Yöntem makalesi

Phytophthora palmivora'nın Agrobakteri Aracılı Dönüşümü İçin Basitleştirilmiş Bir Yöntem

DOI:

10.3791/69753

⸱

20 Mart 2026

 ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Georgia

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora palmivora'nın Agrobakteriya aracılı dönüşümü için basit, etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz; bu protokol P. capsici için de geçerlidir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora, çok sayıda yıkıcı bitki patojeni içeren bir oomycete cinsidir; bunlar arasında geniş konakçı alanına sahip P. palmivora türü de bulunur. Phytophthora'nın fonksiyonel genomiği, sağlam ve kolay uygulanabilir dönüşüm yöntemlerinin sınırlı bulunabilirliği nedeniyle kısıtlanmıştır. Mevcut yaklaşımlar arasında, Agrobakteriya aracılı dönüşüm (AMT) özellikle çekicidir çünkü minimum özel ekipman gerektirir ve genellikle tek kopya gen eklemeleriyle stabil transformanlar üretir. Mantar ve oomiset dönüşümü için çoğu AMT protokolü, Agrobakteriyel indüksiyon ve birlikte yetiştirme ortamında minimal ortam (MM) tuzları kullanır. Bu ortamların hazırlanması genellikle birden fazla stok çözelti yapıp karıştırmayı içerir; bazıları farklı konsantrasyonlarda çok sayıda bileşen içerir. Bu süreç zaman alıcı ve hata yapmaya açıktır, bu nedenle tutarsız dönüşüm başarısına yol açar. Burada, ticari olarak mevcut Murashige ve Skoog (MS) bazal ortamını kullanarak Agrobakteriya indüksiyonu ve birlikte yetiştirme ortamını hazırlayan A. palmivora için sade, basit ve tekrarlanabilir bir AMT protokolünü sunuyoruz. Bu protokol ayrıca P. capsici transformasyonunda başarılı bir şekilde uygulanmış olup, diğer Phytophthora türlerine de uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora, oomycete cinsi olarak, dünyanın en yıkıcı bitki patojenlerini içerir ve ciddi ekonomik kayıplara neden olur 1,2. Bunlar arasında, Phytophthora palmivora geniş kapsamlı bir konak patojenidir ve kakao ve papaya gibi ekonomik açıdan önemli birçok ürünüenfekte eder. Polikal çok yıllık bir ağac olan kakao'da siyah kamun çürümesinin en yaygın nedeni olan bu tür, milyarlarca dolarlık çikolata endüstrisinin ana bileşenini üreten 4,5,6. Bu yıkıcı patojenin moleküler patojenlik mekanizmalarını anlamak, yeni, etkili hastalık kontrol stratejileri tasarlamak için kritik öneme sahiptir ve genetik dönüşüm bu tür araştırmaları mümkün kılan temel bir araçtır.

Phytophthora türlerini dönüştürmek için mikroproje bombardımanı7, polietilen glikol ve kalsiyum diklorür (PEG/CaCl2) aracılı protoplastdönüşümü 8,9,10,11, zoospor elektroporasyonu 12,13,14 ve Agrobakteriya aracılı dönüşüm (AMT)15 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler geliştirilmiştir.16. Bu yaklaşımlar arasında AMT, genellikle tek kopya genentegrasyonu 15,16 üretir ve özel ekipman gerektirmeden nispeten kolaydır.

AMT kullanarak P. palmivora'nın verimli dönüşümü için bir protokol daha öncegeliştirilmiştir 16. Bu yöntemle, P. palmivora'yı çokluyapılar 17,18 ile başarıyla dönüştürdük. Bu yöntem, mantar ve oomycete dönüşümü için yaygın olarak kullanılan minimal ortam (MM) tuz bazlı Agrobakteriyel indüksiyon ve birlikte yetiştirmeortamı kullanır 15,16,19. MM tabanlı dönüşüm protokolünün dönüştürücü üretmede etkili olduğu gösterilse de, birden fazla stok çözümü hazırlayıp birleştirerek medya oluşturmak hem zaman alıcı hem de hataya açık bir iş olabilir.

Burada, Agrobakteriya indüksiyon ve birlikte yetiştirmeortamında MM tuz bazlı ortam bileşenlerini değiştirmek için ticari Murashige ve Skoog (MS) bazal ortamı kullanarak P. palmivora AMT'si için çok basitleştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, birden fazla kimyasal stok çözelti hazırlama ihtiyacını ortadan kaldırır, bu da süreci daha az zaman alıcı ve yüksek derecede tekrarlanabilir hale getirir. Ayrıca, bu yaklaşım daha önce tanımlananyöntem 16'ya kıyasla daha yüksek dönüşüm verimliliği sağlamış gibi görünmektedir ve P. capsici için de geçerlidir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dönüşüm için gerekli stok çözeltilerinin, ortamların ve diğer malzemelerin hazırlanması

  1. Antibiyotik stok çözeltileri
    1. Kanamisin (50 mg/mL), G418 (15 mg/mL) ve sefotaksim (100 mg/mL) stok çözeltilerini hazırlayın: Antibiyotiklerin uygun miktarlarını suda çözüp, çözeltileri filtre-sterilize edin, 1 mL alikotlar hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
    2. Rifampisin (15 mg/mL) stok çözeltisi hazırlayın: DMSO'da uygun miktarda rifampisin erit, 1 mL aliquotlar hazırlayın, folyoya sarın ve -20 °C'de saklayın.
      NOT: DMSO'da hazırlanan kimyasal çözeltileri, Naylon veya PTFE (Teflon) gibi DMSO uyumlu malzemelerden yapılmış şırınga filtreleriyle filtre-sterilize ettiğinizden emin olun.
  2. Agrobakteriyum büyümesi için medya
    1. Luria-Bertani (LB) sıvı ortam: 250 mL ortam hazırlamak için, 250 mL suya 6,25 g LB toz ekleyin, çözeltiyi otoklavlayın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
    2. LB agar ortamı: 250 mL ortam hazırlamak için, 250 mL suya 6,25 g LB tozu ve 3,75 g agar ekleyin, çözeltiyi otoklavlayın ve RT'de saklayın. Plakaları yapmadan önce erimiş LB agar'a uygun antibiyotikler ekleyin. Plakaları antibiyotiklerle takviye edilmiş şekilde 4 °C'de sakla.
  3. P. palmivora büyümesi ve dönüşümü için medya
    1. %10 V8 agar: 500 mL hazırlamak için, 450 mL suya 50 mL V8 orijinal 100% sebze suyu ekleyin. Sonra süspansiyona 0.5 g CaCO3 ekleyip iyi karıştırın. Çözeltiyi otoklav olarak yerleştirin ve tabaklara dökün.
      NOT: Gerektiğinde uygun antibiyotikler ekleyin. Plakaları antibiyotiklerle takviye edilmiş şekilde 4 °C'de sakla.
    2. Yarı güçlü Murashige ve Skoog (1/2 MS) sıvı ortam: 950 mL suya 2.15 g Murashige ve Skoog bazal ortamı (MS) ekleyin, 1 N KOH ile pH 5.6'ya ayarlayın ve 1 L'ye kadar su ekleyin. Doğrudan 1/2 MS agar yapmak için kullanın (adım 1.3.3), kalan 1/2 MS sıvıyı otoklav edin ve RT'de saklayın.
    3. Agrobakteri-zoospore ortak yetiştirici agar (AZCA) için 1/2MS agar: 600 mL AZCA hazırlamak için, 1.3.2. adımdan 567 mL 1/2 MS sıvıyı 9 g agar ile karıştırın. Çözümü otomatik olarak yerleştirip RT'de depolayın.
    4. %50 Gliserol: 50 mL gliserol ile 50 mL su karıştırın, çözeltiyi otoklavla geçirin ve RT seviyesinde saklayın.
    5. 1M MES (pH 5.6): 200 mL hazırlamak için, 160 mL suya 39.048 g MES Hydrate ekleyin, ardından pH değerini NaOH çözeltisiyle 5.6'ya ayarlayın. Sonra, 200 mL'ye kadar su ekleyin, çözeltiyi filtreyle sterilize edin ve karanlık koşullarda RT'de saklayın.
      NOT: MES pH arttıkça yavaş yavaş çözülür. Başlangıçta, pH seviyesini 5.6'ya yaklaştırmak için 10 N NaOH kullanın, bu da tozu neredeyse çözer. Sonra, pH tam olarak 5.6'ya getirmek için 1 N NaOH ekleyin.
    6. %20 Glikoz: 10 g glukozu 40 mL suda çözün, ardından 50 mL'ye kadar su ekleyip çözeltiyi filtreyle sterilize edin ve RT seviyesinde saklayın.
    7. 200 mM Asetosiringon (AS): 40 mg 4'-Hidroksi-3',5'-dimetoksiasetofenonu 1 mL DMSO'da çözün (bkz. 1.1.2 altındaki NOT) ve çözeltiyi folga ile örtün. Dönüşüm gününde taze yapın.
    8. Agrobakteriya indüksiyon ortamı (AIM): 40 mL ortam hazırlamak için, 400 μL %50 gliserol, 400 μL %20 glikoz, 1,6 mL 1 M MES (pH 5,6), 40 μL 200 mM AS'ye 37,6 mL 1/2 MS sıvı (pH 5,6) çözeltisi (1.3.2 adımda hazırlanmış) steril 50 mL tüpte ekleyin. Çözeltiyi iyi karıştırın, tüpü folyo ile kaplayın ve birkaç saat içinde taze kullanın.
    9. Agrobakteri-zoospore ortak yetiştirici agar (AZCA): 600 mL agar hazırlamak için, 6 mL %50 gliserol, 3 mL %20 glikoz, 24 mL 1 M MES (pH 5.6), 600 μL 200 mM AS eklenerek otoklavlanmış ve erimiş 567 mL 1/2 MS agar (pH 5.6) (1.3.3 adımda hazırlanmıştır). Çözeltiyi tabaklara dökün ve ışığı önlemek için siyah bir bezle örtün.
      NOT: Kimyasal çözeltileri, erimiş 1/2 MS agar'a (adım 1.3.9) sıcaklık 55-60 °C olduğunda ekleyin. 1.3.7-1.3.9 adımlarında kaputun ışıklarını kapatın çünkü AS ışığa duyarlıdır. Bu üç adımı dönüşüm gününde gerçekleştirin.
    10. Plich agar: 1 L agar hazırlamak için, 950 mL suda 0,5 g KH2PO4, 0,25 g MgSO4·7H2O, 1 g L-asparagine, 5 g glikoz, 0,5 g maya ekstraktı, 10 μL tiamin (100 mg/mL suda, 4 °C'de saklanıyor), 10 mg β-sitosterol (eklemeden önce 3 mL etanolde çözünür). Çözeltiyi karıştırıp tüm malzemeleri çözüp sonra hacmi 1 L'ye çıkar. Çözeltiyi 500 mL porsiyonlara ayırın ve her 500 mL'ye 7,5 g agar ekleyin. Çözeltiyi otoklavla geçirin ve sıcaklık 55 °C'ye düştüğünde uygun antibiyotikleri ekleyin, ardından tabaklara dökün.
    11. Hybond N+ Membranı: Koruyucu tabakalarla membranı 5 cm x 6 cm boyutlarında parçalara kesin, parçaları alüminyum folyoya sarın ve otoklavlayın. Otoklavlanmış zarı AZCA ortamına yerleştirirken, steril forsepsle tutun ve koruyucu levhaları atın.

2. P. palmivora Kültürü

  1. Dönüşümden yedi-sekiz gün önce, daha önce yetiştirilmiş Phytophthora kültüründen (veya stoktan) bir agar tıkaç yerleştirilerek yeni yapılmış %10 V8 agar tabaklarında P. palmivora papaya izole edilir.
    NOT: Daha yüksek bir zoospor konsantrasyonu elde etmek için taze hazırlanmış, temizlenmemiş %10 V8 agar kullanmak önemlidir.
  2. Levhaları 25 °C'de 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü altında 7-8 gün boyunca inkübe yapın ve dönüşüm gerçekleşene kadar.

3. Agrobacterium tumefaciens Hazırlanması

  1. Dönüşümden üç gün önce, A . tumefaciens çizgisi EHA105 süzümü LB agar plakasında pCB301TOR-GFP16 taşıyarak rifampisin (15 μg/mL) ve kanamisin (50 μg/mL) ile takviye edilmiştir. Plakayı 28 °C'de 2 gün kuluçka altına alın.
    NOT: Agrobacterium'un ilk hazırlanması (adım 3.1) dönüşümden bir hafta önce yapılabilir ve plakalar 2 günlük kuluçka döneminden sonra 4 °C'de saklanabilir.
  2. Dönüşümden bir gün önce, az miktarda Agrobacterium hücresi alın ve antibiyotiklerle desteklenen yeni bir LB agar plakasına yayın (3.1'de belirtildiği gibi), alt ve düz tabanı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün alt ve düz tabanı kullanılmıştır. Daha kolay yayım için, LB agar plakasının ortasına 20 μL LB sıvı ortam ekleyin, bakteri hücrelerini LB ortamıyla karıştırın ve ardından plaka boyunca eşit şekilde yayın. Plakayı gece boyunca 28 °C'de yaklaşık 16-18 saat kuluçka edin.
  3. Gece boyunca büyüyen hücreleri 1 mL pipet ucu ile alıp 1 mL Agrobacterium indüksiyon ortamına (AIM) yukarı aşağı pipet ile tekrar süzülür. Hücreleri, folyo ile kaplı steril 50 mL bir tüpte AIM ile OD600 = 0.4'e kadar seyreltin. P . palmivora zoosporlarıyla birlikte kuluçka için en az 5 mL alın (adım 5.1).
    NOT: 0.1 ile 0.8 arasında değişen bir OD600 başarılı dönüşüm sağlar. OD600 = 0.4, minimum ortam (MM) tuz bazlı Agrobakteriya indüksiyonu ve birlikte yetiştirme ortamı kullanılarak en yüksek dönüşüm verimliliğini sağladığı için rutinolarak kullanılır 16.
  4. Bakterileri RT'de karanlık koşullarda 1,5-2 saat boyunca platform çalkalayıcıda hafif bir çalkalama (yaklaşık 70 rpm) inkübe edin.
    NOT: 3.3. adımda kaputun ışıklarının kapalı tutulması ve kuluçka sırasında 50 mL tüpün kapağının gevşemesi (3.4. adım) önerilir.

4. Zoosporların serbest bırakılması

  1. Agrobacterium tumefaciens kuluçkasının 1 saati (adım 3.4) sonra, 7-8 günlük P. palmivora plakasını 4°C'de önceden soğutmuş 10 mL suyla doldurun, ortam yüzeyindeki hava kabarcıklarını pipet ucuyla hafifçe vurarak çıkarın ve plakayı 4 °C'de 15 dakika kuluçkalayın, ardından ışık altında RT'de 15 dakika inkubasyon yapın.
  2. Serbest bırakılan zoosporları (yaklaşık 7-8 mL) pipetle 15 mL'lik steril santrifüj tüpüne misel ve sporanjları rahatsız etmeden nazikçe aktarın.
  3. Zoospor konsantrasyonunu ölçmek için, zoospor süspansiyonunun bir kısmını (örneğin 20 μL) 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve suyla 10 kez seyreltilin (20 μL zoosporlar için 180 μLH 2O). Tüpü 1 dakika girdabla sayır, böylece zoosporları kolayca saymak için enkist olur, ardından mikroskop altında hemasitometre ile zoospor sayısını sayar. Sayılan sayıyı 10 katına çarparak 4.2. adımda hazırlanan zoospor süspansiyonunun konsantrasyonunu belirleyin.
    NOT: Dönüşüm verimliliği hesaplanmak için zoospore konsantrasyonu ölçülür. Genellikle 1.5 × 106 ile 5 × 106 zoospor /mL arasında değişen konsantrasyonlar kullanırız ve dönüşüm başarısı sağlar.

5. Agrobakteriyel ve zoosporların birlikte kuluçka aşaması

  1. 5 mL Agrobakteriyel (3.4. adımda hazırlanmış) ile 5 mL zoospor süspansiyonu (4.2. adımda hazırlanmış) ile folga ile kaplı steril 50 mL tüpte ekleyin. Tüpü RT'de 2 saat karanlıkta nazikçe karıştırıp inkübe yapın. Kapağı gevşek tutun ve birlikte kuluçka sırasında tüpü sallamayın.
  2. Birlikte kuluçka döneminde (adım 5.1), AZCA plakalarını hazırlayın (adım 1.3.9). Ortam katılaştığında, her AZCA plakasına bir parça sterilize edilmiş Hybond N+ membranı (1.3.11 adımında hazırlanmış) yerleştirin ve plakaları karanlıkta tutun.
  3. Agrobakteriyel ve zoosporun birlikte kuluçka aşamasından (5.1. adım) 2 saat sonra, karışımın 300 μL miktarını AZCA plakalarının üstüne yerleştirilen her bir Hybond N+ membranına (5.2. adım) pipet ucu ile yayarak kenarları sıvıdan arındırın.
  4. Petri kaplarını açıkta bırakarak karışımı kaputu içinde yaklaşık 10 dakika hava kurutmasına izin verin. Membrandaki çözelti akmayı durdurur durmaz plakaları kapatın.
    NOT: 5.1-5.4. adımlarda kaputun ışıklarını kapalı tutun. Gerekirse, karışımı membranlara ekleyip yayırken ışıklar kullanın (adım 5.3).
  5. Hava kurutmadan sonra, plakaları 2 gün boyunca karanlıkta 25 °C sıcaklıkta kuluçka yapın.

6. G418 dirençli dönüştürücülerin seçimi

  1. 48 saat birlikte kuluçka sonrası (adım 5.5), Hybond N+ zarlarını sterilize edilmiş forseps kullanarak ters olarak G418 (30 μg/mL) ve sefotaksim (100 μg/mL) ile takviye edilmiş Plich agar plakalarına aktarın. Zarları levhalara yerleştirirken, onları medium yüzeyine sürüklemeyin.
    NOT: Her P. palmivora izolatı için dönüştürücü seçimi için G418 konsantrasyonu belirlenmelidir; çünkü farklı izolatlar için farklı hassasiyet seviyeleri gözlemlenmektedir. Bunu yapmak için, Plich agar plakalarının merkezine 0,5 cm çapında miselyum tıkaç yerleştirin ve sıfırdan başlayarak 5 μg/mL aralıklarla bir dizi G418 konsantrasyonu ile desteklenir. Her konsantrasyon için üç replikat plaka hazırlayın. Plakaları 25 °C'de 7 gün boyunca kuluçka altına alın. Phytophthora izolatının büyümesini tamamen engelleyen en düşük G418 konsantrasyonunu belirleyin ve bunu dönüştürücü seçimi için kullanın.
  2. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün düz tabanını kullanarak membranın yüzeyini nazikçe bastırıp kaydırarak ortamla yakın temas halinde olduğundan emin olun. Membran ile ortam arasında hava kabarcıklarının olup olmadığını kontrol etmek için plakaların alt tarafını gözlemleyin. Hava baloncuğunu, varsa, aynı mikrosantrifüj tüpünün düz tabanını kullanarak nazikçe sıkın.
  3. Plakaları 25 °C'de 2-3 gün boyunca 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü altında kuluçka edin.
  4. 3 gün kuluçkadan sonra, zarları steril forseps ile çıkarın ve plakaları aynı koşullarda kuluçka edinmeye devam edin. Plakalarda görünür koloniler beliriyorsa zarlar 2 gün sonra çıkarılabilir.
    NOT: Dönüştürücüler genellikle membran çıkarıldıktan sonra 1-3 gün içinde ortaya çıkar, ancak bazı koloniler daha sonra ortaya çıkabilir. Daha fazla dönüştürücü elde etmek için, zarlar çıkarıldıktan sonra plakaları yaklaşık bir hafta boyunca izleyin.
  5. Dönüştürücüleri, aynı G418 konsantrasyonuna veya %30 azaltılmış konsantrasyona sahip %10 V8 agar plakalarına aktarın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolü takip ederek, pCB301TOR-GFP16 taşıyan A. tumefaciens EHA105 kullanarak P. palmivora'yı dönüştürmek için iki bağımsız deney gerçekleştirdik. Beklendiği gibi, zoosporların Agrobacterium ile birlikte inkubasyonu, 30 μg/mL G418 ile takviye edilmiş Plich agar plakalarında G418'e dirençli koloniler elde ederken, kontrol plakalarında Agrobacterium ile enfeksiyon olmadan koloni gözlemlenmemiştir (Şekil 1A). Bu iki deneyden elde edilen10.7 zoosporda G418'e dirençli dönüştürücü sayısı sırasıyla 55 ve 50 idi (Tablo 1), bu da önceki protokol16 ile elde edilen en yüksek sayının (27 ± 5) neredeyse iki katıdır.

Gerçek dönüştürücüler iki yöntemle doğrulandı: Birincisi, floresans mikroskobu kullanılarak GFP floresansının gözlemlenmesi, ikincisi ise EGFP geninin 550 bp fragmanının Taq 2X Master Mix (NEB) ile primer çifti EGFP-F2 (5'- GACGTAAACGGCCACAAGTTC-3') ve EGFP-R2 (5'-GGGTGGTCAGGTGGTTG-3') ile PCR amplifikasyonu. Deney (Deneyim) 1'de, 18 G418 dirençli dönüştürücüden 15'i ve Deneyim 2'de 21 dönüştürücüden 17'si GFP floresansı sergilemiştir (Tablo 1, Şekil 1B). Her iki deneyde de floresans göstermeyen yedi G418 dirençli dönüştürücü için üçünün PCR ile gerçek dönüştürücü olduğu doğrulandı (Şekil 1C). Toplamda, gerçek dönüştürücü oranı %90 olarak tahmin edilmiştir.

Ayrıca, protokolü takip ederek pCB301TOR-GFP taşıyan A. tumefaciens EHA105 kullanarak, zoospor süspansiyonlarının hazırlanmasında küçük bir değişiklik yapıldı (7 günlük bir P. capsici plakasını önceden soğutmuş su ile doldurduktan sonra 4 °C sıcaklıkta kuluçka süresi 30 dakikaya uzatıldı) P. capsici kabak izolasyonunu başarıyla dönüştürdük. Tek bir deneyde 107 başına G418 (30 μg/mL) dirençli dönüştürücü sayısı 13 idi. Dokuz dönüştürücü floresan mikroskobu altında gözlemlendi ve hepsi floresans üretti (Ek Dosya 1), bu da gerçek dönüştürücü olduklarını gösteriyor.

figure-results-1
Şekil 1: P. palmivora'nın pCB301TOR-GFP taşıyan A. tumefaciens EHA105 kullanılarak dönüşümü. (A) Plich agar üzerinde G418'e dirençli P. palmivora dönüştürücülerinin 30 μg/mL G418 ile desteklenmiş görünümü. (B) Temsilci bir dönüştürücü ve P. palmivora vahşi tip (WT) suşunda floresan mikroskobu altında GFP ekspresyonunun tespiti. Görüntüler hem parlak alan (BF) hem de GFP floresans kanalları altında çekildi. (C) Tespit edilebilir GFP floresanslı dört transformanttan ve yedi GFP floresansı olmayan transformanttan EGFP'nin PCR amplifikasyonu. Evrensel primer çifti ITS4/ITS520, DNA bütünlüğünü kontrol etmek için iç transkribe edilmiş aralıklı (ITS) bölgesini amplifikasyon amacıyla kullanıldı. GFP floresansı olmayan transformantlar kalın ve altı çizilmiş metinle vurgulanmıştır. Kısaltmalar: M = NEB 100 bp DNA merdiveni; WT = yabani tip P. palmivora P1 izolat; N = H2O şablonu kullanan negatif kontrol PCR. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

DeneyAgrobakteriya'nın OD 600'üZoospor konsantrasyonu (/mL)Zoospore hacmi (mL)G418'e dirençli dönüştürücü sayısıAlgılanabilir GFP sinyaline sahip dönüştürücü sayısı (Tespit edildi / Gözlemlendi)G418 dirençli dönüştürücü sayısı/ 107 zoospor
10.41.8 x 1064.34315/1855
20.42.9 x 1064.66717/2150

Tablo 1: P . palmivora'nın A. tumefaciens EHA105 kullanılarak pCB301TOR-GFP taşıyan Agrobakteri aracılı dönüşümünün verimliliği.

Ek Dosya 1: Floresan mikroskopu altında yabani tip (WT) P. capsici ve pCB301TOR-GFP taşıyan A. tumefaciens EHA105 kullanılarak üretilen temsili bir dönüştürücü ile GFP ifadesi. Görüntüler hem parlak alan (BF) hem de GFP floresans kanalları altında çekildi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Agrobakteriya indüksiyonu ve oomycete ile mantar dönüşümü için ortak yetiştirme ortamında yaygın olarak kullanılan minimal ortam (MM) tuzlarının bileşenlerini değiştirmek için yarı güçlü Murashige ve Skoog bazal ortamı (1/2 MS) kullanır. MM tuz bazlı ortamın hazırlanması, birçok bireysel kimyasaldan birden fazla stok çözelti yapılmasını ve ardından bu çözeltilerin birleştirilmesinigerektirir 19. 1/2 MS ayrıca birçok kimyasal bileşen içerir; ancak MS ticari olarak önceden karıştırılmış toz olarak yaygın olarak bulunduğundan, ortam hazırlama işlemi tozun suda çözülmesine kadar basitleştirilmiştir. Bu değişiklik, ortam hazırlama süresini önemli ölçüde azaltır ve insan hatası potansiyelini en aza indirir. Ayrıca, protokol dönüşüm verimliliğini artırır ve daha önce tanımlanan AMTyöntemi 16'ya kıyasla daha fazla dönüştürücü sağlar. Ayrıca P. capsici dönüşümünde etkilidir ve muhtemelen diğer Phytophthora türlerine de uygulanabilir. Daha geniş uygulama potansiyelini desteklemek amacıyla, MS bazlı ortam daha önce AtVIP1 (Arabidopsis thaliana VirE2-enteraktif protein 1) ve P. infestans zoospores eksprese eden Agrobacterium tumefaciens suşlarının birlikte kültürlenmesinde kullanılmıştır; bu da P. infestans21'in başarılı dönüşümünü mümkün kılmıştır.

Bu protokolün düşük bir yüzde yanlış pozitif üretebileceğini belirtmek önemlidir. GFP floresans gözlemi veya PCR ile test edilen 39 G418 dirençli dönüştürücüden dördü ne floresans ne de EGFP'nin amplifikasyonu göstermedi (Tablo 1, Şekil 1C). Agrobakteri aracılı dönüşüm sırasında T-DNA'nın kısmi entegrasyonu nadirolmadığından, pCB301TOR-GFP16 plazmidinden NPTII genini içeren T-DNA'nın yalnızca bir kısmının P. palmivora genomuna entegre olması mümkündür. Alternatif olarak, yanlış pozitifler zar ile seçici ortam arasında yetersiz temas nedeniyle ortaya çıkabilir ve bu da G418 seçiminden kaçmaya olanak tanır. Bu nedenle, zarın ortamla tam temas halinde kalmasını sağlamak (adım 6.2) gereklidir.

Bu protokol daha da basitleştirilebilir. Örneğin, Agrobakteriyel indüksiyon ortamında (AIM) MES ve Agrobakteriya-zoospor ortak yetiştirme agarı (AZCA) potansiyel olarak çıkarılabilir. MES, biyokimya ve moleküler biyoloji deneylerinde stabil pH korumak için genellikle bir tamponlayıcı ajan olarak kullanılır; ancak pH 5.6'da 1 M MES stok çözeltisi hazırlamak yeterli zaman alır ve maliyeti artırır. Tatlı fesleğen24 vepapaya 25 gibi bitkilerin AMT'sinde, benzer MS tabanlı Agobakteriya indüksiyonu ve MES'siz ortak yetiştirme ortamı kullanılmıştır; bu da MES'in P. palmivora dönüşümü için gerekli olmayabileceğini göstermektedir. MES'in eksikliğinin dönüşüm verimliliğini bozmadığını doğrulamak için daha fazla deney yapılmalıdır.

Genel olarak, bu basitleştirilmiş protokol P. palmivora, P. capsici ve potansiyel olarak diğer oomycetes'in rutin genetik manipülasyonu için pratik ve erişilebilir bir platform sağlar. Bazıları translasyonel potansiyele sahip olan geniş kapsamlı temel çalışmaları destekler; bunlar arasında enfeksiyon dinamiklerini takip etmek için patojenlerin floresan etiketlenmesi, hücre altı lokalizasyonu incelemek için proteinlerin etiketlenmesi ve gen ifadesi veya protein kodlama dizilerinde hedefli değişiklikler yoluyla fonksiyonel analizler bulunur. CRISPR tabanlı genom düzenleme ile birleştiğinde, protokolün bu yıkıcı patojenlerde patojenlik mekanizmalarının ve temel virülans faktörlerinin tanımlanmasını hızlandırması beklenmektedir. Ortaya çıkan içgörüler, yeni, mekanizma tabanlı hastalık kontrol stratejilerinin geliştirilmesini mümkün kılacaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (NSF Ödülü No. 2418799) ve Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü (NIFA Ödülü No. 2023-67013-42262) tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL Mikrosantrifüj TüpleriVWR525-1126
4'-Hidroksi-3',5' dimetoksiasetofenonTCID2666Asetosiringon (AS)
50 mL TüpGreiner Bio-one227261
Mutlak EtanolFisher BiyoreaktifleriBP28184
AgarFisher BiyoreaktifleriBP1423-500
Alüminyum folyo
Hybond-N+ membranı (30 cm ve 3 m)CytivaRPN303B
Kalsiyum karbonatSigma-Aldrich239216-500GCaCO3
Sefotaksim sodyum tuzuTermobilimsel KimyasallarAAJ6269006
D-(+)-GlikozSigma-AldrichG8270-1KG
DNeasy PowerLyzer Mikrobiyal KitiQiagen12255-50
Forseps
Flüoresans mikroskobuZeissZEISS Aksiyoskop 5 floresans mikroskobu filtre seti 38 HE
G418 sülfatTermobilimsel KimyasallarAC329400010
GliserolSigma-Aldrich911046-1L
Hemacytometer (Parlak Çizgi)Hausser Scientific
Kanamisin sülfatSanta Cruz BiyoteknolojisiSC-257635
L-Asparagine susuzMP BiyomedikalICN10079425
LB Broth, MillerFisher BiyoreaktifleriBP1426-2
Magnezyum sülfat heptahidratSigma-Aldrich63138-250GMgSO4· 7H2O
MES HydrateSigma-AldrichM2933-100G
Murashige ve Skoog Bazal OrtamıSigma-AldrichM5519-50L
Petri Kabı (100 mm x 15 mm)VWR25384-342
Potasyum dihidrojen fosfatSigma-Aldrich1370391000KH2PO4
RifampisinSanta Cruz BiyoteknolojisiSC-200910
Taq 2X Master MixNEBM0270L
Tiamin hidroklorürSigma-AldrichT4625-5G
UV-Görünür SpektrofotometreFisher Scientific14-385-355
V8 Orijinal %100 Sebze SuyuCampbell Çorba Şirketi
VortexerFisher Scientific14-955-163
SuMoleküler Biyoloji Derecesi, Mill-Q su arıtma sistemi kullanılarak arıtılmış
Maya EkstraktıACROS611805000Şu anda Thermo Scientific Chemicals aracılığıyla mevcut
β-SitosterolSigma-Aldrich85451-100G

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamoun, S., et al. The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 16 (4), 413-434 (2015).
  2. Jones, J. D., Staskawicz, B. J., Dangl, J. L. The plant immune system: From discovery to deployment. Cell. 187 (9), 2095-2116 (2024).
  3. Tocafundo, F., et al. Direct and cross-pathogenicity of Phytophthora palmivora against cacao, papaya, and peach palm. Trop Plant Pathol. 46 (6), 664-673 (2021).
  4. Morales-Cruz, A., et al. Independent whole-genome duplications define the architecture of the genomes of the devastating West African cacao black pod pathogen Phytophthora megakarya and its close relative Phytophthora palmivora. G3 (Bethesda). 10 (7), 2241-2255 (2020).
  5. Ali, S., et al. PCR-based identification of cacao black pod causal agents and identification of biological factors possibly contributing to Phytophthora megakarya's field dominance in West Africa. Plant Pathol. 65 (7), 1095-1108 (2016).
  6. Marelli, J. -P., et al. Chocolate under threat from old and new cacao diseases. Phytopathology. 109 (8), 1331-1343 (2019).
  7. Cvitanich, C., Judelson, H. S. Stable transformation of the oomycete, Phytophthora infestans, using microprojectile bombardment. Curr Genet. 42 (4), 228-235 (2003).
  8. Judelson, H. S., Tyler, B. M., Michelmore, R. W. Transformation of the oomycete pathogen, Phytophthora infestans. Mol Plant Microbe Interact. 4 (6), 602-607 (1991).
  9. Wang, W., et al. an oxathiapiprolin-resistance gene, functions as a novel selection marker for Phytophthora transformation and CRISPR/Cas9 mediated genome editing. Front Microbiol. 10, 2402(2019).
  10. Dai, T., et al. An improved transformation system for Phytophthora cinnamomi using green fluorescent protein. Front Microbiol. 12, 682754(2021).
  11. Fang, Y., Cui, L., Gu, B., Arredondo, F., Tyler, B. M. Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9. Curr Protoc Microbiol. 44 (1), 21A.1.1-21A.1.26 (2017).
  12. Evangelisti, E., Yunusov, T., Shenhav, L., Schornack, S. N-acetyltransferase AAC (3)-i confers gentamicin resistance to Phytophthora palmivora and Phytophthora infestans. BMC Microbiol. 19 (1), 265(2019).
  13. Dong, L., et al. Establishment of the straightforward electro-transformation system for Phytophthora infestans and its comparison with the improved PEG/CaCl2 transformation. J Microbiol Methods. 112, 83-86 (2015).
  14. Huitema, E., Smoker, M., Kamoun, S. A straightforward protocol for electro-transformation of Phytophthora capsici zoospores. Methods Mol Biol. 712, 129-135 (2011).
  15. Vijn, I., Govers, F. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans. Mol Plant Pathol. 4 (6), 459-467 (2003).
  16. Wu, D., Navet, N., Liu, Y., Uchida, J., Tian, M. Establishment of a simple and efficient Agrobacterium-mediated transformation system for Phytophthora palmivora. BMC Microbiol. 16 (1), 204(2016).
  17. Gumtow, R., Wu, D., Uchida, J., Tian, M. A Phytophthora palmivora extracellular cystatin-like protease inhibitor targets papain to contribute to virulence on papaya. Mol Plant Microbe Interact. 31 (3), 363-373 (2018).
  18. Pettongkhao, S., Navet, N., Schornack, S., Tian, M., Churngchow, N. A secreted protein of 15 kDa plays an important role in Phytophthora palmivora development and pathogenicity. Sci Rep. 10 (1), 2319(2020).
  19. Minz, A., Sharon, A. Electroporation and Agrobacterium-mediated spore transformation. Molecular and Cell Biology Methods for Fungi. Sharon, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 21-32 (2010).
  20. Bellemain, E., et al. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: An in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10 (1), 189(2010).
  21. Wang, L., et al. A modified Agrobacterium-mediated transformation for two oomycete pathogens. PLoS Pathog. 19 (4), e1011346(2023).
  22. Wu, E., et al. Optimized Agrobacterium-mediated sorghum transformation protocol and molecular data of transgenic sorghum plants. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 50 (1), 9-18 (2014).
  23. Sun, L., et al. TDNAscan: A software to identify complete and truncated T-DNA insertions. Front Genet. 10, 685(2019).
  24. Navet, N., Tian, M. Agrobacterium-mediated transformation of sweet basil (Ocimum basilicum). Bio Protoc. 10 (22), e3828-e3828 (2020).
  25. Hasley, J., Dinulong, R. -J., Adhikari, A., Christopher, D., Tian, M. Genome editing of papaya using both Cas9 and Cas12a. bioRxiv. , (2025).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Agrobacterium TransformationPhytophthora PalmivoraZoospore Co IncubationGFP ExpressionGene Function AnalysisFluorescence MicroscopyOomycete TransformationMurashige Skoog MediumG418 SelectionProtein Localization

İlgili makaleler