Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Acorus calamus L. Ekstraktının bir fare modelinde Radyasyon kaynaklı cilt yaralanması üzerindeki terapötik etkileri

467 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69705

⸱

9 Ocak 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, General Hospital of Northern Theater Command, 2College of Medicine and Biological Information Engineering, Northeastern University, 3Shenzhen Institute for Advanced Study, University of Electronic Science and Technology of China

Bu makalede

Özet

Radyasyon kaynaklı cilt yaralanması, kanser hastalarında radyoterapinin yaygın ve ciddi bir komplikasyonudur. Etkili bir klinik tedavi yoktur. Bu protokol, Acorus calamus L. ekstraktının radyasyon kaynaklı cilt hasarı üzerindeki terapötik etkisini değerlendirerek, klinik önleme ve tedavi için yeni ilaç adayları ve tedavi stratejileri sunmayı amaçlamaktadır.

Özet

Radyasyon kaynaklı cilt yaralanması, kanser tedavisinde yaygın ve sakatlayıcı bir komplikasyondur; genellikle yara iyileşmesinin gecikmesi ve hasta rahatsızlığının artmasına yol açar. Önleme veya tedavi için birkaç terapötik ilaç mevcuttur. Geleneksel Çin tıbbı, özellikle Acorus calamus L., çeşitli cilt hastalıklarının tedavisinde potansiyel göstermiştir, ancak radyasyon kaynaklı cilt yaralanmalarındaki etkinliği hâlâ az araştırılmıştır.

Bu çalışma, cilt hasarını tetiklemek için 45 Gy radyasyonuna maruz kalan bir Sprague-Dawley fare modeli kullandı. Fareler 45 gün boyunca %10, %20 ve %40 Acorus calamus L. ekstraktı ile tedavi edildi. Yara iyileşmesi, iltihaplanma, apoptoz ve anjiyogenez, yara iyileşme oranları, histopatolojik analiz, sitokin ölçümleri, TUNEL boyama ve immünohistokimya kullanılarak değerlendirildi. Acorus calamus L. ile tedavi, yara iyileşmesini hızlandırdı; orta dozlu grup en yüksek iyileşme oranını gösterdi (%88,97 45 günde). Histopatolojik analizler, iltihaplanmanın azaldığını, kolajen organizasyonunun arttığını ve yeni kan damarlarının oluşumunu ortaya koydu. Serum inflamatuar sitokinler (IL-1β, IL-6, TNF-α) seviyeleri önemli ölçüde azaldı ve apoptoz azaldı; ana apoptotik proteinlerin modülasyonu (P53, Bax, Bcl-2) ile birlikte azaldı. VEGF ve bFGF ekspresyonları artırıldı, bu da anjiyogenez ve doku onarımını teşvik etti. Acorus calamus L., radyasyon kaynaklı cilt yaralanmalarının iyileşmesini iltihabı azaltarak, apoptozu engelleyerek ve anjiyogenezi teşvik ederek artırır. Bu bulgular, radyasyon kaynaklı cilt hasarını yönetmede terapötik bir ajan olarak potansiyelini göstermekte ve klinik onkolojide radyasyon kaynaklı cilt yaralanmalarını yönetmek için umut verici bir alternatif sunmaktadır. Moleküler mekanizmalarını netleştirmek için daha fazla çalışma gerekmektedir.

Giriş

Radyasyon kaynaklı cilt yaralanması, hem nükleer kazaların hem de tümör radyoterapisinin sık ve zor birkomplikasyonudur 1. Radyoterapide, hastaların yaklaşık %95'inde eritem, dequamasyon, tekrarlayan nekrotik ülserler, kalıcı ağrı ve yüksek kötü huylu ilerleme riski dahil olmak üzere bir derecede cilt hasarıgelişir. Bu lezyonlar genellikle tedaviye dirençlidir, hastaların yaşam kalitesini önemli ölçüde düşürür ve bazen radyoterapinin kesilmesini gerektirir; bu da radyasyon onkolojisinde büyük bir klinik zorlukoluşturur 3. Radyasyonla indüklenen cilt hasarının temel mekanizmaları karmaşıktır; esas olarak cilt dokularında serbest radikallerin üretimini içerir; bu da hücresel süreçleri bozur ve iyileşme sürecinizorlaştırır 4,5. Bu, apoptozla ilişkili genlerin uzun süreli ifadesi, düzensiz inflamatuar yanıtlar ve değişen sinyal yollarına yol açar; bunların hepsi radyasyon kaynaklı yaraların kalıcı doğasına katkıda bulunur6.

Şu anda radyasyon kaynaklı cilt yaralanmaları için evrensel olarak kabul edilen altın standart bir tedavi bulunmamaktadır. Klinik yönetim, özellikle topikal, inflamatuar veya antioksidanyaklaşımlara vurgu yapar; bu yaklaşımlar anti-inflamatuar, immünosupresif ve vazokonstriktif etkilerle cilt reaksiyonlarını azaltır, ancak uzun süreli kullanımda cilt incelmesine neden olabilir8. FDA onaylı radyoprotektif bir ajan olan Amifostin, klinik kullanımda belirgin yan etkiler nedeniyle sınırlıkalır9. Büyüme faktörleri, hücre çoğalması, anjiyogenezi ve granülasyon doku oluşumunu teşvik ederek yara iyileşmesini hızlandırır, ancak etkileri dar odaklıdır, derin doku yaralanması ve iltihap üzerinde sınırlı kontrol sağlar ve aşırı hiperplaziriski taşır 7. Sonuç olarak, Geleneksel Çin Tıbbı (TCM), bütüncül felsefesi, çeşitli terapötik etkileri olan çok sayıda aktif bileşeni ve olumlu bir güvenlik profiliyle dikkat çekmiştir. Önceki çalışmalar, meyan kökü ekstraktı, aloe polisakkaritleri ve kurkumin gibi doğal ürünlerin, serbest radikalleri temizleyerek, pro-inflamatuar aracıları (TNF-α, IL-6) engelleyerek ve fibroblast proliferasyonunu teşvik ederek radyasyon kaynaklı iltihap ve doku hasarınıhafiflettiğini göstermiştir 10,11,12. Ancak, bu araştırmaların çoğu tek aktif bileşikleri veya tek hedefleri incelemekte olup, çok bileşenli sinerjik etki mekanizmalarına dair yetersiz bir içgörü sağlamaktadır. Acorus calamus L., anti-inflamatuar, antioksidan, antibakteriyel ve yara iyileştirme özellikleriyle tanınan bir bitki olup, çeşitli cilt hastalıklarında potansiyel göstermiştir.

Araneae ailesine ait çok yıllık bir bitki olan Acorus calamus L., terpenler, fenilpropanoidler, flavonoidler, steroidler ve alkaloidler dahil olmak üzere birkaç biyoaktif bileşik içerir. Çok bileşenli bileşimi, birden fazla hedefte eşzamanlı etki sağlar ve sinerjik farmakolojik etkilerüretir 13. Çalışmalar, NF-κB ve MAPK gibi inflamatuar sinyal yollarını inhibe ettiğini ve TNF-α ve IL-6 gibi proinflamatuar faktörlerin mRNA ekspresyonunu doz bağımlı olarak aşağı indirdiğini, SOD ve GSH-Px gibi antioksidan enzimlerin aktivitesini artırarak anti-inflamatuar, antioksidan ve antibakteriyel etkileryarattığını göstermektedir 14,15. Enfeksiyonlar ve alerjilerden kaynaklanan cilt hastalıklarının tedavisinde belgelenmiş faydalarına rağmen, Acorus calamus L.'nin radyasyon kaynaklı cilt yaralanmalarındaki rolü hâlâ yeterince araştırılmamıştır. Son çalışmalar, radyasyon kaynaklı hasara karşı koruyucu etkilerini, yara iyileşmesini teşvik ettiğini ve iltihabı azalttığınıgöstermiştir 13. Ancak, radyasyon kaynaklı cilt yaralanmalarında Acorus calamus L.'nin spesifik terapötik mekanizmaları tam olarak açıklanmamıştır.

Bu çalışmanın genel amacı, radyasyon kaynaklı cilt hasarı hayvan modellerinde Acorus calamus L. ekstraktının terapötik etkilerini değerlendirmektir. Yara iyileşmesini, iltihap yanıtlarını ve hücresel davranışı değerlendirerek ekstraktın etki mekanizmalarını birden fazla açıdan netleştiriyoruz. Bulgular, kanser radyoterapisinden kaynaklanan cilt lezyonlarının klinik yönetiminde Acorus calamus L.'nin kullanımı için teorik bir temel oluşturmayı amaçlamaktadır. Ayrıca, çalışma, ekstraktın işlevsel özelliklerini, uygun müdahale senaryolarını ve temel etkinlik verilerini sunarak okuyucuların bu doğal ürün temelli yaklaşımın araştırmalarını veya klinik ihtiyaçlarını tamamlayıp tamamlamadığını değerlendirmelerine yardımcı olacak. Sonuç olarak, bu çalışma, tümör radyoterapisi alan hastaların yaşam kalitesini artırmak için etkili terapötik seçenekler aramaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada tanımlanan hayvan deneyleri, Kuzey Tiyatro Komutanlığı Genel Hastanesi Hayvan Tıbbi Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylandı (Etik Onay Numarası: 2018-03). Çalışmada SPF dereceli erkek SD fareleri (6-8 hafta, ağırlık 190-220 g) kullanıldı. Kullanılan reaktifler ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Deneysel hayvanların barındırılması

  1. 6 ila 8 haftalık ve 190 ila 220 g ağırlığında 108 SPF erkek SD faresi seçin.
  2. Hayvan odası sıcaklığını 22 ± 2 °C, göreli nem %50 ± %5 ve 12 saat ışık-karanlık döngü olarak tutun. Farelerin yiyecek ve suya sınırsız erişimine izin verin. Bir haftalık bir alışma döneminden sonra, takip deneylerine geçin.

2. Hayvanların gruplanması

  1. Fareleri rastgele beş farklı gruba ayrılın: Normal grup (Normal, n = 18), Model grup (Model, n = 18), pozitif ilaç grupları (Pozitif, n = 18, Betametazon Kremi)16, Düşük dozlu deneysel grup (Deneysel-L, n = 18), Orta doz deneysel grup (Deneysel-M, n = 18) ve Yüksek dozlu deneysel grup (Deneysel-H, n = 18). Normal grup hariç, tüm gruplar radyasyona maruz kaldı.

3. Radyoaktif cilt yaralanmasının hayvansal modelini oluşturmak

  1. Anestezi, %1 sodyum pentobarbital çözelti (40 mg/kg) intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonuyla hassas ve minimum rahatsızlıkla uygulanır. Kornea refleksinin yokluğunu ve parmak sıkışmasına tepki vermediğini gözlemleyerek anestezi derinliğini doğrulayın. Kuruluğu önlemek için farelerin gözlerine merhem sür.
  2. Farelerin sırt tüylerini elektrikli tıraş makinesiyle çıkarın. Sonra sırt bölgesini iyot ve %75 alkolle dezenfekte edin.
  3. Her fareyi yatağa yatağa koy. 32P-β radyaçını (yüzey doz oranı: 0.9 Gy/dakika) iki taraflı omurga bölgesine (2 cm × 2 cm alan) orta hattın 1 cm yan ortasında sabitleyin, böylece kaynağın epidermisle boşluk olmadan temas etmesini sağlayın. Aşıtlama sırasında yer değiştirmeyi önlemek için aplikatörü steril tıbbi bantla sabitleyin. Hedef cilt bölgesini 50 dakika boyunca ışınlayın ve toplam emilmiş doz 45 Gy17 elde edin.
  4. Fare ışınlamadan sonra bilincini kazandığında, onu kendi kafesine geri döndürür; böylece su ve yiyeceğe erişim sağlanır, sıcaklık 22 ± 2 °C arasında, göreceli nem %50 ± %5 ve 12 saat ışık-karanlık döngü sürer.
    NOT: Deneysel süreç, biyolojik ve radyoaktif mesleki koruma prensiplerine sıkı sıkıya bağlı olmalıdır. Ayrıca, tüm operasyonel prosedürler, ilgili tüm personelin güvenliği ve sağlığını sağlamak için tıbbi ve radyoaktif atıkların doğru ve uygun şekilde bertaraf edilmesi yönergelerine uymalıdır.

4. Acorus calamus L. ekstraktının hazırlanması ve ilaç kullanımı

  1. Acorus calamus L.'nin köksaplarını tartın, iyice temizlendiğinden emin olun, hava kurumasına izin verin ve kaba bir toz (40 ağ) haline getirin. %50 etanol içeren 10-20 hacim dahil edin ve oda sıcaklığında 24 saat homojenize edin
  2. Ekstraktın 30 dakika boyunca çökmesine izin verildikten sonra, süpernatantı boşaltın ve kaba safsızlıkları ortadan kaldırmak için 4-8 katman gazlı bez ile ön filtrasyon uygulanır. Daha sonra, filtre kağıdı ile filtreleyin ve filtreyi 50-60 °C sıcaklıkta döner evaporatörde azaltılmış basınçla buharlaştırarak çözücü geri kazanılır; böylece çözücüsüz katı kalıntı elde edilir (AE, nem içeriği %5< %5'dir).
  3. AE merhemhazırlığı 18
    NOT: Çin Farmakopei 2020 Baskısı (Genel Bölüm 0109)'a uygun olarak %10 (Deneysel-L, w/w), %20 (Deneysel-M, w/w) ve %40 (Deneysel-H, w/w) Acorus calamus L. ekstrakt merhemleri formüle edin.
    1. AE'yi (örneğin, %20 merhem için 20 g) ve ilgili ilaç kalitesinde petrolatumu (örneğin, %20 merhem için 80 g) doğru şekilde tartın.
    2. AE'ye toplam petrolatumun %10'unu ekleyin, 5 dakika boyunca kuvvetli tritürle yapın ve homojen bir macun elde edin (geometrik seyreltme yöntemi, AE'nin lipofil bazda eşit şekilde dağılmasını sağlar).
    3. Kalan vazelimi 60 °C'de erit, 55 °C'ye soğutma ve AE-petrolatum macununa yavaşça ekleyin.
    4. 250 rpm'de 30 dakika boyunca 55 °C'de manyetik olarak karıştırın, ardından oda sıcaklığına soğutarak sürekli karıştırarak pürüzsüz, partikül içermeyen bir merhem elde edin.
    5. Boş kontrol hazırlığı: Vazelimi 60 °C'de erit, 250 rpm'de 30 dakika karıştır ve oda sıcaklığına soğutma (AE merhem bazına aynı).
    6. Tüm merhemleri ve boş petrolatumu 4 °C'de kapalı steril kaplarda sakla.
  4. Tüm gruplara radyasyondan sonra 45 gün ardışık olarak günde iki kez 09:00 ve 17:00 saatlerinde topikal olarak uygulandı (normal grup, radyasyonsuz olarak aynı uygulama programını eşzamanlı olarak aldı). Uygulanan doz 0,2 g/cm² olup, dorsal ciltin 2 cm × 2 cm ölçüsünde eşit şekilde dağıtılmıştı. Normal grup araç (petrolatum), model grup ise araç (petrolatum) aldı. Pozitif kontrol grubuna betametazon kremi verildi. Deneysel gruplar L, M ve H ise sırasıyla %10, %20 ve %40 (w/w) oranlarında AE içeren kremler aldı. Her uygulamadan sonra, tedavi edilen bölge emilimi artırmak için 10 saniye nazikçe masaj yaptı ve sıçanlar yalamadan kaçınmak için 5 dakika boyunca tutuldu.

5. Fare derisi dokusu ve kan toplanması

  1. Fareleri %1 sodyum pentobarbital çözelti (40 mg/kg, i.p.) kullanarak anestezi edin. Cerrahi aletleri dezenfekte edin ve yara bölgesindeki deriyi kesin.
  2. Dokunun bir kısmını %4 paraformaldehit (10 mL) ile, başka bir kısmı glutaraldehit/osmiyum tetroksitle (5 mL, %2,5) sabitleyin ve kalan kısmı daha fazla analiz için sıvı azotta saklanın ( bkz. Malzemeler Tablosu).
  3. Farenin karın aortasından kan örnekleri alın. Santrifüj 3.000 × 4 ° C'de 15 dakika boyunca kullanıldı; süpernatantı EP tüplerine aspire etmek; aliquot ve -80 °C'de sakla.

6. İyileşme değerlendirmesi

  1. Aşıtlamadan sonraki 7., 15., 30. ve 45. günlerde yarayı gözlemleyin ve yara yüzeyinin yüksek çözünürlüklü kamerayla görüntülerini çekin. Görüntüleri ImageJ'ye aktarın ve yara bölgesini yaranın kenarı boyunca çizin. Görseldeki alanı hesaplayın. Ölçüm hatalarını önlemek için her işlemin tutarlı olduğundan emin olun. Yara iyileşme süresini ve iyileşme hızını hesaplayın.
    NOT: Yara iyileşme oranı (%) = (İlk radyasyonlu alan - İyileşmemiş yara alanı) / İlk radyasyonlu alan. Yara iyileşme kriterleri: Tam iyileşme, yara alanının %5< kabuk alan veya yara alanının %95'i > iyileşmiş alan olarak tanımlanır. Başlangıçta radyasyona maruz kalan alan: Radyasyona maruz kalan hayvanların stabil bir yara (bir temel) gösterdiği anda ölçülen yara alanı.

7. Elektron mikroskopi muayenesi

  1. Hızlı doku örnekleme ve fiksasyon
    1. Epidermis-dermis tabakasını kapsayan 1 mm³ ölçüsünde bir deri dokusu bloğunu kesmek için keskin bir bıçak kullanın.
    2. Numuneyi hemen önceden soğutulmuş %2,5 glutaraldehit fosfat tamponu (0,1 M, pH 7,4) içinde 4 °C'de 24 saat boyunca sabitleme için daldırın.
  2. Tampon yıkama
    1. 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4) ile üç yıkama yapın, her yıkama için 15 dakika bekleniyor.
  3. Fiksasyon sonrası
    1. Numuneyi 4 °C'de %1 osmiyum tetrooksit çözeltisine geçirin ve 1,5 saat süren fiksasyon sağlanır.
  4. Gradient dehidrasyon
    1. Her adıma 15 dakika ayırarak aseton konsantrasyonlarını kademeli olarak %50, %80, %90 ve %100 olarak geçirin.
    2. 100% asetonla işlemi üç kez tekrarlayın, her daldırma 10 dakika sürer.
  5. Epoksi Reçine gömü
    1. Örneği 2:1 oranında aseton ve epoksi reçine karışımında 2 saat bekletin, ardından gece boyunca saf epoksi reçinesine batırın.
    2. Numuneyi 60 °C'de 48 saat boyunca polimerize ederek katı bir blok oluşturulur.
  6. Kesitleme ve boyama
    1. Ultramikrotom kullanarak 70 nm ultra ince kesitler üretin.
    2. Uranyum asetat ile 15 dakika boyan, ardından 60 °C'de 5 dakika boyunca kurşun sitratla boyan.

8. Hematoksilin-Eozin (HE) boyama

  1. Parafin gömme işlemi
    1. Deri örneklerini alçaltarak, alkol gradyanı kullanarak (örneğin, %70, %80 ve %95 etanol, her biri 15 dakika boyunca, ardından %100 etanolden iki değişim, her biri 15 dakika boyunca) kurutma işlemi yapılır ve ardından doku saydam hale gelene kadar ksilene aktarılır.
    2. Gömülmeyi sağlamak için parafine daldırın, ardından katılaşmaya izin verin.
  2. Mumdan arındırma ve yeniden hidrasyon uygulayın
    1. Parafin bölümlerini ksilen I/II'ye 10 dakika boyunca batırın.
    2. Ksileni %100 etanol ile durulayın, ardından %95 etanol, 3 dakika %80 etanol, 3 dakika %70 etanol ile durulayın ve son olarak damıtılmış suyla durulayın.
  3. Hematoksilin nükleer boyama iletim
    1. Harris'in hematoksilin çözeltisinde oda sıcaklığında 7 dakika bekletin.
    2. Mavi renk oluşana kadar akan suyun altında 10 dakika durulayın.
  4. Farklılaştırma ve karşı boyama uygulayın
    1. Etanolde %1 hidroklorik asit kullanarak 3 saniye boyunca farklılaştırın (mikroskop altında nükleer berraklığı gözlemleyin).
    2. %0,5 amonyak çözeltisiyle 30 saniye karşı boya.
  5. Eozin karşı boyama işlemi yapın
    1. %0,5 eozin çözeltisi (%1 buzul asetik asit içeren) ile 90 saniye boyan.
    2. Fazla lekeyi çıkarmak için damıtılmış suyla 5 saniye hızla durulayın.
  6. Susuz bırakma ve temizleme işlemi uygulanır
    1. Sıralı olarak 70%, 80%, %95, 100% etanol I/II (her biri 1 dakika) geçin.
    2. Ksilen I/II ile 2 dakika temizleyin.
  7. Mühürleme ve gözlem uygulayın
    1. Nötr reçineyi damla olarak uygulayın, sonra örtü ile örtün.
    2. Mikroskobik muayeneden önce 60 °C fırında 30 dakika kurutun.

9. Masson'ın trikrom boyaması

  1. HE öncesi boyamaya benzer şekilde rutin muhaldan temizleme işlemi yapın.
  2. Nükleer boyama
    1. Hematoksilin çözeltisinde 10 dakika bekletin.
    2. Mavi ton geri gelene kadar akan suyun altında 5 dakika durulayın.
  3. Kolajen lifi boyama
    1. Alizarin Red ve Acid Fuchsin karışımına 5 dakika batırın.
  4. Fosfomolibdik asit farklılaşması
    1. %1 fosfomolibdik asit sulu çözeltiye 1 dakika aktarın.
  5. Miyofiberlerin karşı boyama işlemleri
    1. Doğrudan %2,5 anilin mavisi bir çözeltiye 5 dakika aktarın.
    2. %0,5 buzlu asetik asit sulu çözeltisiyle 5 saniye hızla durulayın.
  6. Susuz bırakma ve montaj
    1. Gradyent etanol dehidrasyonunu uygulayın: %95 etanol I, %100 etanol II (her biri 30 saniye).
    2. Ksilen ile temiz.
    3. Nötr reçine ile monte edin, 60 °C'de kurutun ve ardından mikroskop altında inceleyin.

10. IL-1β, IL-6 ve TNF-α seviyelerinin ELISA tespiti

NOT: IL-1β, IL-6 ve TNF-α, hem varlığı hem de şiddeti değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan önemli pro-inflamatuar sitokinlerdir. Seviyelerini izlemek, inflamatuar süreçlere dair bilgi kazanmak ve anti-inflamatuar tedavilerin etkinliğini belirlemek için çok önemlidir.

  1. Serum örnekleri hazırlayın
    1. Serum örnekleri toplamak için Adım 5.3'te detaylandırılan protokolü takip edin.
  2. Seyreltilmiş standartlar ve örnekler
    1. Numune seyreltici kullanılarak standartların gradyan seyreltilmesi oluşturulur; serum örneklerini 1:4 oranında seyreltirin.
  3. Örnekler ekleyin ve kuluçka yapın
    1. Her kuyuyuga 100 μL standart/örnek akdırın; Kuyular bir zarla örtülür; 37 °C'de 90 dakika kuluçka içinde; sonra sıvıyı atın ve kuyuları kurutun.
  4. Antikor-enzim reaksiyonunu tespit et
    1. Her kuyuya IL-1β, IL-6 ve TNF-α için spesifik enzim etiketli 100 μL reaktifan dağıtılır; 37 °C'de 60 dakika kuluçka içinde; sıvıyı çıkarın ve kurutmayın; Plakayı 200 μL yıkama tamponu ile dört kez yıkayın.
    2. Her kuyuya 100 μL streptavidin-HRP çalışma çözeltisi (1:100 seyreltme) ekleyin; 37 °C sıcaklıkta karanlıkta 30 dakika kuluçka; Plakayı 200 μL yıkama tamponu ile dört kez yıkayın.
  5. Renk geliştir ve sonlandır
    1. Her kuyuya 100 μL TMB substrat çözeltisi eklenir; oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika kuluçka; ardından her kuyuya 50 μL stop çözeltisi eklenir.
  6. Verileri okuma
    1. 450 nm'de (630 nm kalibrasyon dalga boyu ile) absorbansı enzimle bağlı immünosorbent test okuyucusu ile 30 dakika içinde ölçün; standart eğri kullanılarak konsantrasyonu (pg/mL) hesaplar.

11. TUNEL testi

  1. Bölüm ön tedavisi
    1. Parafin bölümlerini damıtılmış suya ulaşana kadar mumdan ayırın ve kurutun.
    2. 20 μg/mL konsantrasyonda çalışan bir protein K çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 20 dakika kuluçka yapın.
    3. Bölümleri PBS ile üç kez yıkayın, her yıkama 2 dakika sürer.
  2. Etiketleme reaksiyonu
    1. TdT enzimi ve florescein etiketli dUTP içeren TUNEL reaksiyon karışımını uygulayın.
    2. Karanlıkta 37 °C sıcaklıkta nemlendirilmiş bir odada 60 dakika kuluçka yapın.
  3. Sinyal dönüşümü
    1. PBS ile üç kez yıkayın, her yıkama için 5 dakika bekleyin.
    2. HRP etiketli anti-floressein antikorunu 1:500 seyreltme ile ekleyin.
    3. 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
  4. DAB kromojenik gelişimi
    1. PBS yıkamasından sonra, DAB kromojenik çözeltisi uygulayın ve gelişimi mikroskop altında 1 ila 3 dakika boyunca izleyin.
    2. Damıtılmış su kullanarak reaksiyonu durdurun.
  5. Karşı boyama ve montaj
    1. Çekirdekleri hematoksilinle 1 dakika karşı boya.
    2. Ksilen ile temiz etanol ile kurutma ve nötr reçine ile montaj edin.
  6. Sonuç yorumu
    1. Apoptotik çekirdekleri kahverengi-sarı olarak tanımlar, normal çekirdekler ise mavi görünür.
    2. Her slayt başına rastgele beş yüksek güçlü alan (400×) seçerek apoptoz oranını hesaplayın.

12. İmmünohistokimyasal boyama

  1. Balmumlama ve antijen geri kazanma
    1. Parafin bölümlerini Xylene I'de 10 dakika bekletin, ardından Xylene II'ye 10 dakika daha geçirin. Daha sonra, gradient etanol serisi ile kurutma yapın; %100 Etanol I ile 5 dakika başlayın, ardından %100 Etanol II'de 5 dakika, %95, %80 ve %70 etanolde 3 dakika ile durulayın ve son olarak 2 dakika damıtılmış suyla durulayın.
    2. pH 6.0'da 0.01 M sodyum sitrat tamponu ile yüksek basınçlı ısı onarımı yapılacak ve 3 dakika boyunca 121 °C sıcaklık sağlanacaktır.
  2. Endojen girişimi blok
    1. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %3 H2O 2 çözeltisi ekleyin ve endogen enzimleri inaktive edin.
    2. Dokuya %5 BSA bloklayıcı çözelti uygulayın ve nemli bir odada 37 °C'de 45 dakika boyunca kuluçka yapın; Fazla engelleyici çözeltiyi durulama olmadan aspire edin.
  3. Antikor kuluçka
    1. %5 BSA bloklayıcı çözeltisi dağıtın ve 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
    2. Birincil antikor çalışma çözeltisini optimize edilmiş konsantrasyonda (örneğin, P53, Bax, Bcl-2, VEGF ve bFGF) ekleyin ve 4 °C'de nemlendirilmiş bir odada gece boyunca kuluçka yapın; %0,1 Tween-20 içeren PBS-T tamponu ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    3. HRP etiketli ikincil antikor 1:200 seyreltilmiş bir uygulama; 37 °C'de nemli bir odada 60 dakika kuluçka içinde; PBS-T tamponu ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Sonra, ABC konjugat çözeltiyi ekleyip 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın, ardından PBS tamponuyla 5 dakika boyunca üç yıkama yapın.
  4. DAB renk geliştirme
    1. %0,02 H₂O₂ içeren DAB geliştirici çözelti ekleyin ve gelişimi oda sıcaklığında 1-4 dakika boyunca mikroskop altında izleyin.
    2. Reaksiyonu hemen damıtılmış su ile sonlandırın.
  5. Karşı boyama ve montaj
    1. Örneği Harris'in hematoksilin çözeltisine 1 dakika batırın ve mavi iyileşme için 10 dakika boyunca akan suyun altında durulayın.
    2. Sıralı olarak aşağıdaki çözeltilere daldırın: %70 etanol 30 saniye, %80 etanol 30 saniye, %95 etanol 30 saniye, %100 etanol I 1 dakika ve %100 etanol II 1 dakika.
    3. Tam temizleme ve fiksasyon için, 2 dakika ksilen I'e daldırın, ardından 2 dakika ksilen II'ye aktarın. Nötr reçine montaj ortamını damla olarak ekleyin, örtü ile örtün ve 60 °C fırında 30 dakika kurutun.
  6. Sonuç niceliği
    1. Kahverengi renk olumlu bir tepki gösterir; Pozitif sinyaller (kahverengi-sarı) negatif arka planla karşılaştırılmalıdır.
    2. En az 5 görüş alanında pozitif hücrelerin yüzdesini hesaplamak için Image-Pro Plus yazılımını kullanın.

13. Western blotting tespiti

  1. Doku lizis hazırlığı
    1. Sıvı azotla dondurulmuş cilt dokusunu -80 °C'de önceden soğutulmuş paslanmaz çelik harca yerleştirin; buharlaşmayı azaltmak için üç adımda sıvı azot kademeli olarak eklenir; tüm parçacıklar görünmeyecek hale gelene kadar dikey bir şekilde öğütün; Ortaya çıkan tozu lizis tamponu içeren bir EP tüpüne aktarın.
    2. Proteaz inhibitörü (1:100) ve fosfataz inhibitörü (1:50) dahil edilir; buzda girdabı 30 saniye; ultrasonik bozulma geçirir; 4 °C'de sallanma kuluçka içinde 2 saat kuluçka içinde; 4 °C'de 14.000 × g'de 20 dakika santrifüj; süpernatantı dikkatlice aspire edin.
  2. Protein niceleme ve işleme
    1. Üst yüzeyden 5 μL 96 kuyu bir plakaya dağıtılır; 200 μL BCA çalışma çözeltisi eklemek; 37 °C sıcaklıkta karanlıkta 30 dakika kuluçka; mikroplaka okuyucu kullanarak 562 nm'de absorbansı ölçmek; konsantrasyonu standart eğriye göre belirler.
    2. 5× Azaltılmış Protein Yükleme Tamponu ile protein çözeltisi 4:1 oranında birleştirin; 15 dakika boyunca kaynar su banyosuna koyarak denatürasyon yapın; gelecekte kullanmak üzere -20 °C'de depolayın.
  3. SDS-PAGE elektroforezi
    1. %12 akrilamid çözücü jel hazırlayın; jeli, tarak dişlerinin 1 cm altına ulaşana kadar döker; hava maruziyetini önlemek için izopropanol ile örtür; katılaşmadan sonra izopropanol çıkarılır; %4 konsantre bir jel dök; 15 delikli bir tarak takmak; oda sıcaklığında 30 dakika katılaşmasına izin verin; yükleme kuyusu 1'e 5 μL önceden boyalı protein belirteci ekleyin; 2. kuyuya 20 μL boş lizat ekleyin; her kuyuya 3 ile 14 arasında 40 μg protein içeren 10 μL örnek ekleyin.
    2. 80 V'da elektroforez başlatılır; bromofenol mavisi ayırıcı jele geçtiğinde 120 V'ya geçin; buz-su dolaşımı ile 10-15 °C sıcaklık tutmak; Bromofenol mavisi jelin tabanından 0,5 cm yüksekliğe ulaşana kadar çalıştırın.
  4. Islak blotlama prosedürü
    1. %20 metanol içeren bir transfer tamponu hazırlayın; 4 °C'ye kadar önceden soğut. PVDF zarını 1 dakika boyunca metanole daldırarak aktive edin; NC membranını tampon içinde dengeleyin. Transfer kelepçesini şu sırayla monte edin: "Katot plakası - Sünger pad - Filtre kağıdı - Jel - Membran - Filtre kağıdı - Sünger ped - Anod plakası"; kabarcıkları rulo ile iyice çıkarın; parametreleri hedef protein moleküler ağırlığına göre ayarlayın: 50 kDa < proteinler için 60 dakika boyunca 100 V'da sabit voltaj transferi kullanın; 50-100 kDa proteinler için 250 mA'da 90 dakika boyunca sabit akım transferi uygulanır; 100 kDa > proteinler için 300 mA'da 120 dakika boyunca sabit akım transferi uygulanır; 4 °C'lik dolaşan su banyosuna bağlanın.
  5. İmmünodetectivasyon prosedürü
    1. Transferden sonra, PVDF membranını 1 dakika boyunca metanol içine batırın; TBST ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayım; membran yüzeyini %3 H₂O₂/TBST ile kaplayın; oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçka için; sıvıyı aspire etmek; %5 BSA/TBST bloklama çözümü ekleyin; 37 °C'lik sallama kuluçka makinesinde 1 saat blok kalır; Zarı TBST ile üç kez, her biri 5 dakika boyunca yıkayın.
    2. Birincil antikor çalışan çözüm (örneğin P53, Bax, Bcl-2, VEGF ve bFGF) ekleyin; 4 °C'de sarsıntılı kuluçka makinesinde gece boyunca kuluçka içinde; Zarı TBST ile dört kez, her biri 10 dakika boyunca yıkayın; HRP etiketli ikincil antikor ekleyin; oda sıcaklığında sallanan kuluçka makinesinde 90 dakika kuluçka için; Zarı TBST + %0,5 SDS ile altı kez, her biri 8 dakika boyunca yıkayın.
  6. Kemilyünesans görüntüleme
    1. ECL A ve B çözeltilerinin eşit hacimlerini karıştırın; zar yüzeyini eşit şekilde kaplamak; reaksiyonun karanlıkta 60 saniye boyunca gerçekleşmesine izin ver; fazla sıvıyı amutla; güçlü sinyal proteinleri için tek bir pozlama süresi 1-5 saniye arasında ayarlanır; zayıf sinyal proteinleri için beş segmentte (30/10/60/120/300 s) kümülatif maruziyet gerçekleştirir; Kemilyüminsans görüntüleyici kullanarak görüntü yakalayın.
  7. Veri analiz iş akışı
    1. ImageJ yazılımı kullanılarak proteinleri nicelikle ölçer; tekdüz bir arka plan çıkarma eşiği belirler; hedef proteinin referans proteine (β-aktin veya GAPDH) olan gri tonlama oranını hesaplayın
    2. Verileri analiz için GraphPad Prism'e aktarın.

14. İstatistiksel analiz

  1. Verileri ortalama ± standart hata ile sunun. İki grup arasındaki karşılaştırmalar için bağımsız örnek t-testleri kullanın ve birden fazla grup arasında karşılaştırmalar için tek yönlü ANOVA kullanın.
  2. SPSS 26.0 ve GraphPad Prism 8.0.2 kullanarak verileri analiz edin.
  3. P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı farklılıkların göstergesi olarak değerlendirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Acorus calamus L.'nin radyasyon kaynaklı cilt yaralanması üzerindeki terapötik etkisi
Işıtlamadan 15 gün sonra, tüm fare gruplarında kuru soyulma, lokal kızarıklık, şişlik, ülserasyon ve kabuklanma görüldü. Aşıtlamadan 30 gün sonra, model grup en ciddi cilt hasarını gösterdi; radyasyonlu bölgede kabuk ve ülserasyon zirveye ulaştı. 45 günlük model grubunda minimal kabuk dökülmesi ve yarada bir miktar kasılma görüldü. Buna karşılık, Acorus calamus L. ve pozitif ilaç tedavisi gören gruplar cilt hasarının...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Radyasyon kaynaklı cilt yaralanması, klinik kanser radyoterapisinde en yaygın ve zorlayıcı komplikasyonlardan biri olmaya devam etmektedir. En büyük organ ve radyasyonun ilk hedefi olan deri, radyasyon tarafından üretilen serbest radikaller ve reaktif oksijen türlerinin hasarına hassastır; bu da hücre bölünmesi, göç ve farklılaşma gibi hücresel işlevleri bozabilir ve sonuçta yara iyileşmesinin gecikmesine ve doku hasarınayol açar 20,21...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Liaoning Eyaleti Bilim ve Teknoloji Planı Ortak Planı (Teknik Mücadele Projesi) (2024JH2/102600273) ve Kuzey Tiyatro Genel Hastanesi'nin Bağımsız Araştırma Projesi (ZZKY2024001, ZZKY2024002, ZZKY2024003) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%4 Paraformaldehit Sabit ÇözümBeyotime Biotech Inc (Beyotime), ÇinP0099
Acorus calamus L. ekstraktıKendi içinde hazırlandıN/A   Detaylı hazırlık protokolü, Protokolün 4. Bölümünde açıklanmıştır.
Anti-Bax Antikor   Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Çin)GB11690
Anti-Bcl-2 AntikorWuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Çin)GB113375
Anti-bFGF AntikorProteintech Group, Inc. (Wuhan, Hubei, Çin)11234-1-AP
Anti-P53 Antikor Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Çin)GB111740
Anti-VEGF Antibody Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Çin)GB111971
BCA Protein Tahlili Kiti  Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Çin)G2026-200T
Betametazon Kremi  United Pharmaceutical Co.,Ltd. (Çin)N/A Konsantrasyon: %0,1 w/w
Ulusal İlaç Onay No.: H19994057
EtanolŞanghay Aladdin Biyokimyasal Teknoloji A., Ltd.E111991Acorus calamus L. ekstraktı için ekstraksiyon çözücüsü olarak kullanılmıştır.
Jel ve Blot Görüntüleme SistemiBio-Rad Laboratuvarları, Inc. (Hercules, CA, ABD)ChemiDoc MP
Hematoksilin-Eozin Boyama KitiPekin Solarbio Bilim & Technology Co., Ltd., (Pekin, Çin)   G1120
HRP Keçi Anti-Tavşan IgG (H+L)Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Çin)GB23303
Ters Flüoresans MikroskobuOlympus Corporation (Tokyo, Japonya)IX83   
Masson' s Trichrome Stain KitPekin Solarbio Bilim & Technology Co., Ltd., (Pekin, Çin)   G1340
Mikroplaka Okuyucu (absorbans, floresans ve lüminesans algısı için)Moleküler Cihazlar (San Jose, CA, ABD)SpectraMax iD3
petrolatumSinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd. (Şanghay, Çin)N/A   İlaç kalitesinde beyaz petrolatum; Erime noktası: 45-60 derece ve derece; C;  Ulusal İlaç Onay No.: H31022350
Rat IL-1β ELISA Kit   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ÇinPI303
Rat IL-6 ELISA Kiti    Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ÇinPI328
Rat TNF-α ELISA Kit   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ÇinPT516
TUNEL Hücre Apoptoz Tespit Kiti (DAB)Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ÇinC1091

Kaynaklar

  1. Piffkó, A., et al. Radiation-induced amphiregulin drives tumour metastasis. Nature. 643 (8072), 810-819 (2025).
  2. Wang, K., Tepper, J. E. Radiation therapy-associated toxicity: Etiology, management, and prevention. CA Cancer J Clin. 71 (5), 437-454 (2021).
  3. Grosu-Bularda, A., et al. Navigating the complexities of radiation injuries: therapeutic principles and reconstructive strategies. J Pers Med. 14 (11), 1100(2024).
  4. Kemin, L., Rutie, Y. A critical review of the progress in prevention and treatment of radiation-induced skin damage. Front Oncol. 14, 1395778(2024).
  5. Borrelli, M. R., et al. Radiation-induced skin fibrosis: Pathogenesis, current treatment options, and emerging therapeutics. Ann Plast Surg. 83 (4S Suppl 1), S59-S64 (2019).
  6. Xu, Y., Liu, Q., Li, W., Hu, Z., Shi, C. Recent advances in the mechanisms, current treatment status, and application of multifunctional biomaterials for radiation-induced skin injury. Theranostics. 15 (7), 2700-2719 (2025).
  7. Deng, G. M., He, W. S., Liu, W. Y., Wu, F. S., Chen, J. B. Evolution of radiation-induced dermatitis treatment. Clin Transl Oncol. 26 (9), 2142-2155 (2024).
  8. Bian, X. W., et al. Epigenetic memory of radiotherapy in dermal fibroblasts impairs wound repair capacity in cancer survivors. Nat Commun. 15 (1), 9286(2024).
  9. Singh, V. K., Seed, T. M. The efficacy and safety of amifostine for the acute radiation syndrome. Expert Opin Drug Saf. 18 (11), 1077-1090 (2019).
  10. Wang, Z., Chen, R., Chen, J., Su, L. 18β-glycyrrhetinic acid alleviates radiation-induced skin injury by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway. Biol Chem. 405 (6), 407-415 (2024).
  11. Wang, Z. W., et al. Aloe polysaccharides mediated radioprotective effect through the inhibition of apoptosis. J Radiat Res. 45 (3), 447-454 (2004).
  12. Kongkham, B., Duraivadivel, P., Hariprasad, P. Acorus calamus L. rhizome extract and its bioactive fraction exhibits antibacterial effect by modulating membrane permeability and fatty acid composition. J Ethnopharmacol. 331, 118323(2024).
  13. Abdeahad, H., et al. Therapeutic potency of curcumin on radiodermatitis: A systematic review. Avicenna J Phytomed. 14 (3), 297-304 (2024).
  14. Kim, H., Han, T. H., Lee, S. G. Anti-inflammatory activity of a water extract of Acorus calamus L. leaves on keratinocyte HaCaT cells. J Ethnopharmacol. 122 (1), 149-156 (2009).
  15. Zhao, Y., et al. botanic, phytochemistry and pharmacology of the Acorus L. genus: A review. Molecules. 28 (20), 7117(2023).
  16. Kuan, C., et al. Rice bran extract alleviates inflammation and promotes wound healing in radiation dermatitis. Exp Dermatol. 34 (9), e70162(2025).
  17. Salgueiro, M. J., et al. Biological effects of brachytherapy using a (32)P-patch on the skin of Sencar mice. Appl Radiat Isot. 67 (32), 1769-1774 (2009).
  18. Jain, N., Jain, R., Jain, A., Jain, D. K., Chandel, H. S. Evaluation of wound-healing activity of Acorus calamus Linn. Nat Prod Res. 24 (6), 534-541 (2010).
  19. Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2020 Edition. , China Medical Science Press. Beijing. (2020).
  20. Chen, Y., et al. Senescent fibroblast facilitates re-epithelization and collagen deposition in radiation-induced skin injury through IL-33-mediated macrophage polarization. J Transl Med. 22 (1), 176(2024).
  21. Milam, E. C., Rangel, L. K., Pomeranz, M. K. Dermatologic sequelae of breast cancer: From disease, surgery, and radiation. Int J Dermatol. 60 (4), 394-406 (2021).
  22. Haran, P., Shanmugam, R., Deenadayalan, P. Free radical scavenging, anti-inflammatory and antibacterial activity of Acorus calamus leaves extract against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Cureus. 16 (3), e55987(2024).
  23. Sytykiewicz, H., Łukasik, I., Goławska, S. Chemical composition, anti-tyrosinase and antioxidant potential of essential oils from Acorus calamus (L.) and Juniperus communis (L.). Molecules. 30 (11), 2417(2025).
  24. Liu, Y., et al. Proteomics and transcriptomics explore the effect of mixture of herbal extract on diabetic wound healing process. Phytomedicine. 116, 154892(2023).
  25. Zhou, L., Zhu, J., Liu, Y., Zhou, P. K., Gu, Y. Mechanisms of radiation-induced tissue damage and response. MedComm. 5 (10), e725(2020).
  26. Elgellaie, A., Thomas, S. J., Kaelle, J., Bartschi, J., Larkin, T. Pro-inflammatory cytokines IL-1α, IL-6 and TNF-α in major depressive disorder: Sex-specific associations with psychological symptoms. Eur J Neurosci. 57 (11), 1913-1928 (2023).
  27. García-García, M. L., et al. Fluoxetine modulates the pro-inflammatory process of IL-6, IL-1β and TNF-α levels in individuals with depression: A systematic review and meta-analysis. Psychiatry Res. 307, 114317(2022).
  28. Yan, T., et al. Single-cell RNA-seq analysis of molecular changes during radiation-induced skin injury: The involvement of Nur77. Theranostics. 14 (15), 5809-5825 (2024).
  29. Tu, W., et al. Integrative multi-omic analysis of radiation-induced skin injury reveals the alteration of fatty acid metabolism in early response of ionizing radiation. J Dermatol Sci. 108 (3), 178-186 (2022).
  30. Mukherjee, S., Dutta, A., Chakraborty, A. The cross-talk between Bax, Bcl2, caspases, and DNA damage in bystander HepG2 cells is regulated by γ-radiation dose and time of conditioned media transfer. Apoptosis. 27 (3-4), 184-205 (2022).
  31. Avadanei-Luca, S., et al. Tissue regeneration of radiation-induced skin damages using protein/polysaccharide-based bioengineered scaffolds and adipose-derived stem cells: A review. Int J Mol Sci. 26 (13), 6469(2025).
  32. Hartono, S. P., et al. Vascular endothelial growth factor as an immediate-early activator of ultraviolet-induced skin injury. Mayo Clin Proc. 97 (1), 154-164 (2022).
  33. Guangmei, D., Weishan, H., Wenya, L., Fasheng, W., Jibing, C. Evolution of radiation-induced dermatitis treatment. Clin Transl Oncol. 26 (9), 2142-2155 (2022).
  34. Gupta, S., et al. Exploring anticancer properties of medicinal plants against breast cancer by downregulating human epidermal growth factor receptor 2. J Agric Food Chem. 72 (17), 9717-9734 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Acorus Calamus EkstresiYara İyileşmesiGeleneksel Çin Tıbbıİnflamatuar SitokinlerApoptos İnhibisyonuAnjiyogenez ArtırımıHistopatolojik Analizİmmünohistokimya
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.