Yöntem makalesi

In Vitro Hücresel Esneme ve Görüntüleme İçin Yeni Bir Platform

DOI:

10.3791/69779

⸱

10 Mart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hücrelere izotropik ve tek eksenli dalga formları uygulayan, aynı zamanda ayarlanabilir sertliğe ve özelleştirilebilir protein matrislerine sahip substratlar üzerinde kültürü destekleyen yeni bir cihaz sunuyoruz. Bu basit ve ekonomik platform, araştırmacıların mekanik ipuçlarının hem temel çalışmalarda hem de hastalıkla ilgili bağlamlarda hücresel fonksiyonu nasıl düzenlediğini araştırmalarını sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler, çevrelerinden gelen mekanik ipuçlarına yanıt verir; örneğin, hücre dışı matriks (ECM) sertliği ve döngüsel gerilme gibi değişiklikler, hücre kaderinin belirlenmesi, hücrelerarası iletişim ve gelişim gibi hücresel süreçleri düzenler. Bu güçlerdeki değişiklikler, astım, hipertansiyon ve kanser gibi durumlarda hastalığın ilerlemesine katkıda bulunur veya ilerlemesini sağlar. Mevcut in vitro esneme cihazları tek eksenli veya izotropik deformasyonlar oluşturabilse de, genellikle fizyolojik olmayan sertlikler kullanır, canlı görüntülemeyi sınırlar veya fizyolojik ve patolojik koşullara uygun yüksek gerilme genliklerine ulaşamazlar. Burada, elastomerik kültür çanaklarındaki yapışkan hücrelere kontrollü izotropik veya tek eksenli gerim uygulayan kompakt, mikroskop uyumlu bir sedye cihazı sunuyoruz. Bu çanaklar, ayarlanabilir bir Young modülüne sahiptir ve hücre yapışması için çeşitli matris protein kaplamalarıyla uyumludur; böylece substrat sertliği ve ECM bileşiminin bağımsız modülasyonuna olanak tanır. Önemli olarak, cihazın kullanım kolaylığı, programlanabilir döngüsel dalga formlarının üretilmesini destekleyen step motorlu tasarımı sayesinde desteklenmektedir. Cihazın yeteneğini, mekanik germe altında birincil insan hava yolu düz kas hücrelerinde hücre içi kalsiyum dinamiklerini ve hücre çekiş kuvvetlerini niceleyerek gösteriyoruz. Bu platform, mekanik ipuçlarının hem sağlıklı hem de hastalıkla ilgili bağlamlarda hücresel fonksiyon üzerindeki etkisini araştırmak için çok yönlü bir araç sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler, çevrelerinden gelen mekanik kuvvetleri deneyimlemektedir; bu kuvvetler, hücre kaderininbelirlenmesinde kritik rol oynar; bunlar arasında hücre kaderinin belirlenmesi 1,2, hücrelerarasıiletişim (3,4) ve sağlıklıbüyüme 2,5 bulunur. Ayrıca, bu mekanik kuvvetlerdeki değişiklikler, hastalık ilerlemesinin artmasına ve hastalığın başlangıcına yol açabilir; bunlar arasında ekstraselüler matriks (ECM) yenidenşekillendirmesi 6 ve tümörbüyümesi 7,8,9,10 dahildir. Hücreler,ECM 4'ün sertliğindeki değişiklikler ve kalp, akciğerler ve kas gibi organlardaki döngüsel gerilme gibi bu mekanik ipuçlarını algılayabilir ve yanıtverebilir 11,12. In vitro çalışmalar, ECM sertliği ve bileşiminin hücre sitoskeletinin hem dinlenme sırasında hem de kontraktil agonistlere maruz kaldıktan sonra riditesini etkileyebildiğinigöstermiştir 13. Çok sayıda in vitro ve in situ çalışma, geçici, statik ve döngüsel suşların hücreleri ve dokuları nasıl etkilediğini incelemiş ve yanıtların suş tipi, oranı ve genliğe göre değiştiğinigöstermiştir 14. Örneğin, son çalışmalar, geçici bir gerilmenin, yapışkan hücrelerin sertliğini uygulanan suşla orantılı olarak azalttığını bulmuştur; burada sürekli zorlanma artışı başlangıçta hızlı bir sertlik artışı ve ardından kademeli bir gevşemeyol açmaktadır 15. Ayrıca, kuvvet üretiminin birincil moleküler düzenleyicisi olan kalsiyum sinyal çalışması, esneme ve diğer mekanikkuvvetlerden etkilenir 4,16,17,18,19,20. Sertlik ve gerilmenin mekanobiyolojik yolları nasıl etkilediğini incelemek, her iki faktörün de modüle edilmesini ve hücresel yanıtların izlenmesini gerektirir. Bu nedenle, izotropik veya tek eksenli esneme üretebilen, substrat sertliği, matris protein kaplaması ve çeşitli programlanabilir dalga formları üzerinde bağımsız kontrole sahip yeni bir mikroskop uyumlu hücre germe geliştirdik.

Geçmişte, araştırmacılar benzer şekilde hücre kültürleri ve dokulara belirli hareketler ve mekanik esnemeler uygulayan cihazlargeliştirmişlerdir. En basit örnek, tek eksenli hareket, tek boyuta uygulanan mekanik bir esnemedir. Örneğin, dokuşeritlerine 23 ve kolajenliflerine (24) mekanik esneme ve zorlanma uygulayan veya hücresel yönelimi hizalamak ve hücresel göçü25 tetiklemek için bazı cihazlar geliştirilmiştir. İzotropik esneme, bir jel veya substrata her yönden eşit kuvvet uygulanan ve malzeme boyunca eşit bir gerilme yaratan bir esneme türünü ifade eder. Bu esneme, hücrelerin belirli fizyolojik ortamlarda, örneğin akciğer alveollerinde yaşadığı eşit kuvvet dağılımını simüle eder; burada hücreler nefes alma sürecinde radyal genleşme ve kasılmaya maruzkalır 26,27.

Mevcut sedye cihazlarının, mekanobiyolojiyle ilgili araştırmalarda kullanımlarını kısıtlayan birkaç sınırlamaya sahiptir. Birçok tasarım, mekanik gerilime dayanmak ve hücre kültürortamının ağırlığını desteklemek için tipik fizyolojik aralığı aşan substrat sertlik değerleri kullanır 28. Ancak, bu fizyolojik olmayan sertliğin kullanımı hücre davranışını da etkileyebilir ve modelin doğal doku ortamlarıyla ilgisini sınırlayabilir29. Ayrıca, bazı sedye tasarımları objektif veya ışık yolunu engeller, görüntülemeyi engellerken, diğerleri net gözlem için çok kalınzarlar kullanır 28. Geryeler mikroskoplarla uyumlu olsa ve ince alt tabakalar kullansa bile, zar sarkması ve odak kaybı gibi sorunlar yaygındır. Flexcell gibi ticari platformlar, esnek zarları germek için vakum tabanlı deformasyon kullanır. Bu yaklaşım stabil ve homojen süzüm alanları üretebilse de, canlı hücre mikroskopisi için optimize edilmemiştir ve mikroskop uyumlu konfigürasyonlar pahalı ek aksesuarlar gerektirir. Ayrıca, bu platformlar maksimum suş sadece %21,830 kadar ulaşabilirken, derin emanlar %30'un üzerinde suşlar üretebilirken, astım ve KOAH gibi hastalıklarda daha yüksek suşlar gözlemlenmektedir.

Bu nedenle, substrat sertliği ve ECM bileşiminin hassas bir malzeme kontrolünü sağlarken, yapışkan hücrelere değişken izotropik ve tek eksenli suşların uygulanmasına olanak tanıyan yeni bir hücre esneme cihazı tasarladık. Bu platform, mekanik uyarım sırasında fizyolojik olarak ilgili sertliğe sahip substratlarla canlı görüntüleme gerektiren mekanobiyolojik soruları araştıran araştırmacılar için oldukça uygundur. Cihaz, iki boyutlu bir Hoberman küresinin geometrisinden ilham alan mekanik olarak yönlendirilmiş bir yaklaşım kullanır; bu küre makas benzeri eklemlerle genişler ve daralır (Şekil 1, Ek Şekil 1). Tek basamaklı motor, bir bağlantı mekanizması aracılığıyla 16 radyal olarak düzenlenmiş kolu hareket ettirerek sekiz bağlantı direğinin koordineli genleşmesi ve daralmasını sağlar. Bu konfigürasyon, tüm direklere aynı anda eşit radyal yer değiştirme uygulanarak homojen düzlem içi gerilme üretir. Cihazın benzersiz tasarımı ve kompakt ayak izi, tersli floresan mikroskobu ile tersif floresan mikroskobu ile ticari alternatiflerin maliyetinin çok daha düşük bir maliyetiyle mümkün olur. Lineer step motor, özel bir Arduino kodu ile kontrol edilir ve ayarlanabilir periyot ve genliklere sahip programlanabilir döngüsel dalga formlarını mümkün kılar. Bu çalışmada, cihazın %1'den %15'e kadar hassas ve tekrarlanabilir suşlar sağladığını, geometrik kapasitesinin %200'ün üzerinde olduğunu gösterdik. Ayrıca, mekanik gerilmenin birincil insan hava yolu düz kas hücrelerinin hücre içi kalsiyum dinamikleri ve hücre çekiş kuvvetleri üzerindeki etkilerini niceleştiriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan birincil insan hava yolu düz kas hücreleri (ASMC'ler) ATCC (Virginia)'dan alındı ve donör bilgileri NIH yönergelerine uygun olarak kimliği silindi. Bu çalışma, deneylerden önce Northeastern Üniversitesi Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylandı.

NOT: Cihazın üretimi ve cihaz boyutlarıyla ilgili talimatlar için lütfen GitHub depomuzda bulunan CAD dosyasına bakınız: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging.

1. 3D baskılı kalıp tasarımı

  1. İzotropik kalıp boyutları
    1. Kalıbın dış çapı 37 mm'dir.
    2. Kalıpın dış yüksekliği 4,1 mm'dir.
    3. Dış duvar kalınlığı 2,1 mm'dir.
    4. Kalıpın taban kalınlığı 2 mm'dir.
    5. Bağlantı delikleri kenardan 2 mm uzaklıkta bulunur.
    6. İç hücre kültürü kuyusu alanı 20 mm çapında ve 1,9 mm derinliktedir.
      NOT: Tamamlanmış PDMS kalıpının hücre kültür alanı kalınlığı 200 μm olmalıdır.
  2. Tek eksenli kalıp boyutları
    1. Kalıpın dış boyutları 41 mm x 12 mm x 4 mm (L x B x H) olarak belirlenmiştir.
    2. Bağlantı delikleri genişlik kenarından 3 mm, uzunluk kenarından 4 mm uzaklıkta olup direk derinliği 1 mm'dir.
    3. Dış duvar kalınlığı, genişlik kenarında 1,5 mm, uzunluk kenarında ise 2 mm'dir.
    4. İç hücre kültürü kuyusu boyutları 26 mm x 5,5 mm x 1 mm (L x B x H) olarak belirlenmiştir.
    5. Taban kalınlığı 2 mm'dir.
      NOT: Kalıplar SolidWorks'te tasarlanmış, FormLabs sıvı gri reçine sistemi kullanılarak 3D basılmış ve Northeastern Üniversitesi'nin makerspace'inde üretilmiştir.
  3. Sadece kalıpın ilk kullanımı için talimatlar
    1. Kalıp baskısının pürüzlü kenarlarını zımparalayın.
    2. Negatif kalıpı şeffaf oje ile kaplayarak kürlemeden sonra PDMS kalıbının çıkarılmasını kolaylaştırın. Kalıpı 24 saat boyunca hava kurutmaya bırakın.

2. Hücre kültürü için ayarlanabilir substrat sertliğine sahip optik olarak berrak, elastik jellerin üretimi

NOT: PDMS ve NuSil ile çalışırken uygun PPE (eldiven, laboratuvar önlüğü, göz koruma) giyin.

  1. Sylgard 184 bazını ve kürleyici maddeyi ağırlık oranında 10:1 oranında plastik bir kaba ekleyin.
  2. Dil bastırıcı (veya benzeri bir alet) ile 2-3 dakika boyunca kuvvetli karıştırın.
  3. Karışımı 1 saat gazdan çıkar.
  4. PDMS karışımını özel negatif kalıba dökün (Şekil 2A,B).
    1. İzotropik kalıba 1.3 g ekleyin.
    2. Tek eksenli kalıp için 0,5 g ekleyin.
      NOT: Jeli kalıp boyunca eşit şekilde yaymaya dikkat edin.
  5. Kalıpı 1 saat boyunca gazdan çıkar.
  6. Kalıptaki jelin oda sıcaklığında düz bir yüzeyde 2 saat birikmesine izin verin.
  7. Gece boyunca 60 °C'de kürlenir.
  8. NuSil Gel-8100'ün A ve B kısımlarını eşit oranlarda (1:1) 15 dakika boyunca tündle karıştırın.
    1. Toplam hacmin %0,36'sında Sylgard 184 çapraz bağlayıcı ile karıştırarak 13 kPa 32 sertlikte bir substrat elde edin.
    2. 0.3 kPa sertlikte bir substrat oluşturmak için çapraz bağlayıcı eklemeyin.
  9. Karışımı 30 dakika gazdan çıkarın.
  10. PDMS jelini özel kalıptan dikkatlice çıkarın. Jeli 40 mm bir örtü üzerine yerleştirin.
    NOT: Jelleri yırtmamaya dikkat edin çünkü kırılgandırlar.
  11. NuSil karışımını PDMS jelinin negatif bölgesine dök.
    1. İzotropik jel: 100 μL.
    2. Tek eksenli jel: 50 μL.
  12. İlgili PDMS jellerini, 7 x g ölçüsünde 50 saniye boyunca bir spin kaplama ile NuSil karışımıyla kaplayarak 100 μm eşit bir alt kalınlığı elde edin.
  13. Jelin oda sıcaklığında düz bir yüzeyde 2 saat birikmesine izin verin, ardından gece boyunca 60 °C'de kürlendirin.
    NOT: Lütfen tüm kürleme adımlarının düz bir yüzeyde yapılmasına özen gösterin. Düzensiz bir jel, ilgi alanının tamamının mikroskopun görüntüleme düzleminde kalmasına izin vermez. Görüntüleme görüş alanında odak değişimi ortaya koyarsa, jel düz olmayan bir yüzeyde kürlenmiş olabilir ve yeniden yapılmalıdır.
  14. Tamamlanmış hücre kültürü kapları kapalı petri kaplarında saklanır ve kullanıma kadar saklanır (Şekil 2D-E).

3. Matrix protein kaplaması

  1. Her alt tabakaya 500 μL poli-L-lizin (PLL, 500 μg/mL) ekleyin.
  2. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
  3. Alt tabakaları 3 × 1 mL PBS ile yıkın, ardından 1 mL 10 mM HEPES tamponu (pH 8.0) ile 3 × yıkın.
  4. Her alt tabakaya 500 μL mPEG-SVA (50 mg/mL) ekleyin.
  5. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
  6. Substratları 3 × 1 mL PBS ile yıkayın.
  7. PBS'yi 500 μL PLPP (14.5 mg/mL) ile değiştirin.
  8. Leonardo yazılımıyla birlikte PRIMO mikrodesen sistemi kullanılarak, önceden tanımlanmış deseni UV ışığı ile alt yüzeye 30 saniye boyunca yansıtın.
  9. Substratları 3 × 1 mL PBS ile yıkayın ve sterilizasyon için 15 dakika UV altında koyun.
  10. Her alt tabakaya %0,1 floressein konjuge jelatin 500 μL ekleyin.
  11. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
  12. 3 × 1 mL PBS ile yıkayın.
    NOT: Kalıpları görselleştirmek için, %0,1 floressein-konjuge jelatin ile oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
  13. Görüntülemeye devam edin.

4. Elastik kaplarda insan hava yolu düz kas hücresi kültürü

NOT: Tüm hücre kültürü prosedürlerini standart aseptik teknikle biyogüvenlik kapüşonunda gerçekleştirin.

  1. ATCC (Virginia)'dan birincil insan hava yolu düz kas hücreleri (ASMC) alın ve donör bilgilerinin NIH yönergelerine uygun olarak kimliğinin silindiğinden emin olun. Deneylerden önce Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin onayını onaylayın.
  2. Astım/hastalık öyküsü olmayan farklı cinsiyet ve yaşlardan üç sağlıklı insan donörünün hücrelerini kullanın. Örneğin: bir kadın (18 yaşında) ve iki erkek (34 ve 59 yaşlarında).
  3. Standart koşullarda (37 °C, %5 CO₂) kültür hücreleri yapılır ve tüm deneyler için 6. pasaj ile hücreler kullanılır.
  4. Hücreleri aşağıdaki tam büyüme ortamında yetiştirin:
    1. DMEM/F12 (500 mL)
    2. %10 fetal sığır serumu (FBS) (50 mL)
    3. 1× penisillin/streptomisin (5 mL)
    4. 1× MEM temel olmayan amino asitler (5 mL)
    5. Amfoterisin B (0.5 mL)
  5. Ölçümlerden en az 24 saat önce hücreleri serumsuz ortama geçirin. Serumsuz ortamı şu maddelerle hazırlayın:
    1. Ham'ın F-12 orta uçağı (500 mL)
    2. 1 × penisilin/streptomisin (5 mL)
    3. Amfoterisin B (50 μg/L)
    4. 1× MEM temel olmayan amino asitler (5 mL)
  6. Esnebilen hücre kültürü kaplarını 15 dakika UV ile sterilize edin.
  7. Sterilize edilmiş tabakları %0,1 jelatinle oda sıcaklığında 1 saat kuluçka için, ardından tohumlandırma (Şekil 2F).
    1. Desenli Alt Tabakalar İçin:
      1. Elastik hücre kültüründeki tohum hücreleri, 104 hücre/cm2 yoğunlukta kuyular demektir.
      2. Desenli alanlara tutunmayı artırmak için %10 serum ortamında 10 dakika kuluçka yapın.
      3. Kuyrukları PBS ile yıkayarak bağlanmamış hücreleri çıkarın.
      4. Kuyular %10 serum ortamıyla doldurun ve 24 saat kuluçka yapın.
      5. Serumsuz ortamla değiştirin ve ölçümlerden önce 24 saat kuluçka yapın.
    2. Desensiz alt tabakalar için:
      1. İstenen yoğunlukta tohum hücreleri: İzole hücreler için 102 hücre/cm2. 103 hücre/cm2 seyrek hücreler için. Birleşen hücreler için 104hücre/cm2.
      2. %10 serum ortamında 24 saat kuluçka yapın.
      3. Serumsuz ortamla değiştirin ve ölçümlerden önce 24 saat kuluçka yapın.

5. Floresan kalsiyum görüntüleme ve analiz

  1. Serum açlığı hava yolu ASMC'leri 24 saat boyunca.
  2. Üreticinin talimatlarına göre FLIPR Ca2+ 6 boyasını hazırlayın.
  3. FLIPR Ca2+ 6 boyasını serumsuz ortamla 1:1 oranında karıştırın.
  4. Hücreleri 37 °C ve %5 CO ₂ ile 37 °C ve %5 CO ₂ ile 2 saat kuluçka yapın.

6. Görüntüleme Kurulumu

  1. Aşağıdaki özelliklerle donatılmış bir Leica DMi8 ters mikroskobu kullanın:
    1. Leica DFC6000 kamera
    2. Leica LED8 hafif motor
    3. 5×/0.12 kuru hedef
  2. Uyarımı 480/40 nm'ye ve emisyonu 527/50 nm'ye ayarlayın.
  3. Stretch deneyleri sırasında 2 Hz kare hızında 16 bitlik görüntüler elde edin.

7. Veri analizi

  1. Görüntü dizilerini Fiji'ye aktarın (ImageJ) 33.
  2. Her hücrenin sitoplazmasında ilgi alanlarını (ROI) manuel olarak tanımlayın.
  3. Her ROI için zaman içinde ortalama gri ton yoğunluk değerlerini çıkarın.
  4. Floresans yoğunluk verilerini özel bir MATLAB betikiyle işleyin.
    NOT: Floresans yoğunluğu sitozolik [Ca2+] ile orantılıdır.

8. Çekiş kuvveti ölçümleri ve analizi

NOT: Görüntü analizi, çekiş kuvveti mikroskobu ve motor kontrolü için olan kodlar da dahil olmak üzere tüm kodlar GitHub depomuzda mevcuttur: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging

  1. PDMS-NuSil jel alt tabakalarını, çekme kuvveti mikroskopisi için fiducial belirteç olarak kullanılmak üzere floresan boncuklar tabakasıyla kaplayın.
  2. HBSS'de 1 μm çapında kırmızı floresan karboksilatla modifiye mikrokürelerden oluşan %0,025 çözeltiyi 1:4000 oranına seyreltirerek hazırlayın.
  3. Boncuk çözeltisini 10 saniye vortex ile geçir.
  4. Boncuk çözeltisini jele ekleyin.
    1. 880 μL izotropik jele.
    2. 420 μL tek eksenli jele.
  5. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın, böylece boncuklar yapışabilir.
  6. 1 saat sonra çözeltiyi dikkatlice çıkarın.
    NOT: Boncuk çözeltisini yumuşak jellere nazikçe dök. Yanlış çıkarma boncukların doğru dağıtımını engeller.
  7. Kalan çözeltiyi nazikçe Q-ucu veya Kimwipe ile lekeleyin.
  8. Boncukları 10x/0.32 kuru objektif ile donatılmış Leica DMi8 mikroskobu ile görebilirsiniz.
  9. Esneme öncesi durumda ve esneme protokolü boyunca sürekli olarak görüntü alın.
    NOT: Tüm görüntülemeleri, deformasyon uniformitesinin en yüksek olduğu substratın ortasında yapın. Gerekirse, görüntü çekmeden önce mikroskobu gerilmiş pozisyonda yeniden odaklayın.
  10. Fourier çekme kuvveti mikroskobisine dayalı özel bir MATLAB kodu kullanarak görüntüleri analiz ederek yer değiştirme vektörlerini ve karşılık gelen düzlemsel gerilme alanlarını hesaplayın 34.
  11. Veriyi N denemenin ortalaması olarak gösterin.

9. Hücre esneme cihazının kalibrasyonu

  1. Kuyuya 500 μL H₂O ekleyin; böylece hücre kültürü ortamının ağırlığı simüle ediler ve protein desenini nemli tutar.
  2. Belirli protein desenleri oluşturma protokolü için lütfen "Matrix Protein Kaplaması" başlıklı 3. bölüme bakınız.
  3. Görüntü floresan desenleri her 400 μm motor yer değiştirme adımında bir şekilde yükselir, maksimum 2800 μm'ye çıkar ve ardından ters 400 μm aralıklarla sıfıra döner.
  4. Stepper motordan doğrusal yer değiştirme ile esnelenebilir hücre kültür çanaklarının izotropik deformasyonu arasındaki ilişkiyi, esneme sırasında elastik alt yüzeyde "BREATHE" yazımıyla oluşan floresan protein desenli harflerin alan ve eksantrikliğindeki değişiklikleri ölçerek hem makroskopik hem de bölgesel ölçeklerde karakterize edin. Tüm harfleri kapsayan dikdörtgen bir sınırlayıcı kutu kullanarak kelimenin alanını ve eksantrikliğini hesaplayın.
  5. MATLAB'da görüntü segmentasyonunu uygulayarak her harf için bu parametreleri nicelikle ölçebilirsiniz.
  6. Hücre kültürü çanaksının gerilmemiş boyutlarıyla sıfır yer değiştirmeyi tanımlayın.
  7. Her deneyi, tekrarlanabilirliği sağlamak için iki ila üç bağımsız hazırlanmış gerilebilir hücre kültür kuyusunda tekrarlayın.

10. Veri sunumu ve istatistiksel test

  1. Sedye kalibrasyon deneyleri için denemeleri döngü sayısı olarak tanımlayın.
  2. Her denemeyi ayrı ayrı gösterin, sistem tekrarlanabilirliğini göstermek için tek bir eğriye oluşturmak yerine.
  3. Hata çubuklarını standart sapma olarak belirtin.
  4. Tek yönlü bir ANOVA kullanarak üç veya daha fazla grup ile ilgili veri setlerinde önemli farkları test edin.
  5. İki bağımsız faktörden etkilenen veri setlerindeki anlamlı farkları test etmek için iki yönlü ANOVA'lar ve ardından sonradan çift karşılaştırmalar yapın.
  6. Veriler normal şekilde dağıtıldığında çift karşılaştırmalar için t-testini uygulayın.
  7. Veriler normal olarak dağıtılmadığında medyan değerleri karşılaştırmak için Mann-Whitney sıralama toplamı testini uygulayın.
  8. Kullanılan spesifik testleri, örnek sayısını ve ilgili P-değerlerini sonuçları ile birlikte raporlayın.
  9. Veri setleri arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farkları belirlemek için 0.05 P-değer eşiği kullanın.
  10. SigmaStat'ta istatistiksel testler yapın.
  11. GraphPad Prism ve MATLAB'daki konu figürleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre gereği, lokal deformasyonları yansıtan makroskobik alan değişikliklerini indükler. İzotropik davranışı değerlendirmek için, esnelenebilir hücre kültürü kuyusundaki "BREATHE" kelimesini oluşturan floresan jelatin protein deseninin alan değişikliklerini, ayrıca izotropik bir alt tabakada bireysel harfleriyle birlikte ölçtük. Sonuçlarımız hem kelimenin hem de bireysel harflerin alan açısından eşdeğer değişiklikler gösterdiğini göstermiştir (Şekil 3A,B

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, izotropik ve tek eksenli suşları taklit ederken aynı anda canlı hücreleri görüntülemek imkanı veren yeni bir mikroskopla uyumlu hücre esnesinin tasarımı, geliştirilmesi, doğrulanması ve uygulanmasını anlatıyoruz. Bu cihaz kompakttır ve Leica DMi8 mikroskop aşamasına sığabilir; tüm hareketli parçaları tek bir düzlemde sınırlayarak canlı görüntüleme yapılabilir ve alttaki hücrelere odaklanır. Bu, iki boyutlu bir Hoberman küresinin geometrisinden ilham alan açılı kollar kulla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların hiçbirinin açıklayacak rekabet eden çıkarları yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, kalıpların hazırlanmasında yardımı olan Bay Noah Joseph'e teşekkür eder. Yazarlar, cihazı işleme konusundaki yardımları için Boston Üniversitesi Bilimsel Enstrümanlar Tesisi'nden Heitor Mourato ve Glenn Thayer'a teşekkür ediyorlar. Bu çalışma, Harikrishnan Parameswaran'a verilen Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Kariyer Bursu #2047207 tarafından desteklenmiştir. H.P. araştırmayı tasarladı. S.E.S. ve S.R.P. cihazın genel tasarımını geliştirdi, S.E.S. ve H.P. ise izotropik deneyleri tasarladı. S.E.S. izotropik kalıplar deneylerini yürüttü, deneysel verileri analiz etti ve H.P. V.C. ile birlikte tek eksenli kalıpları tasarladı, jel hazırlama ve boncuklama optimizasyonu yaptı. B.M.G. tek eksenli jel deneylerini gerçekleştirdi, deneysel verileri analiz etti ve H.P. ile V.C. ile birlikte sonuçları yorumladı. S.E.S. ve B.M.G şekilleri hazırladı. B.M.G, S.E.S, V.C. ve H.P. el yazmasının hazırlanması ve düzenlenmesine katkıda bulundular. H.P. el yazmasının nihai versiyonunu onayladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  Dulbecco' ' modifiye edilmiş Eagle' s orta/F12Fisher Scientific12634010500 mL 
(4-benzoilbenzil) trimetilamonium klorür (PLPP)Alvé OleYok14.5mg/mL
%0,1 floressein konjuge jelatin InvitrogenG13187
%0,1 jelatin çözeltisiSigma-AldrichES-006500 mL 
1 μ m çapında kırmızı floresan karboksilatla modifiye mikrosferlerFluoSpheresF8816
1&Times; MEM temel olmayan amino asit çözeltisiSigma-AldrichM7145100 mL
1&Times; Penisillin/streptomisinFisher Scientific15-140-122100 mL
%10 fetal sığır serumuTermo-BilimselA5256701500 mL 
15 mL tüpFisher Scientific14-959-53A
1x glutamin Fisher ScientificMT10010CM
1x İnsülin-Transferrin-Selenyum Büyüme TakviyesiCorning Yaşam Bilimleri25-800-CR
Amfoterisin BSigma-AldrichA294225 μ g/litre
Bilyalı RulmanlarMcMaster-Carr Yok
Kalsiyum klorür dihidratSigma-Aldrich223506
Vagon RayıMcMaster-Carr Yok
FLIPR Ca2+ 6Moleküler CihazlarR8190
GraphPad PrizmasıDotmaticsYok
Jambon' s F-12 orta Sigma-AldrichN8641500 mL 
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi Termo-Bilimsel14025092500 mL 
HEPES buffer Termo-Bilimsel15630080100 mL
Leonardo YazılımıAlvé OleYok
MatlabMathworksYok
metoksi polietilen glikol– Süksinimidil Valerat (mPEG-SVA)Laysan Bio IncYok50mg/mL
Nusil Gel-8100Nusil Yok
Petri KablarıTermo-Bilimsel26399190 mm 
fosfatla tamponlanmış tuzlu sindirim Sigma-Aldrich10010023500 mL 
poli-L-lizin (PLL)Sigma-AldrichP8920500μ g/mL
Birincil insan hava yolu düz kas hücreleri ATCCPCS-130-011
PRIMO optik modülü Alvé OleYok
VidalarMcMaster-Carr Yok
SigmaStatSystat YazılımıYok
Spin CoaterLaurellModel WS-650MZ-23NPPB
Sedye ve Sahne Bağlantı Bileşenleri Boston Üniversitesi'nin Bilimsel Enstrümanlar TesisiYokPaslanmaz çelik
Sylgard 184 baz Elastomer ve Kürleme ajan kitiDowH047J8Q026
T-25 Doku Kültürü Şişesi - Havalandırma Kapağı, SterilCellTreat229331
Dil bastırıcı Termo-Bilimsel22-363-154

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez, Y., Smutny, M. Emerging role of mechanical forces in cell fate acquisition. Front Cell Dev Biol. 10, 864522(2022).
  2. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18, 728-742 (2017).
  3. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  4. Stasiak, S. E., Jamieson, R. R., Bouffard, J., Cram, E. J., Parameswaran, H. Intercellular communication controls agonist-induced calcium oscillations independently of gap junctions in smooth muscle cells. Sci Adv. 6 (32), eaba1149(2020).
  5. Riley, D. J., Rannels, D. E., Low, R. B., Jensen, L., Jacobs, T. P. NHLBI workshop summary: effect of physical forces on lung structure, function, and metabolism. Am Rev Respir Dis. 142, 910-914 (1990).
  6. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 802-812 (2014).
  7. Gong, F., et al. An overview of the role of mechanical stretching in the progression of lung cancer. Front Cell Dev Biol. 9, 781828(2021).
  8. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 63-73 (2009).
  9. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5, e12905(2010).
  10. Hannezo, E., Heisenberg, C. -P. Mechanochemical feedback loops in development and disease. Cell. 178, 12-25 (2019).
  11. Das, S., Ippolito, A., McGarry, P., Deshpande, V. S. Cell reorientation on a cyclically strained substrate. PNAS Nexus. 1, pgac199(2022).
  12. Dartsch, P. C., Hämmerle, H., Betz, E. Orientation of cultured arterial smooth muscle cells growing on cyclically stretched substrates. Acta Anat. 125, 108-113 (1986).
  13. An, S. S., et al. Cell stiffness, contractile stress and the role of extracellular matrix. Biochem Biophys Res Commun. 382, 697-703 (2009).
  14. Arold, S. P., Bartolák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  15. Trepat, X., et al. Universal physical responses to stretch in the living cell. Nature. 447, 592-595 (2007).
  16. Benavides Damm, T., Egli, M. Calcium 's role in mechanotransduction during muscle development. Cell Physiol Biochem. 33, 249-272 (2014).
  17. Ito, S., et al. A novel Ca2+ influx pathway activated by mechanical stretch in human airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 407-413 (2008).
  18. Ito, S. Stretch-activated calcium mobilization in airway smooth muscle and pathophysiology of asthma. Curr Opin Physiol. 21, 65-70 (2021).
  19. Ito, S., et al. Actin cytoskeleton regulates stretch-activated Ca2+ influx in human pulmonary microvascular endothelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 26-34 (2010).
  20. Tanaka, Y., Hata, S., Ishiro, H., Ishii, K., Nakayama, K. Quick stretch increases the production of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) in porcine coronary artery. Life Sci. 55, 227-235 (1994).
  21. Brown, T. D. Techniques for mechanical stimulation of cells in vitro: a review. J Biomech. 33, 3-14 (2000).
  22. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  23. Fredberg, J. J., Bunk, D., Ingenito, E., Shore, S. A. Tissue resistance and the contractile state of lung parenchyma. J Appl Physiol. 74, 1387-1397 (1993).
  24. Shen, Z. L., Dodge, M. R., Kahn, H., Ballarini, R., Eppell, S. J. Stress-strain experiments on individual collagen fibrils. Biophys J. 95, 3956-3963 (2008).
  25. Atcha, H., et al. A low-cost mechanical stretching device for uniaxial strain of cells: a platform for pedagogy in mechanobiology. J Biomech Eng. 140, 0810051-0810059 (2018).
  26. Tschumperlin, D. J., Margulies, S. S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  27. Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells. J Biomech Eng. 138, 4032550(2016).
  28. Ursekar, C. P., et al. Design and construction of an equibiaxial cell stretching system that is improved for biochemical analysis. PLoS One. 9, e90665(2014).
  29. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 13661-13665 (1997).
  30. Cell stretching bioreactor FAQs. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com/resources/faq (2024).
  31. Bossé, Y. The strain on airway smooth muscle during a deep inspiration to total lung capacity. J Eng Sci Med Diagn Ther. 2, 010802(2019).
  32. Yoshie, H., et al. Traction force screening enabled by compliant PDMS elastomers. Biophys J. 114, 2194-2199 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Butler, J. P., Toli ć-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, C595-C605 (2002).
  35. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 4, 764(2021).
  36. Ji, G., Barsotti, R. J., Feldman, M. E., Kotlikoff, M. I. Stretch-induced calcium release in smooth muscle. J Gen Physiol. 119, 533-543 (2002).
  37. Davis, M. J., Meininger, G. A., Zawieja, D. C. Stretch-induced increases in intracellular calcium of isolated vascular smooth muscle cells. Am J Physiol. 263, H1292-H1299 (1992).
  38. Naruse, K., Sokabe, M. Involvement of stretch-activated ion channels in Ca2+ mobilization to mechanical stretch in endothelial cells. Am J Physiol. 264, C1037-C1044 (1993).
  39. Arold, S. P., Bartol ák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  40. Cell stretching bioreactors. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com (2024).
  41. Mitrossilis, D., et al. Single-cell response to stiffness exhibits muscle-like behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18243-18248 (2009).
  42. Parameswaran, H., Lutchen, K. R., Suki, B. A computational model of the response of adherent cells to stretch and changes in substrate stiffness. J Appl Physiol. 116, 825-834 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre GermeMekanik Stim lasyonlarTraksiyon Kuvveti MikroskobisiH cre i Kalsiyum G r nt lemeSubstrat Sertli izotropik GerinimTek Eksenli Gerinimnsan Havayolu D z KasCanl H cre G r nt lemeElastomerik K lt r Kab

İlgili makaleler