Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Dairesel RNA ZBTB46 , lipopolisakkarit hasarlı insan endotel hücrelerinde apoptoz ve oksidatif stresi ERBB2-AKT sinyalini modüle ederek azaltır

248 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69765

⸱

13 Şubat 2026

1Department of Emergency, Fuzhou University Affiliated Provincial Hospital, Fujian Provincial Hospital, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Emergency Medicine

Bu makalede

Özet

Sepsis ile ilişkili akut böbrek hasarı (SA-AKI) önemli ölüm oranlarıyla ilişkilidir. Bu çalışma, LPS kaynaklı HUVEC'lerde (in vitro SA-AKI) circZBTB46'nın aşağı regülasyonunu ortaya koymaktadır. Aşırı ekspresyonu, HUVEC canlılığını artırır, apoptoz, iltihaplanma ve ERBB2/AKT sinyalizasyonu ile birlikte oksidatif stresi azaltır; bu da SA-AKI ile ilgili potansiyel bir terapötik hedef olduğunu gösterir.

Özet

Dairesel RNA'lar, stres yanıtlarının yeni düzenleyicileridir, ancak sepsis kaynaklı akut böbrek hasarına yol açan endotel hasarındaki rolleri henüz tam olarak tanımlanmamıştır. Dairesel RNA ZBTB46'nın (circZBTB46) ERBB2-AKT sinyalini aktive ederek endotel koruması sağladığını hipotezimiz yaptık. İnsan göbek ven endotel hücrelerinin lipopolisakkarid ile zorlandığı hücre tabanlı bir model kullanarak, circZBTB46 ekspresyonunu nicelikle ölçüledik ve zorla ekspresyonunun hayatta kalma, apoptoz, inflamatuar aracılar ve redoks homeostazı üzerindeki etkilerini test ettik. Hücre canlılığı testleri ve akış sitometrisi, hayatta kalma ve apoptozu değerlendirdi. Enzimle bağlantılı immünosorbent testler interleukin-6, tümör nekrozi faktör-α ve interlökin-1β ölçürken, reaktif oksijen türleri olan malondialdehit, süperoksit dismutaz ve katalaz oksidatif hasar ve antioksidan kapasite indeksleri olarak değerlendirildi. Mekanizmayı tanımlamak için gen seti zenginleştirme analiziyle transkriptom profili yaptık, Western blotting ile yol proteinlerini doğruladık ve ERBB2 inhibitörü AG-825 kullanılarak gerekliliği değerlendirdik. Lipopolisakkarit baskılanmış circZBTB46. CircZBTB46 aşırı ekspresyonu, canlılığı artırdı, apoptozu düşürdü, pro-inflamatuar sitokinleri ve reaktif oksijen türlerini azalttı, malondialdehit miktarını azalttı ve süperoksit dismutaz ile katalaz aktivitelerini artırdı. Transkriptomik ve protein analizleri ERBB2-AKT ekseninin aktivasyonunu destekledi ve farmakolojik ERBB2 blokajı sitoprotektasyonu köreltdi ve redoks dengesindeki kazanımları tersine çevirdi. Bu bulgular, circZBTB46'yı ERBB2-AKT sinyalizasyonu yoluyla lipopolisakkarit kaynaklı endotel hasara endogen bir fren olarak tanımlıyor ve circZBTB46'yı sepsis kaynaklı akut böbrek hasarı için mekanik bir düğüm ve potansiyel terapötik hedef olarak belirliyor.

Giriş

Sepsis, patojenik istila ile başlayan, hayatı tehdit eden sistemik inflamatuar bir zincirleme olarak sıkça çoklu organ yetmezliğiylesonuçlanır 1. Bu kritik bağlamda, SA-AKI yoğun bakım ünitelerinde baskın ve klinik olarak önemli bir komplikasyonolarak ortaya çıkar 2. Sistemik enfeksiyonla eşzamanlı olarak böbrek filtrasyon kapasitesinin ani bozulmasıyla karakterize edilen bu durum, klinik kohortlarda septik olmayan AKI'den %38-%42 oranında ölümoranlarını gösterir 2. Sepsis veya septik şok tanısı konan bireylerin yaklaşık %60'ında SA-AKI3 gelişmesi beklenmektedir. Bu nedenle, SA-AKI yoğun bakımda büyük bir zorluk haline gelmiş ve hastalık ile ölümlülüğe önemli katkısağlamıştır 4. Şu anda SA-AKI'nin mekanizması tam olarak anlaşılmamaktadır. Preklinik çalışmalar mikro sirkülasyon fonksiyon bozuklukları, hücresel metabolizmada değişiklikler ve renin-anjiyotensin-aldosteron sistemi (RAAS) içindeki dengesizlikler, mitokondriyal disfonksiyon ve inflamatuar düzensizlik ile ilgili olsa da, SA-AKI'nin patofizyolojik mekanizması hâlâ anlaşılmamaktadır ve şu anda erken tanı ve devam eden yönetimi destekleyecek optimal önlemlereksikliği vardır 5,6,7,8 . SA-AKI yüksek apoptoz, aşırı oksidatif stres ve iltihaplanmaiçerir 9. Bu araştırma çerçevesi içinde, lipopolisakkarit (LPS), insan göbek ven endotelyal hücrelerinde (HUVEC) sepsis ile ilişkili AKI belirtilerini taklit etmek için in vitro sistemde ön hedef keşfiiçin kullanılmıştır 5.

Son yıllarda, kodlamayan RNA moleküllerinin yeni tanımlanmış bir kategorisi olan dairesel RNA'lar (circRNA'lar) çeşitli hastalıklardaki rolleri nedeniyle giderek daha fazla ilgi görmektedir10. CircRNA'lar kararlı dairesel yapıya sahiptir ve mikroRNA'lar (miRNA'lar) için moleküler sünger olarak hizmet vererek, gen transkripsiyonunu düzenleyerek veya protein etkileşimlerinde bulunarak hücresel fizyolojik ve patolojik süreçlerekatılır 11. Araştırmalar, circRNA'ların iltihaplanma, oksidatif stres ve apoptotik yolları modüle etmede kritik rol oynadığını göstermiştir; bu da sepsis ve ilgili durumlar, özellikle akut böbrek hasarı dahil olmak üzere, olası etkilerine yönelik araştırma odaklarının artmasına yolaçmıştır 12. Örneğin, hsa_circ_0072463 SA-AKI13 için umut vadeden bir tanısal belirteç ve terapötik hedef olarak tanımlanmıştır. Circ_001653, BUD1314'ün işe alınmasıyla SA-AKI'yi yatıştırdığı bildirildi. Ancak, SA-AKI'deki circRNA'ların işlevsel önemi büyük ölçüde keşfedilmemiştir.

Bu çalışma, circZBTB46'nın endotel hücre fonksiyonu, oksidatif stres ve inflamatuar yanıtlar üzerindeki etkisini in vitro SA-AKI sistemi kullanılarak incelemek için tasarlanmıştır. LPS kaynaklı bir HUVEC modeli oluşturarak, endotoksin uyarısı altında endotel hasarını araştırdık. LPS ile zorlanmış HUVEC'lerin, sepsis ile ilişkili akut böbrek hasarının çok faktörlü patofizyolojisiyle ilgili ancak eşdeğer olmayan indirgemeci endotoksin/TLR4 kaynaklı endotel stres modelini temsil ettiğini belirtmek gerekir. Bu model öncelikle TLR4 aracılı inflamatuar aktivasyon, oksidatif stres ve apoptozla ilişkili endotel yanıtlarını yakalarken, hemodinamik değişiklikler, komplement ve pıhtılaşma zincirleri, hasarla ilişkili moleküler desenler ve heterojen mikrobiyal uyarılar gibi temel in vivo bileşenleri çıkarır. Bu deneysel çerçeve içinde, circZBTB46'nın ERBB2 sinyal yolunu modüle ederek LPS kaynaklı oksidatif stres ve apoptozu hafifledip hafifletip azaltıp azaltmadığını ve böylece endotel hücre fonksiyonunu koruyup korumadığını araştırdık. Bildiğimiz kadarıyla, bu çalışma sepsis ile ilişkili akut böbrek hasarı bağlamında circZBTB46'yı endotel stres yanıtlarıyla ilişkilendiren ilk kanıtı sunmaktadır. CircZBTB46 aracılı endotel korumanın altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatarak, bu araştırma SA-AKI'nin patojenik mekanizmalarının anlaşılmasını derinleştirebilir ve circRNA merkezli yenilikçi terapötik yaklaşımların yolunu açabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, circZBTB46 modülasyonunun HUVEC'lerde inflamatuar sinyalleşme, oksidatif stres ve ERBB2-AKT yol aktivasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılan deneysel prosedürleri açıklar.

Hücre kültürü
Bu çalışmada kullanılan HUVEC hücreleri ticari bir kaynaktan elde edilmiştir. HUVEC'ler, geniş erişilebilirlikleri, tekrarlanabilir kültür koşulları ve yüksek transfeksiyon verimliliği nedeniyle temsilli bir endotel hücre modeli olarak kullanılmıştır; bu da inflamatuar stres altında endotel sinyal yollarının genetik manipülasyonu ve mekanik incelenmesini kolaylaştırır15,16. HUVEC'ler, %10 (v/v) fetal sığır serumu ve %1 konsantrasyonda antibiyotik-antimikotik kokteyli takviye edilmiş DMEM'de kültürlendi. Tüm hücre kültürleri, standart fizyolojik koşullar altında nemlendirilmiş bir odada (37 °C, %5 CO2) tutuldu; bu da sürekli hücresel proliferasyonu teşvik ederken >%95 canlılığı koruyarak trypan blue hariç testi ile doğrulandı. Endotel spesifik ortamlar (örneğin, EGM-2 veya endotel büyüme takviyeleriyle desteklenen M199) uzun vadeli HUVEC bakımı için yaygın olarak önerilse de, bu çalışmada deneysel tedaviler arasında tutarlılık sağlamak ve LPS stimülasyonu ile farmakolojik inhibitör testleriyle uyumluluğu sağlamak için DMEM kullanılmıştır. AG-825 inhibitör testleri için, HUVEC'leri 10 μM AG-825 içeren taze DMEM ile 1 saat kuluçka edin. Sonra, LPS çözeltisini kuyulara ekleyerek nihai konsantrasyon 10 μg/mL elde edilir ve kültüre 24 saat devam eder. Olası fenotipik kaymayı en aza indirmek için, HUVEC'ler düşük geçiş sayılarında kullanıldı ve sadece kısa süreli testler için DMEM tabanlı deneysel koşullara maruz bırakıldı. Tüm fonksiyonel deneyler, uzun süreli kültür döneminde değil, tanımlanmış tedavi aralıkları içinde gerçekleştirilmiştir.

Hücre transfeksiyonu
circZBTB46'nın biyolojik rolünü aydınlatmak için, aşırı ekspresyon plazmidleri (oe-circZBTB46) ve eşleşen negatif kontrol yapıları (oe-NC) GenScript tarafından sentezlenip doğrulandı. HUVEC'ler, 1 x 10⁵ hücre/kuyu yoğunluğunda 6 kuyu plakalarına tohumlanarak transfeksiyon anında ~%70-%80 birleşime ulaşmak üzere gece boyunca kültürlendi. Her kuyu için, 2,5 μg plazmid DNA'sı (oe-circZBTB46 veya oe-NC) 125 μL indirgenişlemiş serum ortamında seyreltildi ve 2,5 μL P3000 reaktifiyle (Tüp A) karıştırıldı. Paralel olarak, 3,75 μL Lipofektamin 3000 125 μL indirgenişlemiş serum ortamında (Tüp B) seyreltilmiştir. Tüp A ve Tüp B daha sonra birleştirilip nazikçe karıştırıldı ve oda sıcaklığında 15-20 dakika kuluçka içinde kulübe geçirilerek kompleks oluşumu sağlandı (nihai kompleks hacm: 250 μL/kuyruk). Kompleksler, antibiyotiksiz tam ortamda hücrelere damla olarak eklendi. 37 °C, %5CO2 sıcaklıkta 6 saat kuluçka yaptıktan sonra, transfeksiyon ortamı taze tam büyüme ortamı ile değiştirildi. Hücreler, sonraki testlerden önce 48 saat kültürlendi. Tüm prosedürler üreticinin talimatlarına uydu.

LPS kaynaklı model
In vitro SA-AKI modeli oluşturmak için, oe-circZBTB46 veya NC ile transfekte edilen HUVEC'ler (5 x 105 hücre/kuyruk) 96 kuyu plakalarına tohumlanarak %80 birleşim sağlanana kadar 24 saat boyunca korunmuştur. Bunun ardından, bu hücreler 24 saat boyunca 10 μg/mL LPS ile tedavi gördü. LPS tedavisi olmayan HUVEC'ler kontrol grubu olarak görev yaptı.

qRT-PCR
HUVEC'lerden toplam RNA çıkarımı ticari bir reaktif kullanılarak gerçekleştirilmiştir. cDNA sentezi için ters transkripsiyon, ticari reaktif kiti ile gerçekleştirildi. Nicel PCR (qPCR), Gerçek Zamanlı PCR Sistemi ve ana karışım kullanılarak üçlü olarak gerçekleştirildi. Hedef genlerin ifade miktarları U6'ya göre kalibre edildi ve analiz 2−ΔΔCT yöntemi 17,18 ile gerçekleştirildi. CircRNA ifadesi analizi için, U6 küçük nükleer RNA, normalleştirme için iç referans olarak kullanılmıştır; çünkü genellikle küçük kodlamayan RNA'ların nicelendirilmesinde kullanılır ve kısa süreli in vitro deneysel koşullarda nispeten stabil bir ifade sergilediği bildirilmiştir. Bu çalışmada uygulanan primer dizileri aşağıdaki şekilde listelenmiştir:

circZBTB46-İleri: 5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'

circZBTB46-Ters çevir: 5'-CGCCTCTTCTACAGACTGGG-3'

U6-İleri: 5'-TGCTATCACTTCAGCAGCA-3'

U6-Geri dön: 5'-GAGGTCATGCTAATTCTCTCTG-3'.

CCK-8 testi
HUVEC'lerin kullanılabilirliği, ticari olarak satın alınan CCK-8 kullanılarak değerlendirildi. Kısaca, hücreler 96 kuyruklu bir plakaya tohumlanıyor ve hücreler 24 saat boyunca yapışma kültürüne tabi tutulmuştur. Bundan sonra, her kuyuya 10 μL CCK-8 çözeltisi eklendi ve hücreler 37 °C'de 2 saat boyunca daha fazla kuluçka edildi. 450 nm dalga boyunda optik yoğunluğu (OD) ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanıldı. Ön gözlemler, 10 μg/mL LPS'nin HUVEC'lerin canlılığını önemli ölçüde azalttığını ve bu konsantrasyonun sonraki deneysel süreçler için seçilmesine yol açtığını göstermiştir.

Akış sitometrisi
Başlangıçta, HUVEC'ler standart prosedürlere göre EDTA-içermeyen tripsin ile ayrıldı. Üreticinin Annexin V-APC/PI Apoptoz Analiz Kiti için verdiği yönergelere uygun olarak, hücre süspansiyonları enzimatik ayrışmadan sonra 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g boyunca santrifüj edildi. Pellet hücreler daha sonra aynı koşullarda buz gibi PBS ile 2 kez yıkanmış ve 100 μL 1x bağlanma tamponunda yeniden süspansiye alınmıştır. Her örnek 5 μL Annexin V-FITC konjugatı ve 5 μL propidium iyodid (PI) boyama çözeltisi ile işlendi, ardından oda sıcaklığında (20-25 °C) karanlıkta 10 dakikalık kuluçka yapıldı. Son olarak, tüm örneklere 400 μL 1x bağlama tamponu eklendi ve apoptoz, akış sitometresi kullanılarak 1 saat içinde analiz edildi. Etkinlikler ilk olarak FSC/SSC tarafından enkaz hariç tutularak kapatıldı. Apoptoz analizi için, Annexin V-FITC vs PI grafikinde uygun kontroller (lekelenmemiş ve tek boyalı/telafi kontrolleri) kullanılarak dörtgen kapıları uygulanarak canlı (Annexin V-/PI-), erken apoptotik (Annexin V+/PI-), geç apoptotik (Annexin V+/PI+) ve nekrotik (Annexin V-/PI+) popülasyonları tanımlanmıştır. Tüm örneklerde aynı kapı şablonu ve eşikler uygulandı.

ELISA testi
Kültürlenmiş HUVEC'lerin üst yüzeyindeki inflamatuar faktörlerin - tümör nekroz faktörü-α (TNF-α), interlökin-6 (IL-6) ve interlökin-1β (IL-1β) - konsantrasyonları, ticari olarak mevcut ELISA kitleri kullanılarak ölçüldü. Özellikle, üretici talimatlarına göre İnsan TNF-α ELISA Kiti, İnsan IL-6 ELISA Kiti ve İnsan IL-1β ELISA Kiti kullanıldı. Her test için, her kuyu başına 50 μL seyreltilmiş hücre kültürü süpernatantı yüklendi. Standart eğriler, sağlanan seri seyreltmeler kullanılarak oluşturuldu (TNF-α: 0-1000 pg/mL; IL-6: 0-500 pg/mL; IL-1β: 0-200 pg/mL). Numune ve standart eklemeden sonra, plakalar 37 °C'de 90 dakika boyunca kuluçka altına alındı, ardından yıkama tamponu ile beş yıkama yapıldı. Biotin-konjuge algılayıcı antikor eklenip 37 °C'de 60 dakika boyunca kuluçka yapıldı. Bir başka yıkama aşamasından sonra streptavidin-HRP eklendi ve 37 °C'de 30 dakika boyunca kuluçka edildi. Son yıkamadan sonra, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) substratı eklendi ve 37 °C'de karanlıkta 15 dakika kuluçka edildi. Reaksiyon stop çözeltisiyle sonlandırıldı ve emrilme hemen 450 nm'de 630 nm referans dalgaboyu ile ölçüldü. Her örnek ve standart çift olarak analiz edildi ve tüm deneyler üç bağımsız biyolojik kopyayı içerdi. Süpernatanttaki oksidatif stres belirteçleri - malondialdehit (MDA), süperoksit dismutaz (SOD) ve katalaz (CAT) - seviyeleri, sırasıyla MDA ELISA Kit, SOD ELISA Kit ve CAT ELISA Kit kullanılarak sağlanan 19,20,21 protokollerine uygun olarak değerlendirildi. MDA ve SOD testleri için, her kuyu için 40 μL süpernatan kullanıldı; CAT için örnekler yüklemeden önce test tamponuyla 1:10 seyreltiltildi. Standart eğriler kit spesifikasyonlarına göre hazırlandı (MDA: 0-60 nmol/mL; SOD: 0-100 U/mL; CAT: 0-100 U/mL). Kuluçka aşamaları şu şekilde gerçekleştirildi: MDA - 60 dakika 37 °C'de; SOD - 37 °C'de 60 dakika; CAT - 37 °C'de 30 dakika. Plakalar anahtar kuluçka aşamaları arasında 4 kez yıkandı. Renk gelişimi, ilgili substratların eklenmesi ve 37 °C'de kuluçka yapılmasıyla sağlandı (MDA: 15 dakika; SOD: 20 dakika; CAT: 15 dakika). SOD ve CAT için absorbans 450 nm, MDA için ise 532 nm olarak okundu. Tüm ölçümler çift kuyularda yapıldı ve üç bağımsız biyolojik kopyada tekrarlandı.

RNA dizilemesi
Toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre ticari reaktiflerle HUVEC'lerden çıkarıldı. RNA saflığı ve konsantrasyonu spektrofotometre kullanılarak 260 nm ve 280 nm (A260/A280) soğurgunluk ölçülerek değerlendirildi ve RNA bütünlüğü bir Biyoanalizör ile değerlendirildi. Sadece RNA Bütünlük Numarası (RIN) ≥ 7 olan RNA örnekleri sonraki kütüphane hazırlığı için kullanıldı. Ribozomal RNA, kütüphane hazırlığı sırasında ticari bir şirket tarafından yapılan standart rRNA tüketme prosedürü kullanılarak çıkarıldı. Belirtilen yerde, kütüphane yapımından önce RNase R tedavisi uygulanarak lineer RNA'ları seçici olarak sindirmek ve dairesel RNA türlerini zenginleştirmek için yapılmıştır. RNA parçalanması, uygun boyutta RNA parçaları oluşturmak için RNA Kütüphane Hazırlık Kiti kılavuzunun standart protokolüne uygun sıcaklık koşullarında gerçekleştirildi. Dizileme kütüphaneleri, üreticinin talimatlarına göre RNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti kullanılarak hazırlanmış ve 150 bp (PE150) okuma uzunluğuyla eşleştirilmiş uçlu dizileme stratejisi kullanılarak Illumina platformunda sıralanmıştır. Dizileme derinliği transkriptom genelinde analizi desteklemek için yeterliydi. Ham dizileme okumaları, adaptör dizilerini ve düşük kaliteli okumaları kaldırmak için standart kalite kontrol prosedürleriyle işlendi. Temiz okumalar insan referans genomuna hizalandı ve gen ifade seviyeleri buna göre22,23 olarak nicelendirildi. LPS uyarısı altında circZBTB46 aşırı eksprese eden HUVEC'ler ile NC ile tedavi edilmiş HUVEC'ler arasında farklı olarak eksprese edilen genler (DEG) yerleşik istatistiksel yöntemlerle belirlendi. Gen seti zenginleştirme analizi (GSEA), circZBTB46 aşırı ekspresyonuyla ilişkili sinyal yollarını belirlemek için gerçekleştirildi. Genler, deneysel gruplar arasındaki farklı ekspresyona göre sıralandı. Moleküler İmza Veritabanı'ndan (MSigDB) seçilmiş gen setleri zenginleştirme analizi için kullanıldı. Zenginleştirme anlamlılığı normalleştirilmiş zenginleştirme puanı (NES) ve yanlış keşf oranı (FDR) temelinde değerlendirildi; FDR < 0.25 istatistiksel olarak anlamlı olarak değerlendirildi. CircRNA dizileme ve ilgili tüm biyoinformatik analizler dışarıdan sağlandı.

DEG'lerin Tanımlanması
DEG'leri ekranlamak için, iki farklı grup arasındaki ifade seviyeleri DESeq (2012) R yazılım paketi aracılığıyla karşılaştırıldı. İstatistiksel anlamlılık eşikleri, p < 0.05 ile |log2FC| olarak tanımlanmıştır. değeri 0.58'i aşıyor. Isı haritası pheatmap R paketiyle oluşturuldu ve volkan grafiki çizim için Goplot2 R paketini kullandı.

Fonksiyonel zenginleştirme analizi
Doğrusal transkriptlerden elde edilen GO ve KEGG zenginleştirme analizleri çevrimiçi platform EnrichR kullanılarak yapıldı ve Balon Çiziği GOplot R paketine göre çizildi. GSEA yazılımı, MSigDB veritabanı tarafından sağlanan ifade matrisi ve gen seti dosyalarına dayanarak, analiz parametreleri (örneğin, permütasyon sayısı ve istatistiksel yöntemler) belirlenerek kullanıldı. Gen setlerinin zenginlenmesi, normalleştirilmiş zenginleştirme puanı (NES), P-değeri ve FDR değeri kullanılarak değerlendirildi; böylece farklı olarak ifade edilen genlerin işlevleri ve potansiyel biyolojik mekanizmaları derinlemesine incelendi.

Western Blot
Toplam protein, RIPA lizis tamponu kullanılarak (yaklaşık 1 x 10⁶ hücre) RIPA lizis tamponu kullanılarak proteaz ve fosfataz inhibitörleriyle ekstra edildi. Protein konsantrasyonu, BCA Protein Nicefikasyon Kiti ile belirlendi. Eşit miktarda protein (her şerit başına 20 μg) %10 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jellerinde (SDS-PAGE) 80 V'da 30 dakika ve ardından 60 dakika boyunca 120 V ile elektroforez ile çözüldü. Daha sonra, proteinler 100 V'da 90 dakika boyunca 4 °C'de ıslak transfer sistemi kullanılarak poliviniliden florür (PVDF) membranlarına aktarıldı. Zarlar, oda sıcaklığında %1 saat boyunca %5 yağsız sütle %5 yağsız sütle Tris-tamponlu tuzlu sümle %0,1 Tween-20 (TBST) ile tıkandı, ardından aynı blokaj tamponunda (hedef proteinler için genellikle 1:1000, GAPDH için 1:5000) 4 °C'de birinci antikorlarla gece boyunca inkubasyon yapıldı. Kullanılan birincil antikorlar şunlardır: ERBB2, p-AKT, AKT ve GAPDH. Kuluçkadan sonra, zarlar TBST ile 3 kez (yıkamada 10 dakika) yıkanmış ve ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan anti-tavşan antikoru IgG ikincil antikoru (1:5000 bloklayıcı tamponda) ile kuluçka hale getirilmiştir. Üç ek TBST yıkamasının (her biri 10 dakika) ardından, protein bantları Gelişmiş Kemilyüminessans (ECL) Western Blotting Substrate Kit kullanılarak görselleştirildi ve bir görüntüleme sistemi ile görüntülendi. Bant yoğunlukları yazılım kullanılarak nicelendirildi.

İstatistiksel analiz
İstatistiksel değerlendirmeler GraphPad Prism 10 kullanılarak gerçekleştirildi. Veriler, ortalama ± standart hata (SEM) olarak gösterilir. İstatistiksel anlamlılığı belirtmek için p-değeri < 0.05 tanımlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

in vitro SA-AKI modelinde circZBTB46 ifadesinin qRT-PCR analizi
Bu deney seti, circZBTB46 ifadesinin LPS stimülasyonu altında değiştiği ve circZBTB46 modülasyonunun in vitro SA-AKI modelinde endotel hücre canlılığını ve apoptozunu etkilediği hipotezini test etmek için yapılmıştır. Başlangıçta, circZBTB46 ifadesi kontrol koşullarında ve in vitr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Sepsis sırasında, patojenler tarafından salınan LPS gibi patojenle ilişkili moleküler kalıplar (PAMP'ler), Toll benzeri reseptörleri (örneğin TLR4) aktive eder ve sistemik bir inflamatuar yanıtıbaşlatır 26. Bu süreç, TNF-α, IL-6 ve IL-1β gibi birden fazla pro-inflamatuar aracının salgılanmasını tetikler ve bu da sitokinfırtınası 27'yi oluşturur. Aynı zamanda, LPS doğrudan damar endotel hücrelerine zarar verir; bu da mikro dolaşım bozuklukla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir. Yazarlar, bu el yazmasında sunulan ana sonuçların daha önce yayımlanmadığını ve başka bir yerde yayımlanmak üzere değerlendirilmediğini belirtmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AG-825 (ErbB2 İnhibörü)MedChemExpressHY-1019710 μ M - yol blokadası
Agilent 2100 BiyoanalizörüÇevikG2939BARNA bütünlüğü (RIN≥ 7)
AKT AntikorProteintech60203-2-IgWB (1:15000)
Annexin V-APC/PI Apoptoz KitiElabscienceE-CK-A327Apoptoz tespiti
Antibiyotik-AntimikotikGibco15240062%1 konsantrasyon
BCA Protein Nicelik KitiBeyotimeP0012Protein konsantrasyonu
CAT ELISA KitiMEIMIANMM-0897H2Antioksidan enzim
CCK-8 KitiDojindoCK04Hücre canlılık testi
CircRNA dizisiFuzhou Huarong Kehui Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.PE150CircRNA dizilemesi ve ilgili tüm biyoinformatik analizler
CytoFLEX Akış SitometresiBeckman CoulterB53000Apoptoz analizi
DMEMGibco (Invitrogen)11965092Hücre kültürü ortamı
ECL Substrat KitiMilliporeWBKLS0100Protein tespiti
ERBB2 AntikorSino Biyolojik100271-T32WB (1:10000)
Fetal Sığır Serumu (FBS)Biyolojik Endüstriler04-001-1ACS%10 (v/v) takviyesi
GAPDH AntikorProteintech60004-1-IgWB (1:50000)
HUVEC'lerProcell sistemiCP-H082Hücre hattının kaynağı
IL-1β ELISA KitiMEIMIANMM-0181H2İltihabi faktör
IL-6 ELISA KitiMEIMIANMM-0049H2İltihabi faktör
Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850RNA dizilemesi
Lipofektamin 3000InvitrogenL3000008Transfeksiyon reaktifi
LPS (E. coli O111:B4)Sigma-AldrichL263010 μ g/mL SA-AKI modeli için
MDA ELISA KitiMEIMIANMM-2037H2Oksidatif stres belirteci
NanoDrop 2000Thermo FisherND-2000RNA niceliklendirmesi
NEBNext Ultra II RNA Kütüphane KitiNEBE7770SRNA-seq kütüphanesi hazırlığı
oe-circZBTB46 plazmidGenScriptÖzel sentezcircZBTB46 aşırı ifade vektörü
oe-NC plazmidGenScriptÖzel sentezNegatif kontrol vektörü
p-AKT (Ser473) AntikorProteintech66444-1-IgWB (1:1200)
PrimeScript RT Reagent KitTakaraRR047AcDNA sentezi
PVDF ZarlarıMilliporeIPVH00010Western blot transferi
QuantStudio 5 SistemiThermo FisherA28137Gerçek zamanlı PCR
Ribonukleaz RLucigenRNR07250rRNA çıkarımı
RIPA Liz TamponuBeyotimeP0013BProtein ekstraksiyonu
RNAiso PlusTakara9109Toplam RNA çıkarımı
SOD ELISA KitiMEIMIANMM-25469H2Antioksidan enzim
TB Yeşil Premix Ex TaqTakaraRR420AqPCR reaktifi
TNF-α ELISA KitiMEIMIANMM-0122H2İltihabi faktör

Kaynaklar

  1. Vincent, J. L. Current sepsis therapeutics. EBioMedicine. 86, 104318(2022).
  2. White, K. C., et al. Sepsis-associated acute kidney injury in the intensive care unit: incidence, patient characteristics, timing, trajectory, treatment, and associated outcomes. Intensive Care Med. 49 (9), 1079-1079 (2023).
  3. Poston, J. T., Koyner, J. L. Sepsis-associated acute kidney injury. BMJ. 364, k4891(2019).
  4. Bora, E. S., Arda, D. B., Erbas, O. The renoprotective effect of tibolone in sepsis-induced acute kidney injury. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 168 (4), 311-318 (2024).
  5. van der Slikke, E. C., et al. Sepsis is associated with mitochondrial DNA damage and a reduced mitochondrial mass in the kidney of patients with sepsis-AKI. Crit. Care. 25 (1), 36(2021).
  6. Kuwabara, S., Goggins, E., Okusa, M. D. The pathophysiology of sepsis-associated AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1050-1069 (2022).
  7. Pais, T., Jorge, S., Lopes, J. A. Acute kidney injury in sepsis. Int J Mol Sci. 25 (11), 5924(2024).
  8. Sun, J., et al. Mitochondria in sepsis-induced AKI. J Am Soc Nephrol. 30 (7), 1151-1161 (2019).
  9. Zheng, Q., et al. PRDM16 suppresses ferroptosis to protect against sepsis-associated acute kidney injury by targeting the NRF2/GPX4 axis. Redox Biol. 78, 103417(2024).
  10. Beltrán-García, J., et al. Circular RNAs in sepsis: biogenesis, function, and clinical significance. Cells. 9 (6), 1544(2020).
  11. Xu, X., et al. CircRNA inhibits DNA damage repair by interacting with host gene. Mol Cancer. 19 (1), 128(2020).
  12. Chen, Y., et al. Non-coding RNAs in sepsis-associated acute kidney injury. Front Physiol. 13, 830924(2022).
  13. Peng, X., et al. Discovery and verification of mmu_Circ_26986/hsa_Circ_0072463 as a potential biomarker and intervention target for sepsis-associated acute kidney injury. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 154(2024).
  14. Li, X., et al. Circ_001653 alleviates sepsis-associated acute kidney injury by recruiting BUD13 to regulate KEAP1/NRF2/HO-1 signaling pathway. J Inflamm (Lond). 21 (1), 37(2024).
  15. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  16. Kocherova, I., et al. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) co-culture with osteogenic cells: from molecular communication to engineering prevascularised bone grafts. J Cell Mol Med. 23 (8), 5253-5267 (2019).
  17. Duan, Z. Y., et al. U6 can be used as a housekeeping gene for urinary sediment miRNA studies of IgA nephropathy. Sci Rep. 8 (1), 10875(2018).
  18. Veryaskina, Y. A., Titov, S. E., Zhimulev, I. F. Reference genes for qPCR-based miRNA expression profiling in 14 human tissues. Med Princ Pract. 31 (4), 322-332 (2022).
  19. Demirci-Çekiç, S., et al. Biomarkers of oxidative stress and antioxidant defense. Arch Biochem Biophys. 724, 109077(2022).
  20. Ighodaro, O. M., Akinloye, O. A. First line defence antioxidants—superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx): their fundamental role in the entire antioxidant defence grid. Alexandria J Med. 54 (4), 287-293 (2018).
  21. Del Rio, D., Stewart, A. J., Pellegrini, N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 15 (4), 316-328 (2005).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows–Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  23. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2026).
  24. Dauphinee, S. M., Karsan, A. Lipopolysaccharide signaling in endothelial cells. Lab Invest. 86 (1), 9-22 (2006).
  25. Li, F., et al. Qiliqiangxin alleviates Ang II-induced CMEC apoptosis by downregulating autophagy via the ErbB2–AKT–FoxO3a axis. Life Sci. 273, 119239(2021).
  26. Cicchinelli, S., et al. PAMPs and DAMPs in sepsis: a review of their molecular features and potential clinical implications. Int J Mol Sci. 25 (2), 962(2024).
  27. Das, U. N. Infection, inflammation, and immunity in sepsis. Biomolecules. 13 (9), 1322(2023).
  28. Zhou, W. Y., et al. Circular RNA: metabolism, functions and interactions with proteins. Mol Cancer. 19 (1), 172(2020).
  29. Li, S., et al. CircZBTB46 predicts poor prognosis and promotes disease progression of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. Clin Exp Med. 23 (8), 4649-4664 (2023).
  30. Fu, Y., et al. Circular RNA ZBTB46 depletion alleviates the progression of atherosclerosis by regulating the ubiquitination and degradation of hnRNPA2B1 via the AKT/mTOR pathway. Immun. Ageing. 20 (1), 66(2023).
  31. Long, F., et al. CircZBTB46 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptotic cell death by upregulating SCD. Cancers (Basel). 15 (2), 459(2023).
  32. Uckun, F. M., Qazi, S. Upregulated expression of ERBB2/HER2 in multiple myeloma as a predictor of poor survival outcomes. Int J Mol Sci. 24 (12), 9943(2023).
  33. Moutafi, M., et al. Quantitative measurement of HER2 expression to subclassify ERBB2-unamplified breast cancer. Lab Invest. 102 (10), 1101(2022).
  34. Wei, D., et al. KIF11 promotes cell proliferation via ERBB2/PI3K/AKT signaling pathway in gallbladder cancer. Int J Biol Sci. 17 (2), 514-526 (2021).
  35. Fan, K., et al. ERBB2 S310F mutation independently activates PI3K/AKT and MAPK pathways through homodimers to contribute to gallbladder carcinoma growth. Med Oncol. 39 (5), 64(2022).
  36. Zhu, W., et al. Macrophage migration inhibitory factor facilitates the therapeutic efficacy of mesenchymal stem cell-derived exosomes in acute myocardial infarction through upregulating miR-133a-3p. J Nanobiotechnol. 19 (1), 61(2021).
  37. Du, H., et al. Anti-leukemia activity of polysaccharide from Sargassum fusiforme via the PI3K/AKT/BAD pathway in vivo and in vitro. Mar Drugs. 21 (5), 289(2023).
  38. Wang, W., et al. Hydroxysafflor yellow A ameliorates alcohol-induced liver injury through PI3K/Akt and STAT3/NF-κB signaling pathways. Phytomedicine. 132, 155814(2024).
  39. Yao, L., et al. Finerenone ameliorates mitochondrial dysfunction via PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in diabetic tubulopathy. Redox Biol. 68, 102946(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

CircZBTB46Lipopolisakkarit HasarıApoptoz RegülasyonuHücre Canlılığı AnaliziAkış SitometrisiAkut Böbrek Hasarı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.