Yöntem makalesi

Toxoplasma gondii Tachyzoitlere karşı in vitro biyoaktif moleküllerin taraması için antiproliferatif plak testi

DOI:

10.3791/69725

⸱

23 Ocak 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de Quimioterapia de Protozoários Egler Chiari, Departamento de Parasitologia - ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, protozoan Toxoplasma gondii'nin taşizoit evresine karşı yeni biyoaktif moleküllerin taramasına yardımcı olacak basit bir plak testi yöntemini tanımlamayı amaçlamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toksoplazmoz, genellikle göz lezyonları ve yenidoğan malformasyonlarıyla ilişkili parazitik bir enfeksiyondur. 1950'lerin başından itibaren, bu hastalığın birinci basadık tedavisi sülfadiazin, pirimetamin ve folinik asit kombinasyonuna dayanmaktadır. Bu yıllar içinde sadece birkaç alternatif rejim uygulandı. Bu, Toxoplasma gondii'ye karşı yeni biyoaktif moleküllerin keşfedilmesi ihtiyacını ortaya koyuyor. Bu patojenin zorunlu bir hücre içi parazit olması nedeniyle, laboratuvarda geleneksel ilaç taraması genellikle floresan proteinler veya β-galaktosidaz eksprese eden parazitler kullanılarak yapılan testler gibi pahalı materyal ve ekipman gerektirir. Ayrıca, optik mikroskopi nitelendirme gibi yöntemler zaman alıcı olabilir. Plak testi, parazitin litik döngüsü tarafından zarar gören hücre monotabakasındaki bölge sayısını ve yok oluş alanını ölçerek hücre içi patojen çoğalmasının yoğunluğunu değerlendiren bir yöntemdir. Bu çalışma, aktif moleküllerin T. gondii'nin hücre içi takizoidlerine karşı in vitro taraması için tasarlanmış optimize edilmiş plak testi protokolünü tanımlar. Bu protokol, ucuz malzemeler ve basit bir laboratuvar düzeni kullanır; çeşitli araştırma grupları tarafından bu parazite karşı yeni aktif moleküllerin tanımlanmasını kolaylaştıran hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde eder.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toksoplazmoz, dünya genelinde heterojen bir dağılıma sahip zoonotik bir hastalıktır ve küresel nüfusun yaklaşık üçte birinietkiler 1,2. Bu hastalığın belirtileri, konak bağışıklığının derecesi veparazitin çoğalması ile ilişkilidir 3,4. Hastalığın akut fazı, taşizoit evresinin çoğaltılmasıyla karakterize edilir ve genellikle bağışıklık yetkili bireylerde semptomatsızdır 5,6. Buna karşılık, bağışıklık sistemi zayıf bireylerde genel halsizlik, ateş, ensefalit ve retinokoroidit gibi spesifik olmayan semptomlar da bulunur 6,7,8. Klinik önemine rağmen, mevcut tedavi Toxoplasma gondii bradyzoite evresine (kronik fazda) karşı etkisiz olup parazitolojik bir tedavi sağlamaz. Mevcut ilaçlara uygulanan yan etkiler ayrıca tedavi bağlılığınıazaltır 9,10,11. Bu nedenle, toksoplazmoz için yeni, daha güvenli ve daha etkili tedaviler bulmak gereklidir.

Yeni ilaçların geliştirilmesi uzun bir zaman dilimini, milyarlarca dolarlık yatırımı ve birden fazla araştırma aşamasını gerektirir. İlaç geliştirme maliyeti yüksek olduğundan, ilaç endüstrisi en iyi ilaç adayını öncedenseçmelidir. İlaç taraması için, in silico yöntemleri, yapay zeka kullanımı ve en yaygın yaklaşım olan biyolojikyöntemler 16,17,18,19 dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar kullanılabilir. In vitro biyolojik tarama, moleküllerin (kemokütüphaneler) kullanılarak biyolojik aktivitenin tanımlanması için moleküllerin kullanılabilirolmasını içerir 20,21,22. Bu kemokütüphaneler çeşitli moleküller içerdiğinden, kaynakların ve zamanın optimize edilmesi gereklidir. Bu nedenle, plak testi, T. gondii gibi çeşitli patojenlere karşı yeni biyoaktif moleküllerin hızlı taramasına yardımcı olabilecek bir yöntem olabilir.

Plak testi, hücre içi patojenlerin litik döngüsünü kullanarak hücre monotabakasındaki patojenlerin konsantrasyonunu niceleyen in vitro bir yöntemdir ve zamanla nekrotik plakların oluşumuna yolaçar 23. Plak testi tekniğini kullanan ilk çalışma, 20. yüzyılın ikinci yarısına kadar uzanır; Renato Dulbecco'nun ekibi, Batı Atları Ensefalomiyelit virüsüyle enfekte olmuş tavuk fibroblastlarının monokatmanlarını kullanarak oluşan nekrotik plak sayısı ilevirüs 16'nın konsantrasyonu arasındaki orantılılığı göstermiştir. Bu tekniğin T. gondii'de kullanımı da iyi tanımlanmıştır; bu da Ufermann ve işbirlikçileritarafından daha önce açıklanmıştır 23.

T. gondii'nin farklı molekül konsantrasyonlarına karşı inhibisyonundaki yanıtı gözlemlemek için plak testini kullanan ilk çalışmalardan biri, Roberts ve ark. tarafından 1976 yılındayapılmıştır 17. Plak testi virüstitrasyonu 16,24 için yaygın olarak kullanılsa da, bu yöntem sadece birkaç araştırma grubu tarafından moleküllerin anti-T. gondii aktivitesini değerlendirmek için kullanılmıştır. Yüksek verimliliğe sahip bileşik kütüphanelerini test edebilecek ve ucuz malzemeler ile basit bir laboratuvar düzeni kullanan bir test aranan plak testi, rutin laboratuvar ilaç taraması için alternatif olarak araştırıldı. Bu, farklı moleküllerin aktivitesinin basit malzemeler ve görüntü alma sistemi kullanılarak eşzamanlı değerlendirilmesini sağlayan optimize edilmiş bir protokolün kurulmasına yol açtı; bu protokol hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etti. Bu nedenle, laboratuvarımızda doğrulanmış ayrıntılı protokolü burada, diğer grupların T. gondii'nin taşizoitlerine karşı yeni biyoaktif molekülleri taramalarına yardımcı olmak için ayrıntılı olarak tanımlıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parazit ve hücre kültürlerinin manipülasyonu, atık bertaraf ve hedeflenme, Brezilya mevzuatına uygun olarak, Ulusal Sağlık Gözetimi Ajansı (ANVISA) RDC nº 222/2018 uyarınca gerçekleştirilmiştir. Tüm işlemler ICB-UFMG'den İç Biyogüvenlik Komitesi (CIBio) tarafından denetlendi. Bu çalışma, hayvanların, insanların veya genetik olarak değiştirilmiş organizmaların kullanımını içermemektedir. CNPq, CAPES ve FAPEMIG hibeleri bu çalışmayı destekledi. ESMD (CNPq 308082/2023-0) ve RWAV (CNPq 305574/2021-3) CNPq verimlilik bursiyerleridir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Takviye RPMI-1640 ortamının hazırlanması

NOT: RPMI-1640 ortamı, hem süspansiyon hem de tek katmanlı insan lösemi hücrelerinin kültürlenmesi için geliştirilmiştir. Ancak, sonraki çalışmalar çeşitli memeli hücre yetiştiriciliği için uygun olduğunu göstermiştir.

  1. 250 mL RPMI-1640 içeren şişeye 2,5 mL 200 mM L-glutamin (100x) ekleyin.
  2. Ortama 2,5 mL Antibiyotik-Antimikotik (100x) ekleyin.
  3. Sonra, RPMI-1640 (%2 veya %10 FBS) içeren şişeye 5.0 mL veya 25 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
  4. Buzdolabında (2-8 °C) sakla.

2. PBS (1x) Hazırlanması

NOT: pH 7.2 ve 25 °C'de 1 L fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) hazırlaymak için aşağıdaki adımları izleyin.

  1. Aşağıdaki tuz miktarlarını ayrı ayrı ölçün: 1,4 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 ve 8,5 g NaCl.
  2. Ağırlıklı tuzları ayrı ayrı 800 mL deionize su içeren 1 L'lik bir beğene ekleyin. Çözeltiyi tüm tuzlar tamamen çözünene kadar karıştırın.
  3. Çözeltinin pH değerini bir pH ölçer kullanarak ölçün. 7.2 olmalı. Gerekirse, pH 7.2'ye getirmek için 6 M hidroklorik asit veya 3 M sodyum hidroksit kullanın.
  4. Cam çubuk kullanarak, yukarıdaki çözeltiyi 1 L hacimli bir şişeye nicel olarak aktarın.
  5. Hacimli şişeye deiyonize su ekleyin, toplam hacim 1 L'ye ulaşana kadar menisküsün doğru noktada olduğundan emin olun.
  6. Çözeltiyi hacimsel şişede karıştırın, nazikçe ters çevirin.
  7. Son PBS çözeltisini daha küçük cam şişelere (100-250 mL) böl.
  8. Şişeleri 121 °C, 1.1 kg/cm 2 sıcaklığında 15 dakika boyunca otoklav yapın.
  9. PBS çözeltiyi buzdolabında (2-8 °C) sakla.
    NOT 1: Tüm deneyler için 37 °C'de PBS kullanın.

3. %4 formaldehit çözeltisi hazırlanması

  1. 35,68 mL 1x PBS ve 4,32 mL %37 P.A. formaldehit karıştırın.
  2. Çözeltiyi plastik bir şişede oda sıcaklığında (25 °C) sakla.

4. Aktif moleküllerin stok çözeltisinin hazırlanması

NOT: DMSO, DMF, etanol veya sudaki moleküllerin çözünebilirliğini kontrol edin ve en uygun çözücüyü seçin. Parazitler üzerindeki potansiyel seyreltici toksisite etkilerini en aza indirmek için, stok çözeltisi test edilecek bileşiğin en yüksek konsantrasyonundan en az 1000 kat daha yoğun olmalıdır. Örneğin, test edilecek en yüksek konsantrasyon 1 μM ise, stok çözeltisi en az 1 mM olmalıdır. 10 mM stok çözümü hazırlamak için aşağıdaki adımları izleyin:

  1. Test edilecek bileşiği 0.0001 g hassasiyetle analitik bir teraziyle tartın.
  2. 10 mM çözelti elde etmek için gereken seyreltici hacmini aşağıdaki formülle belirleyin:
    V (mL) = (Y MM) x 100
    Burada:
    Y: miligram (mg) cinsinden bileşik kütlesi
    MM: bileşiğin azı dolar kütlesi
    V (mL): çözücünün hacmi
  3. Sulandırıcı maddesini, ağırlıklı bileşiği içeren alıcıya ekleyin.
  4. Vortex mikser kullanarak homojenleştirin.
  5. Çözeltiyi küçük aliquotlara ayırın ve -20 °C sıcaklıkta dondurucuda saklayın.
  6. Kullanmadan önce, aliquot çözeltinin tamamen çözülmesine izin verin ve vortex mikser ile tekrar homojenleşmesini sağlayın.
    NOT: Diğer konsantrasyonlarla alt stok çözeltileri hazırlamak için aşağıdaki formülü kullanın
    V (μL) = x mM × y μL/10 mM
    V (μL) ∶ yeni çözeltiyi hazırlamak için gereken stok çözeltisi hacmi
    x mM: Yeni çözeltinin istenen konsantrasyonu.
    y (μL): yeni çözeltinin istenen hacmi.

5. Hücre kültürü

  1. NHDF hücrelerini kullanarak şişeni 37 °C su banyosunda nazikçe döndürerek kullanın.
    NOT: NHDF hücreleri, İnsan Sünnet Telisi Fibroblastları (HFF) veya kararlı bir monotabaka oluşturan diğer hücre hatlarıyla değiştirilebilir. Plak testi yalnızca stabil bir monotabaka oluşturan hücre hatlarıyla çalışır, yani temasla büyümesi duran hücreler. Tümül hatlar gibi proliferasyon engelleme göstermeyen hücre hatları kullanılamaz; çünkü hücreler, kültür ortamında besinler için parazitlerle rekabet eder ve parazitlerin oluşturduğu plak alanını yeniler.
  2. Çözülmüş hücreleri hemen 10 mL takviyeli RPMI-1640 ortamı içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın (1. adım).
  3. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g ile santrifüjleyin. Dönme döngüsü tamamlandığında, tüpün tabanında bir hücre pelleti görünmelidir.
  4. Hücre pelletini korumak için süpernatantı dikkatlice atın.
  5. Hücre pelletini %10 FBS içeren 12 mL takviyeli RPMI-1640 ortamıyla yeniden askıya alın ve üç adet 25cm 2 kültür şişesi veya bir 75cm 2 şişe tohumlayın. 2-3 gün sonra, hücre çoğalmasının geri dönüşünü belirlemek için kültür termos(lar)ını ters faz kontrast mikroskobu ile inceleyin (hücrelerde en az %40-50 birleşme göstermelidir).
  6. Hücreler tam bir tek tabakaya (%100 birleşme) ulaştığında, ortamı şişeden Pasteur pipeti ile çıkarın. Malzemeyi ve pipeti atın.
  7. Şişeye 1-2 ml PBS ekle, 1 dakika bekleyin ve PBS'yi çıkarın.
  8. Şişeye 1 mL %0,05 tripsin verne çözeltisi ekleyin ve 2 dakika boyunca %5CO2, nem ve 37 °C sıcaklıkla kuluçka makinesine koyun.
  9. 2 dakika sonra, hücrelerin ayrıldığını doğrulamak için ters mikroskopla hücreleri gözlemleyin.
  10. Ayrılmış hücreleri, %10 FBS ile %10 FBS içeren 24 mL takviyeli RPMI-1640 ortamı ile 10 mL serolojik pipet ve otomatik pipet dağıtıcı ile yeniden süzülür.
    NOT: Her 25 veya 75 cm² kültür şişesi, birleşen bir tek katmanlı ile sırasıyla 5 veya 15 adet 25 cm²'lik kültür şişesinde çoğaltılabilir.
  11. Gerekli hacim ortamı (24 mL) eklendikten sonra, hücre süspansiyonunu serolojik pipet ile homojenleştirin.
  12. Hücre süspansiyonundan 4 mL ortada her 25 cm2 şişe veya 12 mL 75 cm2 şişeye aktarın. İlk mataşa içinde 4 ml hücre süspansiyonu bırakmayı unutmayın.
  13. Termosları %5CO2, nem ve 37 °C sıcaklıkla bir kuluçka makinesine yerleştirin.
  14. Tam bir hücre monotabakası elde edilene kadar bekleyin (%100 birleşme).
    NOT: Her mataşa tarih ve pasaj numarasıyla belirtin.

6. Kültür plakası hazırlama

  1. Kültür şişesindeki hücre monokatmanının (%100 birleşim) bütünlüğünü ters mikroskopla inceleyin.
  2. Yukarıda açıklandığı tripsizasyon prosedürünü takip edin (5.7-5.9. adımlar).
  3. 5 mL serolojik pipet kullanılarak, ayrılmış hücreleri 4 mL RPMI ortamıyla yeniden süspansiyona yerleştirin ve bunları 15 mL konik bir tüpe aktarın.
  4. Santrifüj 200 x g ile 5 dakika oda sıcaklığında 5 dakika sür.
  5. Süpernatantı dikkatlice at.
  6. Hücre pelletini 1 mL taze RPMI-1640 ortamıyla yeniden süzül.
  7. Vortex mikser kullanarak homojenleştirin.
  8. 10 μL, steril uçlu bir mikropipet kullanarak %4 formaldehit çözeltisi (1:50 seyreltme) içeren 1,5 mL bir tüpte aktarın.
    NOT: Sulandırma faktörü = (Toplam Hacm (μL)) / (Örnek hacmi (μL))
  9. Bir Neubauer odası kur.
  10. Fiksatif çözümü parazitlerle (madde 6.8'de hazırlanmış) bir vorteks mikser kullanarak homojenleştirin.
  11. Sabit parazitlerle birlikte çözeltinin 10 μL kısmını Neubauer odasına ekleyin.
  12. Neubauer odasının dört dörtlüğünü sayın; her biri 16 kareden oluşuyor.
  13. Millimetre başına hücre sayısını belirleyin:
    Hücre sayısı (millimetre başlıkta) = [(kare başına n° hücre)/4] x Fd x 104
    Burada:
    Fd (Sulandırma Faktörü) = 50
  14. Her kuyunun her kuyusunu tohumlayın; sırasıyla 5 × 104 veya 1 x 105 hücre ile 1 veya 2 mL RPMI-1640 takviyeli ortamda %10 FBS ile yeniden süspansiyona getirilir.
  15. Plakaları %5CO2, nemli atmosfer ve 37 °C sıcaklık içeren bir kuluçka makinesine yerleştirin.
  16. Hücre monotabakası %100 birleşime ulaşana kadar bekle.

7. Tachyzoite in vitro yetiştiriciliği

NOT: Plak testi için T. gondii suşunun RH suşunu öneriyoruz.

  1. Eski ortamı, NHDF hücrelerinin tam bir monotabakası (%100 birleşim) içeren 25 cm2 ölçülüğündeki bir şişeden Pasteur pipeti kullanılarak atın. Sonra, termosa 4 mL taze RPMI-1640 tam ortam ekleyin.
  2. Önceki bir şişeden taze çıkan taşizoitler içeren bir süpernatantın lizlenmiş enfekte kültürle 5 μL aktarılması. 5 μL hacmi 25 cm² şişe başına 6-7 günlük litik döngü sağlar.
  3. Yeni enfekte termos, %5CO2, nemli atmosfer ve 37 °C sıcaklıkla bir kuluçka makinesine yerleştirin.

8. Taşizoit niceliği

  1. Yeni çıkan parazitleri içeren kültür termosundan ortamı Pasteur pipeti kullanarak çıkarın ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  2. Tüpü oda sıcaklığında 760 x g ile 2 dakika santrifüjlen. Dönme döngüsü sona erdiğinde, tüpün tabanında görünür bir pelet görülür.
  3. Süpernatantı dikkatlice at.
  4. Parazit pelletini %2 FBS ile 1 mL taze RPMI-1640 ortamı ile yeniden askıya alın.
  5. Parazit süspansiyonunu vortex mikser kullanarak homojenleştirin.
  6. Parazit süspansiyonundan 10 μL, 490 μL formaldehit çözeltisi (1:50 seyreltme) içeren 1,5 mL bir tüpte, steril uçlu bir pipetle aktarın.
  7. 6.10 ile 6.12'de açıklanan adımları takip edin.
  8. 1 mL'de kaç taşizoit sayısını belirleyin.
    NOT: Takizoidlerin sayısı (millimetre başlıkta) = [(kare takizoidleri sayısı)/4] x Fd x 104
    Burada:
    Fd (Sulandırma Faktörü) = 50

9. Kemokütüphaneden sürünen aktif moleküller için plak testi hazırlama

NOT: Bu test, 1 μM konsantrasyonda T. gondii proliferasyonunu %50'den fazla azaltan molekülleri belirlemeyi amaçlamaktadır. Bu teste başlamadan önce, plak testinde kullanılan bileşik konsantrasyonlarının konak hücreler için toksik olmadığından emin olmak için bir sitotoksisite testi (örneğin MTS yöntemi veya MTT yöntemi) yapılmalıdır.

  1. Hücre kültürlerinin 12 veya 6 kuyu plakalarında %100 birleşime ulaştığını doğrulayın.
  2. Eski ortamı atın ve 12 ve 6 kuyu plakalarındaki her kuyuya sırasıyla %2 FBS içeren 1 veya 2 ml taze takviyeli RPMI-1640 ortamı ekleyin.
  3. Test edilecek bileşikleri her kuyuya istenen konsantrasyonda ekleyin. İlk tarama için 1 μM konsantrasyon önerilmektedir.
    NOT: Her kuyuya eklenecek hacmi hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın.
    V (μL) = (Kuyudaki nihai konsantrasyon (μM) x Kuyu içindeki hacmi (μL))/(Stok çözeltisi (μM))
  4. Her plaka kuyusuna RH suşundan 600 taşizoit (12 kuyu plakası için) veya 1.000 taşizoit (6 kuyu plakası için) ekleyin.
    NOT: Parazit çoğalmasında değişimler, kültür ortamı veya FBS tedarikçileri veya kullanılan hücre hatları arasındaki farklılıklar nedeniyle meydana gelebilir. Bu nedenle, her laboratuvar durumu için optimal parazit sayısını belirlemek amacıyla pilot deney yapılması önerilir. Gerekirse bu deneyde kullanılan parazit miktarını ayarlayın.
  5. Plakaları 37 °C sıcaklıkta, %5CO2 ile ve nemli atmosferde 7 gün boyunca herhangi bir rahatsızlık olmadan kuluçka makinesine yerleştirin.
    DIKKAT: 7 günlük kuluçka dönemi boyunca plakalar hareket ettirilmemeli veya dokunulmamalıdır. Eğer bu olursa, deney mahvolur.

10. Kristal menekşe ile plaka boyama ve görüntü alımı

  1. 7 gün sonra, her kuyunun içinden ortamı çıkarın.
  2. Her iki iyi oda sıcaklığında 1x PBS ile dikkatlice yıka.
  3. PBS'yi atın ve her kuyuya dikkatlice 1 mL %70° alkol ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika bekletin, sonra atın.
  4. %0,5 kristal mor sulu çözeltiyi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
  5. Kristal mor çözeltisini çıkarın.
  6. Her kuyuyu dikkatlice bir kez deionize suyla yıkayın.
    DIKKAT: Yıkama aşamalarında ortamı veya PBS'yi çıkarırken, pipetin ucuyla kuyunun dibine dokunmayın, çünkü bu tek katmanın bütünlüğüne zarar verebilir. Yıkama adımları sırasında, hücrelere doğrudan PBS veya alkol jeti atmayın. Kuyunun kenarına iyice ekleyin.
  7. Plakayı yüzü aşağı emici kağıda koyun ve fazla suyu boşaltmak için oda sıcaklığında 24 saat kurumasına izin verin.
  8. Plakaları yüksek çözünürlüklü düz yataklıtarayıcı 28,29 veya Coomassie mavi jel seçeneği 21,22,30 için yapılandırılmış görüntüleme dokümantasyon sistemi ile fotoğraflayabilirsiniz.

11. Geri Dönüş Testi

NOT: T. gondii tachyzoitleri ile yapılan geri dönüş testinin birincil amacı, kültür ortamından bileşiklerin çıkarılmasından sonra tedavi edilen parazitlerin çoğalma kapasitesinin tamamen ortadan kalkıp azalmadığını veya azaltıp azalmadığınıbelirlemektir.

  1. 6. adımda açıklandığı gibi NHDFcells içeren 6-kuyu plakası tohumlayın. Her kuyu için, %10 FBS ile takviye edilmiş 2 mL takviyeli RPMI-1640'a resüspansiyonlu 1 x 105 hücre ekleyin.
    NOT: Hücre monotabakası her kuyunun %100 birleşimine ulaştığında, plaka plak testi için hazırdır.
  2. Ortamı atın ve her kuyuyuya 2 mL taze ortamda %2 FBS ile süzülmüş 1 x 104 taşizoit ekleyin.
  3. Taşizoitlerin NHDF hücreleriyle 1 saat etkileşime girmesine izin verildikten sonra, seçilen bileşikleri %90 inhibitör konsantrasyona (IC90) yakın nihai konsantrasyonda ekleyin. Sadece ilaç sulandırıcı içeren bir kuyu pozitif kontrol olarak kullanılır.
  4. Taşizoitleri 4 gün boyunca 37 °C'de %5CO2 ile ve nemli bir atmosferde kuluçka içinde tedavi edin.
  5. 4 günlük tedavi süresinden sonra, bileşiklerin tamamen çıkarıldığından emin olmak için plakayı 37 °C'de 1x PBS ile üç kez yıkayın.
  6. Her kuyuya 2 mL taze ortam içermeyen madde ekleyin ve tabağı kuluçka makinesinde 7 gün daha tutun.
  7. Plakayı kristal mor boyayla boyayıp 10. adımda tarif edildiği gibi fotoğraflayın.

12. ImageJ yazılımı kullanılarak görüntü analizi

  1. ImageJyazılımı 32 ile görüntüleri açın.
  2. Oval seçim aracı ile bir kuyuya karşılık gelen alanı seçin (Şekil 1A,B).
    NOT: Seçimi yaparken, kuyu sınırlarındaki kusur gösteren bölgeleri göz ardı edin. Bunlar genellikle kuyunun kenarlarında bulunur.
  3. Yeni bir görüntü kopyalayın ve oluşturun: seçilmiş alanı Ctrl + C tuşlarıyla kopyalayın; Ctrl + N tuşlarına basarak yeni bir görüntü dosyası oluşturmak; kopyalanan görüntüyü Ctrl + V kullanarak yeni siyah pencereye yapıştırın.
    NOT: Yeni görüntü oluştururken varsayılan ayarları kullanın: 8 bit, siyah ile doldur, 512 x 512 piksel ve bir dilim (Şekil 1C).
  4. Gidin: Görsel > Eşik > Ayarlayın veya Ctrl + Shift + T (Şekil 1D) tuşlarına basın.
  5. Eşik penceresinde Huang ve Kırmızı seçeneklerini seçin, ardından Otomatik (Şekil 1E) seçeneğine tıklayın.
  6. Analiz et'e tıklayın, ardından Parçacıkları Analiz Et'i seçin (Şekil 1F). Varsayılan seçenekleri görünen pencerede saklayıp OK tuşuna tıklayın (Şekil 1G).
  7. Yeni bir pencere açılacak. % Alan'da gösterilen değeri kopyalayın ( Şekil 1H'de kırmızı dikdörtgenle vurgulanarak) ve parazit çoğalma veya inhibitisyon yüzdesini hesaplayın.
  8. Bu adımları tabaktaki her kuyuk için tekrarlayın.
  9. Yayılma yüzdesini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
    % proliferasyon = (%İyi işlenmiş alan/%Alan kontrol iyisi) × 100
  10. Inhibisyon yüzdesini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
    %'i inhibisyon = [1- (%İyi işlenmiş alan/%Alan kontrol iyisi)] × 100

Şekil 1
Şekil 1: ImageJ yazılımında sonuçların adım adım analizi. (A) "Oval" araç seçimi. (B) Görüntüde ilgi alanının seçilmesi. (C) Önerilen ayarlarla yeni görüntü penceresi (Ctrl + N). (D) "İlgi alanı yeni görüntü penceresine yapıştırıldıktan sonra eşik analizi" adımları. (E) Eşik penceresinde Huang ve kırmızı seçenekler seçimi yapılır, böylece tüm beyaz alanlar kırmızı ile doldurulur. (F) "Parçacıkları Analiz Et" için kullanılan adımların dizisi. (G) Parçacıkların analizi için kullanılan ayar. (H) Toplam yıkılan alanın yüzdesinin sonucu özet penceresinde gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

13. İstatistiksel analiz

  1. Yayılma engelleme yüzdesi hesaplandıktan sonra verileri Office yazılımında bir Excel tablosunda düzenleyin.
  2. GraphPad Prism 5.0 yazılımını açın ve XY'ye tıklayın (Yeni Tablo & Grafik'in altında).
  3. Y bölümünde ("X:hata çubuğu"nun altında), veri tekrarı sayısını girin (genellikle üç biyolojik kopya). Bu sayı, yapılan tekrarların sayısına bağlı olarak değişebilir.
  4. Sadece grafikin yanında Mean seçeneğini seçin ve "Başka bir yerde hesaplanmış hata değerlerini girin ve çizin" seçeneğini SEÇMEYİN, ardından Oluştur'a tıklayın.
  5. X eksenindeki konsantrasyon verilerini ve proliferasyon inhibisyon yüzdesi verilerini A, A:Y1, A:Y2, A:Y3, A:Y4, A:Y5 sütunlarına yerleştirin.
  6. = Analyze üzerine tıklayın, ardından Dönüştür'e tıklayın ve sonra OK. Yeni bir pencere açılacak. Bu yeni pencerede, X = Log(X) kullanarak X değerlerini dönüştür, ardından Sonuçlar için yeni bir grafik oluştur seçeneğine tıklayın ve ardından OK.
  7. = Analiz et, sonra Normalize et. Yeni bir pencere açılacak. " %0 nasıl tanımlanır?" bölümünde, tıklayın ve Y = 0.0 ayarlayın. % 100 nasıl tanımlanır? bölümünde tıklayın ve Y = 100 ayarlayın; Yüzde seçin ve Sonuçlar için yeni bir grafik oluştur seçeneğine tıklayın.
  8. Sembole tıklayın: Yukarıda bulunan doğrusal olmayan regresyonlu bir eğri uydur = Analiz et. Doz-yanıt - İnhibisyon, sonra log (inhibitör) vs. normalize yanıt - Değişken eğim üzerine tıklayın ve ardından OK tuşuna tıklayın.
    NOT: Aşağıdaki sonuçları gösteren bir pencere açılır: IC50 (Inhibitör Konsantrasyon %50), %95 güven aralığı ve R2 değeri. Bu değerler çok önemlidir ve makaledeki bir sonuç tablosuna dahil edilmelidir.
  9. IC25, IC90 veya IC95 gibi diğer inhibitör konsantrasyonları tahmin etmek için bağlantı (https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm) Quick Calcs - GraphPad kullanın; EC: etkili konsantrasyon. Test edilen her ilaç için Prism yazılımı tarafından elde edilen IC50 ve HillSlope'u raporlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tedavi sonrası plak testini değerlendirmek için hem pozitif (taşizoitlerle enfekte olan ve tedavi edilmemiş hücreler) hem de negatif (%0,1 DMSO içeren enfekte olmayan hücreler) kontroller çok önemlidir. Deneyin sonunda, pozitif kontrol kuyusu, yapışmış hücrelerin kalıntılarıyla iyi tanımlanmış boş alanlar göstermelidir (Şekil 2). Buna karşılık, negatif kontrol kuyusu boş alan olmayan sağlam bir monokatman göstermelidir. Negatif kontrol, tek tabakanın bütünlüğünü ve deney boyunca hücrelerin y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antiproliferatif testler için yeni protokollerin standartlaştırılması, gelecekteki ilaçların tanımlanması üzerine bilimsel araştırmaların ilerlemesi için temel bir adımdır. Burada sunulan protokol, biyoaktif moleküllerin T. gondii taşizoitlerine karşı etkinliğinin in vitro olarak değerlendirilmesine alternatif bir yaklaşım sunar.T.gondii, süzülen hareketlilikle hareket eden zorunlu bir hücre içi parazit olduğundan, parazitler lizlenmiş bir hücreden çıktıkların...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, çıkar çatışması olmadığını belirtir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ayrıca Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) ve CAPES/PROEX'in finansmanına teşekkür etmektedir. Yazarlar, bu araştırmayı desteklediği için Minas Gerais Federal Üniversitesi'nden Pró-Reitoria de Pesquisa'ya teşekkür etmek isterler. ESMD (CNPq 308082/2023-0) ve RWAV (CNPq 305574/2021-3) CNPq verimlilik bursiyerleridir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,05 % Tripsin-EDTAYaşam Teknolojileri25300-062
10 mL serolojik pipetOlenK17-110
15mL şahin tüplü santrifüjFanemModel: 206
5 mL serolojik pipetOlenK17-115
6 kuyu kültür plakasıSarstedt833920
Analitik dengeMettler Toledo Model: AB204 Seri No: 1116473813
Antibiyotik-Antimikotik (100X)Yaşam Teknolojileri15240-062
Otomatik pipetKasviK1-AID
SantrifüjEppendorfModel 5415 R Seri No: 0023591
CO2 Kuluçka MakinesiPHC ŞirketiModel No: MCO-230AICUVL-PA Seri No: 210360090
Kültür şişesi 25 cm2Sarstedt833910
Dimetil sülfoksit (DMSO) P.A.Merck 1,02,95,21,000
Etanol P.AMerck1,00,98,31,000
Fetal Sığır Serumu (FBS)Yaşam Teknolojileri12657-029
Formaldehit %37-38Panreac131328
GraphPad Prism GraphPad Yazılımı-Sürüm 8.0.1
ImageJ  software --Sürüm 1.52e
Görüntüleme dokümantasyon sistemleriBio-RadModel:  ChemiDoc MP Görüntüleme Sistemi Seri No: 734BR2249
Laminar akış başlığıVeco do BrasilModel: VLFS-09
L-glutamin 200 mM (100X)Yaşam Teknolojileri25030-081
Mikro tüp 0.5 mLSarstedt72,699
Yenidoğun Normal İnsan Dermal Fibroblastı (NHDF)LonzaCC-3132Brezilya'nın Fiocruz Paraná'den Dr. Sheila Nardelli tarafından cömertçe sağlanmıştır
Neubauer odası 0.100 mm 0.0025 mm2Yeni Optik7301-1
pHmeterMicronalModel: B374 Seri No: 30/37
Pipet 20-200 ve mikro; LKasvi temel22032893
Pipet 2-20 & mikro; LLabmate Pro656630226
Pipette  0.2-2 & mikro; LLabmate Pro556610114
Pipette  1000-5.000 ve mikro; LUniscienceYM4A021482
Pipette  100-1000 ve mikro; LEppendorf Araştırma PlusQ34354C
Potasyum Fosfat Monobazik  (KH2PO4) P.A Synth01F2002.01.AF
RPMI-1640 ortaSigma-Aldrich R0883
Sodyum klorür (NaCl) P.A. Cromoline Quí mika Fina -
Sodyum fosfat dibazi (Na2HPO4) P.A.CRQ Produtos Quimicos EireliR2715920500
İpucu 1.000 & mikro; LSarstedt7,01,186
İpucu 10 & mikro; LSarstedt7,03,010
İpucu 5.000 ve mikro; LSarstedt70,11,83,001
İpucu  200 µ LSarstedt7,03,030
Transfer pipette  (3,5 mL) Sarstedt86,11,71,001
Tüp 15 mLSarstedt6,25,54,502
Mor KristaliMerck101408
Vortex mikserPhoenixModel: AP56 Seri No: 6633
Su BanyosuHemoquimica do BrasilModel: HM1003 Seri No: 700001556

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molan, A., Nosaka, K., Hunter, M., Wang, W. Global status of Toxoplasma gondii infection: systematic review and prevalence snapshots. Trop Biomed. 36 (4), 898-925 (2019).
  2. Bigna, J. J., et al. Global, regional, and country seroprevalence of Toxoplasma gondii in pregnant women: A systematic review, modelling and meta-analysis. Sci Rep. 10 (1), 12102(2020).
  3. Dian, S., Ganiem, A. R., Ekawardhani, S. Cerebral toxoplasmosis in HIV-infected patients: A review. Pathog Glob Health. 117 (1), 14-23 (2023).
  4. Wang, Z. -D., et al. Toxoplasma gondii Infection in Immunocompromised Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. Front Microbiol. 8, 389(2017).
  5. Layton, J., et al. Clinical spectrum, radiological findings, and outcomes of severe toxoplasmosis in immunocompetent hosts: A systematic review. Pathogens. 12 (4), 543(2023).
  6. Weiss, L. M., Dubey,, Jitender, P. Toxoplasmosis: A history of clinical observations. Int J Parasitology. 39 (8), 895-901 (2009).
  7. Fabiani, S., et al. Ocular toxoplasmosis, an overview focusing on clinical aspects. Acta Trop. 225, 106180(2022).
  8. Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: Clinical features, pathology and management. Clin Exp Ophthalmol. 41 (1), 95-108 (2013).
  9. Dunay, I. R., Gajurel, K., Dhakal, R., Liesenfeld, O., Montoya, J. G. Treatment of Toxoplasmosis: Historical perspective, animal models, and current clinical practice. Clin Microbiol Rev. 31 (4), e00057-e00117 (2018).
  10. Wei, H. -X., Wei, S. -S., Lindsay, D. S., Peng, H. -J. A systematic review and meta-analysis of the efficacy of anti-Toxoplasma gondii medicines in humans. PloS One. 10 (9), e0138204(2015).
  11. Shammaa, A. M., Powell, T. G., Benmerzouga, I. Adverse outcomes associated with the treatment of Toxoplasma infections. Sci Rep. 11 (1), 1035(2021).
  12. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nat Biotechnol. 32 (1), 40-51 (2014).
  13. Paul, S. M., et al. How to improve R&D productivity: The pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 9 (3), 203-214 (2010).
  14. Andrade, E. L., et al. Non-clinical studies required for new drug development - Part I: Early in silico and in vitro studies, new target discovery and validation, proof of principles and robustness of animal studies. Braz J Med Biol Res. 49 (11), e5644(2016).
  15. Brodniewicz, T., Grynkiewicz, G. Preclinical drug development. Acta Poloniae Pharmaceutica. 67 (6), 578-585 (2010).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Roberts, C. O., Chaparas, S. D., McLaughlin, D. The use of the plaque assay in chemotherapeutic and dermal hypersensitivity studies on Toxoplasma gondii. Trans Am Microsc Soc. 95 (3), 470(1976).
  18. Mo, J., et al. Effect of the Pseudomonas metabolites HQNO on the Toxoplasma gondii RH strain in vitro and in vivo. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 21, 74-80 (2023).
  19. Barbosa, B. F., et al. Enrofloxacin is able to control Toxoplasma gondii infection in both in vitro and in vivo experimental models. Vet Parasitol. 187 (1-2), 44-52 (2012).
  20. Wall, G., Lopez-Ribot, J. L. Screening repurposing libraries for identification of drugs with novel antifungal activity. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), e00924-e01020 (2020).
  21. dos Santos, M., et al. Medicines for malaria venture pandemic box in vitro screening identifies compounds highly active against the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Trop Med Infect Dis. 8 (12), (2023).
  22. Costa, A. L. O., et al. Antiproliferative and morphological analysis triggered by drugs contained in the medicines for malaria venture COVID-box against Toxoplasma gondii tachyzoites. Microorganisms. 12 (12), 2602(2024).
  23. Ufermann, C. -M., Müller, F., Frohnecke, N., Laue, M., Seeber, F. Toxoplasma gondii plaque assays revisited: Improvements for ultrastructural and quantitative evaluation of lytic parasite growth. Exp Parasitol. 180, 19-26 (2017).
  24. Condit, R. C. Principles of virology. Fields Virology. I, 25-57 (2007).
  25. Montazeri, M., et al. In vitro and in vivo evaluation of kojic acid against Toxoplasma gondii in experimental models of acute toxoplasmosis. Exp Parasitol. 200, 7-12 (2019).
  26. Ke, O. Y., Krug, E. C., Marr, J. J., Berens, R. L. Inhibition of growth of Toxoplasma gondii by qinghaosu and derivatives. Antimicrob Agents Chemother. 34 (10), 1961-1965 (1990).
  27. Liu, X., et al. Anti-Toxoplasma gondii effects of lipopeptide derivatives of Lycosin-I. Toxins. 15 (8), 477(2023).
  28. Emi, A., et al. Development of an automated plaque-counting program for the quantification of the Chikungunya virus. Sci Rep. 15 (1), 12429(2025).
  29. Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179 (1), 81-89 (2012).
  30. Pereira Filho, A. A., et al. In vitro activity of essential oils from piper species (Piperaceae) against tachyzoites of Toxoplasma gondii. Metabolites. 13 (1), 95(2023).
  31. Martins-Duarte, E. S., et al. In vitro activity of N-phenyl-1,10-phenanthroline-2-amines against tachyzoites and bradyzoites of Toxoplasma gondii. Bioorg Medl Chem. 50, 116467(2021).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Subramanian, G., et al. Targeted phenotypic screening in Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii reveals novel modes of action of medicines for malaria venture malaria box molecules. mSphere. 3 (1), e00534(2018).
  34. Dans, M. G., et al. Screening the medicines for malaria venture pathogen box for invasion and egress inhibitors of the blood stage of Plasmodium falciparum reveals several inhibitory compounds. Int J Parasitol. 50 (3), 235-252 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Antiproliferatif TaramaH cre i ParazitTakizoit Analizila TaramasH cre MonokatmanParazit Proliferasyonun Vitro Protokol

İlgili makaleler