Method Article

Biyolojik Çıkarma Saha Kiti ve Saha QPCR Birimi kullanılarak Alanda Mikrobiyal DNA Analizi

DOI:

10.3791/69713

⸱

January 2nd, 2026

 ,  ,  , 
1Microbial Insights, Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sahada kullanılabilir DNA analizinin güvenilir ve doğru formları birçok sektör için hayati öneme sahiptir. Bu makale, alanda çevresel mikrobiyal analiz için iki yöntem sunmaktadır: 1) biyolojik ekstraksiyon saha kiti kullanılarak çevresel örneklerden mikrobiyal DNA'nın izolasyonu ve 2) alan qPCR ünitesi aracılığıyla DNA analizi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kantif PCR (qPCR) sektörler arasında daha yaygın olarak benimsendikçe, DNA'yı uzak ortamlarda lojistik engeller olmadan çıkarıp analiz etme kapasitesi hayati hale gelmektedir. Açık bir örnek, tren raydan çıkma veya petrol salınımlarından etkilenen uzak alanlarda kirletici bozucu bakterileri nicelikten ölçemek için basit araçlara ihtiyaç duyulmasıdır; böylece risk ve çevresel etkinin zamanında değerlendirilmesini sağlamaktadır. Bunu güvenilir şekilde başarmak için süreçlerin taşınabilir ve hafif olmalı, bilim insanı olmayanlar için kullanıcı dostu, kirlenmeye dayanıklı ve hızlı sonuçlar verebilir ve aynı zamanda titiz kalite kontrolü sürdürebilir. Laboratuvar dışındaki hem nukleik asit ekstraksiyonu hem de qPCR analizi için yıllardır seçenekler mevcut olsa da, teknolojideki ilerlemeler, güvenilir ve doğru performans sunabilen sahada kullanılabilir sistemlerin geliştirilmesini ancak yakın zamanlarda mümkün kıldı. Bu çalışmada, gerçekçi çevresel koşullarda taşınabilir qPCR cihazlarıyla birlikte bir alan DNA çıkarma kiti kullanımını gösteriyoruz. Yaklaşık 30 °C ortam sıcaklıklarında yapılan saha denemeleri, kontrollü laboratuvar ortamlarında elde edilenlerle karşılaştırılabilir DNA verimleri ve amplifikasyon verimlilikleri göstermiştir. Önemli olarak, sahada elde edilen sonuçlar eşdeğer hassasiyet ve tekrarlanabilirlik gösterdi ve taşınabilir iş akışlarının geleneksel laboratuvar altyapısına ihtiyaç duymadan yüksek kaliteli veri sağlayabileceğini doğruladı. Bu bulgular, karar verme için gereken doğruluk ve güvenilirliği koruyor, qPCR'nin erişimini uzak ve kaynak sınırlı ortamlara genişleten merkeziyetsiz moleküler analizlerin potansiyelini ortaya koymaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

QPCR gibi moleküler biyolojik analizler ele alındığında, örnek yönetimi için birkaç sınırlama vardır. Açık bir örnek, tren raydan çıkması veya petrol salınımlarından etkilenen uzak bölgelerde kirletici bozucu bakterileri niceleyen basit ve güvenilir araçlara olan talebdir; bu da çevresel risk ve etkinin zamanında değerlendirilmesinidestekler 1,2,3,4,5. Temel sınırlama, örneği ne kadar soğuk tutarsanız tutun, mikrobiyal toplulukların zamanla kayabileceği (ve değişecek) 6,7 olmasıdır. Verilerin örneklerin toplandığı orijinal ortamı doğru şekilde yansıtmasını sağlamak için, DNA'nın bu örneklerden 24saat 8 içinde çıkarılması önerilir. Açık deniz petrol platformunda mikrob örnekleri toplayan bir mühendis ya da bir yağmur ormanının derinliklerinde yaşayan bir bilim insanı için bu zaman çizelgesi mümkün değildir. Bu uzak konumlardan birinden su veya toprak örneğini aynı gün içinde bir nakliye şirketine göndermek ve ardından bir gece boyunca bir laboratuvara (tüm bunlar soğutma sağlanarak) götürülmek, böylece DNA analiz öncesi çıkarılabilir, bu da kesinlikle imkansızdır.

DNA çıkarıldıktan sonra saat durur ve örnekin tüm genetik bilgisi doğru depolama teknikleriyle süresiz olarakkorunur 9. Bu, ekstraksiyon edilen DNA'yı, çoğu kısıtlı raf ömrüne sahip olan kimyasal, metalurji ve biyolojik örneklerin büyük çoğunluğuna kıyasla inanılmaz derecede benzersiz kılar. Arşivlenmiş DNA, yıllar veya on yıllar sonra geri alınabilir ve yeni platformlarda yeni hedefler için analiz edilebilir. Bu nedenle, çıkarılan DNA'nın gerçekten orijinal mikrobiyal topluluğu temsil etmesi ve gecikmeli geçişten kaynaklanan değişen DNA'yı temsil etmesi çok önemlidir.

Ayrıca, örnekleri çıkarmak ve analiz etmek için laboratuvar zorunluluğu, örnekleme programlarında hem esnekliği hem de tutarlılığı büyük ölçüde sınırlar. Lojistik maliyeti bazı projeler için sadece kısıtlayıcı olabilir10. Örnekleri analiz edebilme yeteneği, ilgi çekici genetik hedefleri saat veya hatta dakikalar içinde doğru şekilde niceliklendirebilme yeteneği, dünya çapında çevresel projeler için birçok kapı açıyor.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Aşağıdaki protokol, bir Bio-Extract Kit (biyolojik çıkarma alanı kiti) ve FieldQuant qPCR (Saha tabanlı qPCR) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

1. Yeraltı suyundan biyokütle örneği ve kapsüllü bir filtre ile biyolojik çıkarma saha kiti kullanılarak DNA izolasyon protokolü

  1. 1. adımdaki tüm adımlarda eldiven ve koruyucu gözlük takın.
  2. Peristalttik pompa ve boru hazırlayın ve Çevre Koruma Ajansı (EPA) Yeraltı Suyu Örneklemerehberliğine 11 uygun olarak kuyunu standart hacim temizleme ile temizleyin.
  3. Kapsüllü filtre, adaptör, kelepçe ve kapakları verilen santrifüj tüpünden çıkarın (Şekil 1).
  4. Boruyu (iç çapı 1/4-5/16 [I.D.]) verilen kelepçeden geçirin ve kelepçeyi sıkarak hortumu kilitli luer adaptörüne sabitleyin (Şekil 2).
  5. Filtrenin girişini önceki adımda takılan Luer-Lock adaptörüne takın.
  6. Filtreyi bir alıcı kabın içine yerleştirin ki filtrelenen su miktarı doğru ölçülebilsin.
  7. Düşük akış hızlarıyla (<0.5 L/dakika) 1 litreye kadar su filtreleyin. Filtrelenen su miktarı, suyun bulanıklığına bağlı olarak değişir.
    1. Filtre 1 L filtrelenmeden önce tıkanırsa, dur ve bir sonraki adıma geç.
      NOT: DNA analizi hassastır ve sistemin biyokütlesine bağlı olarak 10 mL kadar az miktarda yapılabilir.
  8. Filtreden geçen hacmi mililitre (mL) cinsinden manuel olarak kaydedin. Filtrelenmiş suyu atın.
  9. Filtreyi her iki ucundan kapatın. İnce ucu kırmızı kapakla, kalın ucu ise beyaz Luer-Lock tıprağı ile kapatıldığından emin olun.
  10. Filtreyi sağlanan plastik tüpün içine geri yerleştirin.
  11. Etiketi santrifüj tüpüne yapıştırın ve filtreden geçen su miktarını, konumunu, örnekleme tarihini ve istenen analizleri not edin. Çıkarılana kadar 1-4 °C'de sakla.
    NOT: Filtreler örneklemeden sonra 24 saat içinde çıkarılmalıdır.
  12. Dahil edilen alkol hazırlık mendillerini kullanarak, tahliye aşaması için kullanılabilecek düz bir yüzeyi temizleyin (örneğin, ahşap tahta tahtası, kamyon bagaj kapağı vb.)
  13. DNA'yı çıkarmak için, biyolojik çıkarma alanı Kit'inin tüm bileşenlerini düz ve temiz yüzeye yerleştirin (Şekil 3).
    1. Filtrenin her iki ucunu da açın ve kapakları ileride kullanmak üzere kenara koyun. Kitte bulunan 3 mL şırıngadan birini bulun ve açın. 3 mL şırıngaya hava çekin ve filtreye kilitli luer bağlantısıyla bağlayın.
    2. Filtreden kalan suyu dışarı itmek için şırıngadan havayı dışarı itin. Şırıngayı çıkarın ve tekrar etmeden önce daha fazla hava çekin.
    3. Filtreden mümkün olduğunca fazla suyun dışarı atılmasını sağlamak için birkaç kez tekrarlayın. Kırmızı çıkış kapağını kapatın.
  14. Kapalı Solution A şırıngasını iyi karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. Luer kilitli şırınga kapağını çıkarın.
  15. Solution A şırıngasını luer kilitleme ucu aracılığıyla kapsüllü 0.2 μm filtre girişine bağlayın ve pistonu bastırarak Solution A'nın tamamını yavaşça ekleyin. Çok hızlı itmek geri basınç oluşmasına neden olabilir, bu yüzden pistonu yavaşça indirdiğinizden emin olun. Filtre tıkanması Çözüm A'nın eklenmesini engelliyorsa, filtrenin kırmızı çıkış kapağını çıkarın ve tekrar deneyin. Filtreyi kapsamak için kapağı kapatın.
  16. Kapalı filtreyi 5 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde el sıkın.
    NOT: Yorgunluğu önlemek için, bu aşamaya kadar birden fazla örnek hazırlanabilir ve hepsi aynı anda el sıkıştırılabilir. Eğer mümkünse, bu adımı el sıkışması yerine gerçekleştirmek için şarj edilebilir bir vortex mikser kullanılabilir.
  17. Kapalı Solution B şırıngasını iyi karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. Şırıngadan luer kilitleme kapağını çıkarın.
  18. Kapsüllü filtre giriş kapağını çıkarın. Çözüm B şırıngasını luer kilitleme ucu aracılığıyla kapsüllü filtre girişine bağlayın ve pistonu bastırarak Çözüm B'nin tamamını yavaşça ekleyin. Çok hızlı itmek geri basınç oluşmasına neden olabilir, bu yüzden pistonu yavaşça indirdiğinizden emin olun. Filtre giriş kapağını kapsajını kapatın.
  19. Kapalı filtreyi 5 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde el sıkın.
    NOT: Yorgunluğu önlemek için, bu aşamaya kadar birden fazla örnek hazırlanabilir ve hepsi aynı anda el sıkıştırılabilir. Eğer mümkünse, bu adımı el sıkışması yerine gerçekleştirmek için şarj edilebilir bir vortex mikser kullanılabilir.
  20. Giriş kapağını çıkarın.
  21. Filtre ters çevrilirken, kapsüllü filtre ünitesine bağlı 3 mL şırınga ile filtreye 1 mL hava basın ve ardından plunger'ı geri çekerek mümkün olduğunca çok lizat (sıvı) çıkarılır.
    NOT: Eğer lizat özellikle viskoz ise, filtreden çözeltiyi çıkarmak için pistonu birkaç kez itip çekmek gerekebilir.
  22. Lizatı 5 mL'lik bir boncuk tüpüne ekleyin. Tüpü kapalı kapatın ve üstüne parafilm ile kapatın.
  23. Tüpü 5 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde ellerinize sıkın. Tüpü dik konuma getirin ve adımlara devam edin.
    NOT: Yorgunluğu önlemek için, bu aşamaya kadar birden fazla örnek hazırlanabilir ve hepsi aynı anda el sıkıştırılabilir. Eğer mümkünse, bu adımı el sıkışması yerine gerçekleştirmek için şarj edilebilir bir vortex mikser kullanılabilir.
  24. Folyo üst kısmının kontaminasyonunu önleyerek, örnek hazırlık kartuşunu düz bir yüzeye yerleştirin.
  25. 1 mL şırıngayı ambalajından çıkarın ve luer kilitli kolonu şırınganın ucuna vidalın. Numune hazırlık kartuşunun ilk bölümüne iki delik açmak için kolonun sivri ucunu kullanın.
    DIKKAT: Kartuşun bazı bölümlerinde kaotropik tuzlar ve/veya etanol bulunur. Eldiven ve koruma gözlüğü takın.
  26. Plastik hacimsel pipet kullanarak, boncuk tüpünden 1 mL lizat (sadece sıvı, boncukları mümkün olduğunca fazla aktarmaktan kaçının) ilk örnek hazırlık kartuş bölümündeki yeni deliklere aktarın. En iyi sonuç için, foliodaki deliğe pipet yaparken lizatı hafifçe açıyla yavaşça ekleyin.
  27. Şırınga kolonunu kartuşun kırmızı bölümüne geri yerleştirin. Sıvıyı tamamen şırıngaya çekin ve sonra dışarı itin. Bu pompa hareketini 10 kez yapın.
  28. Şırıngadan tüm sıvıyı dışarı itip kartuşun kırmızı bölümüne geri iterek sonraki adıma geçin. Hiçbir sıvı bir bölümden diğerine aktarılmamalıdır - bu, örnek DNA izolasyon protokolünün kalan her aşaması için geçerlidir.
  29. Şırınga-kolonunun sivri ucunu kırmızı-turuncu bölümün üzerine yerleştirin ve folyo bariyerinden iki delik açın. Pistonu kullanarak şırınganın tam hacmini çekip, sıvıyı şırınganın tam seviyesine çekip pompalayıp tamamen dışarı pompalayın. Bu adımı bir kez tekrarlayın, toplamda 2 pompa yapın ve tüm sıvıyı dışarı itin. Bir sonraki adıma sıvı aktarmayın.
  30. Şırınga-kolonunun sivri ucunu turuncu bölümün üzerine yerleştirin ve folyo bariyerinden iki delik açın. Pistonu kullanarak şırınganın tam sıvı hacmini şırıngaya çekin ve tamamen dışarı pompalayın. Bir sonraki adıma sıvı aktarmayın.
  31. Şırınga-kolonunun sivri ucunu sarı bölümün üzerine yerleştirin ve folyo bariyerinden iki kez delin. Pistonu kullanarak şırınganın tam sıvı hacmini şırıngaya çekin ve tamamen dışarı pompalayın. Bir sonraki adıma sıvı aktarmayın.
  32. Şırınga-kolonunun sivri ucunu mavi hava kuruyan bölümün üzerine yerleştirin ve folyo bariyerini sadece bir kez delin. Pistonu kullanarak şırınganın tam hava hacmini şırıngaya çekin ve hızlıca geri pompalayın. Bu pompalama işlemini en az 20 kez hızlıca tekrarlayın, ta ki kolon kuru görünene kadar.
  33. Şırınga-kolonunun sivri ucunu son yeşil bölümün üzerine yerleştirin ve folyo bariyerini iki kez delin. Pistonu kullanarak şırınganın tam sıvı hacmini şırıngaya çekin ve tamamen dışarı pompalayın. Bu adımı tekrarlayın, toplamda 5 pompa için kullanın.
  34. 1 mL şırınga ve örnek hazırlık kolonu kullanılarak, yeşil bölümden tüm çözeltiyi iyi etiketlenmiş 1 mL mikrotübe aktarın - bu alandan çıkarılan DNA örneğidir. 1-10 °C'de (örneğin, buz paketleriyle soğutucuda veya buzdolabında vb.) bir haftaya kadar veya kullanılana kadar saklayın.
    NOT: Uzun süreli depolama için, DNA örnekleri -20 °C'de süresiz olarak saklanabilir.

2. Saha tabanlı qPCR analiz protokolü ve bir saha kıPCR birimi

NOT: Saha tabanlı qPCR cihazı ve cihazı kontrol eden telefon, şarj edilebilir pillere dayanır. Sahaya gitmeden önce her ikisinin de tam şarj olduğundan emin olun.

  1. Tepsideki saf örnek yuvalarına en fazla üç alandan çıkarılmış DNA örneği yerleştirin. Her bölüm için bir örnek olduğundan emin olun: 1, 2 veya 3 numaralı slotlarda bir örnek, 4, 5 veya 6 numaralı slotlarda bir örnek ve 7, 8 veya 9 numaralı slotlarda bir örnek.
  2. Her örnek için test şeritlerini tepsideki ilgili A, B veya C şerit yuvalarına yerleştirin. Şeritteki ilk yuvayı, tepsideki ilk yuva ile hizala.
  3. Telefonun kilidini açın ve tescili qPCR cihazının adını taşıyan uygulamayı açın. Telefon ve saha qPCR ünitesi, entegre kısa menzilli kablosuz ile bağlanır. Uygulama açıldığında, Çalıştır düğmesine dokunun.
    NOT: Uygulama dahildeki telefona önceden yüklenmiştir ve başka bir yere indirilemez.
  4. Bir sonraki ekranda, Kimlik Oluştur butonuna dokunun.
  5. Bir sonraki ekran, her örnek için örnek bilgilerinin girildiği yerdir; Örnek Kimliği altına dokunun ve örnek adını yazın.
    1. Örnek birimlerine dokunun ve ekstraksiyonda kullanılan örnek türü için uygun hacim birimini seçin (gram [g], mililitre [mL] veya sürünt).
    2. Sonra örnek miktarının altına girin ve yukarıdaki saha çıkarımında kullanılan örnek hacmini girin (örneğin, mililitre su filtrelenmiş). Bu işlemi kalan iki örnek için tekrarlayın.
    3. Tüm örnekler için örnek bilgileri girildiğinde, devam etme butonuna dokunun.
      NOT: 3'ten az örnek kullanıyorsanız, örnek ID'sini varsayılan olarak bırakın, herhangi bir birimi seçin ve kullanılmayan örneklerin ilerlemesi için örnek miktarı satırına 1 yazın.
  6. Bir sonraki ekranda klasöre dokun. Bir sonraki ekrana geç ve güncel klasöre kaydet .
  7. Bir sonraki ekranda bir koşu adı yazın ve onayla.
  8. Enstrümanı enstrümanın sol üst köşesinde bulunan güç düğmesine basıp basılı tutarak açın, enstrümanın önündeki tüm ışıklar yanana kadar (~5 saniye). Sonra uygulamada onay tuşuna dokunun ve devam edin.
  9. Bir sonraki ekranda, Entegre kısa menzilli kablosuz ile bağla tuşuna dokunun. Mavi ışık yanıp sönene kadar enstrumanın üstündeki entegre kısa menzilli kablosuz düğmeye (tanıdık bir ticari marka sembolü) basın. Onaya dokunun ve uygulama ile enstrüman birlikte senkronize olunana kadar bekleyin. Senkronize edildikten sonra, uygulamada enstrüman adına dokunarak seçebilirsiniz, ardından bağlantı düğmesine dokunarak test şeritlerini yüklemeye devam edin.
    NOT: Enstrüman ve uygulama ilk kez senkronize olmuyorsa, enstrumandaki entegre kısa menzilli kablosuz ışığın hala yanıp söndüğünden emin olun ve tekrar tuşla scan yapın.
  10. Test şeritlerinin kapaklarını çıkarmadan önce, liyofilize pelletlerin test şeridi kuyularının üstünde olup olmadığından emin olun. Eğer öyleyse, kuyunun dibini nazikçe hafifçe sallayarak peletin kuyuya daha aşağı düşmesini sağlayın.
  11. İlk örnek için go şerit tüplerinden kapakları çıkarın. Test şeridinin ilk kuyusuna 18 μL steril su ekleyin ve peleti çözmek için yukarı aşağı nazikçe pipetleyin. Kalan 2 kuyu için de tekrarlayın.
  12. Her kuyuya 2 μL örnek ekleyin ve tüplerin içine kauçuk test şeridi kapağları yerleştirilerek borulara, kappaların arasındaki çentikler tepsinin arkasına bakacak şekilde kapatılır. Gerekirse kalan örnekler için 2.10-2.12 adımlarını tekrarlayın. Tüm test şeritleri doldurulup şerit kapaklarıyla kapatıldıktan sonra, uygulamada onay tuşuna dokunun.
  13. Her test şeridini tek tek çıkarın ve kuyunun dibindeki baloncukları kontrol edin. Kuyulardan herhangi birinde baloncuk varsa, şeridi nazikçe ileri geri sallayın, ta ki kabarcıklar kuyunun üstüne doğru yukarı doğru hareket edene kadar. Tüm kuyular kontrol edildikten sonra, uygulamada onaylamasına dokunun ve şeritleri enstrümata yüklemeye başlayın.
  14. Cihazın kapağını açın ve test şeritlerini, tepsideki sırayla aynı sırayla ve yönde qPCR cihazına yerleştirin; böylece kuyunun menteşeleri ve kapaklar arasındaki çentikler cihazın arkasına bakacak şekilde yerleştirilir. Tüm şeritler eklendikten sonra, kapağı nazikçe aşağı iterek yerine kilitlenene kadar ve dokunarak onaylayın.
  15. Uygulamada çalıştır başlat düğmesine dokun.
    NOT: Koşu başlayacak ve önceden ayarlanmış koşu koşullarıyla tamamlanması ~45 dakika sürecek. Bu koşullar düzenlenemez.
  16. Çalışma bittiğinde, sonuçlara e-posta ile bak. Telefon WiFi'ye geçtiğinde, sonuçlar analiz ve raporlama için gönderilecek; o zamana kadar sonuçlar enstrümanda saklanır.
    1. Wifi'ye bağlandıktan sonra, kullanıcı sonuçları göndermek için tekrar gönderme tuşuna basması gerekir.
  17. Denemeler arasında tepsiyi temizleyin, böylece örnekler arasında kontaminasyon oluşmasın.
    NOT: Çıktı, her kuyu için döngü eşik (Ct) değerlerini içeren bir Excel dosyasıdır. Bu sonuçlar laboratuvara gönderilir; laboratuvar, amplifikasyon kalitesini kontrol eder ve her qPCR hedefine özgü, orijinal örnek hacmi ve matrisine göre doğrulanmış standart eğriler kullanılarak Ct değerlerini bolluğa dönüştürür. Bu sonuçlar kullanıcıya elektronik teslimat olarak ve PDF olarak gönderilir.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Temsilli çevresel örneklerden DNA çıkarımı hem biyolojik ekstraksiyon saha kiti hem de daha önce tanımlanan yüksek doğrulanmış laboratuvar tabanlı bir yöntemkullanılarak gerçekleştirilmiştir 4. Şekil 4'te gösterildiği üzere, saha kiti kullanılarak DNA izolasyonunun başarılı tamamlanması, qPCR sonuçlarının yüksek doğrulanmış laboratuvar temelli bir ekstraksiyon yöntemiyle karşılaştırıldığında doğrulanmıştır. Bu tutarlılık, yöntemin sahadaki çevresel örneklerin DNA bütünlüğünü koruduğunu doğrular.

Saha qPCR kitinin bileşenleri Şekil 5'te gösterilmiştir. Alan qPCR ünitesi kullanılarak standart bir Dehalococcoides (DHC) kültür seyreltme analizi, hem iç mekan (21 °C) hem de dış (30 °C) sıcaklıklarda yapıldı ve cihazın gerçek dünya saha koşullarında sağlamlığını gösterdi. Şekil 6'da gösterilen sonuçlar, her birinin 10 farklı tekrarında düşük sapmayı vurgulamaktadır. Tam bağlam için, DHC, klorlu çözücüleri bozunabilen bir organizmadır ve çevre iyileştirme endüstrisinde genellikle qPCR ilenicelendirilir 4.

Aletlerin hassasiyetini doğrulamak için, DHC üç farklı konsantrasyonda on saha saha qPCR cihazıyla tekrarlanmış şekilde analiz edilmiştir (Şekil 7). Düşük bolluklarda bile, göreceli standart sapma tüm koşularda düşük (%5'in altında) kaldı. Standart sapmaya kıyasla, göreli standart sapma logaritmik veriler için önemlidir çünkü sonuçları aşağıdaki denklemle normalleştirir:

Denklem 1

RSD Göreceli Standart Sapmadır, σ veri setinin standart sapmasıdır ve μ veri setinin ortalamasıdır.

Bu makaledeki her iki yöntem birlikte, replika alan çıkarımları ve qPCR testlerinde tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Saha ve laboratuvar ekstraksiyonları ile qPCR analizi arasındaki uyum, laboratuvar altyapısına bağlı olmadan güvenilir ve yüksek kaliteli verilerin elde edilebileceğini göstererek, mikrobiyal analizlerin uzak veya kaynak sınırlı ortamlarda yapılmasını mümkün kılmaktadır.

Şekil 1
Şekil 1: Kapsüllü filtre kiti bileşenleri. Kapsüllü filtre, su örneğinden biyokütle filtrelemek için kullanılır. Boru aracılığıyla peristaltik pompaya bağlanarak su filtreden itilir. Toplam su hacmi not edildikten sonra su atılır ve filtrede toplanan biyokütle DNA çıkarımı için hazır hale getirilir. Bileşenler: a. filtre ve bileşenleri kullanımdan önce ve sonra tutan steril tüp, b. giriş kapağı, c. hortum kelepçesi, d. luer kilitli boru bağlantı adaptörü, e. kapsüllü filtre, f. kauçuk çıkış kapağı. Görsel, Microbial Insights, Inc.'in izniyle kullanılmıştır.12. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2
Şekil 2: Filtre ve boru bağlantısı. Boru luer kilitli boru bağlantı adaptörünün üzerine itilir ve hortum kelepçesi ile yerinde tutulur. Borunun diğer ucu peristaltik pompaya bağlıdır (bu bağlantı ve pompanın işleyişi bu protokolün kapsamı dışındadır). Görsel, Microbial Insights, Inc.'in izniyle kullanılmıştır.12. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3
Şekil 3: DNA izolasyon saha kiti bileşenleri. Tüm bileşenler kullanımdan önce sterildir. Bileşenler şunları içerir: (1) kapsüllü filtre kiti (daha fazla detay için Şekil 1'e bakınız), (2) 3 mL şırınga, (3) Çözelti A ile önceden yüklenmiş, kaplı 1 mL şırınga, (4) Çözelti B ile önceden yüklenmiş 1 mL şırınga, (5) 3 mL şırınga, (6) silikon boncuk tüpü, (7) izolasyon kolonlu 1 mL şırınga, (8) 1 mL tek kullanımlık transfer pipeti, (9) DNA izolasyon örneği hazırlık kartuşu, (10) 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü. Resim yok: sarsıntı sırasında sızdırmazlık için parafilm kareleri ve ekstraksiyon için kullanılan yüzeyi temizlemek için kullanılan alkol hazırlık mendilleri. Görsel, Microbial Insights, Inc.'in izniyle kullanılmıştır.12. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4
Şekil 4: Gerçek dünya örnekleri kullanılarak alan çıkarımı karşılaştırması. Laboratuvar yöntemi (kırmızı çubuklar) kullanılarak iki temsilli örnekten izole edilen DNA'nın karşılaştırmalı qPCR sonuçları ile biyolojik çıkarma alanı kiti (mavi çubuklar) karşılaştırılabilir. Bunlar, standart bir qPCR analizinde beklendiği gibi kopya olarak analiz edilmedi. Gen hedefleri (x ekseni) her iki yöntem için de bir büyüklük derecesi içinde bolluk (y ekseni) gösterir. Her belirli gen hedefi hakkında bilgiler dahil edilmemiştir çünkü bu makalenin kapsamı dışındadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5
Şekil 5: Saha tabanlı qPCR cihazı ve bileşenleri. Bileşenler şunları içerir: A. Saha tabanlı qPCR enstrumanı, B. numune hazırlık tepsisi, liyofilize reaktifler içeren C. test şeridi, cihazın çalıştırılması için kullanılan uygulamayla önceden yüklenmiş D. telefon. Görsel, Microbial Insights, Inc.'in izniyle kullanılmıştır.12. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6
Şekil 6: Saha qPCR dayanıklılığının gösterimi. Dehalococcoides (DHC) standardı, açık hava (30 °C, kırmızı çubuklar) ve iç mekan (21 °C, mavi çubuklar) sıcaklık koşullarında on kopyada analiz edilmiş, cihazın saha için güvenilirliğini vurgulamaktadır. Replikat koşu numarası x ekseni boyunca listelenir ve hesaplanan DHC bolluğu y ekseni boyunca listelenir. İç (20 °C) ortalaması 4.92 × 10² hücre/mL, SD = 1.14 × 10² hücre/mL (n = 10) olarak hesaplandı; Dış (30 °C) ortalaması ise 5.89 × 10² hücre/mL, SD = 1.80 × 10² hücre/mL (n = 10) olarak hesaplandı. 20 °C ve 30 °C'de elde edilen ölçümler anlamlı bir şekilde farklılık göstermedi (Welch'in t-testi, p = 0.17). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7
Şekil 7: Saha qPCR hassasiyetinin gösterisi. 10 farklı cihaz arasında hassas performans, üç farklı standart konsantrasyonda ikili olarak çalıştırılır. Gerçek değer ve çoğaltma sayısı (her standart konsantrasyonda 10 cihaz için n = 2) x ekseni boyunca, alan birimine özgü renkli çubuklarla birlikte listelenir. Y ekseni, her koşu için hesaplanan bolluğu gösterir. Her standart konsantrasyon için yüzde göreli standart sapma, çubukların üzerindeki noktalı çizgilerde gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün kritik bir özelliği, laboratuvar altyapısı veya elektrik12 gerektirmeden saha koşullarında mikrobiyal DNA çıkarımı ve qPCR analizini mümkün kılmasıdır. Yöntem, taşınabilirlik ile güvenilirlik arasında dengelenecek şekilde optimize edilmiştir ve dış mekanda ortam sıcaklıkları aralığında yapılsa bile laboratuvar tabanlı iş akışlarıyla tutarlı tekrarlanabilir sonuçlar sağlar12. Önerilen kullanım aralığı 4 °C ile 95 °C (39 °F ile 104 °F) arasındadır ve standart dış hava sıcaklıklarında (30 °C, 86 °F) yan yana karşılaştırma saha ekibi için güvenilir tutarlılık gösterir (Şekil 6). Bu tutarlılık, saha sonuçlarının laboratuvar veri setleriyle birlikte yorumlanabilir olmasını sağlamak için gereklidir.

Protokol başarısı için birkaç adım çok önemlidir. Ekstraksiyon sürecinde, sıvının filtrelerden tamamen alınması ve reaktiflerin titifikçe karıştırılması, verimli liz ve DNA geri kazanımı için önemlidir. Benzer şekilde, lizatın numune hazırlık kartuşuna dikkatlice aktarılması ve boncuk taşınmasını en aza indirmek, tıkanmayı veya kolon arızasını önlemenin anahtarıdır. Sorun giderme stratejileri arasında, geri basıncı azaltmak için piston bastırmasını yavaşlatmak ve viskoz lizatlar sıvının hareketini engelliyorsa şırınga pompalamayı tekrarlamak yer alır. qPCR için, analiz kuyularında kabarcıklardan kaçınmak ve tam pellet yeniden süspansiyonunu sağlamak doğru amplifikasyon için kritik öneme sahiptir.

Avantajlarına rağmen, yöntemin sınırlamaları vardır. DNA verimleri, tezgah üstü santrifüj tabanlı kitlerle elde edilenlerden daha düşük olabilir ve yüksek derecede bulanık veya organik zengin örnekler kolon performansını zorlayabilir. İzolasyon kitleri basit ve herkes için kolay olsa da - daha önce laboratuvar deneyimi olmayan kullanıcılar da dahil - sahada deneyimsiz bir kişiyi karşılaştırırken ek hata riski vardır. Ayrıca, saha qPCR birimi hızlı sonuçlar verirken, standart termosikllere kıyasla sınırlı sayıda eşzamanlı reaksiyonla sınırlıdır (şu anda her çalışma başına 9 gen hedefiyle sınırlıdır). Ancak bu sınırlamalar, analiz hızı ve sahada mikrobiyal topluluk profillerini yakalama yeteneğiyle dengelenir. Hangi qPCR hedeflerinin analiz edilebileceği konusunda herhangi bir kısıtlama yoktur, sadece üniteyi sunan laboratuvarın kataloğu dışında.

Bu yöntemin önemi, moleküler analizleri harekete geçirme kapasitesindedir ve petrol sahaları, tarım alanları veya uzak ekosistemler gibi ortamlarda mikrobiyal popülasyonların gerçek zamanlı izlenmesini mümkün kılar. Örnekleme anında DNA bütünlüğünü koruyarak ve yerinde sonuç üreterek, bu yaklaşım lojistik engelleri azaltır, veri kalitesini artırır ve hızlı karar alma imkanı sağlar. Gelecekteki uygulamalar arasında halk sağlığında patojen gözetim, biyoremediasyon ilerlemesinin izlenmesi veya su sistemlerinde mikrobiyal risk değerlendirmesi yer alabilir. Küçük değişikliklerle, platform ek moleküler hedefler ve ortaya çıkan qPCR testleri için sürekli uyarlanabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hem FieldQuant hem de Bio-Extract'in fikri mülkiyetine sahip Microbial Insights tarafından istihdam edilmektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın finansmanı ve desteği Microbial Insights, Inc. tarafından sağlanmıştır.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5/16" silikon boruAmazon (www.amazon.com)796753613221Alternatif modeller kabul edilebilir olabilir
SoğutucularZımbalar (www.staples.com)24299978Alternatif modeller kabul edilebilir olabilir
DNA İzolasyon Saha KitiMicrobial Insights, Inc. https://microbe.com/bio-extract/Mülkiyet
Aksesuarlı Saha QPCR ÜnitesiMicrobial Insights, Inc. https://microbe.com/fieldquant/Mülkiyet
EldivenlerAmazon (www.amazon.com)Boyuta bağlıAlternatif modeller kabul edilebilir olabilir
Yeraltı suyu filtreleriMicrobial Insights, Inc. https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
BuzYerel marketteNA
Kamoer DIP1500 peristaltik pompa 24 V 1500 mL/dakika higAmazon (www.amazon.com)701705886813Alternatif modeller kabul edilebilir olabilir
İğneburunlu penseAmazon (www.amazon.com)762983170575Alternatif modeller kabul edilebilir olabilir
Kağıt havlularZımbalar (www.staples.com)2126874Alternatif modeller kabul edilebilir olabilir
Koruyucu gözlüklerAmazon (www.amazon.com)B0BNHKWR6WAlternatif modeller kabul edilebilir olabilir
Sharpie İnce Uçlu İşleyiciAmazon (www.amazon.com)71641300033Alternatif modeller kabul edilebilir olabilir

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Adeloju, S. B., Khan, S., Patti, A. F. Arsenic contamination of groundwater and its implications for drinking water quality and human health in under-developed countries and remote communities-a review. Appl Sci. 11 (4), 1926(2021).
  2. Masindi, V., Foteinis, S. Groundwater contamination in Sub-Saharan Africa: Implications for groundwater protection in developing countries. Clean Eng Technol. 2 (1), 100038(2021).
  3. Balasooriya, B. K., Rajapakse, J., Gallage, C. A review of drinking water quality issues in remote and Indigenous communities in rich nations with special emphasis on Australia. Sci Total Environ. 903 (1), 166559(2023).
  4. Chen, G., et al. Natural attenuation potential of vinyl chloride and butyl acrylate released in the East Palestine, Ohio train derailment accident. Environ Sci Technol. 58 (40), 17743-17755 (2024).
  5. Singer, L. T., Schumacher, F., Fabisiak, J., Dietz, L. J., Ciesielski, T. The East Palestine train derailment: A complex environmental disaster. Neurotoxicol Teratol. 110, 107522(2025).
  6. Rubin, B. E. R., et al. Investigating the impact of storage conditions on microbial community composition in soil samples. PLoS One. 8 (7), e70460(2013).
  7. Fromin, N. Impacts of soil storage on microbial parameters. Soil. 11 (1), 247-265 (2025).
  8. Wang, Y., Li, X., Chi, Y., Song, W., Yan, Q., Huang, J. Changes of the freshwater microbial community structure and assembly processes during different sample storage conditions. Microorganisms. 10 (6), 1176(2022).
  9. Kia, E., et al. Integrity of the human faecal microbiota following long-term sample storage. PLoS One. 11 (10), e0163666(2016).
  10. Seifert-Dähnn, I., et al. Costs and benefits of automated high-frequency environmental monitoring-the case of lake water management. J Environ Manage. 285 (1), 112108(2021).
  11. Groundwater Sampling (SESDPROC-301-R3). , United States Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (2013).
  12. Microbial Insights. , Microbial Insights, Inc. At. At https://microbe.com/ (2025).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial DNA AnalysisField DNA ExtractionPortable qPCREnvironmental MonitoringDNA IsolationQuantitative PCRField Based qPCRContaminant Degrading BacteriaMolecular WorkflowsSample Preparation

Related Articles