de her bir embriyo embriyolar yerine geri.

6. İmmünoboyama ve nöronal etiketleme

RNAi (ya da ektopik ifade) elde edilene kadar, embriyoların parçacık doğumdan sonra 1 ila 3 gün boyunca oda sıcaklığında ve karanlıkta saklayın. Daha sonra deney örneklerinin ve kontroller aşağıdaki yordamlardan birini yürütmek:

  1. Netrin mRNA varlığı ya da yokluğu assay in situ hibridizasyon. Digoxigenin etiketli sülük netrin riboprobes tüm sülük embriyolar melezleşmiştir.
  2. Netrin protein ve nöronal doku (anti asetillenmiş tubulin) özgü diğer proteinler için tahlil İmmünositokimya. Bu prosedür tüm embriyolar da yapılır.
  3. , Tedavi ve kontrol segmentlerinde ilgi nöronların (bizim durumumuzda mechanosensory basınç nöronlar) tam milleri etiket boya doldurur için tek bir nöron içine lipofilik boyalar (DII ve Dio) Microinjections . Bu testte, canlı embriyolarının (intakt veya disseke) yapılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu gösteri, knock-canlı sülük embriyo lokalize hacmi küçük altın parçacıkları hücre içine teslim ve genler yıkmak için pnömatik kılcal silah kullandı. Hedef bölge genellikle çapı ~ 0 ile 50 mm arasında ayarlanabilir ortalama penetrasyon derinliği etrafında ~ 15 mm, 150 mm ve parçacıklar bulundu. Parçacıklar akson rehberlik faktör Netrin dsRNA molekülleri ile kaplı iken, açıkça sadece partikülleri içeren hücreler meydana gelen netrin ifade görünür knock-down neden oldu. Parçacıklar onların çekirdekleri durdu nöronal hücrelerin plazmid kodlam...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz knock-ve zaman atlamalı filmleri büyüyen duyusal projeksiyonlar sağlamak için gen için yapıları üreten yardımlarından dolayı Dr. Michael Baker teşekkür etmek istiyorum. Biz Virginia Vandelinder pnömatik silah deneyleri ile teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
altın partiküllerDiğerSeashell Technology, LLCS1600ri
bağlama tamponuReaktifSeashell Technology, LLC
silikon kauçukReaktifDow CorningSylgard 184

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
  2. Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
  3. Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
  4. Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
  5. Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103(2005).
  6. Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Pn matik Kapiller TabancaBiyolistik ile letimAlt n Partik l Kaplamaift Zincirli RNAPlazmid DNANetrin NakavtEmbriyo Haz rlama

İlgili makaleler