Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Arabidopsis yapraklarından bitki ekstrasellüleri veziküllerinin optimize edilmiş apoplastik yıkama toplama yöntemiyle izolyasyonu ve arındırılması

1.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69715

⸱

24 Mart 2026

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Arabidopsis thaliana yapraklarından hücre dışı veziküllerin (EV) izole edilmesi için optimize edilmiş bir yöntemi tanımlar; bu yöntem aşağı akış moleküler ve fonksiyonel analizleri destekler.

Özet

Ekstraselulyar veziküller (EV'ler), çeşitli organizmalar ve hücre tipleri tarafından salgılanan zarla bağlı nanopartiküllerdir ve giderek hücreler arası ve krallıklar arası iletişimde önemli arabulucular olarak kabul edilirler. EV biyolojisi memeli sistemlerinde iyi yerleşmiş olsa da, bitki EV araştırmaları nispeten yeni ve hızla genişlemektedir; kısmen bitki EV'lerinin bağışıklık ve bitki-mikrop etkileşimlerinde rol alan küçük RNA, mRNA, protein ve diğer yükleri taşıyabildiğine dair kanıtlarla desteklenmektedir. Ancak, yüksek saflıktaki bitki EV'lerini izole etmek, sert hücre duvarları, bol ikincil metabolitler ve apoplastik sıvı toplama sırasında sitozolik kontaminasyon riski nedeniyle teknik olarak zordur. Bu protokol, bitki EV'lerinin Arabidopsis thaliana yaprak dokusundan izolasyonu ve arındırılması için basitleştirilmiş bir iş akışını önler. Nazik bir şırınga bazlı infiltrasyon adımı hücresel hasarı ve sitozolik sızıntıyı en aza indirmek için kullanılırken, tek yaprak bıçaklarının kullanılması (yaprak sapı/damar dokusu olmadan) damar ilişkili ve hücre içi içeriklerden kaynaklanan kontaminasyonu azaltmaya yardımcı olur. EV'ler başlangıçta diferansiyel santrifüjle zenginleştirilir ve daha da saflaştırılabilir; ya sakaroz yoğunluk gradyanı fraksiyonasyonu veya boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile kullanılabilir. Bu protokol, nanopartikül takip analizi ve iletim elektron mikroskopisiyle değerlendirildiği gibi, apoplastik sıvı toplama sırasında hücre hasarını ve sitoplazmik sızıntıyı en aza indirerek koruyan yapısal bütünlüğe ve hücresel kirlenmeyi azaltan EV'ler sağlar. Bu EV örnekleri, RNA profilleme, proteomik ve bitki-mikrop etkileşim çalışmaları için fonksiyonel analizler gibi sonraki uygulamalar için uygundur. Genel olarak, bu yöntem yüksek kaliteli bitki elektrikli araçları elde etmek için tekrarlanabilir ve uyarlanabilir bir yaklaşım sunar.

Giriş

Ekstraselüler veziküller (EV'ler), bakterilerden insanlara kadar çok çeşitli organizmalar tarafından salgılanan lipid çift katmanlı membranparçacıklarıdır 1,2. Hayvan sistemlerinde, EV'ler genellikle biyogenez yolları ve3 boyutlarına göre ekzozomlar, mikroveziküller ve apoptotik cisimler olarak sınıflandırılır. Ekzozomlar (~30-150 nm çapında), çoklu veziküler cisimlerin (MVB) plazma zarıyla birleşmesinden oluşur ve intraluminalveziküller 4'ün salınmasına yol açarken, mikroveziküller (~100-1000 nm çapında) doğrudan plazmazarından çıkar 5. Ekzosomlar ve mikroveziküllerin yanı sıra, memeli hücreleri programlanmış hücre ölümü sırasında serbest bırakılan apoptotik cisimlerde üretirler 6. Bu veziküller, bağışıklık modülasyonu, tümör ilerlemesi ve terapötik teslimatta rol oynamış olup, yoğun biyomedikal araştırmaların konusuolmuştur 7,8. Bitkilerde, EV sınıflandırması hayvanlara göre daha az tanımlanmıştır. Arabidopsis thaliana üzerinde yapılan çalışmalar, protein belirteçleri, boyut ve varsayılan biyogenez yollarındaki farklılıklara dayanarak birden fazla bitki EV alt tipi tespit etmiştir. Bunlar arasında, multiveziküler cisimlerden (9,10) türeyen ekzosom benzeri veziküller olarak kabul edilen tetraspanin (TET)-pozitif EV'ler, sintaksin proteini Penetrasyon 1(PEN1) pozitifEV'ler 11, ekzosist pozitif organeller (EXPO) türeviEV'ler 12,13 ve otofaji ile ilişkili EV'ler 14 ve polensomlar15 gibi diğer EV popülasyonları yer alır.

Artan kanıtlar, bitkilerin patojenlere karşı savunma stratejisinin bir parçası olarak EV'ler salgıladığını gösteriyor. Bitki EV'leri, mantar ve oomycete patojenlerinin virülansını bastıran küçük RNA'lar, mRNA'lar ve diğer düzenleyici moleküller dahil olmak üzere çeşitli moleküler yükler taşır. Bu bulgular, EV'leri "RNA savaşı" araçları olarak vurguluyor; bitkilerin patojenin gen ifadesini doğrudan bastırmasını sağlıyor; bu mekanizma tarım koruması için derin sonuçlara sahip. Bağışıklığın ötesinde, bitki EV'leri hücre duvarı yeniden şekillenmesine, stres yanıtlarına ve gelişimsel sinyallere dekatkıda bulunabilir 21. Hayvan EV araştırmalarının aksine, standartlaştırılmış izolasyon ve karakterizasyon protokollerinin yaygınolarak kabul edildiği 22, bitki EV alanı hâlâ biçimlenme aşamasındadır. Bu, çalışmalar arasında tekrarlanabilirlik ve karşılaştırılabilirliği sınırlar ve bu vezikülleri izole etmek ve incelemek için sağlam, standartlaştırılmış metodolojilere acil bir ihtiyaç yaratır.

Bitki EV'lerinin izole edilmesi, hayvan sistemlerinde karşılaşılmayan benzersiz teknik zorluklar sunar. Hasarlı bitki dokuları, bol miktarda ikincil metabolit, hücre duvarı kalıntısı ve EV'lerle birlikte saflaştırılabilen organeller parçalar içerir; bu da sonraki karakterizasyonukarmaşıklaştırır 23. Ayrıca, bitki EV izolasyonu ve arındırılması için yaygın olarak kullanılan apoplastik yıkama sıvısı (AWF), genellikle veziküller ve kirleticilerin heterojen birkarışımı üretir 24. Diferansiyel santrifüjleme yaygın olarak kullanılan temel yaklaşım olarak kalmaya devam etse de, ayrı EV alt popülasyonlarını tam olarak çözemez veya EV'leri birlikte izole edilmiş makromolekülerkomplekslerden ayıramaz (25,26). Son incelemeler ve metodolojik çalışmalar, bitki EV izolasyonu ve karakterizasyonu için önemli rehberlik ve en iyi uygulamadeğerlendirmeleri sağlamıştır 27,28,29,30,31. Buna rağmen, bu yaklaşımların pratik uygulanması ve entegrasyonu hâlâ zordur ve yoğunluk gradyanı santrifüjü ve boyut dışlama kromatografisi gibi ek saflaştırma adımları, çalışmalar boyunca EV saflığını ve tekrarlanabilirliğini artırmak için sıklıkla gereklidir.

Burada, çok aşamalı bir arıtma stratejisi kullanarak EV'lerin Arabidopsis apoplastik yıkama sıvısından izole edilmesi için sadeleştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Yaygın olarak kullanılan ve vakumpompaları 11 ile tüm bitki sızmasına dayanan bitki EV izolasyon yaklaşımlarının aksine, bu protokol damar yapılarından gelen kontaminasyonu artırabilecek yaprak sapları ve damar dokularının dahil edilmesini engeller. Bunun yerine, apoplast toplanımını artırmak ve doku bozulmasını en aza indirmek için izole yaprak bıçakları ve nazik bir şırınga tabanlı infiltrasyon yöntemi kullanılır. Dikkatli yaprak kullanımı, yönlendirme ve santrifüj koşulları, hücre içi bileşenlerden kaynaklanan kontaminasyonu daha da azaltır ve EV izolasyonu için daha temiz bir başlangıç malzemesi sağlar. Diferansiyel santrifüjlemeden sonra, EV'ler daha yüksek vezikül saflığı ve çözünürlüğü için sukroz yoğunluk gradyanının fraksiyonlanması veya boyut dışlama kromatografisi kullanılarak daha da saflaştırılabilir. Ortaya çıkan EV preparatları, RNA dizileme, proteomik profilleme ve patojenlerin etkileşimi ile EV alım çalışmaları gibi fonksiyonel testler gibi sonraki uygulamalar için oldukça uygundur; böylece bitki EV araştırmalarında tekrarlanabilirlik ve yorumlanabilirlik artırılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: EV bütünlüğünü korumak için soğutmalı santrifüjde 4 °C sıcaklıkta santrifüj adımlarını uygulayın. Steril tüpler kullanılmalıdır. Tüm örnek işleme adımları, doku hasarını en aza indirmek ve EV kalitesini tehlikeye atabilecek kontaminasyonun önlenmesi için paralel çalışan birden fazla kişi tarafından hızlı ve verimli şekilde yapılmalıdır.

1. Yaprak hazırlığı ve sızma

  1. 20 mM MES hidrat, 2 mM CaCl2, 0.1 M NaCl, pH 6 içeren 1 L vezikül izolasyon tamponu (VIB) hazırlanır.
  2. Yaprakların distal bıçak bölgelerini bıçak tabanından keserek yaprak sapını çıkararak hasat edin.
    NOT: Yeterli EV verimini sağlamak için her işlem veya genotip başına en az 100 dört haftalık bitki önerilmektedir. Arabidopsis bitkileri 8 saat ışık/16 saat karanlık döngüler altında yetiştirildi. Yaprakların ağartması ve buruşması gibi belirgin stres belirtileri gösteren yaprakları kullanmayın.
  3. Yaprakları ters osmoz (RO) suyla üç kez yıkayın. Kağıt havlulara koyun ve nazikçe kurutulun.
  4. Yaklaşık 50 mL yaprakları 120 mL'lik bir şırıngaya yükleyin. Yaprakları yerleştirmek için şırıngaya hafifçe dokun.
  5. Yapraklar tamamen suya girene kadar şırıngaya yaklaşık 60 mL VIB ekleyin. Hapsolmuş havayı pompaya nazikçe basarak dışarı at. Sızıntıyı önlemek için enjektörün ucuna dört kez katlanmış bir parafilm parçasını basın.
    NOT: Şırınga bazlı vakum sızması yaparken, vakum uygulamadan önce şırınga ve pistonun güvenli bir şekilde monte edildiğinden emin olun. Kuvveti yavaş yavaş uygulayın ve aniden plunger hareketini veya kontrolü kaybetmeyi önlemek için şırıngaya sıkı bir şekilde tutun.
  6. Pistonu yavaşça dışarıya çekerek yapraklara sızarak boşluk oluşturun. Pistonu uzatılmış pozisyonda 5 saniye tutun, sonra yavaşça bırakın. Bu sızma döngüsünü 2-3 kez tekrarlayın, yapraklar daha koyu ve saydam görünene kadar, bu da başarılı bir sızıntı anlamına gelir.
  7. NOT: Pistonu çekmek, vakum direnci nedeniyle orta düzeyde bir kuvvet gerektirir. Şırınga, kontrollü infiltrasyonu sürdürmek için piston yavaşça çekilirken sıkıca tutulmalıdır.
  8. Yapraklar sızdıktan sonra pistonu çıkarın. Fazla tamponu lavaboya dök.
  9. Tüm hasat edilen yapraklar sızana kadar 1.4-1.7 numaralı adımları tekrarlayın (Şekil 1A).

2. Apoplastik yıkama sıvısı (AWF) toplama

  1. ~12 inçlik bir Scotch bant şeridi kesin ve yapışkan tarafı yukarı koyun. Bantın bir ucunu, geniş ucunun hemen altında boş, gereksiz 1 mL'lik bir şırıngaya sararak sabitleyin. Yaklaşık 50-70 infiltrasyon yaprağı, yapışkan yüzey boyunca üst üste bakışlı katmanlar halinde dikkatlice dizelin; her bıçağın tabanı alt şırıngaya bakacak ve uçları toplanmak için yukarıya doğru bakacak şekilde konumlandırın (Şekil 1B).
    NOT: Birden fazla yaprak bir bant şeridine katmanlamak hasarı önlemeye yardımcı olur. Tüm yaprakları bıçağın bir ucuna bakacak şekilde hizalaması ve toplama tüpünün altına doğru hizalanarak santrifüjleme sırasında verimli apoplastik sıvı geri kazanımı sağlanır.
  2. Bantlı yaprakları şırınganın etrafına sıkıca sarın, ardından demetin üstünü iki şerit Scotch bandla sabitleyin. Sarılmış şırıngayı, yaprakların kesilen ucu ve şırınganın tabanı tüpün altına doğru yönlendirilecek şekilde 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Yaprakların sıkıca bantlandığından emin olun, çünkü gevşek sargılar yaprak hasarına yol açabilir ve kırık hücreler açığa çıkararak apoplast yıkama sıvısını kirletebilir (Şekil 1B).
  3. Infiltrasyon yaprağı ×içeren sarılı şırıngayı, sabit açılı rotorla donatılmış soğutmalı santrifüj ile 4 °C'de 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Apoplastik yıkama sıvısını yeni 15 mL'lik konik bir tüpte topla ve örneği buz üzerinde tut. 2.1-2.3 adımlarını tekrarlayın, tüm yapraklar AWF toplamak için kullanılana kadar.
    NOT: AWF açık olmalı, yeşil veya açık yeşil değil. Yeşil bir AWF kloroplast/klorofil varlığını gösterir ve hücre kontaminasyonunu da gösterebilir. Yaprak hasarını en aza indirmek için sabit açılı bir rotor kullanın.

3. Arabidopsis EV izolasyonu diferansiyel santrifüjleme ile AWF'den

  1. Toplanan apoplastik yıkama sıvısını 2.000 g'de 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlenerek standart ivme ve yavaşlama ayarlarına sahip salıncak kovalı rotorla donatılmış soğutmalı santrifüj ile santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, üst gövdeden büyük hücresel kalıntıları çıkarmak için 0,45 μm naylon hücre filtresi kullanılır. Pelleti at. Filtrelenmiş süpernatantı yeni santrifüj tüplerine aktarın (Şekil 2).
  2. Filtrelenmiş süpernatantı 10.000 × g sıcaklıkta, sabit açılı rotorla donatılmış soğutmalı santrifüj ile 30 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın; standart ivme ve yavaşlama ayarlarına sahip soğutucu bir santrifüj. Pelleti atın ve süpernatantı ultrasantrifüj için kalın. Bu adım, büyük hücresel kalıntıları ve büyük vezikülleri daha da ortadan kaldırır (Şekil 2).
  3. Süpernatantı 17 mL ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve 100.000 × g yükseklikte , 4 °C'de 1 saat boyunca ultrasantrifüj yapın; standart ivme ve yavaşlama ayarlarıyla salıncak kovalı rotorla donatılmış bir ultrasantrifüj kullanın. Santrifüjlemeden sonra, üst yüzey atılır ve peleti yaklaşık 16 mL VIB tamponunda tekrar süzülerek yıkama için yerleştirir. EV'leri toplamak için ultrasantrifüj turunu tekrarlayın (Şekil 2).
    NOT: 100.000 x g ölçüsünde santrifüj, ekzozom gibi küçük veziküllerin sedimentasyonu için yapılır. Sonraki yıkama adımları, peleti tamponda yeniden süzülerek EV olmayan proteinleri ortadan kaldırmaya yardımcı olur. Ultrasantrifüj tüpleri, santrifüjden önce üreticinin spesifikasyonlarına göre dikkatlice kütle olarak dengelenmelidir. Kullanımdan önce boru ve rotorlarda kusur olup olmadığını kontrol edin ve çalıştırmadan önce rotorun düzgün sabitlendiğinden emin olun.
  4. Süpernatantı atın ve peleti VIB'de tekrar askıya alın. EV pelletinin tam geri kazanılmasını sağlamak için pipet ucu kullanarak tüpün altını nazikçe kazıyarak (Şekil 2).
    NOT: EV peleti genellikle saydamdır ve yeniden askıya alındığında görsel olarak algılanmayabilir. Tüpün altını nazikçe kazımak, EV yeniden süspansiyon sürecini kolaylaştırır. İstenilen EV konsantrasyonuna ulaşmak için yeniden süspansiyon hacmini ayarlayın; çünkü daha küçük yeniden süspansiyon hacimleri genellikle daha yoğun EV hazırlıklarına yol açar. Genellikle, 50 μL'de yeniden süzülen EV'ler yaklaşık 1-1,5 μg/μL protein konsantrasyonları ve 109-10 10 parçacık/mL parçacık konsantrasyonları elde eder.
  5. Yeniden askıya alınmış EV'leri hemen kullanım için 4 °C'de veya sıvı azotta ani donmadan uzun süreli depolama için -80 °C'de sakla.
    NOT: Uzun vadeli depolama EV bütünlüğünü azaltabilir. Mümkün olduğunda taze hazırlanmış elektrikli araçlar kullanın.

4. EV arıtımı için sakroz yoğunluk gradyanı fraksiyonunun kullanımı

NOT: Sadece ultrasantrifüjleme, birden fazla vezikül türünün birlikte çökelmesini sağlar. Daha hassas çözünürlük elde etmek için, vezikülleri kaldırma yoğunluğu ve yüzme özelliklerine göre ayıran yoğunluk gradyanı fraksiyonu kullanılabilir. Bu yaklaşımda, sakaroz gradyanları tanımlanmış EV alt popülasyonlarını zenginleştirmek için kullanılır. Alternatif olarak, iyodiksanol gradyanları da kullanılabilir.

  1. EV'lerin üstten yüklemeli sukroz gradyan ayrımı
    1. %10-90 sakaroz gradyan stokları hazırlamak için şu konsantrasyonlardan oluşmaktadır: %10, 16%, %22, %28, %34%, %40, %46. %52, %58, %64, %70 ve %90 VIB kullanıyor. %70 ve %90 stokları çözmenize yardımcı olmak için 60 °C su banyosu kullanın.
    2. Her sükroz çözeltisinden 1 mL katmanı 17 mL'lik ultrasantrifüj tüpüne yerleştirerek kesintisiz bir gradyan hazırlayın; en yoğun çözelti alt kısımdan başlayıp en az yoğunlaştırılmış olana kadar ardışık olarak devam edin. Gradyanı oluştururken %10 sükroz tabakasını hariç tutun.
      NOT: Her yoğunluk tabakasını tüpün iç duvarı boyunca dikkatlice dağıtarak bitişik katmanlar arasındaki karışımı en aza indirin. Sürekli ve kontrollü akış sağlamak ve gradyan stabilitesini artırmak için yavaş dağıtım hızına ayarlanmış otomatik pipet önerilir. Düzenli manuel pipet kullanılırsa, dağıtım yavaş ve istikrarlı şekilde yapılmalı, pipet ucu önceki katmanın arayüzünün hemen üzerinde konumlandırılmalı ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemeye özen gösterilmelidir.
    3. Yeniden askıya alınmış EV pelletini (~100 μg EV proteini) 1 mL %10 sakroz çözeltisi ile karıştırın. Sonra, bu karışımı kesintisiz katmanın son katmanı olarak katmanlayın. Toplam hacim ~12.1 mL olacak.
    4. 100.000 g gücünde santrifüj, 4 °C'de 16 saat boyunca.
      NOT: Uzun süreli ultrasantrifüj çalışmaları için, boruların, kapakların ve rotorların uzun süreli yüksek hızlı çalışma için derecelendirildiğini ve üretici tarafından önerilen dengeleme prosedürlerinin uygulandığını doğrulayın.
    5. Üstten pipetle her örnek için altı 2 mL fraksiyon toplayın. Her fraksiyonu yeni bir 17 mL'lik ultrasantrifüj tüpüne aktarın.
    6. Toplanan fraksiyonları ~16 mL VIB tamponunda yeniden askıya alın ve 100.000 g boyunca 4 °C'de 1 saat boyunca santrifüj yapın.
    7. Üstten atılın, ardından her peleti 50 μL VIB'de tekrar askıya alın.
      NOT: EV pelleti görünmüyor. Pipet ucuyla tüpün tabanını nazikçe kazıyarak tekrar askıya alın. Tampon hacmini gerekirse ayarlayın (örneğin, daha yüksek konsantrasyon için 10 μL).
  2. EV'lerin alt yüklemeli sukroz gradyanlı ayrımı
    1. VIB tamponu kullanarak aşağıdaki yoğunlaşmalardan oluşan %10-90 sakaroz gradyan stokları hazırlamak. %70 ve %90 stokları çözmenize yardımcı olmak için 60 °C su banyosu kullanın.
    2. Yeniden askıya alınmış EV pelletini (~100 μg EV proteini) %90 sakaroz çözeltisi olan 1 mL ile karıştırın. Sonra, bu karışımı kesintisiz bir tabakanın ilk katmanı olarak katmanlayın.
    3. Kalan süreksiz sukroz gradyanını, EV-90% sakroz karışımının üzerine sıralı olarak her sakaroz çözeltisinden 1 mL katmanlayarak hazırlayın; %70 sakarozdan başlayıp adım adım daha düşük konsantrasyonlara (%64, %58, %52, %46, %40, %34, %28%, %22, %16 ve %10) sertçe katman getirin. Tüpün duvarındaki her katmanı pipetle dikkatlice dağıtarak bitişik katmanlar arasında karışmayı en aza indirin. Toplam hacim ~12.1 mL olacak.
    4. Santrifüj 100.000 g'de 72 saat ve 4 °C'de kullanıldı.
      NOT: Uzun süreli ultrasantrifüj çalışmaları için, boruların, kapakların ve rotorların uzun süreli yüksek hızlı çalışma için derecelendirildiğini ve üretici tarafından önerilen dengeleme prosedürlerinin uygulandığını doğrulayın.
    5. Üstten pipetle her örnek için altı 2 mL fraksiyon toplayın. Her fraksiyonu yeni bir 17 mL'lik ultrasantrifüj tüpüne aktarın.
    6. Toplanan fraksiyonları ~16 mL VIB tamponu ve santrifüjde 100.000 g ağırlığında 1 saat boyunca 4 °C'de yeniden askıya alın.
    7. Süpernatantı atın, ardından her peleti 50 μL VIB tamponunda tekrar askıya alın.
      NOT: EV pelleti görünmüyor. Pipet ucuyla tüpün tabanını nazikçe kazıyarak tekrar askıya alın. Tampon hacmini gerekirse ayarlayın (örneğin, daha yüksek konsantrasyon için 10 μL).

5. EV'leri arındırmak için boyut dışlama kromatografisinin (35 nm sütun) kullanımı

  1. Tampon hazırlığı ve kolon dengelenmesi
    1. VIB ve tüm ek tamponları taze hazırlayın. Tüm tamponları kullanmadan önce 0,22 μm bir membran ve gazı vakum altında filtreleyin; böylece hava kabarcıkları oluşmasını ve gözenek tıkanıklığını önleyin.
      NOT: Eksik gazdan ayırma veya filtrelenmemiş tamponların kullanılması, reçine yatağına hava kabarcıkları veya partikül madde sokabilir, bu da akışın bozulmasına ve EV ayırma verimliliğinin azalmasına yol açabilir. Sütunda baloncuklar gözlemlenirse, koşu durdurulmalı ve sütun yeniden dengelenmelidir.
    2. Kolon kapaklarını çıkarmadan önce kolon ve tamponların oda sıcaklığına (18-24 °C) dengilibe olmasına izin verin.
      NOT: Sütun ve tamponlar, kapak çıkarılmadan önce tamamen oda sıcaklığında dengelenmelidir. Soğuk bir sütuna oda sıcaklığında tampon uygulamak, reçine içinde kabarcık oluşumuna neden olabilir, bu da bozulma elülasyon profillerine ve tekrarlanabilirliğin azalmasına yol açabilir.
    3. Sütunu dik pozisyona getirin ve sütunun üst başlığını dikkatlice çıkarın.
    4. Alt kapağı çıkarın ve tamponun kolondan tamamen boşalmasına izin verin.
      NOT: Dengelenmeden önce depolama tamponunun kolondan tamamen boşaltıldığından emin olun.
    5. Kolon, üç sütun hacmi (25,5 mL) gazdan ayrılmış 0,22 μm VIB tamponu ile defileyerek dengeleyin.
  2. EV yükleme ve örnek toplama
    1. Her SEC saflatması için toplam 100 μg EV proteini kullanın. SEC kolonuna yüklemeden önce, EV örneklerini VIB kullanarak son hacmi 500 μL'ye ayarlayın.
    2. 500 μL EV süspansiyonunu doğrudan kolonun üstündeki yükleme fritine uygulayın.
    3. VIB tamponu eklemeden önce numunenin reçine yatağına tamamen girmesine izin verin. Doğru boyut tabanlı elülasyonu sağlamak için ayırma boyunca sürekli kolon akışını sürdürmek.
      NOT: Kolon akışı ayrım boyunca sürekli kalmalıdır. Kolonun kurumasına izin vermek veya akışı uzun süre durdurmak, boyut bazlı ayrımı bozur ve kesim örtüşmesine ve EV-zenginleşmenin azalmasına yol açabilir.
    4. EV örneği (500 μL) reçine yatağına tamamen girdikten sonra, 2 mL VIB ekleyin ve tamamen elüasyon yapmasına izin verin. Bu eluat, sütunun ölü hacmine karşılık gelir ve atılmalıdır. EV fraksiyonları daha sonra 400 μL VIB ekleyerek ve eluat toplanarak toplandı ve bu işlem tekrarlanarak 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 1-6 fraksiyonları elde edildi.
      NOT: Ölü hacimde elektrikli araçlar bulunmamalıdır. 35 nm sütunu kullanılarak doğrulamaya dayanarak, EV'ler genellikle 1-3 fraksiyonları halinde geri kazanılır. Gerekirse, ölü hacim nanopartikül takip analizi (NTA) veya EV belirteçleri için immünoblotasyon ile değerlendirilerek EV'lerin yokluğunu doğrulayabilir.
  3. Kolon temizliği ve depolama
    1. Fraksiyon toplama işlemi hemen sonra, kolonu bir sütun hacmi (8,5 mL) olan 0,5 M NaOH ile temizleyin ve reçineyi dezenfekte edin. Sonra, nötr pH'ı geri getirmek için kolonu 17 mL VIB ile yuyuyor. Sütun bir sonraki örnek yüklemeye hazır olur.
      NOT: Kolonun sadece tampon ile yıkaması, kalıntı proteinleri veya vezikülleri çıkarmak için yeterli değildir. NaOH temizleme adımı, özellikle aşağı akış nüklein asit veya RNA analizleri için örnekler arasında geçişi önlemek için gereklidir.
    2. Uzun vadeli depolama için, temizlikten sonra kolonu iki sütun hacmi deiyonize su ile yıkayın, ardından depolama için %20 etanol içeren iki sütun hacmi ekleyin. Sütunu tekrar kapseye alın ve dik tutun.
      NOT: Etanol depolamadan önce kolonun deiyonize suyla durulanması reçine yatağında tuz kristalleşmesini önler; bu da kolonun performansını korur.

6. EV doğrulama, nicel belirleme ve boyut/morfoloji değerlendirmesi

  1. Nanopartikül takip analizi (NTA)
    1. EV boyut dağılımı ve parçacık konsantrasyonunu NTA ile ölçün.
    2. EV örneklerini steril, 0,2 μm filtrelenmiş VIB'de 1:100 hassasiyetinde seyreltirerek optimal tespit aralığında (yaklaşık 10⁷-10⁹ partikül/mL) partikül konsantrasyonu elde edin.
    3. Sulandırılmış örnekleri baloncuk oluşumunu önlemek için nazikçe karıştırın ve 532 nm lazer ile yüksek hassasiyetli sCMOS kamera ile donatılmış enstrumana yükleyin.
    4. Dinamik gözlem hacmi tabanlı konsantrasyon algoritması uygulayarak, 10 nm (1.000 nm'ye kadar) tespit eşiği olan NS Xplorer yazılımı kullanarak veri toplama ve analiz gerçekleştirin.
  2. Western Blot EV işaretleyicilerinin analizi
    1. Western blot analizi için, 50 μL VIB'de sukroz gradyan ayrılmasından sonra elde edilen EV fraksiyonlarını yıkayıp yeniden askıya alın. Her fraksiyondan 10 μL aliquot'u SDS yükleme tamponu ile karıştırın, denatüre edilmiş ve EV belirteci TET8 antikorlarıyla immünoblottan önce %12 Tris-glisin jeli üzerinde çözüldü.
    2. SEC'ten türetilen EV fraksiyonları için, her fraksiyondan 400 μL önce 100 kDa moleküler ağırlıklı kesim santrifüj filtresi kullanılarak 50 μL'ye konsantre edilir. Ardından, yukarıda açıklandığı gibi Western blot analizi için konsantre numuneden 10 μL kullanın.
  3. Geçirim elektron mikroskopisi (TEM)
    1. 5 μL EV'nin BIB'de asılı olarak parlayan karbon-formvar 300 ağlık ızgaralara yatırılması. Sonra, fazla örneği filtre kağıdı ile çekin.
    2. Sonra, ızgarayı 3 μL elektron mikroskopik boyama ile negatif boyandırın, filtre kağıdıyla fitilleyin ve 300 kV TEM ile görüntülemeden önce hava kurumasına izin verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Optimize edilmiş AWF toplama protokolünün doku hasarını ve sitoplazmik kontaminasyonu azaltıp azaltmadığını değerlendirmek için, yöntemimiz (Yöntem 1) kullanılarak elde edilen AWF, tüm tesis vakum pompası infiltrasyonu11'e dayalı alternatif bir yöntemle (Yöntem 2) doğrudan karşılaştırıldı. İnfiltrasyon sonrası hücre hasarı, Trypan Blue boyama ile değerlendirildi; bu boyalanma, Yöntem 1 ile işlenen yapraklarda belirgin şekilde azalmış bir lekelenme gösterdi ve bu d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bitki EV'leri, özellikle mantar patojenleriyle krallıklar arası iletişimi aracılık etmekte bitki bağışıklığında kilit oyuncular olarak ortayaçıkmıştır 32. Artan kanıtlar, bitkilerin apoplasta EV'ler salgıladığını ve burada küçük RNA'lar (sRNA'lar), mRNA'lar ve Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani ve oomycete pathogen Phytophthora capsici10,18,33...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

B.D., Texas A&M Üniversitesi'nin Pathways to the Doctorate Bursu tarafından desteklenmektedir. B.H., Texas A&M Üniversitesi ve Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı HATCH'7009138 proje numarası TEX08074 tarafından desteklenen girişim fonlarıyla desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.45 & mikro; m naylon filtrelerVWR76479-032
1 ml gereksiz şırıngaBD Biosciences309659
100 kDa ultra santrifüj filtreAmiconUFC 910008
100 ml gereksiz şırıngaBD Biosciences551721050
15 ml konik tüplerVWR89039-664
50 ml konik tüplerVWR89039-656
Arabidopsis thaliana (Col-0)Laboratuvar tarafından bakımı yapılan hatlarGeçerli değil
Karbon-formvar 300-mesh ızgaralarTED PELLA01753-F
Şeffaf bantScotch Magic TapeS-9783
ParafilmFisher Scientific13-374-12
PBS tamponuKendi yapımGeçerli değil
qEV orijinal sütun Gen2 35 nmIZON BilimICO-35
Soğutmalı santrifüjEppendorf5810R
Soğutmalı santrifüj sabit açılı rotorEppendorfF-34-6-38
Soğutmalı santrifüj salıncaklı kovalı rotoruEppendorfA-4-62
SucroseVWR470302-810
UltrasantrifüjBeckman CoulterXPN-100
Ultrasantrifüj tüpleriBeckman Coulter337986
UranyLess lekeElektron Mikroskopi Bilimleri250218-01

Kaynaklar

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Zhou, X., et al. Small extracellular vesicles: The origins, current status, future prospects, and applications. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 184(2025).
  3. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  4. Akers, J. C., Gonda, D., Kim, R., Carter, B. S., Chen, C. C. Biogenesis of extracellular vesicles (EV): Exosomes, microvesicles, retrovirus-like vesicles, and apoptotic bodies. J Neurooncol. 113 (1), 1-11 (2013).
  5. Ratajczak, M. Z., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: Discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  6. Hristov, M., Erl, W., Linder, S., Weber, P. C. Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro. Blood. 104 (9), 2761-2766 (2004).
  7. Marar, C., Starich, B., Wirtz, D. Extracellular vesicles in immunomodulation and tumor progression. Nat Immunol. 22 (5), 560-570 (2021).
  8. Ruan, S., et al. Extracellular vesicles as an advanced delivery biomaterial for precision cancer immunotherapy. Adv Healthc Mater. 11 (5), e2100650(2022).
  9. Cai, Q., et al. Message in a bubble: Shuttling small RNAs and proteins between cells and interacting organisms using extracellular vesicles. Annu Rev Plant Biol. 72, 497-524 (2021).
  10. Cai, Q., et al. Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes. Science. 360 (6393), 1126-1129 (2018).
  11. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles isolated from the leaf apoplast carry stress-response proteins. Plant Physiol. 173 (1), 728-741 (2017).
  12. Ding, Y., et al. Exo70e2 is essential for exocyst subunit recruitment and expo formation in both plants and animals. Mol Biol Cell. 25 (3), 412-426 (2014).
  13. Wang, J., et al. Expo, an exocyst-positive organelle distinct from multivesicular endosomes and autophagosomes, mediates cytosol to cell wall exocytosis in Arabidopsis and tobacco cells. Plant Cell. 22 (12), 4009-4030 (2010).
  14. Jeon, H. S., et al. Pathogen-induced autophagy regulates monolignol transport and lignin formation in plant immunity. Autophagy. 19 (2), 597-615 (2023).
  15. Prado, N., et al. Nanovesicles are secreted during pollen germination and pollen tube growth: A possible role in fertilization. Mol Plant. 7 (3), 573-577 (2014).
  16. Samuel, M., Bleackley, M., Anderson, M., Mathivanan, S. Extracellular vesicles including exosomes in cross kingdom regulation: A viewpoint from plant-fungal interactions. Front Plant Sci. 6, 766(2015).
  17. Pinedo, M., De La Canal, L., De Marcos Lousa, C. A call for rigor and standardization in plant extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 10 (6), e12048(2021).
  18. Huang, Y., et al. Rice extracellular vesicles send defense proteins into fungus rhizoctonia solani to reduce disease. Dev Cell. 60 (8), 1168-1181.e6 (2025).
  19. Wang, S., et al. Plant mrnas move into a fungal pathogen via extracellular vesicles to reduce infection. Cell Host Microbe. 32 (1), 93-105.e6 (2024).
  20. He, B., et al. Publisher correction: Rna-binding proteins contribute to small rna loading in plant extracellular vesicles. Nat Plants. 7 (4), 539(2021).
  21. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles as key mediators of plant-microbe interactions. Curr Opin Plant Biol. 44, 16-22 (2018).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  23. Regente, M., et al. Plant extracellular vesicles are incorporated by a fungal pathogen and inhibit its growth. J Exp Bot. 68 (20), 5485-5495 (2017).
  24. Mu, J., et al. Interspecies communication between plant and mouse gut host cells through edible plant derived exosome-like nanoparticles. Mol Nutr Food Res. 58 (7), 1561-1573 (2014).
  25. Baldrich, P., et al. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  26. Regente, M., et al. Vesicular fractions of sunflower apoplastic fluids are associated with potential exosome marker proteins. FEBS Lett. 583 (20), 3363-3366 (2009).
  27. Rutter, B. D., Innes, R. W. Growing pains: Addressing the pitfalls of plant extracellular vesicle research. New Phytol. 228 (5), 1505-1510 (2020).
  28. Thieron, H., et al. Practical advice for extracellular vesicle isolation in plant-microbe interactions: Concerns, considerations, and conclusions. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70022(2024).
  29. Borniego, M. L., et al. Diverse plant Rnas coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  30. Chen, A., He, B., Jin, H. Isolation of extracellular vesicles from Arabidopsis. Curr Protoc. 2 (1), e352(2022).
  31. Koch, B. L., Rutter, B. D., Innes, R. W. Arabidopsis produces distinct subpopulations of extracellular vesicles that respond differentially to biotic stress. bioRxiv. , (2024).
  32. Hamby, R., Cai, Q., Jin, H. RNA communication between organisms inspires innovative eco-friendly strategies for disease control. Nat Rev Mol Cell Biol. 26 (2), 81-82 (2025).
  33. Hou, Y., et al. A phytophthora effector suppresses trans-kingdom RNAi to promote disease susceptibility. Cell Host Microbe. 25 (1), 153-165.e5 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Vezikül İzolasyonuDiferansiyel SantrifüjlemeSukroz GradyanıBoyut Dışlama KromatografisiNanopartikül İzlemeTransmisyon Elektron MikroskobuBitki Mikrop Etkileşimi
Arabidopsis yapraklarından bitki ekstrasellüleri veziküllerinin optimize edilmiş apoplastik yıkama toplama yöntemiyle izolyasyonu ve arındırılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.