Yöntem makalesi

Fare Deri altı Yağ Dokusundan Türetilen Stromal Vasküler Fraksiyonla Adiposit İnsülin Direncinin Modellenmesi

DOI:

10.3791/69769

⸱

27 Mart 2026

 ,  , 
1State Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention and Treatment of High Incidence Diseases in Central Asia, Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology for Endemic Diseases, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Xinjiang Medical University, 2Changzhou Third People's Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, fare deri altı yağ dokusundan türetilen stromal vasküler fraksiyonu kullanarak inceleyici bir protokol sunmakta ve insülin direncini simüle etmek için deksametazon ile işlenmiştir. Yağ dokusu karmaşıklığını koruyarak, mekanik araştırmalar için fizyolojik olarak özgün bir platform sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağ dokusunda insülin direnci, tip 2 diyabet gibi metabolik bozuklukların merkezi bir özelliğidir, ancak birçok in vitro model, doğal yağ dokusunun hücresel karmaşıklığını tam olarak yansıtmayan ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına dayanır. Bu protokolün amacı, fare deri altı yağ dokusunun stromal damar fraksiyonundan (SVF) türetilen primer adipositler kullanılarak adiposit insülin direncini modellemek için tekrarlanabilir ve deneysel olarak erişilebilir bir yöntem oluşturmaktır. Protokol, SVF hücrelerinin enzimatik sindirimle izole edilmesini, lipid yüklü olgun adipositlere adipogenik farklılaşmasını ve ardından deksametazon kullanılarak insülin direncinin indüksiyonunu açıklar. İnsülin direnci, fonksiyonel ve moleküler okumalarla operasyonel olarak tanımlanır ve doğrulanır; bunlar arasında insülin uyarılı glukoz alımı ve tüketiminin azalması ile PI3K-AKT yolunda ana insülin sinyal proteinlerinin fosforilasyonunun azalması dahildir. SVF'den türetilen hücresel heterojenliği koruyarak, bu yaklaşım, adiposit insülin sinyalinin geleneksel hücre hatlarına göre daha yakın koşullarda incelenmesini destekleyen birincil hücre tabanlı bir sistem sağlar. Bu protokol, adiposit insülin direnci mekanizmalarını incelemek veya metabolik müdahaleleri değerlendirmek için standart bir platform arayan araştırmacılar için tasarlanmıştır; ancak okumaların saflaştırılmış adiposit popülasyonundan ziyade karışık SVF kökenli bir kültürden gelen yanıtları yansıttığını kabul eder.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tip 2 diyabet hastalığı (T2DM), küresel olarak en hızlı büyüyen bulaşıcı olmayan metabolik hastalıklardan biri haline gelmiştir; toplam hasta sayısı şu anda 537 milyonu aşmakta ve 2045 yılına kadar 783 milyonu aşmasıöngörülmektedir. Temel patofizyolojik özellikleri, periferik doku insülin direnci (IR) olarak ortaya çıkar ve ilegin β-hücre işlev bozukluğuile birlikte bulunur 2. IR'nin özü, hedef organlarda fizyolojik olarak yoğunlaştırılmış insülinin tetiklediği biyolojik etkilerin önemli ölçüde azalmasındadır; bu etkiler glikoz alımının azalmasına, karaciğer glukoz çıkışının artmasına ve lipolyis inhibisyonununbozulmasına yol açar. Yağ dokusu, insülinin en kritik hedef organlarından biridir. Obezite, yağ hücrelerinin insüline karşı duyarsızlaşmasına neden olur; bu da glikoz alımını azaltır, trigliserid sentezini engeller; aynı zamanda lipolizi artırır ve daha fazla serbest yağ asitleri salgılar; böylece sistemik insülin direnci 4,5 artırılır.

Fizyolojik koşullarda, insülin PI3K-AKT yolunu aktive ederek glikoz taşıyıcısı 4'ü (GLUT4) hücre zarına aktarır; böylece adipositlerde glikoz alımını ve trigliserid sentezini destekler. Aynı zamanda, insülin lipid damlacıklarının yüzeyinde adipoz trigliserid lipaz (ATGL) ve hormona duyarlı lipazın (HSL) aktivitesini inhibe eder ve böylecelipoliz 6'yı engeller. IR meydana geldiğinde, insülin sinyalinin bozulması lipolyis inhibisyonunu zayıflatır ve bu da kan dolaşımına büyük miktarda serbest yağ asitleri (FFA) salınımına yol açar. Bu, FFA'ların kan dolaşımına büyük ölçüde salınmasına yol açar ve karaciğer, iskelet kası ve pankreas gibi organlarda ektopik trigliserid birikmesine neden olur. Bu, dudak toksisitesini ve kronik iltihaplanmaya yol açar ve nihayetinde T2DM7'nin başlangıcına ve ilerlemesine katkıda bulunur. Bu nedenle, in vivo IR özelliklerini yeniden üreten olgun bir adiposit modeli oluşturmak, IR'nin moleküler mekanizmalarını aydınlatmak ve yeni müdahale stratejileri geliştirmek için hayati öneme sahiptir.

Şu anda, 3T3-L1 fare embriyonik fibroblast hücre hattı, kısa indüksiyon döngüsü ve iyi tekrarlanabilirliği nedeniyle adiposit IR'nin in vitro çalışmaları içinklasik bir araç haline gelmiştir 8,9. Ancak, 3T3-L1 hücrelerinin embriyonik kökeni, uniform genetik arka planları ve uzun süreli geçişten sonra fenotipik kaymaya yatkınlıkları, yetişkin in situ adipositlere kıyasla metabolik davranışlarda önemli farklılıklara yol açar ve translasyonel tıbbi değerlerinisınırlar. 10,11. Buna karşılık, kemirgenlerin deri altı yağ dokusundan izole edilen stromal vasküler fraksiyon (SVF) multipotent yağ kök hücreleri (ASC) açısından zengindir. Bu ASC'lerden farklılaşan olgun adipositler, yaygın kullanılan 3T3-L1 hücre hattına kıyasla yerli beyaz adipositlere daha çok benzeyen morfolojik, fonksiyonel ve transkripsiyonel özellikler sergiler. Bu da SVF kaynaklı adipositleri, primer doku karmaşıklığını daha iyi yaklaştıran bir bağlamda insülin sinyalini ve direncini incelemek için tamamlayıcı bir modelyapar.

Bu protokol, ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarından daha fazla doku heterojenliğini koruyan primer adiposit modelinde insülin etkisini incelemeyi hedefleyen araştırmacılar için en uygundur. Ancak, kullanıcılar SVF'nin endotel ve bağışıklık hücrelerini içeren karışık bir popülasyon olduğunu unutmamalıdır; Bu nedenle, okumalar, adipositlerin önemli ama dışlayıcı olmayan bir bileşen olduğu bir kültürün davranışını yansıtır. Bu model, saf, senkronize adiposit popülasyonu gerektiren çalışmalar için daha az uygun olabilir.

Bu çalışma, SVF'den türetilen olgun adipositler kullanılarak insülin dirençli bir hücre modeli oluşturmak için bir protokol önermektedir. Protokol, SVF izolasyonu, kültürü, farklılaşması ve insülin direncinin indüksiyonu sürecinin tamamını detaylandırarak, adipositlerin insülin dirençli durumunu in vivo başarıyla taklit eder. Model değerlendirmesi glikoz tüketimi, hücresel morfoloji ve moleküler mekanizmalar seviyelerinde yapılacaktır. Bu, adipositlerde insülin direncinin altında yatan moleküler mekanizmaların incelenmesi için teknik bir temel sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Sincan Tıp Üniversitesi Hayvan Deneysel Etik Komitesi tarafından onaylandı (Etik Onay No.: IAGUC-20240228-41).

1. SVF izolasyonu

  1. Deneysel hayvanlar: 9-11 g ağırlığında 4-6 haftalık SPF kalitesinde C57BL/6J fareleri kullanın. Onları 22 ± 2 °C sıcaklıkta, 12 saatlik ışık-karanlık döngüsünde, ücretsiz yiyecek ve suya erişimle besleyin.
  2. Steril hazırlık: Tüm aletleri ve tüketim malzemelerini 121 °C'de 30 dakika boyunca otoklav edin. Denemeden önce, laminar akış kapağına %75 etanol püskürtün ve ≥15 dakika boyunca UV ışığı ile ışınlayın. Tüm işlemleri Sınıf II biyogüvenlik kabinde yürütün. Steril eldiven ve maske takın.
  3. Yağ dokusu toplama: Fareleri karbondioksit soluma ile ötenazi edilir ve ardından servikal dislokasyon yapılır. Yüzey dezenfeksiyonu için hemen %75 etanol'e 10 dakika batırın. Steril oftalmik makas kullanarak, göğüs ve karın orta hattı boyunca dairesel bir kesi yapın. İç uylukta bulunan ve testis bölgesine doğru V şeklinde uzanan iki taraflı inguinal beyaz yağ dokusunu ortaya çıkarmak için küt diseksiyon yapın. Görünür lenf düğümlerini dikkatlice çıkarın. Yağ dokusunu önceden soğutulmuş PBS'ye toplayın ve üç hızlı durulama yapın.
  4. Kollagenaz sindirimi: Yıkanmış yağ dokusunu hemen steril bir kültür kabına aktarın ve 1-2 mm³ parçalarına kıyrılın. %0,2 Tip II kollajenazı ekleyin (Dulbecco PBS'sinde çözünmüş, pH 7,4, önceden 37 °C'ye ısıtılmış) dokunun hacmi 1,5x-2 katı kadar. 37 °C'de, sabit sıcaklıkta bir çalkalayıcıda 100 devirde 10 dakika kuluçka yapın. Aşırı sindirimi önlemek için her 3 dakikada bir nazikçe ters çevirin.
  5. Sonlandırma ve filtreleme: Sindirim tamamlandığında, reaksiyonu sonlandırmak için 37 °C'de eşit miktarda önceden ısıtılmış tam ortam (DMEM/F-12 + %10 FBS + %1 penisilin streptomisin) eklenir. 1 mL pipet ucu kullanarak nazikçe 5x-8x pipet yapın. 70 μm hücre süzgecinden süzerek sindirilmemiş doku parçalarını ve olgun adipositleri çıkarabilirsiniz.
  6. Santrifüjleme ve yıkama: Filtratı 300 x g sıcaklığında 25 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Olgun adipositleri içeren süpernatantı dikkatlice atın. Pelleti tam ortamda tekrar askıya alın. Tekrar 300 x g ile 5 dakika boyunca 25 °C'de santrifüj yapın. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayarak kalan kollajenaz ve kalan olgun adipositleri çıkarabilirsiniz.
  7. Tohumlama ve kültür: Son peleti 1 mL tam ortamda yeniden askıya alın. 10 cm hücre kültürü kabında 4 fare inguinal yağ örneği yoğunluğunda tohum. %5 CO₂ ile 37 °C'de kuluçka yapın. İlk ortam değişimini 24 saat sonra yaparak yapışmayan hücreleri çıkarın. Sonrasında, ortamı her 48 saatte bir değiştirin. Hücreler %80-90 birleşime ulaştığında geçiş yapın.
    NOT: Birleşme oranı %90'ı aştığında hücreleri geçiş yapmayın; çünkü hücreler temas inhibisyonuna ulaşmış ve çoğaltma kapasiteleri azalmıştır.

2. Tip II Kolajenaz çalışma çözeltisi hazırlanır

  1. Reaktifler ve tüketilebilirler: Tip II kollajenaz elde edin (aktivite ≥ 120 U/mg); BSA (Yağlı asitsiz ≥ %98); HEPES; Dulbecco'nun PBS'si (Ca²⁺ 1,8 mmol/L, Mg²⁺ 0,9 mmol/L içerir), pH 7,2-7,4; 0.22 μm steril düşük protein bağlayıcı filtre.
  2. %0,2 tip II kollagenaz çözeltisi hazırlanır: 60 mg tip II kollagenaz tozu, 800 mg BSA ve 48 mg HEPES 50 mL'lik santrifüj tüpüne alın. Dulbecco'nun PBS ile 40 mL'ye kadar seyreltirin. 1 M NaOH veya HCl kullanarak pH 7.4 ± 0.1'e ayarlayın. 0.22 μm filtreyle filtre ile sterilize edin. Tüp başına 5 mL alıp -20 °C'de sakla. Tekrarlayan donma-erime döngülerinden kaçının.
  3. Hücreler geçiş sonrası %100 birleşmeye ulaştığında farklılaşmayı tetikler. Optimal farklılaşma durumu, girdap benzeri morfoloji sergileyen hücrelerle gösterilir. İlk 48 saat için indüksiyon çözümü I'yi kullanın, ardından indüksiyon çözümü II'ye geçin (Tablo 1).
  4. Aşağıdaki kriterlerle başarılı farklılaşma doğrulanmaktadır: İndüksiyonun 4. gününde yağ kırmızısı O boyama, çoğu hücrede lipid damlası birikimi (yaklaşık %50) ortaya çıkar ve ana adipogenez belirteçlerinin ifadesinde istatistiksel olarak anlamlı bir artış (p < 0.05) ile birlikte görülür.

3. İnsülin direnci modelinin kurulması

  1. İnsülin direncini başlatmak için başlangıç noktası olarak 4. diferensiasyon gününü seçin. Mikroskop altında, tüm hücrelerin morfolojik olarak iğne şeklinden yuvarlak bir geçiş gösterdiğini, çoğu hücrenin sitoplazmasının yüksek kırma indeksli lipid damlacıklarıyla dolu olduğunu doğrulayın.
  2. Ortamı, 1 μmol/L Dex içeren indüksiyon ortamı II ile değiştirin ve 48 saat boyunca kültüre devam edin (Tablo 1). Bu işlemden sonra, kurulan insülin dirençli adiposit modeli göz önünde bulundurulmaktadır. Bu hücrelerde başka morfolojik değişiklikler görülmemektedir. Bu hücreleri doğrudan glikoz alım/tüketim testleri ve insülin sinyal yolu proteinlerinin tespiti için kullanın.
  3. Başarılı insülin direnci modeli oluşturulması için kriterler: 48 saat deksametozon tedavisinin ardından, 100 nM insülin ile uyarlanan çoğu hücrede glikoz alım kapasitesinin yaklaşık %40 azaldığını doğrulayın. Ayrıca, anahtar insülin sinyal yolu proteinlerinin fosforilasyon seviyelerinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma (p < 0.05) doğrulanmaktadır.
    NOT: Bu süreç, sürekli olarak indüksiyon bakım ortamı II'nin eklenmesini gerektirir.

4. Kültür süpernatantında kalıntı glukozun tespiti

  1. Belirlenen zaman noktasında hücre kültürü süpernatantlarını toplayın. Hücreleri 4 °C ve 300 x g sıcaklıkta 5 dakika boyunca santrifüjle çıkarın.
  2. Süpernatantlardaki glikoz konsantrasyonlarını glikoz oksidaz-peroksidaz (GOD-POD) test kiti kullanarak ölçün. Konsantrasyonları şu formülle hesaplayın:
    Glikoz konsantrasyonu (mmol/L) = (A(örnek) - A(boşluk)) / (A(standart) - A(boşluk)) * C(standart)
    Glikoz tüketimi (mmol/L) = Hücresiz ortamda glukoz konsantrasyonu (mmol/L) - Hücre süpernatantındaki glukoz konsantrasyonu (mmol/L)
    Normalize Glikoz Tüketimi (mmol/mg protein) = Ham Glukoz Tüketimi (mmol/L) / Toplam Hücresel Protein Konsantrasyonu (mg/L)

5. Western Blot

  1. Hücreleri belirlenen zaman noktasında tam ortamda 100 nM insülin ile 37 °C'de 10 dakika boyunca uyararak PI3K-AKT yolunu aktive edin. Daha sonra, her 3,5 cm hücre kültürü kabına 200 μL hücre lizin tamponu eklenin. 30 dakika buzda kuluçka yapın. 13.040 x g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. BCA çalışma çözeltisi kullanarak protein konsantrasyonunu nicelikle ölçün.
  2. Örnekleri %8 SDS-PAGE jeli üzerine yükleyin. Jeli 80 V'da çalıştırın, örnekler üst üste biriktirme/ayıran jel arayüzüne ulaşana kadar. Voltajı 120 V'a çıkarın ve işaret bantları tamamen çözülene kadar çalıştırın. 200 mA sabit akımda 2 saat boyunca aktarım gerçekleştirin.
  3. Zarı oda sıcaklığında %5 yağsız süt veya BSA ile 2 saat boyunca inkubasyon yapın. Zarı TBST ile 3 kez yıkayın. Daha sonra, 4 °C'de gece boyunca primer antikor ile kuluçka yapın. Birincil antikorlar (Sulandırma): AKT: 1:1000, p-AKT (Ser473): 1:1000, β-Aktin: 1:1000, PI3K p110α: 1:1000, Phospho-PI3K p110: 1:1000, C/EBPα: 1:2000, FABP4: 1:2000.
  4. Zarı TBST ile 3 kez yıkayın. Daha sonra, HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikorla oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın. İkincil Antikorlar (Seyreltme): Keçi anti-fare IgG-HRP: 1:5000, Keçi anti-tavşan IgG-HRP: 1:5000.
  5. Sinyali ECL kemilyünülüminesansı kullanarak tespit edin. Deneysel sonuçları Western blot görüntüleyici kullanarak görselleştirin ve kaydedin.
  6. Ortaya çıkan bantların gri tonlu değerlerini ImageJ yazılımı kullanarak analiz edin.

6. Glikoz alımı boyama testi

  1. Hücreleri belirli iki zaman noktasında ayrı ayrı 12 saat boyunca açlıktan aç bırakın; RPMI 1640 ile %1 FBS içerir ve bazal glikozdan gelen paraziti ortadan kaldırır.
  2. 100 nM insülin ile 10 dakika uyarmanın ardından, her kuyuya 1 mL 1x 2-NBDG çözeltisi ekleyin. Plakayı 37 °C'de 1 saat boyunca ışıktan korunarak kuluçka edin.
  3. Hücreleri 2-3 kez yıkayın. Her kuyuya 1 mL kullanıma hazır Hoechst boyama çözeltisi ekleyin. Tabağı 37 °C'de karanlıkta 10 dakika kuluçka yapın. Boyama çözeltisi, kültür damarının yan duvarı boyunca yavaşça ekleyin; hücre tabakasıyla doğrudan temas kurmayın ve hücrelerin ayrılmasını önleyin.
  4. Hücreleri 2-3 kez yıka, sonra PBS ekleyin. Hücrelerin floresan görüntülerini ters floresan mikroskop kullanarak yakalayın.
  5. ImageJ yazılımı kullanarak görüntülerin nicel analizini gerçekleştirin. Her kanalı ayırmak için ImageJ kullanın; böylece glukoz alım sinyalini (yeşil kanal) nükleer floresan sinyalinden (mavi kanal) izole eder.
  6. Tüm görüntüleri 8 bitlik gri tonlu görüntülere dönüştürün. Pozitif sinyal bölgelerini tanımlamak için varsayılan otomatik eşik algoritmasını uygulayın.
  7. Bu belirlenen bölgelerde ortalama floresans yoğunluğunu ölçün. Glikoz alımı floresans sinyalini, yeşil kanalın ortalama floresans yoğunluğunu mavi kanalın karşılık gelen ortalama floresans yoğunluğuna bölerek normalleştirin.

7. Yağ kırmızısı O boyama

  1. Oil Red O stok çözeltisini RNase içermeyen suyla 3:2 oranında seyreltin. Çözeltiyi sıralı olarak filtre kağıdı ve 0,22 μm filtreyle filtreleyin ve çalışma çözeltisi hazırlanır.
  2. Hücre kültür ortamını aspire edin ve hücreleri PBS ile 2 kez nazikçe yıkayın. Her kuyuya %4 paraformaldehit ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika sabitleyin.
  3. Fiksatif ekleyin ve hücreleri çift damıtılmış suyla yıkayın. Her kuyuya 1 mL Yağlı Red O çalışma çözeltisi ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında karanlıkta 25 dakika kuluçka yapın.
  4. Boyamadan sonra, boyama çözeltisini aspire edin. Hücreleri damıtılmış suyla iyice yıkayarak arka planı çıkarıp lekelenmiş eserleri çıkarın. Hücreleri kapatmak için 1 mL damıtılmış su ekleyin. Hemen ters bir mikroskopla parlak alan görüntüleri yakalayın.

8. BODIPY

  1. BODIPY stok çözeltiyi steril suyla 1:200 hacim oranında seyreltirerek çalışma çözeltiyi hazırlanır.
  2. Hücre kapak kapaklarını steril PBS ile yıkayın. Her örtüye 30 μL %4 paraformaldehit çözeltisi ekleyip oda sıcaklığında 30 dakika sabitleyin.
  3. Fiksatoru aspire edin ve PBS ile 3 kez yıkayın. Her hücre kapak parçasına 30 μL BODIPY çalışma çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika kuluçka yapın.
  4. Kapak kapaklarını PBS ile 3 kez yıkayın. Her örtü slipine 30 μL DAPI lekesi ekleyin. Hücre çekirdeklerini etiketlemek için oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika kuluçka yapın.
  5. Kapak kapaklarını PBS ile üç kez daha yıkayın. Montaja devam edin: Temiz bir mikroskop slaytına 10 μL anti-fade montaj ortamı ekleyin. Forseps kullanarak, hücre kapak kaymasını (hücre tarafı aşağı) montaj ortamına nazikçe ters çevirin. Montaj malzemesinin karanlıkta kurumasına izin verin.
  6. Hemen lazer taramalı konfokal mikroskopla görüntüler alın.

9. İstatistiksel analiz

  1. Her deney üç biyolojik kopyayı içeriyordu. GraphPad Prism 10.0 yazılımı kullanarak verileri analiz edin. Normal dağılım kriterlerini ortalama ± standart sapma (ortalama SD±) olarak karşılayan nicel veriler sunun. Varyansın normalliği ve homojenliğini sağlayan iki grup için, bağımsız örnekler t-testi uygulanır. Birden fazla grup için, tek yönlü ANOVA yapın, p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir.

10. Güvenlik ve atık bertarafı

  1. Hayvan dokularının işlenmesi
    1. Primer hücrelerle ilgili tüm işlemleri steril koşullarda Sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
    2. Tüm hayvansal doku atıklarını, kullanılmayan organları ve kirlenmiş tüketim malzemelerini biyolojik zararlı atık olarak sınıflandırın. Bu atıkları belirlenmiş biyolojik tehlike torbalarına yerleştirin, otoklavlama yoluyla işlenir ve sonunda bertaraf edilir.
  2. Deksametazonun Kullanımı
    1. Dex tozunu tartırken eldiven, tıbbi maske ve laboratuvar önlüğü giyin. Kimyasal bir duman davlumbazında çözelti hazırlığını yapın.
    2. Dex ile kirlenmiş atıkları ayrı ayrı toplayın ve kimyasal atık olarak bertaraf edin.
  3. Biyotehlike maddelerin işlenmesi
    1. Deneysel işlemlere başlamadan önce çalışma yüzeylerini ve biyogüvenlik dolaplarının içini %70 etanol ile iyice dezenfekte edin.
    2. Hücre kültüründen oluşan tüm sıvı atıkların enfeksiyesiz hale getirilmesini sağlamak için otoklavlandığından emin olun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C57BL/6J farelerinin iWAT'ından izole edilen SVF hücreleri, kültür kablarında ilk tohumlanmada noktalı bir askıya geçmiştir. Yaklaşık %40'ı hücrelerin 18 saatlik tohumlamadan sonra birincil tutunmasını tamamladı; tohumlama sonrası 5. gün hücreler tamamen yayılmıştı ve birleşme oranı %95'e ulaştı (Şekil 1A,B). Hücreler birleşme noktasına ulaştığında ve karakteristik girdap benzeri bir düzen gösterdiğinde, farklılaşma ortamı değiştirildi. İndüksiyonun 4. gününde, hücreler için...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapsamlı araştırmalar, SVF hücre tabanlı modellerin yağ dokusunun patolojik özelliklerini simüle etmede benzersiz değer sağladığını göstermektedir. Ancak, bu modellerin uzun yapım döngüsü, genellikle doku izolasyonu, birincil kültür, indüklenmiş farklılaşma ve Dex tedavisi için yaklaşık 14 gün sürer; bu süreç deneysel süreklilik ve hücresel durum kararlılığı için zorluklar yaratmaktadır. Bu zorlukları ele almak için, bu çalışma aşağıdaki temel ölçütlere odaklanan deneysel bir iş akışını ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu çalışmada çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82260177) ve Orta Asya'da Yüksek Sıklıklı Hastalıkların Patogenezi, Önleme ve Tedavisi Devlet Ana Laboratuvarı (SKL-HIDCA-2023-20) tarafından desteklenmiştir. Finansman kuruluşunun bu çalışmanın tasarımı, uygulanması veya yorumlanması üzerinde hiçbir etkisi yoktu. Finansman kurumu, bu makalenin yazılmasına veya yayımlanmasına sunulmasına katılmamıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 μ m filtresiBiosharpBSF-XS-0232-01
2-NBDGBeyotimeS0561M
3-İzobütil-1-metilksantinSigma15879
%4 PoliformaldehitBiosharpBL1278A
70 μ M hücre süzgeciBiosharpBS-70-CS
Anti-AKTProteintech10175
Anti-C/EBPαAbklonAB40764
Anti-FABP4Hücre Sinyal Teknolojisi 2120'LER
Anti-pAKT (Ser473)Proteintech28731
Anti-PI3K Biyografi10657R
Anti-pPI3K (s110)Biyografi6417R
Anti-β-ACTINProteintech60008
BCA Protein Test KitiThermo Fisher23225
BODIPY 493/503InvitrogenD3922
BSA SigmaA7030
Hücre tırmanışı dilimleri Biosharp BiosharpBS-14-RC
Hücre Kültürü Çanak, 100mm x 20mmCorning430167
Hücre Kültürü Çanak, 35mm x 10mmCorning430165
DAPI ÇözümüSolarbio28718-90-3
DeksametazonSigmaD2915
DMEM/F-12GibcoC11330500BT
Dulbecco' s PBSCytivaSH30264.02
Eppendorf tüpüCorningMCT-175-C 
FBSLife-iLabAC03L0555
Flüoresans mikroskobuLeicaDMi8
Glukoz oksidaz-peroksidazNanjing JianchengF006-1-1
Keçi anti-fare IgG-HRPPekin Zhongshan JinqiaoZB-2305
Keçi anti-tavşan IgG-HRPPekin Zhongshan JinqiaoZB-2301
GraphPad PrizmasıSürüm 10.0.0/
HepesBioFroxx1112GR025
HochestbiosharpBL803A
ImageJSürüm 1.54p/
İnsülinSolarbio18040
Lazer taramalı konfokal mikroskopNikon Ti-E
Montaj Orta AntifadingSolarbioS2100
Yağ kırmızısı O boyama çözeltisiSigmaO0625-25G
Penisillin-StreptomisinHycloneSV30010
RIPA TamponuThermo Fisher89901
Roziglitazon,SigmaR2408
RPMI 1640VivaCellC3010-0500
Yağsız Süt TozuBioFroxx1132GR500
TBS TamponuSolarbioT1060
Tip II kollagenazSigmaC6885

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). Worldwide trends in underweight and obesity from 1990 to 2022: a pooled analysis of 3663 population-representative studies with 222 million children, adolescents, and adults. Lancet. 403 (10431), 1027-1050 (2024).
  2. Stumvoll, M., Goldstein, B. J., van Haeften, T. W. Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy. Lancet. 365 (9467), 1333-1346 (2005).
  3. Arkan, M. C., et al. IKK-beta links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat Med. 11 (2), 191-198 (2005).
  4. Li, M., et al. Trends in insulin resistance: insights into mechanisms and therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 216(2022).
  5. Miao, Z., et al. The causal effect of obesity on prediabetes and insulin resistance reveals the important role of adipose tissue in insulin resistance. PLoS Genet. 16 (9), e1009018(2020).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Segalla, L., Chirumbolo, S., Sbarbati, A. Dermal white adipose tissue: Much more than a metabolic, lipid-storage organ. Tissue Cell. 71, 101583(2021).
  8. Hoehn, K. L., et al. IRS1-independent defects define major nodes of insulin resistance. Cell Metab. 7 (5), 421-433 (2008).
  9. Zhou, X., Wang, L. L., Tang, W. J., Tang, B. Astragaloside IV inhibits protein tyrosine phosphatase 1B and improves insulin resistance in insulin-resistant HepG2 cells and triglyceride accumulation in oleic acid (OA)-treated HepG2 cells. J Ethnopharmacol. 268, 113556(2021).
  10. Liu, X., Liu, X. N., Li, T. J., Liu, B. Research Progress of the Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes into Mature Adipocytes. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 39 (5), 727-731 (2017).
  11. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  12. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  13. Tan, S. X., et al. Selective insulin resistance in adipocytes. J Biol Chem. 290 (18), 11337-11348 (2015).
  14. Zebisch, K., Voigt, V., Wabitsch, M., Brandsch, M. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Anal Biochem. 425 (1), 88-90 (2012).
  15. Wang, T., Sharma, A. K., Wolfrum, C. Novel insights into adipose tissue heterogeneity. Rev Endocr Metab Disord. 23 (1), 5-12 (2022).
  16. Taniguchi, C. M., et al. Divergent regulation of hepatic glucose and lipid metabolism by phosphoinositide 3-kinase via Akt and PKClambda/zeta. Cell Metab. 3 (5), 343-353 (2006).
  17. Jacinto, E., et al. SIN1/MIP1 maintains rictor-mTOR complex integrity and regulates Akt phosphorylation and substrate specificity. Cell. 127 (1), 125-137 (2006).
  18. Cozzone, D., et al. Isoform-specific defects of insulin stimulation of Akt/protein kinase B (PKB) in skeletal muscle cells from type 2 diabetic patients. Diabetologia. 51 (3), 512-521 (2008).
  19. Sakoda, H., et al. Dexamethasone-induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes is due to inhibition of glucose transport rather than insulin signal transduction. Diabetes. 49 (10), 1700-1708 (2000).
  20. Burén, J., Liu, H. X., Jensen, J., Eriksson, J. W. Dexamethasone impairs insulin signalling and glucose transport by depletion of insulin receptor substrate-1, phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B in primary cultured rat adipocytes. Eur J Endocrinol. 146 (3), 419-429 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ns lin SinyalizasyonuAdipojenik DiferansiyasyonGlukoz Al mns lin Direnci ModeliPI3K AKT YoluDeksametazon nd ksiyonuPrimer Adipositler

İlgili makaleler