Bu makale şunları açıklar: (1) test moleküllerinin DOL 6 kadar erken bir tarihte neonatal farelere oral gavaj iletimi; ve (2) DOL 10'dan südden kesilmeye (DOL 20) kadar yapılan biyopsilerde kolonik epitel bariyer fonksiyonunun ex vivo değerlendirilmesi, Ussing odalarıyla parasellüler ve transhücresel geçirgenlik değerlendirilerek değerlendirildi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Neonatal fare yavrularında oral gavaj ve Ussing Chambers kullanılarak bağırsak bariyeri bütünlüğünün fonksiyonel değerlendirmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Artan kanıtlar, yaşamın ilk 1.000 gününün bağırsak-mikrobiyom eksenini şekillendirmedeki önemini vurguluyor. Bu erken yaşam penceresi, uzun vadeli fizyolojik yolların ve immünolojik adaptasyonların oluşturulmasında kritik öneme sahiptir; bu da disbiyoz ve bariyer fonksiyon bozukluğuna bağlı hastalıklara yatkınlığı etkileyebilir. Altta yatan mekanizmaların daha derin anlaşılması, yeni doğumlu bağırsağın parasellüler ve transhücresel geçirgenliği dahil olmak üzere temel fizyolojik parametrelerin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesini gerektirir. Bu parametrelerin değerlendirilmesi, erken yabancı moleküllere maruz kalmanın bağırsak bütünlüğü ve uzun vadeli sağlık sonuçlarını nasıl etkileyebileceğini açıklamak için gereklidir. Bu nedenle, makalenin ilk bölümü, fare yavrularında ilgi çekici moleküllerin ağızdan uygulanmasını 6 yaşta erken bir zamanda anlatır; bu süreçte stres, yaralanma riski ve yamyamlık en aza indirilir. Yağlanmış, yuvarlak uçlu 24-G besleme iğneleri, en az 2,5 g ağırlığındaki fare yavrularını gavlamak için kullanılır. İkinci bölüm, DOL-10 ile südden kesilme arasındaki yavrulardan kolon örnekleri üzerinde Ussing odası testleri kullanılarak parasellüler ve transhücresel geçirgenliğin ex vivo değerlendirmesini özetlemektedir. Küçük biyopsiler için uyarlanmış pinsiz kaydırmalar, Ussing odalarıyla birlikte yenidoğan kolon örneklerini yerleştirmek için kullanılır. Parasellüler probu FITC-Dextran 4 kDa ve transhücresel işaretleyici horseradish peroksidaz 44 kDa Tip VI, testin başında sistemin apikal bölmesine eklenir. Örnekler, bazolateral bölmede 0 dakika, 30 dakika, 60 dakika, 90 dakika ve 120 dakikada toplanarak sonda geçiş miktarı ölçülür. Her iki işaretçiyi geçişi, standart eğriler kullanılarak hesaplanan ve akı olarak ifade edilen bir plaka okuyucu tarafından doğrudan (FITC) ve dolaylı olarak (HRP) nicelendirilir.
Giriş
Bağırsak bariyeri bütünlüğü, mukozal bağışıklık yanıtını koordine ederek ve bağırsak epitelinin seçici geçirgenliğini düzenleyerek genel sağlığın korunmasında temel bir rol oynar. Bu bariyer sistemi, besinlerin geçişini kontrol ederken patojenlerin, antijenlerin ve toksinlerin sistemik dolaşıma geçişiniönler. 1. Bu arayüzün kronik bozulması, artan bağırsak geçirgenliğiyle ilişkili olan ve genellikle "sızdıran bağırsak" olarak adlandırılan bu durum, artık sadece bir sonuç olarak değil, aynı zamanda kronik inflamatuar durumların ve çeşitli bağırsak dışı patolojilerin tetikleyicisi olarak datanımlanmıştır 2.
Örneğin, bağırsak bariyerinin zayıflaması, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), genç idiopatik artrit (JIA) ve tip 1 diyabet (T1D) gibi otoimmün ve metabolik bozuklukların önemli bir bileşeni olduğu gösterilmiştir. Bu, bağırsak bariyer durumunu önemli bir biyobelirteç olarak vurgulamakla birlikte, patofizyolojik süreçlerin mümkün olan en erken başlanmasını önlemek ve akut iltihapın kronik duruma ilerlemesini önlemek için terapötik bir hedefolarak da öne çıkar 3,4,5,6.
Bu bağlamda, yenidoğan dönemi, bağırsak-mikrobiyota arayüzünün oluşumu ve olgunlaşmasının ömür boyu bağırsak ve sistemik sağlığı derinden etkilediği benzersiz ve son derece hassas bir gelişimpenceresini temsil eder 7. Bu erken aşamada, bağırsak epiteli ve bağışıklık sistemi hem endojen hem de dışsal faktörlere karşı yüksek hassasiyet gösterir; hızlı büyüme ve farklılaşma yaşarken, aynı zamanda mikrobiyal kolonizasyon ve beslenme değişikliklerine uyum sağlar. Bu kritik gelişim döneminde bağırsak bariyerinin bütünlüğünü bozan bozulmalar, yaşamın ilerleyen dönemlerinde geniş bir akut ve kronik hastalık yelpazesinin başlangıcında kritik bir rol oynayabilir. Bu durumlar, gıda alerjisi gibi bağışıklık aracılı hastalıkları ve IBD, JIA ve T1D 7,8,9 gibi daha ağır kronik hastalıkları içerir. Bu hastalıklar, patofizyolojik süreçlerin genellikle erken başladığını vurgular; çünkü birincil başlangıcı genellikle çocukluk ile erken yetişkinlik arasındagerçekleşir 10,11. Bu nedenle, yenidoğanlarda bağırsak bariyeri fonksiyonunu yöneten mekanizmaları anlamak, birçok kronik hastalığın yükünü azaltmaya yönelik önleyici ve terapötik stratejiler geliştirmek için gereklidir.
Bu bağlamda, bağırsak bariyeri bütünlüğünü, kronik hastalık mekanizmalarını ve özellikle yenidoğan ortamında iltihabı incelemek için güvenilir, fizyolojik olarak ilgili araçlara acil ihtiyaç vardır. Bu tür araçlar, yetişkin bağlamında zaten kanıtlanmış deneysel testlerin hassasiyet ve etkinlikten ödün vermeden çoğaltılmasına olanak tanımalıdır. Ayrıca, yenidoğan ortamında bağırsak homeostazı üzerinde faydalı veya zararlı etkileri olacağı beklenen birçok moleküler adayın hem kısa hem de uzun vadeli etkilerinin araştırılması giderek daha acil hale gelmektedir. Mevcut araçlar arasında, neonatal fare yavrularında oral gazaj uygulaması, ilgi çekici moleküllerin belirli bir gelişim aşamasında taşınmasının oldukça güvenilir bir yöntemini temsil etmektedir. Çeşitli biyoaktif bileşiklerin, ilaçların veya mikrobiyal metabolitlerin bağırsak olgunlaşması ve bariyer fonksiyonu üzerindeki etkilerinin kontrollü incelemelerine olanak tanır.
Bu makalenin ilk bölümü, fare yavrularının Yaşam Günü (DOL) 6 tarihinden itibaren gavaj yöntemini tanımlar; bu yöntem, besin çeşitlendirmesi nedeniyle bağırsak mikrobiyotası türlerinin büyük genişlemesinden önce, sırasında ve sonrasında yapılan müdahalelerin incelenmesine olanak tanır. Bu teknik, yavrular büyüdükçe bağırsak sağlığı üzerindeki tedavi etkilerinin uzunlamasına analizlerini mümkün kılar.
Bu makalenin ikinci bölümünde ve bu yaklaşımı tamamlayıcı olarak, Ussing odaları kullanılarak kolonik epitel bariyer fonksiyonunun ex vivo değerlendirmesi, geçirgenlik özelliklerinin hassas ve nicel bir ölçümü sağlar. Yenidoğan farelerden (örneğin, DOL 10 yavrularından) kolon biyopsilerinde hem parasellüler hem de transhücresel geçirgenliğin değerlendirilmesi, epitel bariyer bütünlüğü ve fonksiyonu üzerindeki birkaç ana adayın etkisinin hassas belirlenmesine olanak tanır. Parasellüler taşıma, epitel tabakasının hücrelerarası boşluğunda gerçekleşen esasen pasif bir mekanizmadır. Elektrokimyasal ve osmotik gradyanlarla oluşan küçük çözünücülerin lümenden bazolateral tarafa geçişini sağlar. Bu mekanizma esas olarak sıkı birleşim ailesine ait proteinler, örneğin klaudinler ve okludin tarafından düzenlenir. Transhücresel taşıma ise, daha büyük çözünen maddelerin emilimine ve epitel hücreleri aracılığıyla belirli kanallar, taşıyıcılar ve pompalar aracılığıyla gerçekleşmesine olanak tanıyan aktif bir mekanizmadır.
Fluorescein izotiosiyanat (FITC)-dextran (4 kDa) büyüklüğü nedeniyle ağırlıklı olarak parasellüler taşınım geçirirken, yadağ peroksidazı (HRP; 44 kDa) hücre transhücresel yollarla bazolateral tarafa seçici olarak iletilir. Bu endozen olmayan belirteçlerin nicelendirilmesi, sırasıyla parasellüler ve transhücresel geçirgenliklerin belirgin değerlendirilmesini sağlar. FITC ve HRP ile yapılan Ussing odası testi, doku mimarisini korur ve bağırsak yolunun herhangi bir segmentinin sırasıyla parasellüler ve transhücresel geçirgenliklerinin gerçek zamanlı ölçümüne olanak tanır. Yenidoğan gavaji ve Ussing odası analizinin bu kombinasyonu, belirli moleküllerin bağırsak bariyerinin işlevini hem hemen hem de uzun zaman dilimlerinde nasıl etkilediğini incelemek için güçlü bir strateji sunar; iltihabı azaltmak ve kronik hastalığı hayatın en erken aşamalarından itibaren önlemek için stratejiler geliştirir.
Özetle, bu protokol şu konuları mümkün kılan iki tamamlayıcı deneysel prosedürü tanımlar: (1) erken yenidoğan döneminde fare yavrulara ilgi duyan moleküllerin uygulanması (adım 1); (2) Ussing odaları kullanılarak neonatal yavrulardan südden kesilen yavrulara kadar bağırsak segmentlerinde hem para hem de transhücresel geçirgenliğin değerlendirilmesi (adımlar 2-6).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan işlemleri geçerli ulusal düzenlemelere uygun olarak yürütüldü ve Fransız Yüksek Eğitim, Araştırma ve İnovasyon Bakanlığı tarafından APAFIS platformu (Yetki numarası: APAFIS#23855) ve Agence Nationale pour la Recherche (ANR) hibeleri aracılığıyla onaylanmıştır: 11-IDEX-0005-02, ANR-24-CE15-7152 ve 18-IDEX-0001. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Yenidoğan fare yavrularının gawage
NOT: Aşağıdaki yöntem Francis ve ark.12'den uyarlanmıştır. Orijinal protokol, fare yavru köpeklerinin DOL 2 kadar erken bir tarihte gawage yapılmasına izin verirken, burada DOL 6'dan önce gawage yapılmamıştır; çünkü erken yaşlardaki teknik gereksinimler işlemi oldukça zorlaştırmaktadır. Ayrıca, daha genç yavrular kullanmak, tedavinin ilk günlerinde hayvan kaybı riskini artırdığı için çalışmaları zorlaştırır ve böylece daha büyük gruplar gerekir.
- Gavage çözümleri hazırlığı ve kurulumu
- Her yavruyu ayrı ayrı tartın.
- Gavaj çözeltisinin konsantrasyonu ve hacmini, uygulanan toplam hacmin vücut ağırlığı başına 20 μL'yi geçmemesi için ayarlayın.
NOT: Standart koşullarda, fare yavru köpekleri DOL 6 seviyesinde nadiren 2,5 g'den az ağırlık alır. - 24 G'lik yuvarlak uçlu besleme iğnesini deiyonize su ile iyice yıkayarak yıkayın, ardından %70 etanol ile bir şırınga ile yıkayın ve ardından otoklavla temizleyin.
NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için her tedavi grubu için ayrı bir besleme iğnesi kullanılması önerilir. - Temiz kağıt havluları ~38 °C sıcaklığına ayarlanmış dezenfekte edilmiş ısıtma pedine koyun.
- Hayvan kafeslerini açmadan önce eldivenleri %70 etanol ile yıkayarak yavrulara koku bulaşmasını ve yamyamlık riskini azaltmayı unutmayın.
- Yavru köpeklerin olası sesleri nedeniyle oluşan stresi azaltmak için barajı başka bir odadaki ayrı bir kafese taşıyın.
- Temizlenmiş eldivenleri yuva malzemeleriyle ovuşturun, böylece garaj sırasında yavrulara dış kokuların bulaşma riskini azaltın.
- Bir yavrunun xiphoid süreci (göğsüň alt ucu) ile yavrunun burnu arasındaki uzunluğu ölçerek besleme iğnesinin maksimum yerleştirme uzunluğunu işaretleyin (Şekil 1A,B).
- Fare yavrularının özofageal içi gawage
- İğnenin başını steril bir şekilde bir şırıngaya takın ve istenen hacimden fazla gavaj çözeltisi çekerek gerekli hacmin tamamını hava kabarcıkları vermeden verin, çünkü bu gaz kabarcıkları emme riskini ciddi şekilde artırır.
- Baskın olmayan elin başparmağı ve işaret kısmını kullanarak, yavruyu kaldırmak için skapulalar arasındaki deriyi nazikçe sıkın.
NOT: Yavrunun sırtından çok fazla deri çekmeyin, çünkü bu boğulmaya neden olabilir. - Yavruyu neredeyse yatay bir pozisyonda tutun ve beslenme iğnesini nazikçe ağız boşluğuna sokarak boğazın arkasına kadar farenkse dik ilerletin (Şekil 1C).
- Aynı açı ve derinliği koruyarak, iğneyi dil boşluğunun sağ veya sol kısmına kaydırarak dilden kaçının.
- İğnenin açısını yavaşça ayarlayın ve yavrunun başını nazikçe geriye doğru eğin; şırınga, baş ve sırt hizalanana kadar, başı hafifçe geriye doğru eğik hale getirin (Şekil 1D).
- Hiç baskı uygulamadan, şırınganın kendi ağırlığı altında yavaşça aşağı inmesine izin verin, maksimum yerleştirme işareti burun seviyesine yaklaşana veya ulaşana kadar (Şekil 1E).
NOT: Dirençle karşılaşılırsa, enjektörü parmaklar arasında ileri geri yuvarlayarak nazikçe döndürerek inişi kolaylaştırın. Eğer şırınga hâlâ ilerlemiyorsa, yerleştirme açısını ayarlamayı deneyin veya gavaj çözeltisiyle yağlanmış bir besleme iğnesi kullanarak işlemi yeniden başlatın. İğne, boğulmayı önlemek için 20 saniyeden fazla bakılmamalıdır. - Maksimum yerleştirme işaretine ulaşıldığında veya kapandığında, istenen hacmi hızlıca dağıtın. Hacim dağıtılırken direnç sağlanırsa, şırınga-baş-arka hizasını kontrol edin ve yerleştirme derinliğini hafifçe ayarlayın.
NOT: Uzun süreli iğne sokma boğulma, mücadele ve hayvanın yaralanma riskini önemli ölçüde artırdığı için hacimin hızlı dağıtımı önerilir. - Doğru hacim uygulandıktan sonra, iğneyi yerleştirme için kullanılan aynı açıdan nazikçe çekin.
- Yavruyu, daha önce ısıtıcı pedin üzerine yerleştirilmiş kağıt havlunun üzerine koyun ve iyileşmeyi izleyin. Normal bir nefes alma düzeni 20 saniyeden kısa sürede geri gelmeli.
NOT: Hayvanın burun veya ağzından çıkan baloncukların ortaya çıkması aspirasyonu gösterir ve DOL 14'ten küçük yavrularda derhal ötenazi gerektirir. Orofarenks ile özofagus arasındaki bir lezyonun neden olduğu için hayvanın ağzında çok az miktarda kan varlığı, hayvanın izlenmesini gerektirir, ancak sistematik ötenazi yapılmaz. Yavru iyileşme kesin değilse, yan yat. Eğer kendini düzeltmeye çalışmazsa, hemen ötanazi yapın. - Hayvanın iyileşmesi kesinleşince, yavruyu yuvaya geri koyup damlasıyla yeniden toparlayın.
NOT: DOL 10'a kadar yavrular düşük hareketliliğe sahiptir ve kafesteki tüm yavrular gawage tamamlanana kadar ısıtma pedinde kalabilirler. Daha yaşlı yavrular pedde gözetimsiz bırakılmamalıdır, çünkü kaçmaya çalışabilirler.
Şekil 1: DOL 10'da yeni doğan fare yavrusu gawage. Burun ile ksifoid süreci arasındaki mesafe (A) ölçülür, böylece besleme iğnesinde maksimum yerleştirme uzunluğu işaretlenir (B). Besleyici iğne, ağız boşluğunun sol veya sağ kısmına (C) yerleştirilir. Boğazın arkasına ulaşıldığında, iğnenin açısı hayvanın şırıngası, başı ve sırtı hizalanana kadar ayarlanır (D). İğne, maksimum yerleştirme işaretine (E) ulaşılana kadar direnç göstermeden hafifçe aşağı kaymasına izin verilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
2. Yenidoğan fare yavrusu ötenazi ve kolon toplama
- Ulusal mevzuatla zorunlu kılınan uygun yöntemle ötenazi yapın.
NOT: DOL 10'a kadar yavrular kafasının kesilmesi ve DOL 10'dan daha büyük yaşta yavruların servikal çıkıntısı önerilir. CO2 veya anestezi ile ötenazi önerilmez çünkü yavrular bu yöntemlere karşı büyük bir tolerans gösterir. - Ötenazi yapılan hayvanı dürbün mikroskopu altına yerleştirin.
- Hayvanın karnına %70 etanol uygulayın.
- Forseps kullanarak, karın derisini ve alttaki peritoneumu sıkıştırın ve ince makasla (rostral-kaudal eksene dik) büyük bir enine karın kesisi yapın, bağırsak kesilmeden.
- İnce makası nazikçe kesiye yerleştirin ve kesiyi her iki taraftan peritononun yanlarına doğru uzatın.
- Forseps ve ince makas kullanarak, peritoneumun üst ve alt kısımlarını, torakal bölgeden alt pelvik bölgeye kadar açın (Şekil 2A).
- Kolonun distal kısmını belirleyin ve eksenine paralel bir kesi yapın, rektuma doğru.
- Kolonun harekete geçirilmesi için kolonun terminal/rektal kısmında bir kesi yapın.
- Kolonu nazikçe çekip sekuma doğru ilerleyin, potansiyel bağ veya yağ dokusu parçalarını çıkarın.
- Kolonu karından ileosekal birleşimde, çekumun üstünde keserek serbest bırakın (Şekil 2B).
- Çekum ve proksimal kolonun ilk birkaç milimetresini atmak, ardından proksimal kolondan Ussing kaydırmasının açıklık boyutundan büyük bir veya iki örnek alın (Şekil 2C).
NOT: İki büyük biyopsi sabitlenmesi tavsiye edilir; çünkü yenidoğan kolonu son derece kırılgandır ve temizlik ile montaj sırasında kolayca yırtılabilir, yaralanabilir veya delinebilir. - Makaslar kapalıyken, yassılaştırılmış biyopsideki dışkıyı hafif baskı uygulayarak nazikçe çıkarın ve proksimalden distal uca kaydırın.
- Boşaltılmış kolon parçasını buz gibi soğuk KRB tampponuna yerleştirin.
Şekil 2: DOL 10 yavrusu kolonunun diseksiyonu. Yavrunun epidermisi ve peritoneumu, kolonun istemsiz kesilmesini önlemek için iki adımda kesilip açılır, ta ki karın boşluğunun tamamı ortaya çıkana kadar (A). Kolon, karın bölgesinden distal/rektal kesitin ilk kesiği ile serbest bırakılır, ardından secum (B) üzerinde ikinci bir kesik yapılır. Proksimal kolonun ilk milimetreleri atılır ve Ussing kaydırmalarının açıklık boyutundan büyük bir ila iki kolon örneği toplanır (C). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
3. Ussing odalarında fare biyopsileriyle kolonik geçirgenlik testi
- Testin hazırlanması
- Ussing deneyinin gününden bir gün önce. Optimal test koşullarını sağlamak için, deneyden bir gün önce birkaç çözeltinin hazırlanması önerilir. Bu çözümler, Tablo 1'de talimatlara uygun şekilde hazırlanmıştır.
NOT: Aşağıdaki tablolar 12 Ussing odası için gerekli miktarları göstermekte olup, aliquote için KRB 10 kat fazla fazladır.
NOT: KRB 10x çözeltisi 4 °C'de 6-12 ay boyunca saklanabilir. - Deney gününde, hayvanların ötenazisinden 30 dakika önce:
- Tablo 2'de belirtildiği gibi 400 mL KRB tamponu hazırlayın.
NOT: KRB 10x, deiyonize su ve bikarbonat, yağıntıyı önlemek için CaCl2 eklenmeden önce 15 dakika boyunca karbogen gazı (%95 O2; %5 CO2) ile önceden karıştırılıp kabarcıklandırılmalıdır. - Karbogen sistemi (%95 O2; %5CO2) kullanarak taze KRB tamponunu 15 dakika boyunca köpükle getirin.
- 400 mL KRB tamponunu ikiye bölerek 200 mL Krebs-Glukoz, 200 mL Krebs-Mannitol ve HRP çözeltisi Tablo 3'te açıklandığı gibi hazırlanır.
- Tablo 2'de belirtildiği gibi 400 mL KRB tamponu hazırlayın.
- Sistem kurulumunu kullanma
- Ussing sistemini 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
- Odaları aşağıdaki gibi önceden monte edin:
- Her yuvanın mandallarını kaldırın.
- Kameraları sistemi sıkıştırmadan yuvalarına yerleştirin.
- İki gaz sağlayan tüpü odaların her bir parçasına yerleştirin.
- Ön açıklıklara dört elektrodu sokun (varsa - burada kapsanmıyor) veya deneyden önce yapıştırıcı dolu 200 μL konilerle dört açıklığı sızdırdırın.
- Olası sızıntılar beklentisi için tepsileri odaların altına yerleştirin.
- Doku montajı
- Daha önce temizlenmiş kolon örneğini fazla nemi gidermek için kağıt havluyla hafifçe kurutun.
- Kolon parçasını büyüteç altına yerleştirin ve ince makas bıçaklarından birini luminal kısmın içine çok nazikçe sokarak kesin (Şekil 3A).
NOT: Makas tamamen yerleştirildikten sonra kesim tek hareketle yapılabilir. Kullanılan kolon kesimi mümkün olduğunca düz olmalı ve burulmaktan kaçınmalıdır. - İnce forseps kullanarak, dokuyu kaydırmanın beyaz kısmına monte ederek luminal kısmı yukarıda, operatöre doğru tutun. Doku yağ, dışkı, kırışıklık, delik ve kesik izlerinden arınmış olmalı ve açıklığı geniş şekilde kaplamalıdır (Şekil 3B).
- Dürbün mikroskobu altındaki kaydırıcıyı kapatın ve dokunun olası yer değiştirme potansiyelini kontrol edin. Kaydırmaya baskı uygulandığında dokuda hafif bir deformasyon görülmelidir; bu da kaydırmanın sıkıca kapalı olduğunu gösterir.
NOT: Kaydırmaları Ussing odasına (Şekil 4) takın ve numune kurutmasını önlemek için hazır olur olmaz tek tek dengeleme adımını başlatın. - Kaydırmayı kapalı tutmak için hafif baskı tutarken, sürgü kaydırıcıyı Ussing odasına yerleştirin; böylece lümenin (kaydırmanın şeffaf kısmı) sola baktığından emin olun.
- Her iki mandalayı kapatın ve sağdaki vidayı sıkın, ta ki oda hava geçirmez hale gelsin, kaydırıcı hareket edemeyecek hale kadar.
- Son kurulum ve dengeleme
- Odanın sol (apikal) bölmesine 4 mL Krebs-Mannitol ekleyin.
- Odanın sağ (bazolateral) bölmesine 4 mL Krebs-Glukoz ekleyin.
- Çapraz kontaminasyonu önlemek için her iki bölme arasına küçük bir parafilm parçası yerleştirin.
- Gaz girişini açın (%95 O2 / %5 CO2) ve çıkışı 1-2 baloncuk/s arasında ayarlayın.
- Pasteur pipeti kullanarak doku veya sistem üzerindeki büyük kabarcıkları ortadan kaldırın.
- Sistemin dengesini 20-30 dakikaya kadar bırakın.
- FITC 4kDa + HRP + Mannitol çözeltisini Tablo 4'te açıklandığı gibi hazırlayın.
- Ussing deneyinin gününden bir gün önce. Optimal test koşullarını sağlamak için, deneyden bir gün önce birkaç çözeltinin hazırlanması önerilir. Bu çözümler, Tablo 1'de talimatlara uygun şekilde hazırlanmıştır.
- Kolonik geçirgenlik testine başlanma
- Sistem dengesine ulaşıldığında, apikal bölmeden (solda) 200 μL Krebs-Mannitol yerine 200 μL FITC 4Kd + HRP + Mannitol çözeltisi ile değiştirilin ve hemen zamanlayıcı başlatın. Ucu, bölmede nazik iniş çıkışlar yaparak yıkayın ve ucu her bölek arasına atın.
- Her oda için, bazal (sağ) bölmeden 2 x 100 μL (kopyalar) toplayın ve hacimleri siyah bir 96 kuyu plakaya yerleştirin. Plakanın üzerinde bulunan FITC'nin fotodegradasyonunu önlemek için alüminyum folyo ile kaplayın.
- Daha önce toplanan 200 μL taze Krebs-Glukozu hemen 200 μL taze Krebs-Glukoz ile değiştirin.
- (2) ve (3) adımları her 30 dakikada bir tekrarlayın, böylece zaman noktaları elde edilir: T0, T30, T60, T90 ve T120.
- FITC'nin fotodegradasyonunu önlemek için plakayı alüminyum folyo ile mühürleyin ve FITC nicelik ölçmesine geçin.
| MgCl2 1M | |||
| MW (g/mol) | Son Hacim = 20 mL | Son yoğunlaşma | |
| milli-q H2O | Son cilde getir | ||
| MgCl2, 6H2O | 203.3 | 4.066 g | 1 M |
| KRB 10X | |||
| MW (g/mol) | Son Cilt = 1L | Son yoğunlaşma | |
| milli-Q H20 | Son cilde getir | ||
| NaCl | 58.44 | 70 g | 1.198 M |
| KCl | 74.55 | 3.4 g | 45,6 mM |
| Na2HPO4 , 2H2O | 177.99 | 1 g | 5.62 mM |
| NaH2PO4 , 2H2O | 156.01 | 2.3 g | 14,7 mM |
| MgCl2 1M | 5 mL | 5 mM | |
| Bikarbonat 750 mM | |||
| MW (g/mol) | Son Hacim = 250 mL | Son yoğunlaşma | |
| milli-q H2O | Son cilde getir | ||
| NaHCO3 | 84 | 15,75 g | 750 mM |
| CaCl2 2M | |||
| MW (g/mol) | Son Hacim = 50 mL | Son yoğunlaşma | |
| milli-q H2O | Son cilde getir | ||
| CaCl2 | 111 | 11.098 g | 2 M |
Tablo 1: Ussing deneyinden bir gün önce çözelti hazırlığı.
| KRB Tamponu (400 mL) | ||
| Hacim | Son yoğunlaşma | |
| KRB 10X | 40 mL | 1X |
| H2O (milli-Q) | 352 mL | |
| Bikarbonat 750 mM | 8 mL | 15 mM |
| CaCl2 2M | 240 μL | 1.2 mM |
Tablo 2: Ussing deneyi günü KRB tampon hazırlığı.
| Krebs-Glukoz/Mannitol (her biri 200 mL) | ||||
| Son hacim = 200 mL | Son yoğunlaşma | |||
| KRB Tamponu | Son cilde getir | |||
| Glikoz | 360 mg | 10 mM | ||
| veya | ||||
| Mannitol | 364 mg | 10 mM | ||
| HRP çözümü | ||||
| Son hacim = 1480 μL | Son yoğunlaşma | |||
| Krebs-Mannitol | Son cilde getir | |||
| HRP | 13 mg | 8.8 mg/mL | ||
Tablo 3: Ussing deneyi gününde Krebs-glikoz/mannitol ve HRP çözeltilerinin hazırlanması.
| FITC 4kDa + HRP + Mannitol çözeltisi | ||
| 12 odalı | Hacim | Son yoğunlaşma |
| HRP (8.8mg/ml) | 1345 μL | |
| Krebs-Mannitol | 1155 μL | |
| FITC 4Kd | 166,6 mg | 16,66 mM |
Tablo 4: Ussing deneyi gününde FITC 4 kDa + HRP + mannitol çözeltisi hazırlanıyor.
Şekil 3: DOL 9 yavrudan bir kolon örneğinin montajı. Bir adet ince bir makas bıçağı, numunenin luminal segmentine yerleştirilerek tek hareketle (A) kesilir. Açık örnek, Ussing kaydırma açıklığına monte edilir ve luminal taraf operatöre (B) bakmaktadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tamamen hazırlanmış Ussing odalarının resmi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
4. FITC nicel olarak kolonik para-hücresel geçirgenlik değerlendirmesi
- FITC Standartları hazırlığı
- FITC 4Kd + HRP + Mannitol çözeltisini Krebs-Glukoz içinde seyreltirerek Tablo 5 ve Şekil 5'te açıklandığı gibi standart seyreltmeleri hazırlayın.
- Her standart seyreltmeden 2 x 100 μL (tekrar) levhaya n°1'den n°7'ye kadar olan aralıklar arasında biriktirin. Plaka okuma başlayana kadar ışığı korumak için plakayı alüminyum folyo ile mühürleyin.
- Veri toplama: Bir plaka okuyucu kullanarak, uyarılma dalga boyunu 485 nm, emisyonu 535 nm olarak ayarlayın ve plakayı mümkün olan en kısa sürede okun.
NOT: Plakanın hem optimal kazançta hem de manuel ayarlanmış kazanç ile okunması, plakalar arası değerler karşılaştırmasını kolaylaştırmak ve standart seyreltmeler sırasında bir hata yapıldığında verilerin interpolasyonuna olanak sağlamak için tavsiye edilir. - Plaka depolama: FITC nicelendirme verileri saklandıktan sonra, HRP niceliği sonraki günlerde yapılacaksa plakalar gece boyunca 4 °C'de alüminyum folyo ile kapalı şekilde saklanır veya daha uzun depolama için -80 °C'de dondurulur.
Şekil 5: FITC standart seyreltme hazırlığının görsel temsili. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| FTIC standart seyreltmeleri | |||||||
| N° | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Sulandırma | 1:10000 FITC stok çözümü | 1:2 seyreltme No°1 | 1:2 seyreltme No°2 | 1:10 seyreltme n°1 | 1:2 seyreltme No°4 | 1:2 seyreltme No°5 | |
| Krebs-Glukoz | |||||||
| FITC (μM) | 1.66 | 0.83 | 0.415 | 0.166 | 0.083 | 0.0415 | 0 |
Tablo 5: Ussing deneyi gününde FITC standart seyreltmelerinin hazırlanması.
5. HRP nicelleştirme yoluyla kolonik trans-hücresel geçirgenlik değerlendirmesi
- HRP nicelik testi gününden bir gün önce:
- Test günü optimal koşulların sağlanması; Deneyden bir gün önce birkaç çözeltinin hazırlanması gereklidir. Bu çözümler, Tablo 6'da açıklandığı şekilde hazırlanmıştır.
NOT: Aşağıdaki tablolar, bir 96 kuyuyla plaka için gerekli miktarları göstermektedir. HRP Standartları alkotasyonla -20 °C veya -80 °C'de birkaç aya kadar saklanabilir. Dengesizlik nedeniyle sadece taze karbonat/bikarbonat tamponları kullanın. - Anti-HRP antikor çözeltisi hazırlandığında, hemen 100 μL ile Clear 96-Well Clear Flat Bottom High Binding mikroplaka kaplayın. Alüminyum folyoya sarın ve 4 °C'de gece boyunca kuluçka yapın.
- Test günü optimal koşulların sağlanması; Deneyden bir gün önce birkaç çözeltinin hazırlanması gereklidir. Bu çözümler, Tablo 6'da açıklandığı şekilde hazırlanmıştır.
- HRP nicelik testi gününde:
- Tablo 7'de açıklandığı gibi %5 BSA Engelleme tamponunu hazırlayın.
- Plakanın içeriğini atın ve her yıkama arasında 350 rpm'de 1 dakika çalkalayarak 280 μL PBS Tween ile 4 kez yıkayın.
- Her kuyuya 200 μL BSA bloklama tamponu ekleyin.
- Plakayı alüminyum folyo ile kapatın ve en az 1 saat 500 rpm'de bir sarstıkta kuluçka yapın. Bu arada, örnekleri eritip seyreltin (1:10 veya 1:50) ve standart seyreltmeleri Tablo 8'de açıklandığı gibi hazırlayın.
- Plakanın içeriğini atın ve her yıkama arasında 350 rpm'de 1 dakika çalkalayarak 280 μL PBS Tween ile 4 kez yıkayın.
- 50 μL standart veya seyreltilmiş numune ekleyin, plakayı mühürleyin ve RT'de 300 rpm'de 1 saat kuluçka yapın.
- İnkubasyon sırasında, QuantaBlu reaktiflerini RT'ye getirin ve Tablo 9'da açıklandığı gibi çalışma çözeltisini hazırlayın.
- Plakanın içeriğini atın ve her yıkama arasında 350 rpm'de 1 dakika çalkalayarak 280 μL PBS Tween ile 4 kez yıkayın.
- Her kuyuya RT veya 37 °C (ortalama 1,5-90 dakika, 30 dakika) 100 μL QuantaBlu Çalışma Çözeltisi ekleyin.
NOT: Analiz ilerlemesini takip ederek UV ışık kaynağı altında güçlü mavi bir floresans ortaya çıkabilir. - Peroksidaz aktivitesini durdurmak için her kuyuya 100 μL QuantaBlu Stop Solution ekleyin. Plakayı mühürleyin ve RT'de 350 rpm'de çalkalama altında 10 dakika kuluçka yapın.
- Bir plaka okuyucu kullanarak, uyarılma dalga boyunu 315 nm'ye ve emisyonu 470 nm'ye ayarlayın. Plakayı mümkün olan en kısa sürede okuyun.
NOT: Plakanın hem optimal kazançta hem de manuel ayarlanmış kazanç ile okunması, plakalar arası değerler karşılaştırmasını kolaylaştırmak ve standart seyreltmeler sırasında bir hata yapıldığında verilerin interpolasyonuna olanak sağlamak için tavsiye edilir. QuantaBlu Florojenik Peroksidaz Substrat kitine alternatif olarak, Tetrametilbenzidin gibi diğer peroksidaz substratları kullanılabilir (durak çözeltisi kullanılarak veya kullanılmadan sırasıyla 450 veya 650 nm ölçülür), ancak bu alternatifin kullanımı daha düşük hassasiyet pahasına gelir.
| BSA çözümü | |||
| MW (g/mol) | Son Hacim = 12,7 mL | Son yoğunlaşma | |
| Milli-Q H2O | Son cilde getir | ||
| BSA | 66430 | 1,27 g | 100 mg/mL |
| Krebs-Glukoz + BSA | |||
| MW (g/mol) | Son Hacim = 30 mL | Son yoğunlaşma | |
| Krebs-Glukoz | Son cilde getir | ||
| BSA çözümü | 60 μL | 0.2 mg/mL | |
| PBS Tween | |||
| MW (g/mol) | Son Hacim = 500 mL | Son yoğunlaşma | |
| PBS 1X | Son cilde getir | ||
| Tween-20 | 500 μL | 0.1% | |
| Sodyum karbonat sol. | |||
| MW (g/mol) | Son Hacim = 3.22 mL | Son yoğunlaşma | |
| Milli-Q H2O | Son cilde getir | ||
| Na2CO3 | 105.99 | 34.13 mg | 0.1 M |
| Sodyum bikarbonat sol. | |||
| MW (g/mol) | Son Hacim = 12,7 mL | Son yoğunlaşma | |
| Milli-Q H2O | Son cilde getir | ||
| NaHCO3 | 84 | 106.68 mg | 0.1 M |
| Kaplama Tamponu pH 9.6 | |||
| Son Cilt ≈ 11 mL | |||
| Sodyum karbonat sol. | 2.58 mL | ||
| Sodyum bikarbonat sol. | pH = 9.6 (~8.4 mL) olana kadar ekleyin | ||
| 10 μM HRP Standard | |||
| Başlangıç yoğunlaştırma | Son hacim = 5 mL | Son yoğunlaşma | |
| Krebs-Glukoz | Son cilde getir | ||
| HRP çözümü | 8.8 mg/mL | 50 μL | 0.088 mg/mL |
| BSA çözümü | 100 mg/mL | 10 μL | 0.2 mg/mL |
| 1.5 nM HRP Standardı | |||
| Başlangıç yoğunlaştırma | Son hacim = 15 mL | Son yoğunlaşma | |
| Krebs-Glukoz | Son cilde getir | ||
| 2,0 μM HRP Standard | 0.088 mg/mL | 2.25 μL | 13.2 ng/mL |
| BSA çözümü | 0.2 mg/mL | 3 μL | 40 ng/mL |
| Anti-HRP antikor çözeltisi | |||
| Başlangıç yoğunlaştırma | Son hacim = 10 mL | Son yoğunlaşma | |
| Kaplama Tamponu | Son cilde getir | ||
| Anti-HRP antikor | 5.6 mg/mL | 8.93 μL | 5 μg/mL |
Tablo 6: HRP deneyinden bir gün önce çözelti hazırlığı.
| BSA engelleme tamponu | |||
| Başlangıç yoğunlaştırma | Son Hacim = 25 mL | Son yoğunlaşma | |
| PBS 1X | 12,5 mL | ||
| BSA çözümü | 100 mg/mL | 12,5 mL | 50 mg/mL |
Tablo 7: HRP deneyi gününde BSA engelleme tampon hazırlığı.
| Standart | Krebs-Glukoz + BSA | 1.5 nM HRP Standardı | Fmol HRP/50 μL |
| Boş | 1000 μL | 0 μL | 0 |
| 1 | 993.75 μL | 6.25 μL | 0.09375 |
| 2 | 987.5 μL | 12.5 μL | 0.1875 |
| 3 | 975 μL | 25 μL | 0.375 |
| 4 | 950 μL | 50 μL | 0.75 |
| 5 | 900 μL | 100 μL | 1.5 |
| 6 | 850 μL | 150 μL | 2.25 |
| 7 | 800 μL | 200 μL | 3 |
| 8 | 700 μL | 300 μL | 4.5 |
| 9 | 600 μL | 400 μL | 6 |
| 10 | 400 μL | 600 μL | 9 |
| 11 | 200 μL | 800 μL | 12 |
Tablo 8: HRP deneyi gününde HRP standart hazırlığı.
| QuantaBlu Çalışma Çözümü | |
| Son Hacim = 12 mL | |
| QuantaBlu Substrat Çözümü | 10.8 mL |
| QuantaBlu Kararlı Peroksit Çözeltisi | 1.2 mL |
Tablo 9: HRP deneyi gününde QuantaBlu çalışma çözeltisi hazırlığı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Standart eğri ve kuyu konsantrasyonu niceliklendirmesi
Boş atışların ortalama değeri levhanın her kuyusundan çıkarıldı. Y ekseninde absorbans değerleri ve X ekseninde konsantrasyonlarla, GraphPad Prism'den "Standart bir eğriyi interpole et" fonksiyonu kullanılarak standart bir eğri oluşturuldu. Tüm standart noktalar hizalanmışsa, "Çizgi" modeli en iyi sonucu verir. Alternatif olarak, "Sigmoidal, 4 PL, X konsantrasyondur" modeli, doğrusal olmayan standart eğri interpolasyonu ile büyük esneklik ve doğru...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Oral gavaj, bireysel yenidoğan farelere kesin ve tanımlanmış bir ışık dozunun tekrar tekrar uygulanmasını sağlar. Buna karşılık, gönüllü besleme uygulanabilir bir alternatif olmasına rağmen, daha düşük dozlama hassasiyetiyle daha düşük bileşik miktarı vermek için hayvan başına uzun uygulama süresi gerektirir12. Ayrıca, oral gavaja , enjeksiyon yoluyla mümkün olanlardan daha büyük hacimleri barındırır; bu da daha düşük konsantrasyonlarda daha yüksek toplam...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını belirtirler.
Teşekkürler
Bu çalışma, ANR-11-IDEX-0005-02 Laboratoire d'excellence INFLAMEX, Fondation de l'avenir ödülü (2025, AP-RM-24-012) ve ANR hibeleri Diab1GUT (ANR-24-CE15-7152) tarafından maddi destek alınarak gerçekleştirildi. Çalışma, INFIBREX konsorsiyumu bağlamında yürütülmüş ve Fransız hükümeti tarafından başlatılan ve Université Paris Cité tarafından "Mükemmellik İnisiyatifi" IdEx programı (ANR-18-IDEX-0001) kapsamında uygulanan "France 2030" yatırım planının desteğinden faydalanmıştır. İltihap Araştırma Merkezi'ndeki Ussing Chamber Teknik Platformu'na paha biçilmez destekleri için minnettarlık duyuyoruz ve uzman yardımları için Alexandra Willemtz ve Maude Le Gall'a özel teşekkürlerimizi sunuyoruz. Ayrıca, iltihap Araştırma Merkezi'ndeki Hayvan Tesisi Platformu'na temel destekleri için içten teşekkürlerimizi sunarız; özellikle Isabelle Renault ve Guillaume Anselmet'e teşekkürler.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10x DPBS CA & O olmadan Mg | Dulbeccos | 14200091 | |
| Anti-HRP antikor | Nordic Biyositesi | GTX10183 | Monoklonal Fare Dağ Peroksidaz IgG [2H11] |
| Dürbün lupe | Olympus | SZ61 | Şart şart yok. |
| Siyah 96 kuyu plaka düz tabanlı | ThermoFisher Scientific | 137101 | Plakalar siyah olmalı ve floresans ölçümlerine uyarlanmalıdır. Okuma sırasında kapağın açılması gerekir. |
| BSA | Merck | A4503 | |
| C57BL/6J fareleri | Charles Nehri | 632C57BL/6J | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Şeffaf 96 kuyruklu Şeffaf Düz Tabanlı Yüksek Bağlama | Corning | 9018 | |
| D-(+)-Glikoz | Merck | G8270 | |
| Distile H2O | |||
| D-Mannitol | Merck | M4125 | |
| İnce Penseps | FST | 11445-12 | |
| İnce Makas | FST | 14058-09 | |
| FITC-Dextran 4Kd | FD4 | TdB Labs | Fotodegradasyona karşı hassas. |
| Isıtma pedi | Minerve | 20 031 01 | |
| HRP | Merck | P8375 | |
| MgCl2, 6H2O | Merck | M2670 | |
| Milli-Q H2O | |||
| P2300 EasyMount Ussing Sistemi & Odalar | Fizyolojik Aletler | EM6-C-CE | Sistemler, odalar ve kaydırıcılar hepsi uyumlu olmalı. |
| P2306 Ussing Chamber Slider | Fizyolojik Aletler | PI-P2306 | Farklı boyut ve biçimdeki dokular için farklı kaydırıcı modelleri mevcuttur. |
| QuantaBlu Florojenik Peroksidaz Substrat Kiti | ThermoFisher Scientific | 15169 | |
| Yeniden Kullanılabilir Besleme İğneleri Yuvarlak Uç | FST | 18061-24 | 24 Gauge, 1.25mm uç çapı, yuvarlak uç. Steril su, %70 etanol ile yıkanmalı ve kullanımdan önce otoklavlanmalıdır. |
| Sodyum bikarbonat | Merck | S6297 | |
| Sodyum karbonat | Merck | S7795 | |
| Spektrofotometre | TECAN | Spark 10M | 137101 siyah plakalar kullanılıyorsa, üstten alma özelliğine sahip bir plaka okuyucu gereklidir. |
| Tween-20 | Merck | P7949 |
Kaynaklar
- Di Vincenzo, F., Del Gaudio, A., Petito, V., Lopetuso, L. R., Scaldaferri, F. Gut microbiota, intestinal permeability, and systemic inflammation: A narrative review. Intern Emerg Med. 19 (2), 275-293 (2024).
- Mu, Q., Kirby, J., Reilly, C. M., Luo, X. M. Leaky gut as a danger signal for autoimmune diseases. Front Immunol. 8, 598(2017).
- Sorini, C., et al. Loss of gut barrier integrity triggers activation of islet-reactive T cells and autoimmune diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (30), 15140-15149 (2019).
- An, J., et al. The role of intestinal mucosal barrier in autoimmune disease: a potential target. Front Immunol. 13, 871713(2022).
- Picco, P., et al. Increased gut permeability in juvenile chronic arthritides: a multivariate analysis of the diagnostic parameters. Clin Exp Rheumatol. 18 (6), 773-778 (2000).
- Dunleavy, K. A., Raffals, L. E., Camilleri, M. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel disease: underpinning pathogenesis and therapeutics. Dig Dis Sci. 68 (12), 4306-4320 (2023).
- Borrego-Ruiz, A., Borrego, J. J. Early-life gut microbiome development and its potential long-term impact on health outcomes. Microbiome Res Rep. 4 (2), 20(2025).
- Di Costanzo, M., De Paulis, N., Biasucci, G. Butyrate: A link between early life nutrition and gut microbiome in the development of food allergy. Life (Basel). 11 (5), 384(2021).
- Kindgren, E., Ahrens, A. P., Triplett, E. W., Ludvigsson, J. Infant gut microbiota and environment associate with juvenile idiopathic arthritis many years prior to disease onset, especially in genetically vulnerable children. eBioMedicine. 93, 104654(2023).
- Borowitz, S. M. The epidemiology of inflammatory bowel disease: clues to pathogenesis. Front Pediatr. 10, 1103713(2023).
- Leete, P., et al. The effect of age on the progression and severity of type 1 diabetes: potential effects on disease mechanisms. Curr Diab Rep. 18 (11), 115(2018).
- Francis, F., et al. Probiotic studies in neonatal mice using gavage. J Vis Exp. (143), e59074(2019).
- McClain, R. M., et al. Neonatal mouse model: review of methods and results. Toxicol Pathol. 29 (Suppl), 128-137 (2001).
- Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19, 98(2019).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Westerhout, J., Wortelboer, H., Verhoeckx, K. Ussing chamber. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , (2015).
- Hempstock, W., Ishizuka, N., Hayashi, H. Functional assessment of intestinal tight junction barrier and ion permeability in native tissue by Ussing chamber technique. J Vis Exp. (171), e62468(2021).
- Sjögren, E., Eriksson, J., Vedin, C., Breitholtz, K., Hilgendorf, C. Excised segments of rat small intestine in Ussing chamber studies: A comparison of native and stripped tissue viability and permeability to drugs. Int J Pharm. 505 (1), 361-368 (2016).
- Moussaoui, N., et al. Changes in intestinal glucocorticoid sensitivity in early life shape the risk of epithelial barrier defect in maternal-deprived rats. PLoS One. 9 (2), e88382(2014).
- Gleeson, J. P., et al. The enhanced intestinal permeability of infant mice enables oral protein and macromolecular absorption without delivery technology. Int J Pharm. 593, 120120(2021).
- Birchenough, G. M. H., et al. Postnatal development of the small intestinal mucosa drives age-dependent, regio-selective susceptibility to Escherichia coli K1 infection. Sci Rep. 7 (1), 83(2017).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
