Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Wen Yang Ding Chuan Tang, M2 makrofaj kaynaklı fibroblast aktivasyonunu engelleyerek astımlı hava yolu yeniden modellemesini azaltır

195 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69737

⸱

24 Mart 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 2Department of Respiratory, The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, 3Department of Clinical Pharmacy, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 4Department of Central Laboratory, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 5Department of Stomatology, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 6Department of Magnetic Resonance, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University

Bu makalede

Özet

Bu makale, Wenyang Dingchuan Decoction tarafından M2 makrofaj polarizasyonunun inhibisyonu yoluyla pulmoner fibroblast fibrozisinin düzenlenmesi üzerine bir çalışmayı anlatmaktadır.

Özet

Wen Yang Ding Chuan Tang'ın (WYDCT) fibroblast fonksiyonu, astımda hava yolu yeniden şekillendirilmesi ve altta yatan mekanizma üzerindeki etkilerini incelemek. IL-4, RAW264.7 makrofajlarının M2 polarizasyonunu indüklemek için kullanıldı ve polarize makrofajlar daha sonra WYDCT ile tedavi edilip fare akciğer fibroblastları üzerindeki etkisi araştırıldı. Polarize RAW264.7 hücreleri farklı tedavilere tabi tutuldu ve ardından fibroblastlarla birlikte kültürlendi. M1 ve M2 belirteç seviyeleri, hücre morfolojisi ve IL-6 konsantrasyonu değerlendirildi. STAT3 protein seviyesi analiz edildi. Fibroblast canlılığı, çoğalması, koloni oluşumu, PCNA ekspresyonu ve fibronektin, COL1A1 ve α-SMA ekspresyonu, gerçek zamanlı PCR, Western blot, CCK-8, Edu, immünfloresans ve koloni oluşumu testleri dahil olmak üzere çeşitli testlerle analiz edildi. WYDCT, RAW264.7 hücrelerinde IL-4 kaynaklı morfolojik değişiklikleri tersine çevirdi, M2 belirteçleri (Arg-1, CD206) ve IL-6 seviyelerini azalttı ve RAW264.7 hücrelerinde STAT3 ekspresyonunu azalttı; IL-6 takviyesi ise WYDCT'nin M2 belirteçleri üzerindeki etkisini yeniden sağladı. Ayrıca, WYDCT fibroblastların canlılığını ve çoğalmasını inhibe etti, PCNA ekspresyonunu azalttı ve fibroz belirteçlerini (fibronektin, COL1A1, α-SMA) azalttı; bu da WYDCT'nin makrofaj M2 polarizasyonunu baskılayarak akciğer fibroblastlarının canlılığını, çoğalmasını ve fibrozunu inhibe ettiğini ve IL-6/STAT3 sinyal yolunun önemli rol oynayabileceğini göstermektedir.

Giriş

Astım, bronşiyal astım olarak da bilinir, solunum yollarının kalıcı bir inflamatuardurumudur 1. Sıklıkla alerjen maruziyeti, soğuk sıcaklıklar ve hem fiziksel hem de kimyasal tahriş edicilerle ilişkilendirilen bu durum, inflamatuar hücrelerin infiltrasyonu, geri dönüş halinde hava yollarının daralması, mukus salgılanması ve bronkospazmile karakterize edilir 2. Şu anda dünya genelinde en az 300 milyon astım hastası var ve bu sıkıntı heryıl 3. yılda artmaktadır. 2015 yılında 400.000 kişi astımdan hayatını kaybetti ve bu da ciddi bir küresel sağlıksorunu haline geldi 4,5. Çin de aynı sorunla karşı karşıya; yapılan çalışmalar astım yaygınlık oranının %4,2 olduğunu göstermekte; bu oran yaklaşık 45,7 milyon yetişkin hastaya ulaşıyor ve gelişmiş ülkelere kıyasla daha düşük kontroloranları bulunuyor; 6,7. Bu hastalıktan etkilenen bireylerin refahı büyük ölçüde tehlikeye girer ve bu da aileler üzerinde ciddi bir maddi yük yaratır.

Hava yolu remodelasyonu, astım tedavisinde kontrol edilmesi zor olan önemli bir faktörolarak kabul edilir 8. Bu nedenle, kronik kalıcı astımın tedavisi kilit bir nokta haline gelir. Klinik uygulamada genellikle soluma kortikosteroidlerin bronkodilatörlerle birlikte kullanılması ve hastalarda semptomları etkili bir şekildehafifletebileceği 9. Ancak, bu tedavilerin bazı yan etkileri vardır ve bazı hastalar için semptomları iyileştirmede daha az etkili olabilir. Ayrıca, ilaçların bırakılmasından sonra astım tekrar etme eğilimindedir. Araştırmalar, akciğer fibroblastlarının aktivasyonunun astım10 ilerlemesi sırasında hava yolu yeniden şekillendirilmesiyle ilişkili olduğunu göstermiştir. Aktivasyon sırasında akciğer fibroblastları fenotipik dönüşüm geçirir ve hava yolu yeniden modellemesinin temel patolojik özelliği olan ekstrasellüler matriks (ECM) birikmesini sağlamak için anahtar proteinleri salgılar. Özellikle, fibronektin, ECM montajı için erken bir iskelet görevi görür ve diğer matris bileşenlerinin toplanmasını ve yapışmasını destekler; COL1A1 (tip I kolajen α1 zinciri) ECM'nin ana yapısal proteinidir ve aşırı birikimi hava yolu duvarının kalınlaşmasına ve sertleşmesine yol açar; α-SMA (α-düz kas aktini), fibroblastların güçlü kasılma ve sekretör yeteneklere sahip miyofibroblastlara dönüşmesini işaret eder; bu da ECM birikimini ve hava yolu fibrozunu daha da hızlandırır.

IL-6, STAT3 yolu aktivasyonu11 için en önemli sitoplazmik sinyal faktörüdür. Yükselmiş IL-6, STAT3 yolunu aktive eder. Astımlı fare akciğer dokusunda STAT3 ve fosforile mRNA ile protein ekspresyonu önemli ölçüde artar. IL-6/STAT3 sinyal yolu, astım tedavisi için hedeflerden biridir. Çalışmalar, IL-6/STAT3 sinyal yolunun aktivasyonunun astımda hava yolu iltihabı ile ilişkili olduğunu ve bu yolun inhibe edilmesinin hava yolu iltihabınıazaltabileceğini doğrulamıştır 12,13. IL-6/STAT3 ayrıca makrofajların M2 polarizasyonu ile ilişkilidir. Yabancı çalışmalar, IL-6 ekspresyonunun aşağı akım STAT3 aktivasyonunu önemli ölçüde azalttığını ve bunun tümör yüzey sayılarının azalması, proliferasyonun azalması ve karaciğerdeki M2 makrofaj sayısının azalmasıyla ilişkiliolduğunu göstermiştir 14.

Makrofajlar olarak bilinen bağışıklık hücreleri, klasik aktivasyon (M1) ve alternatif aktivasyon (M2) olmak üzere farklı fenotiplere ayrılabilir; her biri benzersiz rolleri yerine getirir15. M1 makrofajları inflamatuar reaksiyonlar ve doku hasarı tetikleyebilirken, M2 makrofajlar hücre çoğalmasını teşvik eder ve yara iyileşmesi ile doku onarımını kolaylaştırır. Araştırmalar, astımda hava yolu yeniden şekillendirilmesinin M2 makrofajları ile ilişkiliolduğunu göstermiştir 16. In vitro deneyler, makrofajların M2 polarizasyonunu IL-4 ile indüklemenin, α-SMA pozitif hücrelerin proliferasyon kapasitesini önemli ölçüde artırdığınıgöstermiştir 17. M2 makrofaj polarizasyonunun inhibrelenmesi, astımda hava yolu yeniden şekillendirilmesini tedavi etmek için etkili bir yaklaşımdır.

Astım, geleneksel Çin tıbbında "Xiao Bing" kategorisine girer. Xiao Bing'in patolojik faktörleri esas olarak balgamı içerir. Balgam üretimi, iç organlarda Yin ve Yang arasındaki dengesizlikten kaynaklanır; dış patojenler, diyet ve hastalık sonrası durumlar gibi dış faktörlerle birleşir; bu durum vücut sıvılarının hareketini etkiler ve durgunluğa ve birikmeye yol açar. Astım tedavisinde geleneksel Çin tıbbının mekanizmalarının sürekli araştırılmasıyla, giderek daha fazla çalışma, geleneksel Çin tıbbının hava yolu iltihabını hafifletmede, aşırı mukus salgısını azaltmada ve hava yolu yeniden şekillendirilmesini engellemede önemli etkileri olduğunugöstermiştir 18,19. Xiao Bing'de öncelikle akciğer, ardından dalak ve böbrekler etkilenir. Xiao Bing hastalarında eksik akciğer qi ve dış patojenlere karşı zayıf bir savunma vardır; bu da akciğer qi yayılımının kaybına ve yang qi'nin uzun süreli, tekrarlayan yaralanmalarına yol açar ve bu da akciğer yang eksikliğine yol açar. Yang eksikliği, vücut sıvılarının anormal dolaşımına yol açar ve bu sıvılar balgam haline yoğunlaşır. Uzun süreli ataklarda, soğuk balgam dalak ve böbreklerin yangını etkiler; bu da akciğer-dalak-böbrek yang eksikliği, yin ve yang dengesizliği, aşırı baskı veya yapı eksikliği ve vücut sıvılarının anormal dolaşımına yol açar. Akciğer sıvıları dağıtamaz, dalak suyu ve özeti dönüştüremez, böbrekler buharlaşıp sıvıları dönüştüremez; bu da balgamın yoğuşmasına ve astım olarak ortaya çıkan stazis oluşumuna yol açar. Bu nedenle, yang eksikliği Xiao Bing'in temel nedenidir ve balgam duruzması özelliğidir. Wen Yang Ding Chuan Tang, Epimedium (15 g), Ephedra (işlenmiş) (10 g), Ginseng (15 g), Astragalus (15 g), Ginkgo biloba (15 g), Flos Farfarae (15 g), Acı Kayı Çekirdeği (15 g), Pinellia ternata (işlenmiş) (10 g), Schisandra chinensis (10 g), Earthworm (10 g), Persica (10 g) ve Licorice (işlenmiş 10 g) dahil olmak üzere 12 Çin tıbbi bitkisinden oluşur. Bu bitkisel formül, "She Sheng Zhong Miao Fang" kitabındaki Ding Chuan Tang'ın değiştirilmiş formülasyonundan türetilmiştir ve yang'ı ısıtmak, qi'yi güçlendirmek, balgamı çözmek, kan dolaşımını teşvik etmek ve öksürük ile astımı hafifletmek gibi etkilere sahiptir. Bu tedavinin klinik etkinliği kanıtlanmış olup, astımda hava yolu yeniden modellenmesini ele alma mekanizmasına yönelik güncel deneysel araştırmalara yol açmıştır.

Astım için mevcut farmakolojik tedavilerle karşılaştırıldığında, inhalasyonlu kortikosteroidler, β2-agonistler ve IgE veya IL-5'i hedefleyen monoklonal antikor bazlı biyolojik ilaçlarla karşılaştırıldığında, Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) potansiyel olarak çok hedefli ve daha güvenli bir tedavi stratejisi sunmaktadır. Geleneksel kortikosteroidler hava yolu iltihabını etkili bir şekilde azaltır, ancak genellikle immünosupresion, hormonal dengesizlik ve yoksunlukta nüks gibi yan etkilerle ilişkilidir. Biyolojik ajanlar daha spesifik olmalarına rağmen maliyetlidir ve belirli astım fenotipleriyle sınırlıdır. Buna karşılık, geleneksel Çin tıbbı teorisinden türetilen WYDCT, klinik ve deneysel çalışmalarda gösterildiği gibi, bağışıklık dengesinin düzenlenmesi, hava yolu iltihabını azaltma ve hava yolu yeniden şekillendirilmesini bastırma konusunda kapsamlı etkileruygular 20. Çok bileşenli bileşimi, makrofaj polarizasyonunu, fibroblast aktivasyonunu ve sitokin salınımını aynı anda modüle edebilir; böylece astım patolojisinde daha geniş ve potansiyel olarak daha sürdürülebilir bir iyileşme sağlar.

Bu çalışmada, Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) su özdüsü, sabit geleneksel oranda on iki bitkiden hazırlanmış, 1 g/mL (ham ilaç eşdeğeri) nihai stok çözeltisine konsantre edilmiş ve hücre kültürü kullanımı için filtrelenmiştir. Ekstrakt, 50, 100 ve 200 μg/mL konsantrasyonlarında uygulandı; bu konsantrasyonlar, farmakolojik aktiviteyi korurken sitotoksisite olmamasını sağlamak için ön hücre canlılık testlerine dayanarak seçildi. In vitro model, RAW264.7 makrofajlarının IL-4 indüklenmiş M2 polarizasyonunu ve fare akciğer fibroblastları (L929 hücreleri) ile birlikte kültür yapılmasını içererek, makrofaj parakrin etkilerinin fibroblast aktivasyonu ve fibrozla ilgili yanıtlar üzerindeki etkilerini değerlendirmemizi sağladı. Bu detaylar, WYDCT'nin hava yolu yeniden modellemesinde doz-yanıt özelliklerini ve mekanik yollarını inceleyen gelecekteki çalışmalar için tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar.

Yukarıdaki bulgulara dayanarak, Wen Yang Ding Chuan Tang'ın astımda makrofajların M2 polarizasyonunu engelleyerek ve fibroblastların aktivasyonunu baskılayarak hava yolu remodelasyonuna karşı etkisini gösterdiğini öne sürdük.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, insancıl hayvan muamelesi için uluslararası, ulusal ve kurumsal yönergelere uygun olarak ve ilgili mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Özellikle, farelerle ilgili tüm prosedürler Qiqihar Tıp Fakültesi Üçüncü Bağlı Hastanesi Hayvan Etik Bakım Komitesi (AECC-2022-009) tarafından onaylanmıştır. Fareler, standart laboratuvar koşullarında, yiyecek ve suya erişim imkanı altında tutuldu ve acıyı en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi. Çalışma boyunca insani son noktalar belirlendi ve izlendi.

1. WYDCT ekstraktının hazırlanması

Wen Yang Ding Chuan Tang'ın 12 otu geleneksel orana göre tartıldı: Epimedium (15 g), işlenmiş Ephedra (10 g), Ginseng (15 g), Astragalus (15 g), Ginkgo biloba (15 g), Flos Farfarae (15 g), Acı Kayısı Çekirdeği (15 g), işlenmiş Pinellia ternata (10 g), Schisandra chinensis (10 g), Toprak solucanı (10 g), Persica (10 g), ve işlenmiş Meyan Kökü (10 g).

On kat daha fazla damıtılmış su eklendi ve karışım 30 dakika kaynatıldı. Çıkarma iki kez tekrarlandı ve filtratlar birleştirildi. Birleşik ekstrakt, düşük basınç altında 1 g/mL kadar ham ilaç eşdeğeri konsantrasyonuna konsantrasyonla konsantrasyonla konsantre edildi. Ekstrakt, 0,22 μm bir membrandan filtrelenmiş, alicitasyonlu ve −20 °C'de saklanmıştır. Çalışma konsantrasyonları (50, 100 ve 200 μg/mL) kullanımdan hemen önce seyreltilerek hazırlandı.

2. Hücre kültürü ve M2 polarizasyonu

RAW264.7 hücreleri (ATCC, ABD) 10 mL DMEM'de, %10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile takviye edilmiş 10 mL DMEM'de 10 cm'lik tabak başına 1 × 10⁶ hücre yoğunluğunda çözüldü ve tohumlandı. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemli atmosferde 37 °C'de, %80-90 birleşimine ulaşılana kadar 24 saat boyunca kuluçka edildi.

Kültür ortamı daha sonra 20 ng/mL IL-4 içeren taze DMEM ile değiştirildi ve hücreler M2 polarizasyonunu indüklemek için ek 24 saat kuluçka edildi. İnkubasyondan sonra hücreler PBS ile iki kez yıkanmış ve ardından WYDCT ekstraktı (10 mg/mL stok çözeltisi belirtilen son konsantrasyonlara seyreltilmiş şekilde) ile 24 saat boyunca işlenmiştir. IL-6 takviye deneyleri için, WYDCT tedavisi sırasında 50 ng/mL IL-6 eklenmiştir.

%0,1 DMSO ile işlenmiş hücreler negatif kontrol olarak hizmet verdi. Hücresel morfoloji, ters mikroskop altında incelendi ve temsilci görüntüler alındı.

3. Fare akciğer fibroblastlarının izolasyonu ve kültürü

Fareler, onaylanmış etik protokollere uygun olarak ötenazi edildi. Akciğer lobları toplandı ve soğuk Hanks'in dengeli tuz çözeltisine kondu. Görünür kan damarları ve bağ dokusu çıkarıldı, akciğer dokusu küçük parçalara (~1 mm3) bölündü.

Doku parçaları, 37 °C'de hafif bir hareketle 40 dakika boyunca %0,25 tripsin ile sindirildi, ardından %0,25 tripsin ile 30 dakika ikinci sindirim yapıldı. Hücre süspansiyonu 300 × g ile 5 dakika boyunca santrifüjlendi, süpernatant atıldı ve pellet, %10 fetal sığır serumu ile takviye edilen DMEM'de yeniden süspansiyona geçirildi.

Süspansiyon, fibroblastların yapışmasını sağlamak için 100 dakika kuluçka yapıldı, ardından hücreler 300 × g ile 5 dakika boyunca tekrar santrifüjlenerek saflığı artırdı. Arıtılmış fibroblastlar uygun kültür plakalarına tohumlanarak %5 CO₂ içeren nemli atmosferde 37 °C'de kuluçka altına alınarak yaklaşık %80 birleşime ulaşıldı.

4. Fibroblastların koşullandırılmış ortamla birlikte kültürlenmesi

Süpernatant, işlenmiş RAW264.7 hücrelerinden toplandı ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 3000 × g ile santrifüjlendi. Fibroblast kültür ortamı, toplanan makrofaj koşullu ortamla değiştirildi. Fibroblastlar, fonksiyonel testlerden önce %5 CO₂ içeren nemli bir atmosferde 37 °C'de 24 saat kuluçka edildi. İnkubasyon sonrasında, fibroblastlar RNA ve protein ekstraksiyonu için toplanarak sonraki qRT-PCR ve Western blot analizleri yapıldı.

5. Hücre canlılığı (CCK-8 testi)

Fibroblastlar, 100 μL kültür ortamı içeren 96 kuyu talı plakalarda kuyu başına 5 × 10³ hücre yoğunluğunda tohumlanmıştır. Hücreler 24 saat boyunca belirtilen tedavilere maruz kaldı. Daha sonra, her kuyuya 10 μL CCK-8 reaktifi eklendi ve plakalar 37 °C'de 2 saat kuluçka edildi. Optik yoğunluk (OD) mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm olarak ölçüldü. Hücre canlılığı (OD_treated / OD_control) olarak hesaplandı × %100. Tüm deneyler üç biyolojik kopya ile gerçekleştirildi.

6. Koloni oluşumu testi

Hücreler, 6 kuyu plakalarında 1 × 10³ hücre yoğunluğunda tohumlanmış, her koşulda üç çoğaltılmış kuyuya ekilmiştir. Plakalar, görünür koloniler oluşana kadar 10-14 gün kuluçka içinde tutuldu. Koloniler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0,1 kristal menekşe ile boyandı. Boyamadan sonra koloniler yıkanıp fotoğraflandı. Bağlanan boya, %30 asetik asitte 15 dakika çözündü ve optik yoğunluk 590 nm olarak ölçüldü. Üç bağımsız deney gerçekleştirildi.

7. EdU yayılma testi

Hücreler 24 saat boyunca belirtildiği şekilde tedavi edildi. Daha sonra, her kuyuya 100 μL 50 μM EdU eklendi ve hücreler 37 °C'de 2 saat kuluçka edildi. Hücreler %4 paraformaldehit ile 30 dakika sabitlendi ve 5 dakika boyunca 2 mg/mL glisinle söndürüldü. Hücreler, PBS'de %0,5 Triton X-100 ile permeabilize edildi, yıkandı ve 30 dakika boyunca Apollo boyama çözeltisiyle inkübe edildi. Çekirdekler Hoechst 33342 (1×) ile 30 dakika boyunca karşı boyandı. EdU-pozitif hücreler gözlendi ve floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi.

8. IL-6 için ELISA

RAW264.7 hücre süpernatanı, 4 °C'de 15 dakika boyunca 3000 × g ile santrifüjlendi. IL-6 seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre Beyotime ELISA kiti kullanılarak ölçüldü. Soğukkans mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü ve IL-6 konsantrasyonları standart bir eğriye göre hesaplandı.

9. İmmünoflüoresans

Fibroblastlar önceden soğutulmuş asetonda 10 dakika sabitlendi ve PBS ile üç kez yıkandı. Hücreler %0,1 Triton X-100 ile 10 dakika geçirimli oldu ve 30 dakika boyunca PBS'de %1 BSA ile bloklandı. Hücreler daha sonra 4 °C'de gece boyunca PCNA'ya karşı primer antikor (1:100) ile kuluçka edildi. PBS ile üç kez yıkandıktan sonra, hücreler oda sıcaklığında 1 saat boyunca FITC ile konjuge edilmiş ikincil antikor (1:200) ile kuluçka altına alındı. Çekirdekler DAPI ile karşı boyanmış, yıkanmış ve floresans mikroskobu ile görüntülenmiştir.

10. qRT-PCR

Toplam RNA, üretici protokolüne göre Trizol reaktifi (Beyotime, Çin) kullanılarak çıkarıldı. Ters transkripsiyon, cDNA Sentez Kiti ile 2 μg RNA ve rastgele primerler kullanılarak gerçekleştirildi. PCR reaksiyonları, 10 μL SYBR Green Master Mix, her gen-spesifik primerden 0,5 μL (nihai konsantrasyon 0,5 μM) ve 1 μL cDNA şablonu içeren 20 μL hacimde hazırlandı. Kullanılan primerler arasında CD16, iNOS, Arg-1, CD206, fibronektin, COL1A1, α-SMA ve GAPDH (diziler sağlanmıştır) bulunuyordu.

Termal döngü koşulları, ilk denaturasyondan oluşuyordu; 95 °C'de 5 dakika boyunca, ardından 40 döngü 95 °C'de 30 saniye, 60 °C'de 30 saniye ve 72 °C 30 saniye için. Erime eğrisi analizi, amplifikasyonun özgüllüğünü doğrulamak için 60 °C'den 95 °C'ye kadar 0,5 °C aralıklarla yapıldı.

Veri Analizi: Göreli ifade 2^−ΔΔCT yöntemiyle hesaplanmış ve GAPDH olarak normalleştirilmiştir. Primerler şunlardı: CD16 (fare): 5′- AGGAGCTGAGGAGGAGGAGG-3′ ve 5′- TGAGGAGGAGGAGGAGGAGC-3′, iNOS (fare): 5′-TGCTCCCCAGGAGATGTTGT-3′ ve 5′-TGGTCTGGTGTGTGGTACGG-3′, Arg-1 (fare): 5′- GCTGGTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGTC-3′ ve 5′- GGTGGCTTTGCTGGTCTCTCTCTCTC-3′ , CD206 (fare): 5′- GGCTTCTATGAGCTGGGTGA-3′ ve 5′- CTGGGCTCTGGATTGTTGTT-3′, fibronektin (fare): 5'-CGTGGTGAAGGTGTTCTGC-3' ve 5'-GAGGTCACAGTGGTCTTGCT-3', COL1A1 (fare): 5'-CCCTGGGACACCTGGCTTTT-3' ve 5'-GCGGGTCACCTTCTCTTCTTCTC-3', α-SMA (fare): 5'-CTGGAACAGCACAGCTTCTC-3' ve 5'-GGGACATAGCACAGCTTCTC-3', GAPDH (fare): 5′- TGTGTCCGTCGTGGATCTGA -3′ ve 5′- CCTGCTTCACCTTCTTGAT-3′.

11. Western Blot

Hücreler, proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu kullanılarak lizleştirildi. Protein konsantrasyonları BCA testi kullanılarak belirlendi. SDS-PAGE için, %10 poliakrilamid jelin her hattına 60 μg protein yüklendi ve 120 V'da 1,5-2 saat boyunca ayrıldı. Proteinler, 100 V'da 1 saat boyunca ıslak transfer yöntemiyle PVDF membranına aktarıldı. Oda sıcaklığında TBS-T'de %5 yağsız sütle 1 saat bloke edildikten sonra, zar 4 °C'de gece boyunca primer antikorlarla (1:1000 seyreltme) inkübe edildi. TBS-T ile yıkamaların ardından, zar HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikorlarla (1:5000 seyreltme) oda sıcaklığında 1 saat kuluçka edildi. Ek yıkamalardan sonra, protein bantları ECL kemilyüminsans reaktifi kullanılarak tespit edildi ve kemimilüminesans görüntüleme sistemi ile görüntülendi. Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı kullanılarak nicelendirildi ve protein seviyeleri dahili kontrol olarak GAPDH'ye normalleştirildi.

12. İstatistiksel analiz

Veriler SPSS 17.0 kullanılarak analiz edildi. Sürekli değişkenler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi. İki grup arasındaki karşılaştırmalar eşleşmemiş t-testi kullanılarak yapılırken, birden fazla grup arasında karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA ve ardından LSD post hoc testi ile yapıldı. 0.05'in altında olan p-değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

WYDCT'nin RAW264.7 hücreleri üzerindeki etkileri M2 makrofajların polarizasyonu

RAW264.7 hücre morfolojisini ışık mikroskobu kullanarak gözlemledik. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, IL-4 uyarısı hücrelerin uzamasına neden oldu ve bu da tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla daha uzun, iğne benzeri bir şekil elde etti. Ayrıca, IL-4 uyarılı hücreler artan sitoplazmik granülarlık ve kültür substratına daha fazla yapışma göstermiştir. Bu morfolojik değişikl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmanın amacı, WYDCT'nin astımda fibroblast aktivitesi ve hava yolu yeniden modellenmesi üzerindeki etkisini ve altta yatan mekanizmaları incelemekti. Mevcut bulgular, WYDCT'nin RAW264.7 makrofajlarının M2 polarizasyonunu engelleyebileceğini, bunun da fare akciğer fibroblastlarının canlılığını, çoğalmasını ve fibrozunu etkilediğini göstermektedir. Ayrıca, IL-6/STAT3 sinyal yolu bu etkilerin arabuluculuğunda kilit rol oynamıştır.

Makrofaj polarizasyonu, a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

Bu araştırma projesine katkıda bulunan tüm ortaklara içtenlikle teşekkür ederiz. Bu çalışma, 2022 yılında Heilongjiang Eyaleti'ndeki Üniversite Temel Bilimsel Araştırma İşletme Giderleri tarafından desteklendi (No.2022-KYYWF-0827), bunun için minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Apollo 643 Hibridizasyon ReaktifiGuangzhou RiboBio Co., Ltd.C10371-2
Arginaz-1 (E4U1I) Fare mAb Hücre Sinyal Teknolojisi, Inc.43933T
BCA protein konsantrasyon belirleme kitiBeyotime Biotechnology Co., Ltd.P0012
BeyoBlot HRP ile Konjuge Fare Anti-Tavşan Doğuşlu IgG (H+L)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.A0210
Karbondioksit kuluçka makinesiŞanghay Lishen Bilimsel Ekipman A.Ş., Ltd.HF240
CD206/MRC1 (E6T5J) XP® Tavşan mAbHücre Sinyal Teknolojisi, Inc.24595T
Hücre Sayma Kiti-8Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C0037
COL1A1 (E8F4L) XP Tavşan mAb Hücre Sinyal Teknolojisi, Inc.72026T
Dimetil SülfoksitBeyotime Biotechnology Co., Ltd.ST038-100ml
DMEM yüksek şekerli ortamGrand Island Biyoloji Şirketi11965092
EDUBeyotime Biotechnology Co., Ltd.ST067-250mg
Fcγ RIII/CD16 (F6K6G) Tavşan mAb Hücre Sinyal Teknolojisi, Inc.71345T
Fetal buzağı serumuGrand Island Biyoloji ŞirketiA5256701
Fibronektin/FN1 Antikor Hücre Sinyal Teknolojisi, Inc.63779S
FITC-Konjuge Keçi Anti-Fare IgG (H+L)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.A0568
Floresans nicel PCR cihazıYarui Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.MA-6000
Hoechst 33342 Canlı Hücre Boyama Çözeltisi (100X)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C1029
iNOS (E1W4J) Tavşan mAbHücre Sinyal Teknolojisi, Inc.70706SF
ters mikroskopGuangzhou Mingmei Optoelectronics Technology Co., Ltd.MI52-N
LRRK2 T1348N mut RAW 264.7ATCCSC-6005
mmunostaining Permeabilizasyon Tamponu (Triton X-100 ile)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.P0096-100ml
Fare IL-6 ELISA KitiBeyotime Biotechnology Co., Ltd.PI326
Fare Akciğer Fibroblast HücreleriWuhan Procell Life Technology Co., Ltd.CP-M006
PCNA (PC10) Fare mAbHücre Sinyal Teknolojisi, Inc.2586T
Penisillin-streptomisinGrand Island Biyoloji Şirketi15140148
Rekombinant Murine IL-4Beyotime Biotechnology Co., Ltd.P5916-5μ g
Rekombinant Murine IL-6Beyotime Biotechnology Co., Ltd.P5925-10μ g
Redu enzim etiketi aletiRayto Yaşam BilimleriRT-6100
Stat3 (124H6) Fare mAb Hücre Sinyal Teknolojisi, Inc.9139T
Süper temiz tezgahJinan BioBase Biotech Co., Ltd.BBS-SDC
SynGAP-α 2 (E4Y6I) Tavşan mAb Hücre Sinyal Teknolojisi, Inc.56927T
Thermo Fisher Scientific RIPA Liz ve Ekstraksiyon TamponuThermoFisher89901
Trizol (Toplam RNA ekstraksiyon reaktiv)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.R0016
β-Aktin AntikorHücre Sinyal Teknolojisi, Inc.4967S

Kaynaklar

  1. Chetta, A., Calzetta, L. Bronchial asthma: An update. Minerva Med. 113 (1), 1-3 (2022).
  2. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: The ins and outs. Annu Rev Immunol. 26, 205-232 (2008).
  3. Ding, S., Zhong, C. Exercise and asthma. Adv Exp Med Biol. 1228, 369-380 (2020).
  4. Bateman, E. D., et al. Global strategy for asthma management and prevention: GINA executive summary. Eur Respir J. 31 (1), 143-178 (2008).
  5. GBD Risk Factor Collaborators. Global, regional, and national comparative risk assessment of 84 behavioural, environmental and occupational, and metabolic risks or clusters of risks, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1345-1422 (2017).
  6. Huang, K., et al. risk factors, and management of asthma in China: A national cross-sectional study. Lancet. 394 (10196), 407-418 (2019).
  7. Bousquet, J., et al. Next-generation Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma (ARIA) guidelines for allergic rhinitis based on Grading of Recommendations Assessment, Development and Evaluation (GRADE) and real-world evidence. J Allergy Clin Immunol. 145 (1), 70-80.e3 (2020).
  8. Varricchi, G., et al. Biologics and airway remodeling in severe asthma. Allergy. 77 (12), 3538-3552 (2022).
  9. Cardet, J. C., Papi, A., Reddel, H. K. 34;As-needed" inhaled corticosteroids for patients with asthma. J Allergy Clin Immunol Pract. 11 (3), 726-734 (2023).
  10. Zhou, Z., et al. TGF-β1 promotes SCD1 expression via the PI3K-Akt-mTOR-SREBP1 signaling pathway in lung fibroblasts. Respir Res. 24 (1), 8(2023).
  11. Sun, J. Y., et al. An IL-6/STAT3/MR/FGF21 axis mediates heart-liver cross-talk after myocardial infarction. Sci Adv. 9 (14), eade4110(2023).
  12. Francisco, D., et al. Surfactant protein-A protects against IL-13-induced inflammation in asthma. J Immunol. 204 (10), 2829-2839 (2020).
  13. Xue, Y., et al. STAT3 and IL-6 contribute to corticosteroid resistance in an OVA and ozone-induced asthma model with neutrophil infiltration. Front Mol Biosci. 8, 717962(2021).
  14. Zhao, J., et al. PRMT1-dependent macrophage IL-6 production is required for alcohol-induced HCC progression. Gene Expr. 19 (2), 137-150 (2019).
  15. Landis, R. C., Quimby, K. R., Greenidge, A. R. M1/M2 macrophages in diabetic nephropathy: Nrf2/HO-1 as therapeutic targets. Curr Pharm Des. 24 (20), 2241-2249 (2018).
  16. Wang, Q., et al. Targeting M2 macrophages alleviates airway inflammation and remodeling in asthmatic mice via miR-378a-3p/GRB2 pathway. Front Mol Biosci. 8, 717969(2021).
  17. Wang, J., et al. FIZZ1 promotes airway remodeling through the PI3K/Akt signaling pathway in asthma. Exp Ther Med. 7 (5), 1265-1270 (2014).
  18. Bao, H. R., et al. Sinomenine attenuates airway inflammation and remodeling in a mouse model of asthma. Mol Med Rep. 13 (3), 2415-2422 (2016).
  19. Wei, L., et al. Effects of Shiwei Longdanhua formula on LPS-induced airway mucus hypersecretion, cough hypersensitivity, oxidative stress and pulmonary inflammation. Biomed Pharmacother. 163, 114793(2023).
  20. Wen, L., et al. Modified Dingchuan Decoction treats cough-variant asthma by suppressing lung inflammation and regulating the lung microbiota. J Ethnopharmacol. 306, 116171(2023).
  21. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  22. Fang, J., et al. TcpC inhibits M1 but promotes M2 macrophage polarization via regulation of the MAPK/NF-κB and Akt/STAT6 pathways in urinary tract infection. Cells. 11 (17), (2022).
  23. Nam, S. Y., et al. NecroX-5 ameliorates inflammation by skewing macrophages to the M2 phenotype. Int Immunopharmacol. 66, 139-145 (2019).
  24. Zhao, B., et al. Matrine suppresses lung cancer metastasis via targeting M2-like tumour-associated-macrophages polarization. Am J Cancer Res. 11 (9), 4308-4328 (2021).
  25. Braune, J., et al. IL-6 regulates M2 polarization and local proliferation of adipose tissue macrophages in obesity. J Immunol. 198 (7), 2927-2934 (2017).
  26. Zhang, B., et al. Hyperglycemia modulates M1/M2 macrophage polarization via reactive oxygen species overproduction in ligature-induced periodontitis. J Periodontal Res. 56 (5), 991-1005 (2021).
  27. Wang, Y., et al. Xuanfei Baidu Decoction protects against macrophage-induced inflammation and pulmonary fibrosis via inhibiting IL-6/STAT3 signaling pathway. J Ethnopharmacol. 283, 114701(2022).
  28. Liu, G., et al. Therapeutic targets in lung tissue remodelling and fibrosis. Pharmacol Ther. 225, 107839(2021).
  29. Ramaesh, K., Billson, F. A., Madigan, M. C. Effect of bile acids on fibroblast proliferation and viability. Eye (Lond). 12 (4), 717-722 (1998).
  30. Zhu, B., et al. Formononetin ameliorates ferroptosis-associated fibrosis in renal tubular epithelial cells and in mice with chronic kidney disease by suppressing the Smad3/ATF3/SLC7A11 signaling. Life Sci. 315, 121331(2023).
  31. Han, D., et al. Hesperidin inhibits lung fibroblast senescence via IL-6/STAT3 signaling pathway to suppress pulmonary fibrosis. Phytomedicine. 112, 154680(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

M2 MakrofajlarIL-6 STAT3 YoluAkciğer FibroblastlarıMakrofaj PolarizasyonuFibrozis BelirteçleriWestern BlotGerçek Zamanlı PCR
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.