Method Article

Farelerin Kas ve Terminal Schwann Hücrelerinde Mitokondriyal Morfolojinin Yerinde Niceletilmesi Yöntemleri

DOI:

10.3791/69732

⸱

April 10th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Kinesiology and Sport Management, College of Education and Human Development, Texas A&M University, College Station, 2National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal boya terminali olan Schwann hücre mitokondrilerinin in vivo konfokal mikroskopi için yerel enjeksiyonları. Bu yöntem, sağlıklı veya hasta kaslı farelerin iskelet kas dokularında gösterilen kavram kanıtını kullanarak yüksek çözünürlüklü mitokondriyal görselleştirme sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal ağ morfolojisi, hücresel sağlık göstergesi olarak yaygın olarak kullanılır; Ancak, sağlam dokular içindeki mitokondriyal mimariyi nicelendirmek teknik olarak zordur. Nöromüsküler bağlantıların korunması ve yenilenmesi için hayati öneme sahip terminal Schwann hücreleri (tSC'ler), anatomik konumları ve doku bozulmalarına karşı hassasiyetleri nedeniyle yerinde analiz edilmesi özellikle zordur. Bu protokol, standart konfokal mikroskopi kullanarak tüm iskelet kaslarında ve tSC'lerde üç boyutlu mitokondriyal ağ morfolojisini etiketlemek ve niceliklendirmek için tekrarlanabilir bir yaklaşımı tanımlar. Bu yöntem, membran potansiyeline duyarlı mitokondriyal boyanın in vivo teslimatını ve ardından hızlı doku işleme ve yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülemeyi uygular. Görüntü yığınları, mitokondriyal ağ bağlantısı, alanı ve parçalanmasını nicelendirmek için analiz edilir. Protokol ilk olarak distrofik ve sağlıklı iskelet kaslarında mitokondriyal morfolojideki beklenen farklılıkları doğrulamak için doğrulanmış ve ardından S100β raporlayıcı fareler kullanılarak tanımlanan tSC'lerde mitokondriyal ağları görselleştirmek ve niceliklendirmek için uyarlanmıştır. Bu yaklaşım, mitokondriyal morfolojinin sağlam nöromüsküler dokularda transjenik mitokondriyal raporlayıcılar veya özel görüntüleme platformları gerektirmeden analiz edilmesini sağlar. Protokol, yalnızca üniversite çekirdek tesislerinde yaygın olarak bulunan ekipmanları gerektirir ve diğer ince veya yüzeysel erişilebilir dokulara uyarlanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriler, hücrenin akciğerleri olarak işlev gören ve hücresel solunum sırasında oksijen tüketerek metabolik talebe yanıt olarak adenozin trifosfat (ATP) üretimini destekleyen olağanüstü plastikorganellerdir 1. Eskiden ayrık organeller olarak düşünülse de, mitokondrilerin yüksek derecede entegreolduğu ve yerel gereksinimlere uygun olarak ağları boyunca enerji alt tabakasını paylaştığı anlaşılmaktadır. Entegrasyon, izolasyona göre belirgin bir avantaj sağlar: bağlı mitokondriler enerji açıklarını destekler ve yüksek metabolik talep sırasında oksidatif fosforilasyon için elektrokimyasal gradyanları korur. Gerçekten de, mitokondrilerin dağılımı, hacmi ve morfolojisi, çevrelerindeki enerji ihtiyaçlarına uygundur5. Sağlıkta, mitokondriyal ağların düzenli dönüşümü mitokondriyal biyogenezi, füzyon ve fisyon olayları ilemitofagegi 2,3 yoluyla sürdürülür. Mitokondriyal biyogenez, sağlıklı mitokondrileri korumak ve genişletmek için gereklidir. Fiziksel egzersiz gibi metabolik talep, peroksisom proliferatör tarafından aktive edilen ko-aktivatör 1α γ(PGC-1α)5 reseptörünün ifadesini artırır. Bu süreç, özellikle egzersiz kaynaklı AMP ile aktive edilmiş protein kinaz (AMPK), kalsiyum ve reaktif oksijentürlerinin (6,7) egzersiz kaynaklı yükselmesi yoluyla gerçekleşir. Füzyon, ağları genişletir, hayatta kalma yeteneğini artırır ve eksiklikleri tamamlar; fisyon, işlevsiz bölge 2,3,8'in tercihli hariç tutulmasıyla mitokondriyal hasarı daha da azaltır. Kaldırıldıktan sonra, dışlanan bölgeler mitofajiya geçirmelidir; böylece işlevsiz organeller ve proteinler birikmesiönlenir 6,9.

İskelet kası, vücut kütlesinin yaklaşık %40'ını oluşturur ve aerobik metabolizma ile hücresel sinyal için mitokondrilere dayanarakhomeostazı 10 sürdürür. Topluca, iskelet kası işlev bozukluğu koşullarında, mitokondriyal kalite kontrol mekanizmalarıbozulur 10. Kas disfonksiyonu araştırmaları genellikle mitokondriyal solunum, hacm, morfoloji ve reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini ölçerek mitokondriyalkaliteyi değerlendirir 3,10. Bu bağlamda, uzun süreli kas disfonksiyonu sırasında mitokondriyal solunum azalırken, ROS artarken ağlar parçalanır 3,10. Mitokondriyal morfolojideki bozulmalar büyük ölçüde mitokondriyal fisyon proteinlerinin, dinamin ile ilişkili protein 1 (DRP1) ve mitokondriyal fisyon 1'in (FIS1)2,8,11 aktivasyonundan kaynaklanır. Kas atrofisine yanıt olarak, dış mitokondriyal membranın yüzeyinde bulunan FIS1, DRP1'i çoklu DRP1 dimerleriyle oligomerize ederek mitokondri etrafında bir filament oluşturur; bu filament mitokondri bölümü "sıkıştırılır" ve parçalanmayateşvik edilir 3,11. Birlikte, mitokondriyal fisyonun aşırı aktivitesi, yeni oluşan mitokondrilerin füzyonundaki azalmalar ve işlevsiz mitofajiya, işlevsiz veya hasta kaslarda tanımlanan işlevsiz mitokondriyal ağların parçalanmış görünümündensorumludur 2,12.

Nöromüsküler birleşim (NMJ), kas uyarılmasının bulunduğu yerdir. Somada başlatılan aksiyon potansiyelleri, miyelinleyici Schwann hücreleri (SC) tarafından örtülen aksonlar boyunca yayılır ve terminal Schwann hücreleri (tSC) tarafından kapsüllenen NMJ'lerde sonlanır. NMJ'ler yaralanmadan sonra yenilenebilir. Ancak, yaralanma yeri ile NMJ arasındaki mesafe13,14 arttıkça rejenerasyon olasılığı ve hızı azalır. Sinir yaralanmasının ardından keseksiyon, ezme veya esneme ile gerçekleştiğinde, SC'ler dedifferentasyonasyonlu progenitor benzeri bir duruma geçer15,16. Demyelinizlenmiş SC'ler çoğalır ve makrofajlarla birlikte yerel ortamı yeniden şekillendirmek için yara yeri ile proksimal akson kütüğü arasındaki enkazı Walleriandejenerasyonu yoluyla temizleyerek yeniden şekillendirir 17,18. Göç eden SC'ler, başarılı sinir rejenerasyonu için ortamı yeniden şekillendiren bir inflamatuar yanıtsinyal 18. Sinir yenilenmesi, Bunger bantlarını oluşturan öncül benzeri SC'ler tarafından oluşturulan sinir kılıfında gerçekleşir ve bu bantlar aksonlarınyeniden büyüttüğü 19. Akson kütüğü daha sonra filopodiyani genişleterek reinnervasyonubaşlatır 14. Reinnervasyondan sonra, tSC'ler NMJ20'de yeniden yatırım yaparsa presinaps tamamen yenilenebilir.

Mitokondriyal morfoloji, hücre tipleri arasında belirgin şekilde değişir ve doku fonksiyonunauygundur 21. Karaciğer dokularından alınan raporlar, mitokondrilerin daha kompakt ve küresel olduğunu, beyindeki beyaz madde üyelerinin ise daha uzun ve tübülerolduğunu gösteriyor. Yaşlanma ve oksidatif stres gibi durumlarda, bu dokulardaki mitokondriler donut benzeri bir fenotip sergiler. Ancak osteoblastlarda, mitokondriyal donut oluşumu ve parçalanma, mitokondrilerin ve mitokondriyal kaynaklı veziküllerin artan salgılanması ile ve osteoblastolgunlaşmasıyla ilişkilendirilmiştir 23. İskelet kası mitokondriyal ağları birçok türde kapsamlı şekilde incelenmiş olsa da, periferik sinir sisteminin tSC'lerinden mitokondriyal ağların görüntülemesinde sınırlamalar yaşanmaktadır. Bunlar, hücre ultrayapısı izolasyondan sonra önemli ölçüde değiştiği için doğal ortamlarında yakalamak zordur ve bu dokuları, iskelet kası yüklemeden in vivo boyayla hedef almak zordur.

Canlı sistemlerde mitokondriyal morfolojiyi yakalamak için kullanılan görüntüleme teknikleri, ışık veya elektronmikroskopisi olarak kategorize edilebilir 5. Geleneksel ışık yakalama mikroskopisiyle boyalar canlı hücreleri etiketleyebilir, sabit hücreler immünoetiketlenebilir ve mitokondriler genetik olarak 5,24 olarak etiketlenebilir. Canlı hücre görüntüleme genellikle floresans analizinden önce hücrelerin 20–60 dakika boyunca kuluçka yapılmasını gerektirir. Boyalar, membran potansiyeli yoluyla mitokondrilere yönlendirilir ve bu nedenle değişen membranpotansiyeli koşullarında değiştirilebilirler 5. İskelet kasındaki tSC'lerin mitokondriyal morfolojisini boya yükü yoluyla yakalamak teorik olarak mümkündür; ancak tüm dokuların görüntülenmesi ve detaylı etiketleme teknikleri gerekir. Özellikle, iskelet kası etiketlemesinden kaynaklanan müdahale olmadan mitokondrileri sağlam yapılar içinde yakalar. Bu sınırlamaları aşmak için, mitokondriyal floresan boyama sağlıklı ve distrofik farelerde yaşayan iskelet kasını etiketlemek için kullanıldı, ardından in vivo ve in situ görüntüleme için tSC mitokondrileri etiketlendi. Tibialis ön (TA) kas, yüzeysel anatomik konumu, iyi karakterize edilen enjeksiyon hacmi ve miyofasiyal dağılımı(25,26,27) ve eşzamanlı fonksiyonel ölçümler için uygunluğu nedeniyle iskelet kası görüntülemesini optimize etmek için seçilmiştir. Gluteus maximus (GM) kası, yerleşik enjeksiyonprosedürü 28,29, arka plan floresansını en az indiren ince yapısı ve GM ile gluteus medius arasındaki nöromüsküler birleşimlerin yüzeysel ventral konumu nedeniyle tSC görüntüleme için seçildi; bu da iskelet kas liflerinden önce tSC'lerin tercihli etiketlenmesini mümkün kılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Altı aylık (n=3) yetişkin erkek DBA/2J [Vahşi tip (WT)] (RRID: IMSR_JAX:000671) ve D2.B10-DMDD2.mdx/J [D2.mdx (mdx)] (RRID: IMSR_JAX:013141), üç ila beş aylık (n=8) yetişkin erkek ve dişi B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J (S100B) (RRID: IMSR_JAX:005621) [DBA'dan fark olmadan WT ile birleştirilmiş] araştırmacılar tarafından bakımı yapılan bir fare kolonisinden kullanıldı. TA ve GM enjeksiyonları, doku işleme ve görüntüleme için genel deneysel iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir. Ek bir D2. mdx faresi, mdx'te tSC görüntüleme için araştırmacı tarafından bağışlanmıştır (n=1). Tüm hayvan prosedürleri, Texas A&M Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış (AUP 2022-0215) ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Araştırma Konseyi Rehberi'ne (8. baskı)30 uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Ötenazi, anestezik aşırı doz izofluran altında servikal dislokasyon ile gerçekleştirildi.

1. 2 μM'lik floresan mitokondriyal leke çalışma çözeltisi hazırlamak

  1. Mitokondriyal boyayı (50 μg) üreticinin talimatlarına göre 322 μL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde askıya alın ve 200 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlanır.
  2. 30 mL 2 μM çalışma çözeltisi hazırlamak için, 300 μL 200 μM stok çözeltisi 29,7 mL steril salin içine aktarılır. İyice karıştırın.
  3. 2 μM'lik çalışan çözeltinin 250 μL'sini mikrosantrifüj tüplerine Aliquot yapar ve -80 °C'de depolanır ve kullanıma kadar saklanır.
    NOT: -80 °C'de 3 yıl depolama süresinin ardından tespit edilebilir sinyal bozulması gözlemlenmedi.

2. Boya ve hayvan hazırlığı

  1. Deneyden 15 dakika önce bir donmuş aliquot erit. Çözeltiyi 30 G, 1 cc insülin şırıngasına çekin.
  2. Hayvanı izofluran ile anestezi edin. Göz merhemi uygulayın, enjeksiyon bölgesini tıraş edin ve hayvan ile ısı kaynağı arasında yerleştirilmiş bir sıcaklık probu bulunan ısıtıcı lamba kullanarak vücut sıcaklığını koruyun.
  3. Tıraş edilmiş enjeksiyon bölgesini %70 izopropil alkolle temizleyin.

3. Tibialis anterior (TA) kas mitokondriyal boya uygulaması ve fonksiyonu

  1. TA boya uygulaması
    1. Anestezi edilmiş WT ve D2.mdx farelerin sağ TA kasına 50 μL 2 μM mitokondriyal boya enjekte edin.
    2. İğneyi diz tarafına doğru distal tendona yerleştirin ve iğneyi enjeksiyon yolu boyunca çekerken pistonu basın.
    3. Boyayı diseksiyondan önce 1 saat in vivo kuluçka yapın.
  2. TA kas fonksiyonu ölçümleri
    1. 45 dakika boya kuluçkasından sonra, fareyi izofluran ile anestezi edin (%2–3 indüksiyon, %1,5–%2 oksijen bakımı).
    2. Sol TA kasını cerrahi olarak açığa çıkarır ve çevredeki dokuları korur. Distal tendonu kas test sisteminin yük kirişine bağlayın.
    3. Açıkta kalan kası laboratuvar mendiliyle sarıp, %0,9 steril tuzlu suyla 3 mL min⁻1 sıcaklığında 40 °C'ye ısıtılmış şekilde sulanın. Isı lambası kullanarak kas sıcaklığını 32 °C'de tutun.
    4. Platin/iridyum tel elektrotları kas karnına doğrudan uyarma için yerleştirin.
    5. Yük ışınını bir mikrometreye bağlayın ve optimal uzunluğu (L0) 1 Hz'de seğirme kısıtmalarıyla (Tw) ayarlayın. L0'ı dijital kaliper ile kaydedin.
    6. 140 Hz'de maksimum tetanik kasılmaları (P0) üç kez indükle ve kasılmalar arasında 60 saniyelik dinlenme sağlanır. En yüksek kuvvet değerini (g) kaydedin. Analiz yazılımıyla kas fonksiyon sistemi kullanarak veri edinin.
  3. TA doku işleme
    1. Kuluçkadan sonra, ötenazi öncesi TA kasını izole edin ve disseksiye edin.
    2. İzole kas lifi demetlerini %4 paraformaldehit içine oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yerleştirin ve lifleri stereomikroskop altında nazikçe okşayarak kullanın.
      DIKKAT: Paraformaldehit zehirlidir ve uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) takılırken kimyasal bir buhar kapüşonunda ele alınmalıdır.
    3. Çekirdekleri etiketlemek için hücre permisyona sahip nükleik asit boyasını 5–10 μg/mL konsantrasyonuna ekleyin.
    4. Fazla boya gidermek için örnekleri fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) üç kez 5 dakika boyunca yıkarın.
    5. Örnekleri sıralı olarak 50%, %75 ve %100 etanol ile 5 dakika boyunca kurutun.
    6. Örnekleri doku temizleme çözeltileri I ve II'de sıralı olarak oda sıcaklığında, oda sıcaklığında, dokuyu tamamen batıracak yeterli hacim kullanarak inküçke.
    7. Temizlenmiş TA demetlerini bir kapak üzerine yerleştirin ve cam blokla (2,5 cm × 2 cm × 1 cm; kütlesi 7,8 g) nazikçe düzleştirin26.

4. TA kas örneklerinin görüntülenmesi

  1. Kas örneklerini konfokal mikroskopla görüntüleyerek yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) optik kesitler elde edin.
  2. 63x büyütme objektif lens (N.A. 1.40) kullanılarak kas için yaklaşık 100 μm derinlikte Z-yığını görüntüleri alın.
  3. Görüntüleme sisteminin 646 nm uyarılma dalga boylu konfokal yazılımını en az arka planla en yüksek netliği sağlamak için kullanın.
  4. 1 μm adım boyutlarıyla "Sistem Optimize Edilmiş" parametreleri kullanarak dekonvolüsyon modu kullanarak görüntüler elde edin.
    NOT: Susuz kalma ve foto ağartmayı önlemek için, dokuları doku temizleme çözümü II'ye aktarın ve onları bir örtü parçasına yerleştirin. Görüntülemeden önce dokuya iki damla temizleyici çözelti 2 kontur.

5. GM kas tSC boya yüklemesi ve görüntüleme

  1. TSC'lerin spesifik floresan tanımlaması için S100β fareleri kullanın.
  2. GM kasının üzerinde küçük bir deri kesisi yapın. Yara kapanmasından önce GM altına 2 μM uzak kırmızı floresan mitokondriyal leke 75 μL enjekte edin.
  3. Yarayı kapatın ve boya 45 dakika kuluçka geçirerek alttaki kas liflerinin önemli ölçüde etiketlenmesi olmadan tSC'leri seçici olarak etiketleyin.
  4. GM kaslarını disseksiye yapın ve hemen soğutulmuş %0,9 steril salin içine yerleştirin. Fazla yağ ve bağ dokusunu hızla kesin.
  5. Disseksiyon edilen GM'leri görüntüleme için bir kapak sayfasına aktarın.
  6. Sadece D2.mdx fareleri kullanıyorsanız, mikrodiseksiyon banyosuna 1:500 seyreltilmiş floresan asetilkolin reseptör (AChR) boyası ekleyin. Dokuyu 30 dakika kuluçka altına geçirerek nöromüsküler birleşimin (NMJ) postsinaptik bileşenlerini görselleştirin.
  7. Bu çift etiketleme yaklaşımını kullanarak postsinaptik mitokondrileri tSC-spesifik mitokondrilerden ayırt edin.
    DIKKAT: Diseksiyon sonrası morfolojik değişiklikleri en aza indirmek için görüntüleme için bir kapak parçasına yerleştirmeden önce en fazla 10 dakika ile GM'nin diseksiyon ve temizlenmesini sınırlamak. Bu zaman sınırı, diseksiyon sonrası morfolojik değişiklikleri ve mitokondriyal bozulmayı en aza indirmek için kritiktir.
  8. Yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) optik kesitler elde etmek için konfokal mikroskopi yapın.
  9. 20x büyütme objektif lens (N.A. 0.75) kullanarak tSC'ler için yaklaşık 16 μm derinlikte Z-yığını görüntüleri alın. 63x büyütme objektif lens kullanarak bireysel tSC'lerin yüksek çözünürlüklü temsilci görüntülerini elde edin.
  10. Görüntüleme oturumu sırasında doku dehidratasyonunu ve fotobeyazmayı en aza indirmek için montaj prosedürlerini uygulayın.
    DIKKAT: Tuzlu sönümlü dokuları bir örtü kıvırına aktarın, böylece ventral taraf ters mikroskopi için aşağıya bakmalıdır.
  11. GM'nin dorsal yüzeyine 2 μL genel montaj ortamı uygulayın.
  12. Dokuyu kalibre edilmiş bir cam bloğla (2,5 cm × 2 cm × 1 cm; kütlesi 7,8 g) kullanarak nazikçe düzleştirerek eşit bir görüntüleme düzlemi sağlanır.

6. Odaklı iyon ışını mikroskopisi

  1. Önceden belirlenmiş protokollere göre odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskopisi (FIB-SEM)gerçekleştirin. 26.
    1. Konfokal görüntüleme sırasında tespit edilen yeni morfolojik özellikleri doğrulamak ve görselleştirmek için özellikle FIB-SEM uygulanır.

7. Görüntü analizi

  1. TA kas örnekleri
    1. TA taramalarının konfokal optik kesitlerinin (yaklaşık 75–112 μm kalınlığında) nicel analizi yaparak yapay zeka odaklı görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.
      NOT: Algoritma uyumunu artırmak için otomatik segmentasyondan önce birden fazla denetimli eğitim oturumu gerçekleştirin.
    2. Yazılımın beyaz mitokondriyal boyayı temsil eden pikselli bilgiyi koruyup siyah arka planı hariç tutmasını öğretmek için tek optik bölümleri (Z-dilimleri) içe aktarın.
    3. Yüksek kaliteli analiz ve doğruluk sağlamak için araştırmacı incelemesi için görüntü maskeleri geliştirin.
    4. Algoritma optimizasyonundan sonra 3D görüntü yığınlarını tek optik bölümlere ayırın.
    5. Analiz için her 3D görüntüden her beşte bir Z-dilimini seçin; her veri noktası, örnek başına bu bireysel bölümlerin ortalamasını temsil eder.
    6. Mitokondriyal morfolojiyi nicelikten belirleyerek mekânsal dağılım ve ağ bağlantı metriklerini türetin.
    7. Tüm örneklerde yoğunluk eşiklerini, kenar algılama ayarlarını ve voxel boyutu kalibrasyonunu standartlaştırarak deneysel değişkenliği en aza indirin.
  2. GM örneklerindeki tSC'ler
    1. 1 μm optik bölümleri yaklaşık 6–25 μm kalınlığında Z-yığınlarına birleştirin ve görüntüleri 2D görüntü analiz yazılımı kullanarak ayrı renkli kanallara ayırın.
    2. Ölçek çubukları kullanarak yazılımı kalibre edin ve tSC mitokondri görselleştirmesini minimum arka plan parazitiyle optimize etmek için eşik uygula.
    3. İkilileştirme yapın ve arka plan gürültüsünü kaldırarak alan ve parçacık sayılarının ölçülmesi için tSC mitokondrilerini veya tSC'leri izole edin.
    4. Tutarlı işleme sağlamak için ikili görüntüleri kaydedin ve biyolojik kopyalar arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için tüm görüntüleme deneylerini aynı koşullarda yapın.

8. İmmünohistokimya

  1. Kesitsel alan (CSA) değerlendirmek için sol TA kas örneklerini optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömül.
    1. 10 μm kalınlıkta kesim örnekleri -17°C'ye ayarlanmış bir kriostat kullanılarak mikroskop slaytlarına toplanın.
    2. Tavşan anti-laminin birincil antikoru (1:400) ve keçi anti-tavşan rodamin ikincil antikoru (1:400) kullanılarak miyofiber sınırlarını belirlemek için laminin için kas kesitlerini boyamak.
    3. Kaydırmaları görüntülemeden önce uygun bir montaj ortamı kullanarak monte edin.
  2. Konfokal mikroskop kullanılarak 20x (N.A. 0.75) amaç amacıyla her örnek için rastgele 2–3 ilgi alanı (580 x 580 μm) seçilerek görüntü slaytları yapılır.
  3. Kas başına bölgeler arasında ortalama değerler ve TA kas kesitinde yaklaşık 400 miyolif analiz ediliyor.
  4. Miyolifleri maskeleyerek CSA (μm 2) belirlemek için yarı otomatik kas segmentasyon yazılımı kullanın.

9. İstatistiksel analiz

  1. Özet verileri, ortalama ± ortalama standart hata (S.E.M.) olarak bildirin.
  2. Grup ortalama farkları arasındaki anlamlılığı belirlemek için parametrik, eşleşmemiş öğrenci t-testlerini kullanarak özel bir istatistiksel yazılım kullanarak istatistiksel analiz yapın.
  3. TA kaslarından alınan CSA ve kas kuvveti üzerinde basit doğrusal regresyonlar yaparak bunları DMD patolojisinin belirteçleri olarak kullanarak TA kaslarından mitokondriyal morfolojiyi ve GM tSC'lerini karşılaştırın.
  4. DMD patolojisi ile mitokondriyal patoloji arasındaki korelasyonu belirlemek için Pearson r korelasyon katsayılarını değerlendirin. İstatistiksel anlamlılığı P ≤ 0.05 olarak tanımlayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal ağlar bağlantıda beklenen azalmalar gösterdi
İki grupta, WT ve mdx, TA kas konfokal taramalarının temsilci 3D floresan görüntüleri sunulmaktadır (Şekil 2). WT grubuyla karşılaştırıldığında, mdx farelerinde mitokondriyal bağlantı WT'ye kıyasla daha düşük görünür (Şekil 2A–D). Mdx farelerde [<100μm 2] daha fazla sayıda küçük mitokondriyal parça gözlemlendi (WT, 17,3 ± %...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondrilerin hücresel yapılar içindeki konumu ve morfolojisi, mitokondriyal sağlık ve metabolik talep ileilişkilidir 21. Mitokondriyal sağlığın klinik önemi ve farklı hücre tiplerinin farklı solunum kinetikleri ve morfolojileriyle birleşince, iskelet kaslarında mitokondriyal morfolojilerin değerlendirilmesi için kolayca uygulanan, konfokal mikroskopi tabanlı bir yöntem geliştirildi; bu yöntem in vivo içinde korunması zor bir doku tipinde morfolojiye gö...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların rekabet eden çıkarları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, tSC mitokondrilerini değerlendirmek için kullanılan D2.mdx farelerini cömertçe sağladıkları için Dr. Mariappan Muthuchamy, Mendell Rimer ve Peter Nghiem'e teşekkür ediyor. Bu çalışma, Sydney ve J.L. Huffines Spor Hekimliği ve İnsan Performansı Öğrenci Araştırma Bursu ile Texas A&M Üniversitesi Eğitim ve İnsan Gelişimi Fakültesi'nden alınan fonlarla desteklendi. A.B.M. ayrıca NIH LRP (NIAMS, 2L40AR077899-02A3) tarafından da desteklendi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-in-1 Whole Animal SystemAurora Scientific, Ontario, Canada1300AAnalysis yazılımlı kas fonksiyon sistemi
AIVIA Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA15AI sürücülü görüntü analiz yazılımı
anti-laminin MilliporeSigmaL9393-.2mLMiyofiber sınır etiketi
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J Fare SuşuJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:005621S100β
Cryostar NX50 CryostatEpredia, Kalamazoo, MI, USAhttps://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50Cryostat
D2.B10-DMDD2.mdx/J Fare SuşuJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:13141D2.mdx
DBA/2J Fare SuşuJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:00671WT
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific; Hampton, NJ, USABP231-100Mitokondriyel leke restorasyon reaktifi
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Hücre geçirgenliği nükleik asit leke
ImageJ/Fiji National Institutes of Health, Bethesda, MD, USASCR_0022852D analiz yazılımı
Invitrogen ProLong Gold antifade reaktifi ve DAPI Fisher Scientific, Hampton, NJ, USAP36941Montaj ortamı
KimWipeKimberly-Clark, Irving, TX, USA06-666ALaboratuvar mendil
Leica LAS_X yazılımı Leica Biosystems, Wetzlar, GermanySCR_013673Konfokal yazılım
MitoView Fix 640Biotium70075-50ugUzak kırmızı floresan mitokondriyal leke
NIS-Elements Advanced Research yazılımı Nikon, Melville, NY, USASCR_014329Kesit alanı analiz yazılımı
Permount Montaj Ortamı Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA#SP15-100Genel montaj ortamı
Prism 9 yazılımı GraphPad Software, La Jolla, CA, USARRID: SCR_002798İstatistiksel analiz yazılımı
Rhodamine (TRITC)Fisher Scientific; Hampton, NJ, USAAP132RMIİkincil antikor
Stellaris 5 Beyaz Işık Konfokal Mikroskobu ve ilgili dekonvolüsyon yazılımıLeica Microsystems, Wetzlar, Germany158301313:158201310:158004752:
158301312:158301314:158401100:
158209011:158301130:158204510:
158301120:158401140:158204511:
15500332:15506428:15506517:155
13859:15521522:15525226:155252
32:15525314:15555009:15555017:
15555046:27100022:155933660:
155933666:155933668:158000640
:158002407:158003150:158004141
:158004201:158004421:158004423
:158200681:158202140:158203114:
158203200:158203220:158204201:
158204510:158204709:158301200:
9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP
_CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_
LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C		Konfokal mikroskop
SZ61Olympus, Breinigsville, PA, USAsz61Stereo mikroskop
Tissue-Plus O.C.T. Compound Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA23-730-571Optimal kesme sıcaklığı bileşiği
Visikol ISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH1-30Doku temizleme çözeltisi 1
Visikol IISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH2-30Dokular temizleme çözeltisi 2
α-bungarotoxin 552Biotrend, Koln, Germany00014Asetilkolin reseptör boyası

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Memme, J. M., Slavin, M., Moradi, N., Hood, D. A. Mitochondrial bioenergetics and turnover during chronic muscle disuse. Int J Mol Sci. 22 (10), 5179(2021).
  2. Iqbal, S., Hood, D. A. The role of mitochondrial fusion and fission in skeletal muscle function and dysfunction. Front Biosci. 20 (1), 157-172 (2015).
  3. Hyatt, H. W., Powers, S. K. Mitochondrial dysfunction is a common denominator linking skeletal muscle wasting due to disease, aging, and prolonged inactivity. Antioxidants. 10 (4), 588(2021).
  4. Katti, P., et al. Mitochondrial network configuration influences sarcomere and myosin filament structure in striated muscles. Nat Commun. 13, 6058(2022).
  5. Glancy, B. Visualizing mitochondrial form and function within the cell. Trends Mol Med. 26 (1), 58-70 (2020).
  6. Yan, Z., Okutsu, M., Akhtar, Y. N., Lira, V. A. Regulation of exercise-induced fiber type transformation, mitochondrial biogenesis, and angiogenesis in skeletal muscle. J Appl Physiol. 110 (1), 264-274 (2011).
  7. Powers, S. K., Nelson, W. B., Hudson, M. B. Exercise-induced oxidative stress in humans: Cause and consequences. Free Radic Biol Med. 51 (5), 942-950 (2011).
  8. Hyatt, H., Deminice, R., Yoshihara, T., Powers, S. K. Mitochondrial dysfunction induces muscle atrophy during prolonged inactivity: A review of the causes and effects. Arch Biochem Biophys. 662, 49-60 (2019).
  9. Drake, J. C., Yan, Z. Mitophagy in maintaining skeletal muscle mitochondrial proteostasis and metabolic health with ageing. J Physiol. 595 (20), 6391-6399 (2017).
  10. Chen, X., et al. Mitochondrial dysfunction: Roles in skeletal muscle atrophy. J Transl Med. 21 (1), 503(2023).
  11. Zhang, Z., Sliter, D. A., Bleck, C. K. E., Ding, S. Fis1 deficiencies differentially affect mitochondrial quality in skeletal muscle. Mitochondrion. 49, 217-226 (2019).
  12. Silva, K. A. S., et al. Angiotensin II suppresses autophagy and disrupts ultrastructural morphology and function of mitochondria in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 126 (6), 1550-1562 (2019).
  13. Cattin, A. L., et al. Macrophage-induced blood vessels guide Schwann cell-mediated regeneration of peripheral nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  14. Caillaud, M., Richard, L., Vallat, J. M., Desmoulière, A., Billet, F. Peripheral nerve regeneration and intraneural revascularization. Neural Regen Res. 14 (1), 24-33 (2019).
  15. Girouard, M. P., Bueno, M., Julian, V., Drake, S., Byrne, A. B., Fournier, A. E. The molecular interplay between axon degeneration and regeneration. Dev Neurobiol. 78 (10), 978-990 (2018).
  16. Belanger, K., Dinis, T. M., Taourirt, S., Vidal, G., Kaplan, D. L., Egles, C. Recent strategies in tissue engineering for guided peripheral nerve regeneration. Macromol Biosci. 16 (4), 472-481 (2016).
  17. Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos Trans R Soc Lond. 140, 423-429 (1850).
  18. Napoli, I., et al. A central role for the ERK-signaling pathway in controlling Schwann cell plasticity and peripheral nerve regeneration in vivo. Neuron. 73 (4), 729-742 (2012).
  19. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  20. Hastings, R. L., Mikesh, M., Lee, Y. I., Thompson, W. J. Morphological remodeling during recovery of the neuromuscular junction from terminal Schwann cell ablation in adult mice. Sci Rep. 10 (1), 11132(2020).
  21. Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Front Physiol. 11, 541040(2020).
  22. Stahon, K. E., Bastian, C., Griffith, S., Kidd, G. J., Brunet, S., Baltan, S. Age-related changes in axonal and mitochondrial ultrastructure and function in white matter. J Neurosci. 36 (39), 9990-10001 (2016).
  23. Suh, J., et al. Mitochondrial fragmentation and donut formation enhance mitochondrial secretion to promote osteogenesis. Cell Metab. 35 (2), 345-360.e7 (2023).
  24. Laker, R. C., et al. A novel MitoTimer reporter gene for mitochondrial content, structure, stress, and damage in vivo. J Biol Chem. 289 (17), 12005-12015 (2014).
  25. Fernando, C. A., Pangan, A. M., Cornelison, D., Segal, S. S. Recovery of blood flow regulation in microvascular resistance networks during regeneration of mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 597 (5), 1401-1417 (2019).
  26. Hammers, D. W., et al. The D2.mdx mouse as a preclinical model of the skeletal muscle pathology associated with Duchenne muscular dystrophy. Sci Rep. 10 (1), 14070(2020).
  27. Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells. Front Cell Dev Biol. 9, 757305(2021).
  28. Ramos, S. V., Hughes, M. C., Delfinis, L. J., Bellissimo, C. A., Perry, C. G. R. Mitochondrial bioenergetic dysfunction in the D2.mdx model of Duchenne muscular dystrophy is associated with microtubule disorganization in skeletal muscle. PLoS One. 15 (10), e0237138(2020).
  29. Rosen, H. G., et al. Inhibition of mitochondrial fission protein Drp1 ameliorates myopathy in the D2-mdx model of Duchenne muscular dystrophy. bioRxiv. , (2024).
  30. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  31. Ino, D., Iino, M. Schwann cell mitochondria as key regulators in the development and maintenance of peripheral nerve axons. Cell Mol Life Sci. 74 (5), 827-835 (2017).
  32. Pareyson, D., Piscosquito, G., Moroni, I., Salsano, E., Zeviani, M. Peripheral neuropathy in mitochondrial disorders. Lancet Neurol. 12 (10), 1011-1024 (2013).
  33. Schröder, J. M., Sommer, C. Mitochondrial abnormalities in human sural nerves: Fine structural evaluation of cases with mitochondrial myopathy, hereditary and non-hereditary neuropathies, and review of the literature. Acta Neuropathol. 82 (6), 471-482 (1991).
  34. Schröder, J. M. Neuropathy associated with mitochondrial disorders. Brain Pathol. 3 (2), 177-190 (1993).
  35. Santosa, K. B., Keane, A. M., Jablonka-Shariff, A., Vannucci, B., Snyder-Warwick, A. K. Clinical relevance of terminal Schwann cells: An overlooked component of the neuromuscular junction. J Neurosci Res. 96 (7), 1125-1135 (2018).
  36. Morton, A. B., et al. Inducible deletion of endothelial cell Efnb2 delays capillary regeneration and attenuates myofibre reinnervation following myotoxin injury in mice. J Physiol. 602 (19), 4907-4927 (2024).
  37. Morton, A. B., Norton, C. E., Jacobsen, N. L., Fernando, C. A., Cornelison, D. D. W., Segal, S. S. Barium chloride injures myofibers through calcium-induced proteolysis with fragmentation of motor nerves and microvessels. Skelet Muscle. 9 (1), 27(2019).
  38. Sukhorukov, V. M., Dikov, D., Reichert, A. S., Meyer-Hermann, M. Emergence of the mitochondrial reticulum from fission and fusion dynamics. PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002745(2012).
  39. Ferramosca, A., Zara, V. Mitochondrial carriers and substrate transport network: A lesson from Saccharomyces cerevisiae. Int J Mol Sci. 22 (16), (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial MorphologyIn Situ QuantificationSkeletal MuscleTerminal Schwann CellsConfocal MicroscopyMitochondrial NetworkMembrane Potential DyeMitochondrial FragmentationNeuromuscular JunctionS100 Reporter Mice

Related Articles