Yöntem makalesi

İnsan SOD1-G93A ALS farelerinde hassas CNS hedefleme ve öngörücü etkinlik için SOD1-ASO'ların bel intratekal enjeksiyonu

1.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69788

⸱

24 Şubat 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biogen

Bu makalede

Özet

Bu makale, yetişkin farelerde CNS hedefli tedaviler için intratekal teslimat yöntemlerini detaylandırır; protokol hassasiyetine odaklanır ve tekrar enjeksiyonu mümkün kılar. Makale, antisens oligonukleotidlerin SOD1-ALS model farelerinde mutant SOD1 ekspresyonunu azalttığı bir doğrulama çalışmasından elde edilen bulguları içeriyor ve bu yaklaşımın nörodejeneratif hastalıklar üzerine preklinik araştırmalarda faydasını desteklemektedir.

Özet

Merkezi sinir sistemi (CNS) hedefli tedavilerin intratekal (BT) uygulaması, doğrudan beyin-omurilik sıvısına (CSF) ilaç gönderimi için minimal invaziv bir yol sunar; böylece spesifiklik ve hedefe bağlanma daha da artırılır. IT kateterizasyonu sıçanlarda sürekli doğum için standart olsa da, farelerde uygulanması anatomik kısıtlamalar ve omurga yaralanması ve enfeksiyon dahil prosedürle ilgili komplikasyonların artan riski nedeniyle sınırlıdır. Bu sınırlamaları aşmak için, yetişkin farelerde BT ilaç teslimatı için akut iğne delme tekniği kullandık; bu yöntem, tek veya tekrar edilen dozlama rejimleriyle uyumlu, tekrarlanabilir ve daha az invaziv bir alternatif sağladık. SOD1-G93A mutasyonunu barındıran amiyotrofik lateral skleroz (ALS) transgenik fare modelinde, SOD1 genini hedefleyen antisens oligonukleotidlerin (ASO) verimli bir IT teslimatını sağladık. Bu yaklaşım, mutant SOD1 ekspresyonunu etkili bir şekilde azaltmış ve hastalık fenotipini önemli ölçüde iyileştirmiştir; bu da elektrofizyolojik ve biyobelirteç değerlendirmeleriyle gösterilmiştir. Bu sonuçlar hem BT teslimat yöntemini hem de terapötik etkinliği doğrulamaktadır ve sonuçlar intracerebroventriküler (ICV) uygulamasıyla karşılaştırılabilirdir. En önemlisi, bu teknik, insan klinik çalışmalarında kullanılan prosedürleri yansıtır ve CNS yönlendirilmeli müdahalelerin preklinik değerlendirmesinde güçlü translasyonel önem ve fayda sağlar. Tutarlılığı sağlamak ve hedef dışı etkileri önlemek için teknik uzmanlık gerekse de, bu BT teslimat stratejisi, küçük hayvan modellerinde terapötik gelişimi ilerletmek için sağlam, tekrarlanabilir ve klinik olarak ilgili bir metodolojiyi temsil eder.

Giriş

Bu çalışmada, lomber intratekal (IT) enjeksiyon protokolünü tanımlıyor, bunu intracerebroventriküler (ICV) ile karşılaştırıyor ve merkezi sinir sistemi (CNS) hedefli tedavilerin gelişimini yönlendirmek için farmakodinamik sonuçları ve tolere edilebilirliği değerlendiriyoruz. RNA hedefleme tedavileri, özellikle antisens oligonukleotidler (ASO'lar), gen ifadesinin transkripsiyon sonrası modülasyonunu mümkün kılarak CNS hastalıkları için umut verici bir yöntemdir. Bu yaklaşımlar özellikle nörodejeneratif bozukluklar için önemlidir; çünkü ilerleyici nöronal kayıp, hastalık ilerlemesini potansiyel olarak değiştirmek için kesin, yerel ve zamanında müdahalelere ihtiyaç olduğunu vurgular. Burada, IT enjeksiyon protokolünün ASO tedavileri için ICV teslimatıyla etkinliğini doğrudan karşılaştırıyoruz.

Preklinik çalışmalarda, yetişkin farelerde (erkek veya dişi, 30-70 günlük, 13-20 g ağırlığında) lomber intratekal enjeksiyonlar, farmakolojik ajanlar veya biyolojik vektörleri doğrudan beyin omurilik sıvısına (CSF) göndermek için kullanılmıştır; bu nedenle 1,2 hedefli CNS hedeflenmiştir. 5-10 μL enjeksiyon hacimleri genellikle yavaş uygulanarak geçici BOSS basınç artışlarını ve reflü artışlarını sınırlamak için uygulanır; intratekal erişim ise L5-L6 omurgalararasıboşluk 1,2 üzerinden sağlanır. Prosedür başarısı, yaş ve vücut ağırlığı CSF hacmini ve kontrolü etkilediği nörolojik hasarı önlemek için dikkatli bir tekniğe bağlıdır. İnce ölçülü iğnelerin kullanımı (örneğin, 27-30 G iğne, 25 μL Hamilton şırıngasına bağlanmış) güvenilir teslimatısağlar 2. Temel teknik zorluklar, ölü alan kayıplarının en az görülmesi, epidural yanlış enjeksiyon ve sızıntının önlenmesi ve dozlama doğruluğunu ve CSF dağılımını etkileyebilecek operatöre bağlı değişkenliği azaltmaktır.

CNS bozuklukları için etkili tedaviler geliştirmek, CNS'nin yapısal karmaşıklığı ve hücresel heterojenliği nedeniyle büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu özellikler, hedefli ilaç teslimatını engeller ve biyodağılımı çoklu anatomik ve fizyolojik engeller arasında kısıtlar; bu da özel teslimat stratejileri gerektirir. Temel bir engel, DNS genelinde ilaç penetrasyonunu kısıtlayan fizyolojik ve anatomik engellerden kaynaklanır. Beyin ve omurilik, kan-beyin bariyeri (BBB) ile birlikte kan-beyin bariyeri (BBB) ile birlikte dolaşan tedavilere ve kandaki diğer moleküllere karşı güçlü bir savunma sağlayan dura mater, araknoid mater ve pia mater olmak üzere üç meningeal katman içinde kaplıdır. Bu engeller MSS stabilitesini korumak için hayati öneme sahip olsa da, ASO'lar, monoklonal antikorlar ve viralvektörler 1,2,3,4 gibi büyük, hidrofilik moleküllerin taşınmasını önemli ölçüde engeller. BT yönetimi, bu kısıtlamaları aşmak için doğrudan BOG'ye subarachnoid alanda tedavi getirerek bir yol sunar. Bu teslimat yolu, ilaç dağıtımını CNS bölümleri arasında kolaylaştırır, daha geniş doku nüfuzunu teşvik eder ve böylece MSS içindeki çeşitli hücre tiplerinde ifade edilen hedeflerle etkili etkileşimi sağlar. 1980'de Hylden ve Wilcox tarafından fare1'de morfin teslimatı için ilk kullanımından bu yana, BT enjeksiyonları, küçük moleküller, biyolojik ilaçlar, gen terapisi vektörleri veASO'lar 5,6,7,8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli terapötik ajanların ilatılmasında daha yaygın bir yöntem haline gelmiştir.

ASO'lar, tamamlayıcı RNA dizilerini bağlamak ve gen ifadesini RNaz H-aracılı bozunma, splice modülasyonu ve terzümasyon 11,12,13,14,15 gibi mekanizmalarla gen ifadesini modüle etmek üzere kimyasal olarak mühendislik olarak tasarlanmış tek zincirli oligonukleotidlerdir. Fosforotiyoat omurga modifikasyonları, 2'-O-metoksietil (2'-MOE) ikameleri ve kısıtlanmış etil kalıntıları gibi kimyasal iyileştirmeler, onların stabilitesini, bağlanma afinitesini ve nükleazlara karşı direncini artırır6. Bu özellikler, nörogenetik bozukluklarda rol oynayan patojenik genleri hedeflemede uygulamalarını desteklemiştir. İntratekal uygulanan ASO tabanlı tedaviler, spinal kas atrofisi (SMA) ve amiyotrofik lateral skleroz (ALS) gibi hastalıklarda klinik fayda göstermiştir 12,13,14,15. Örneğin, Nusinersen (Spinraza), SMA 7,14'te SMN1 kaybını telafi etmek için SMN2 transkriptlerinde ekzon 7 eklenmesini artırır. Mutant huntingtin transkriptlerini hedefleyen benzer stratejiler Huntington hastalığı 12,13'te de incelenmiştir. Bu denemeler16 yılının başlarında sonlandırılmış olsa da, CNS yönlendirdiği ASO yaklaşımlarına olan ilginin devam ettiğini vurguluyor.

ALS, hem üst hem de alt motor nöronların ilerleyici dejenerasyonuyla karakterize edilen ölümcül bir nörodejeneratif bozukluktur. Hastalık, dünya genelinde 100.000 kişide 6 ila 9 kişiyi etkileyen ve yaklaşık 100.000 kişi-yılda 2 vaka oranında ortaya çıkan bu hastalık, kas zayıflığı ve spastisitenin giderek kötüleşmesiyle ortaya koyulmakta olup, çoğu hasta semptomlar başladıktan 2-3 yıl sonra17 yıl içinde nöromüsküler solunum yetmezliğine yenik düşmektedir. Çoğu vaka sporadik (sALS) olsa da, yaklaşık %10'u ailesel (fALS) olup hastalığın genetik sürücüleri hakkında içgörüler sunar. En çok incelenen genlerden biri Cu/Zn süperoksit dismutaz 1 (SOD1)'dir; bu gen, fALS'nin yaklaşık %15 ila %20'sini, sALS'in %2'sinden azını oluşturur ve otozomal dominant bir şekilde kalıtılır18. SOD1, süperoksit radikallerini hidrojen peroksite dönüştürerek reaktif oksijen türlerini detoksifikasyona dönüştüren sitoplazmik antioksidan bir enzim kodlar. G93A, A4V ve H46R gibi mutant SOD1 formları konformasyonel instabiliteler gösterir; bu da protein toplanması ve toksik bir fonksiyon kazanımına yol açar; bu da oksidatif stres, mitokondriyal işlev bozukluğu ve eksitotoksisiteye katkıda bulunur 19,20,21,22,23,24,25 . Ayrıca, ALS patolojisi, mikroglia ve astrositleri içeren hücre dışı otonom mekanizmalarla kötüleşir; bu mekanizmalar kronik bir inflamatuar ortama ve ilerleyici nöron hasarına katkıdabulunur 26,27,28,29. Bu nedenle, ASO'lar kullanılarak SOD1 ifadesinin susturulması, hastalık patogenezini hafifletmek için umut vadeden bir tedavi yolu sunmaktadır.

SOD1-G93A transgenik fare modeli (Jax Strain #: 004435), endogen insan SOD1 promotoru kontrolü altında insan G93A mutant formunu ifade eder ve ALS'nin erken motor eksiklikleri, omurilik nörodejenerasyonu ve kısaltılmış hayatta kalma gibi klinik özellikleriniyakından özetler. Önceki preklinik çalışmalar, SOD1-G93A sıçanlarında doğum sonrası 65. günde, 28 gün ardışık 100 μg dozda osmotik pompalar kullanılarak sürekli intraventriküler doğum yoluyla SOD1-spesifik ASO'ların uygulanmasının SOD1 seviyelerinin önemli şekilde bastırılmasına, nöroinflamatuar yanıtların azalmasına, klinik belirtilerin gecikmeli ortaya çıkmasına ve motor performansın iyileşmesine yolaçtığını göstermiştir 31. Ayrıca, SOD1-ALS ile yaşayan kişilerde ASO aracılı SOD1'in katlanması, kan bazlı bir biyobelirteç olan nörofilament hafif zincir (NfL) seviyelerindeki azalmalarlailişkilendirilmiştir (32). Bu araştırmada, SOD1-G93A farelerine IT enjeksiyonu yoluyla SOD1 hedefleyen ASO'ları uyguladık ve moleküler, elektrofizyolojik ve biyomarker okumaları üzerindeki etkilerini değerlendirdik. Omurilik dokusunun nicel analizi, SOD1 mRNA seviyelerinde anlamlı azalmalar olduğunu ortaya koydu. Bileşik kas hareket potansiyellerinin (CMAP) elektrofizyolojik değerlendirmeleri, nöromüsküler fonksiyonun korunduğunu göstermiştir. Aynı zamanda, serum NfL seviyeleri azaldı ve bu da devam eden nöronal hasarın hafifletilmesini yansıtıyordu.

Alternatif CNS uygulama yöntemlerinin mekansal dağılımını ve göreceli etkinliğini değerlendirmek için, terapötik ajanın lateral ventriküllere getirilerek SK akışı yoluyla ependimal ve perivaskülerboşluklar boyunca yayıldığı karşılaştırmalı bir kol ekledik. BT ve ICV uygulama yollarını karşılaştırarak, farmakodinamik sonuçlar ve doku hedeflemedeki farklılıkları ayırmayı hedefledik; böylece CNS odaklı ASO tedavileri için teslimat stratejilerini geliştirdik. Ayrıca, translasyon fizibilitesini değerlendirmek için, hayvan başına sekiz hafta arayla dört BT enjeksiyonu içeren bağımsız toleranslılık çalışmaları yaptık. Test edilen tüm rejimlerde belirgin bir rahatsızlık veya morbidite belirtisi gözlemlenmedi; bu da hayatta kalma bağlamında IT ASO dozunun tolere edilebilirliğini destekledi. Bu sonuçlar, farelerde tekrarlanan intratekal enjeksiyonların tolere edilebilirliğini gösteren öncekiraporlarla tutarlıdır 34.

BT ASO uygulamasının klinik önemi, SOD1 ile ilişkili ALS35 için yakın zamanda alınan tofersen (QALSODY®) düzenleyici onaylarıyla da desteklenmektedir. Klinik çalışmalar, CSF SOD1 proteinindeki azalmalar ve nörofilament hafif zincir seviyelerinde (nöroaksonal hasarın biyobelirteçhesi) azalmasıyla güçlü hedefe bağlanma gösterdiğini gösterdi. İlk faz 3 VALOR çalışmasında birincil son nokta sağlanamasa da, açık etiket uzatması dahil entegre analizler, tedavinin erken başlamasının potansiyelfaydalarını göstermiştir 35.

Buradaki veriler toplamda, SOD1-G93A ALS fare modelinde SOD1 hedefleyen ASO'ların BT teslimatının etkili moleküler çökerte, biyobelirteç iyileştirmesi ve fonksiyonel koruma ile avantajlı tolere sağladığını göstermektedir. Bu sonuçlar, IT ASO sunumunu MSS genetik bozuklukları için mantıklı ve klinik olarak uygulanabilir bir yaklaşım olarak destekler ve devam eden translasyonel gelişim için sağlam bir preklinik çerçeve sağlar.

Protokol

Buradaki tüm prosedürler, IACUC onaylı protokoller ve kurumsal kimyasal hijyen ve biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak onaylanmış ve yürütülmüştür.
NOT: C57BL/6J (JAX #000664) ve SOD1-G93A transgenik farelerde (JAX #004435) standart koşullarda (12 saat ışık/karanlık döngü, 22-24 °C, yiyecek ve suya imtiyaz edilebilir) tutulan çalışmalar yapılacaktır.

1. İnsan SOD1'i hedef almak için kimyasal olarak modifiye edilmiş ASO'ların uygulanması

  1. İnsan SOD1 geninin 3' çevrilmemiş bölgesi (UTR) içinde 613-629 nukleotidlerini özel olarak hedeflemek için doğrulanmış antisens oligonukleotidler (ASO) kullanmak (RefSeq: NM_000454.5)36: A*GoToG*T*T*T*T*A*T*T*T*ToToA*T*C
  2. MOE (2'-O-Metoksiyetil) (normal fontla gösterilir), cEt (Kısıtlı Etil) (italik), DNA (kalın yazı), fosfat bağları (o) ve fosforotiyoat bağları (*) dahil ederek stabilite ve etkinliği artırmak için doğrulanmış kimyasal modifikasyonlar ekleyin; daha öncebildirildiği gibi 36. Ek Dosya 1 , ASO kimyasını ilgili renk kodlamalarıyla sunar.
  3. İnsan veya kemirgen genomlarına tamamlayıcılık göstermeyen, aynı modifikasyon şemasını takip ederek hedef dışı bir kontrol ASO hazırlayın: C*CoToAoT*A*G*G*A*C*T*A*T*C*C*AoGoA*A

2. ASO çözümlerinin steril koşullarda hazırlanması ve işlenilmesi

  1. ASO'yu steril yapay beyin-omurilik sıvısında (aCSF; Tablo 1) steril koşullarda 10 mg/mL konsantrasyonuna ulaşmak, hayvan başına nihai enjeksiyon hacmi 10 μL (100 μg) hedeflenmektedir.
  2. Moleküler bütünlüğünü korumak için steril pipetle nazikçe karıştırın, ardından iyi karışması için 5-10 saniye hafifçe girdabla karıştırın.
  3. Sulandırılmış çözeltiyi steril 0,2 mm şırınga filtresinden geçirerek partikülleri ve kirleticileri çıkarın.
  4. Son çözeltiyi aseptik olarak steril mikrosantrifüj tüplerine aseptik olarak yerleştirin ve 4 °C'de izlenen, sıcaklık kontrollü bir ünitede 1 haftaya kadar saklanın; böylece donma-erime döngülerinden kaçınarak stabiliteyi koruyabilirsiniz.

3. İntratekal enjeksiyondan önce fare hazırlığı

  1. Her fareyi dijital bir denge kullanarak en yakın 0,1 g kadar tart, ardından burun konisine aktarın ve %2-2,5 oksijen konsantrasyonunda izofluran ile anestezi yapın; Derinliği sürekli izleyin ve pedal refleksinin kaybıyla cerrahi düzlemi doğrulayın.
  2. Termostatla kontrol edilen bir ısıtma pedi hazırlayın ve fareleri hazırlık ve toparlanma sürecinde desteklemek için 37 °C'ye ayarlayın.
  3. Anestezi indüksiyonundan hemen sonra korneanın kurumasını önlemek için her iki göze göz kayganlaştırıcısı uygulayın. Daha sonra fareyi hipotermiyi önlemek, fizyolojik stresi en aza indirmek ve işlem boyunca normal kardiyovasküler ve solunum fonksiyonlarını desteklemek için ısıtma pedinin ventral yatağı pozisyonuna yerleştirin.
  4. İşlemden önce 3,25 mg/kg ile steril bir şırınga ile buprenorfin uzatılmış salınımlanabilir enjekte süspansiyonu (1,3 mg/mL) deri altına uygulanın ve 20 g vücut ağırlığı başına 0,05 ml enjekte edilsin.
  5. Bel bölgesini orta yan bölgeden pelvik kuşağa kadar tıraş edin, ardından bölgeyi dönüşümlü izopropil alkol ve povidon-iyot sürüntleriyle dezenfekte edin, üç kez tekrarlayın ve bölgenin tamamen hava kurumasına izin verin.

4. Doğrudan intratekal enjeksiyon

  1. Anestezi ve cerrahi alan hazırlığından sonra, fareyi temiz bir enjeksiyon alanına taşıyın ve ısıtma pedine ventral yatma pozisyonuna yerleştirin.
  2. Fareyi palpasyon ve enjeksiyonu kolaylaştırmak için omurgayı kavşayan bir pozisyona yerleştirin.
    1. Karın altında, alt torasikten üst bel seviyesinde kavisli bir spatula yerleştirerek hafif omurga fleksiyonu oluşturulur ve beşinci ile altıncı (tercihen L5-L6) veya dördüncü ve beşinci (L4-L5) laminalar arasındaki lomber omurgalar arası boşlukları genişletilir.
    2. İğne eğimi laminalar arasında ilerleterek bel sarnıçlarına girip subaraknoid boşluğa ulaşın, böylece enjeksiyon güvenliği ve doğruluğunu artırmak için kemikle doğrudan temas kurmayın.
  3. Pelvik kuşağı, bir elin başparmağı ve işaret parmağı arasında pelvik kuşağı nazikçe kavrayarak ve diğer elinizle dorsal orta hattını palpasyon ederek hedef omurgalar arası boşluğu L4-L5 veya L5-L6 arasında konumlandırarak stabilize edin.
  4. 29-G, 1/2 inçlik iğneyle dorsal cilt yüzeyine dik veya 70-80° açıda, eğim kafatası yönelmiş steril 0,3 mL insülin şırıngasını hizala. İğne, dura mater'e girerken hafif bir dirençle karşılaşana kadar ilerledin, ardından intratekal boşluğa devam edin.
  5. Uç intratekal boşluğa girene kadar sabit bir şekilde yerleştirin; başarılı intratekal girişi gösteren bir kuyruk sallaması refleksiyle doğrulanın.
  6. Eğer önemli bir direnç karşılaşılırsa veya kuyruk fırlatma refleksi gözlemlenmezse, iğneyi geri çekin, anatomik işaretleri yeniden belirleyin ve enjeksiyonu tekrar denemeden önce iğne yerleşimini ayarlayın. İlk deneme L5-L6 omurlararası uzayda yapıldıysa, sonraki deneme L4-L5 omurlararası uzayda gerçekleştirilir.
  7. Basınç değişimlerini en aza indirmek ve CSF reflüsünü önlemek için ASO çözeltisinden 10 μL yavaşça (10 saniyeden fazla) enjekte edin. İğne, enjeksiyondan sonra 10 saniye daha yerinde tutulabilir.
  8. İğneyi dikkatlice dikey ve pürüzsüz olarak çekerek doku hasarını ve geri akmayı önleyin.
  9. İyileşme döneminde fareyi sürekli olarak izleyin, solunum, motor fonksiyon, duruş ve ağrı ya da sıkıntı belirtilerini gözlemleyin.
  10. Fareyi ev kafesine geri götürmeden önce onun normal hareket kabiliyetini ve davranışını geri kazandığından emin olun.
  11. Enjeksiyon bölgesi, ASO dozu, enjeksiyon hacmi ve işlem sırasında ve sonrasında yapılan davranışsal veya fizyolojik gözlemler dahil olmak üzere tüm ilgili prosedür detaylarını IACUC protokollerine uygun olarak belgeleyin.

5. Fare izlenmesi ve enjeksiyon sonrası iyileşmeyi desteklemek

  1. Her fareyi 37 °C sıcaklıkta tutulan önceden ısıtılmış bir kurtarma odasında bireysel veya iyi aralıklı bir bölmeye yerleştirin.
  2. Hipotermiyi önlemek için anestezik iyileşme sırasında odanın sıcaklığını kontrol altına alın.
  3. Solunum hızı ve desen, duruş ve dokunsal uyaranlara tepki vermeyi sürekli olarak takip edin.
  4. Fareyi düzeltme refleksini yeniden kazanana ve koordineli hareket gösterene kadar gözlemleyin.
  5. Açık görüş sağlamak ve paraziti önlemek için aşırı kalabalıktan kaçının.

6. Ev kafesine dönüş kriterlerinin belirlenmesi

  1. Faresin dengeli ve spontane hareket halinde stabil olduğunu doğrulayın.
  2. Zorlanan veya düzensiz nefes alma, ses çıkarma ve uzun süreli tepkisizlik gibi bir sıkıntı belirtisi olmadığından emin olun.
  3. Minimal çabayla su ve kalori alımını korumak için besin açısından tam bir jel diyet takviyesi gibi yumuşak besin desteği sağla.

7. Farelerin iyileşme sonrası gözlemi yapılması

  1. Fareler grup olarak barındırıyorsa, keşif, bakım ve sosyal etkileşim gibi normal davranışları doğrulayın.
  2. Sıra dışı duruş, zayıflık veya felç, düzensiz nefes alma veya azalmış tepki gibi anormal iyileşme belirtilerini sürekli olarak takip edin ve bu belirtiler ortaya çıkarsa derhal yeniden değerlendirin.
  3. İyileşme gecikirse veya tehlikeye girerse veteriner müdahalesine başvurun.

8. Stereotaksik cerrahi ve ameliyat sonrası bakım ile lateral ventrikülde intracerebroventriküler enjeksiyon

NOT: Mekansal dağılım ve göreceli etkinliği değerlendirmek için intracerebroventriküler (ICV) enjeksiyon içeren karşılaştırmalı bir kol ekleyin; ASO'ları lateral ventriküllere göndererek CSF aracılı yayım ve intratekal teslimatla karşılaştırın. ICV enjeksiyonlarını, fareler için iyi kurulmuş, standart protokolleregöre gerçekleştirin 37.

  1. Fareyi hareketsizlik için %2-2,5 oranında oksijen konsantrasyonunda izofluran ile anestezi yapın ve fareyi ısıtma pedine ventral yatma pozisyonuna yerleştirin; ardından işlem öncesinde steril 1 mL enjekte edilebilir süspansiyon (1,3 mg/mL buprenorfin hidroklorür) ile steril 1 mL enjekte edici enjekte süspansiyonu (1,3 mg/mL buprenorfin hidroklorür) ile 3,25 mg/kg ile steril bir şırınga, 20 g vücut ağırlığı başına 0,05 mL iğne ile uygulanır. Farenin saç derisini makas makinesiyle tıraş edin.
  2. Tüm cerrahi işlemleri anestezi altında yapın. ICV ameliyatı boyunca steril bir aseptik alan koruyun. Sadece steril aletler kullanın ve steril olmayan yüzeylerle temas etmemek için dikkatlice kullanın.
  3. Fareyi standart yatağa pozisyonda dijital bir ekran konsolu ile stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin. Ön dişleri fare adaptörünün diş çubuğuna yerleştirerek başı immobilize edin, ardından adaptörü solum ve egzoz solunum tüpleriyle sabitleyerek izofluran verin. Kulak çubuklarını kulaklara takın ve vidaları sıkın, böylece başlık sağlam bir şekilde sabitlensin.
  4. Bölgeyi üç kez tekrarlayan izopropil alkol ve povidon-iyot sürüntleriyle dezenfekte edin ve kafatasını açığa çıkarmak için steril bir skalpelle orta hat kesisi yapın. Yumuşak dokuları çıkarmak için steril pamuk ucu kullanın ve bregmanın net göründüğünden emin olun.
  5. Kafatasında bregma işareti yap. ASO içeren şırıngayı iğneli (26-G, 26-G, 26s/2"/2, uçlu tarzda) bregmanın hemen üstüne yerleştirin. İğneyi hedef koordinatlara hizala: AP -0.3 mm, ML ±1.0 mm, DV -3 mm kafatası yüzeyinden. AP ve ML koordinatlarında kafatasını işaretleyin.
  6. İşaretlenen koordinatlarda bir burr deliği oluşturun ve ardından stereotaktik bir çerçeve kullanarak şırınga iğnesini kafatası yüzeyinden -3 mm derinliğe indirin. Çözeltiyi 10 μL/dakika hızında enjekte ederek toplam 10 μL hacmi elde edilene kadar. Enjeksiyonu tamamladıktan sonra iğneyi 4 dakika yerinde tutun, sonra reflüyü en aza indirmek için yavaşça çekin.
  7. Saç derisi kesisini dikin, fareyi tamamen uyanana kadar önceden ısıtılmış 37 °C bir kurtarma odasına yerleştirin ve stabiliteyi doğruladıktan sonra ev kafesine geri koyun. Beslenme açısından tam bir jel diyet takviyesi sağlamakta ve anormal iyileşme belirtilerini sürekli takip edin; örneğin alışılmadık duruş, zayıflık veya felç, düzensiz nefes alma veya azalmış tepki gibi; Bu belirtilerden herhangi biri ortaya çıkarsa hemen tekrar değerlendirin.

9. Bileşik kas hareket potansiyellerinin elektrofizyolojik değerlendirmeleri (CMAP)

  1. Deneycilerin, veri toplama ve analiz sırasında önyargıyı ortadan kaldırmak için her farenin genotipi ve tedavi grubuna kör olmasını sağlamak.
  2. Fareyi hareketsizlik ve rahatlık için izofluran ile anestezi yapın ve vücut sıcaklığını 37 °C'de tutun.
  3. Pedal refleksinin kaybını garantileyerek yeterli anestezi olduğunu doğrulayın.
  4. Hem uyarım hem de kayıt için tek kullanımlık 28 G monopolar iğne elektrotları kullanın. Kayıt elektrotunu tibialis ön kasına 1 mm yerleştirin.
  5. Siyatik siniri siyatik çentik yakınında, her 2 saniyede bir 0,1 ms monofazik kare dalga darbeleri ile uyarın; 1,0 mA'dan başlayıp 0,5 mA'lık aralıklarla artırılarak supramaximal yanıt (genellikle 1,5-3,5 mA) sağlanana kadar.
  6. Supramaksimal eşik belirlendikten sonra, bu seviyenin 0,5 mA üzerinde CMAP yanıtları kaydedilir. Uyarı sonrası 0,8 ms olan CMAP genliğini (tepeden tepeye) ölçün, her fare için gecikme hariç ve her fare için sol ve sağ bacakların genliklerini ortalamaktır.

10. Serum pNFH seviyelerinin ölçülmesi

  1. Belirlenen zamanlarda pıhtı aktivatörü ve serum ayırma jeli içeren kapiller kan toplama tüpleri kullanılarak yüz ven ponksiyonu ile 100 μL tam kan toplayın.
  2. Serum izole etmek için 2000 g kan örnekleri 10 dakika boyunca 4 °C'de alın.
  3. Tamamen otomatik, kartuş tabanlı mikrofluidik immünoassay analizöründe biyolojik örneklerde pNFH ölçümü için doğrulanmış immünoassay reaktifleri kullanarak serum fosforile nörofilament ağır zincir (pNFH) seviyelerini nicelikle ölçmek.

11. RNA'nın izole edilmesi ve RT-qPCR yapılması

  1. Fare, boyun/göğüs omurilik dokularını, kriyojenik programlanabilir yüksek enerjili salınımlı boncuk değirmeninde 6 mm çelik boncuk kullanarak örnek pulverizasyonu için dakikada 1.000-1.200 darbe ile 30-40 saniye boyunca üflemeye çalışın.
  2. Toz parçalanmış dokuyu (15 mg) 2,8 mm seramik boncuklar kullanılarak 700 μL Fenol-guanidinyum tiosiyanat bazlı lizis ve RNA ekstraksiyon reaktifi, programlanabilir yüksek hızlı boncuk bazlı mekanik homojenizatör ile 5,62 m/s hızda iki 30 saniyelik döngü boyunca homojenize edin.
  3. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, sütun içi DNaz tedavisi dahil toplam RNA çıkarın.
  4. cDNA sentezi için yüksek kapasiteli ters transkripsiyon reaktif sistemi kullanarak cDNA sentezi yapın.
  5. qPCR tespiti için, insan SOD1 geninin ekzon 4'ünü hedefleyen ilgi çekici geni tespit etmek üzere özel primer/prob setleri tasarlayın:
    ön primer (5′-TGGTGTGGCCGATGTGTCTA-3′),
    ters primer (5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′)
    Prob (5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGATCTCA-MGB/NFQ-3′)
  6. Fare GAPDH'yi (TaqMan Assay ID: Mm99999915_g1) ev işleri geni olarak kullanın.
  7. Her reaksiyon başına 20 ng cDNA, hızlı döngülü prob tabanlı qPCR master karışımı, gen spesifik primerler ve ev (VIC/MGB) ve hedef (FAM/MGB) transkriptlerinin tespiti için floresan etiketli hidroliz probları kullanılarak yüksek verimli gerçek zamanlı nicel PCR (qPCR) cihazında qPCR uygulanır.

12. Verilerin istatistiksel analizi

  1. Yaşam içi ölçümlerden (CMAP), serum pNFH'den ve gen ifade analizinden elde edilen verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun.
  2. Tek yönlü ANOVA ile grup ortalamaları arasındaki istatistiksel anlamlılığı değerlendirin, ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi yapılarak p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlıdır.
  3. Grafikler oluşturmak ve tüm analizleri çalışmada yapılanlarla tutarlı şekilde yapmak için uygun istatistiksel analiz yazılımı kullanın.

Sonuçlar

Yetişkin farelerde intrathecal (BT) uygulamanın hassasiyetini ve verimliliğini titizlikle tanımlamak için, önce CSF akışı ve doku geçirimliliğinin görsel izleyicisi olarak Evans mavi boyasını (%0,5) kullanarak temel doğrulama deneyleri yaptık. Yetişkin yabani tip C57BL/6J fareleri (süst #000664; ağırlık 25-30g) hareket artefaktlarını ortadan kaldırmak için oksijende izofluran (%2-2,5) ile anestezi edildi ve bel bölgesi aseptik koşullarda hazırlandı. IT enjeksiyonları, doz/hacim ve boyama yoğunluğu ilişkisi değerlendirilmek için 20 μL, 30 μL ve 50 μL tek artan dozlarda subaraknoid boşluğa lomber ponksiyon ile yapıldı. İğnenin doğru yerleşimi, enjeksiyon sırasında kuyruk sallanması veya negatif direnç gözlemlenerek doğrulandı.

Boya teslimatından 5 dakika sonra, fareler damar yapısından kalan boya çıkarmak için soğuk fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ile transkardiyal perfüze edildi. Omurilik daha sonra nazikçe çıkarılıp standart aydınlatma altında nötr bir arka plan üzerinde fotoğraflandı. Görsel inceleme, boya alan tüm farelerde Evans mavisinin dorsal-ventral dağılımı tutarlı ve eşit olduğunu ortaya koydu. Daha yüksek enjeksiyon hacimleri, rostrokaudal eksen boyunca yoğunlaşmış boya doygunluğuyla korelasyonluydu, ancak 20 μL hacimle enjekte edilen farede bile sağlam boyama da vardı. Buna karşılık, Evans mavi boyası almayan farelerde (steril salin enjekte edilen kontrol grubu) omurilik dokusunda görünür bir renk veya arka plan lekesi görülmemiştir (Şekil 1). Bu bulgular, farelerde yapılan BT enjeksiyonlarının omurilik boyunca hızlı ve tekrarlanabilir çözünen taşınmasını mümkün kıldığını göstermektedir. Bu deneylerin sınırlamaları arasında, boya dağılımının nicel değerlendirmesinin olmaması ve ASO uygulaması için kullanılan 10 μL enjeksiyon hacminde boya dağılım analizinin olmaması yer almaktadır. Ancak, insan SOD1-G93A farelerinde gen ifadesi düzeyinde sonraki hedef etkileşim ölçümlerinde, insan SOD1-spesifik gen ekspresyonu analizi kullanılarak nicel ölçümler gerçekleştirildi. ASO uygulaması için sonraki deneylerde kullanılan 10 μL enjeksiyon hacmi, farelerde güvenli ve iyi tolere edilen dozu sağlamak için seçildi ve önceki çalışmalara dayanarak yeterli CNS maruziyeti sağlamasıbeklenmektedir 38.

Bu anatomik doğrulama üzerine inşa ederek, SOD1-ALS modellerinde doğrulanmış bir tedavi stratejisi olan mutant SOD1'i hedefleyen ASO'lar kullanarak BT teslimatının işlevsel önemini değerlendirdik. İnsan mutant SOD1 genini taşıyan hemizigot SOD1-G93A transgenik fareler, öngörülebilir motor nöron dejenerasyonu ve nöromüsküler gerileme gösterir; bu da onları köklü bir preklinik model haline getirir. 5 haftalıkken, semptomatik başlangıçtan önce, farelere 100 μg konsantrasyonda 100 μg konsantrasyonda tek bir SOD1-spesifik ASO bolusu verildi. Bu doz, McCampbell ve ark. (2018)36 tarafından bildirilen farelerde ICV uygulaması kullanılarak yapılan önceki optimizasyon çalışmalarına dayanarak seçilmiştir. BT ile ICV teslimatı arasındaki etkinliği karşılaştırmak için, ayrı bir grup aynı ASO dozunda stereotaktik teslimat kullanılarak ICV enjeksiyonları aldı. Kontroller, IT yolu üzerinden Inactive ASO (hedefsiz kontrol) aldı.

Tedaviden beş hafta sonra (10 haftalıkken), fareler hafif izoflüran anestezisi altında bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP) testi geçirdi. Standart siyatik sinir stimülasyon protokolleriyle arka uzuv kaslarından alınan CMAP kayıtları, hem BT hem de ICV ile tedavi edilen gruplarda, aktif olmayan ASO ile tedavi edilen kontrollere kıyasla genliğin önemli korunduğunu gösterdi (p < 0.0001, tek yönlü ANOVA ile Tukey'nin post -hoc testi). Önemli olarak, genlik koruması BT ve ICV teslimat yöntemleri arasında anlamlı bir fark yaratmadı (p > 0.05), bu da benzer nöromüsküler korumayı gösterir (Şekil 2A).

Nöron bütünlüğünün sistemik biyobelirteçlerini değerlendirmek için, fosforile edilmiş nörofilament ağır zincirinin (pNFH) serum seviyeleri yüksek hassasiyetli bir elektrokemilyüminsans testi kullanılarak ölçüldü. Enjeksiyon sonrası 5 hafta zaman noktasında alınan kan örneklerinde, ASO ile tedavi edilen farelerde araçla tedavi edilen kontrollere göre pNFH konsantrasyonunda >%40 azalma (p < 0.0001) gösterilmiştir ve BT ile ICV modaliteleri arasında anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir (Şekil 2B). Uniform moleküler biyobelirteç yanıtı, elektrofizyolojik verileri doğrularak, bu ALS modelinde BT sunumunun nörodejeneratif süreçleri etkili bir şekilde azalttığını öne sürmektedir.

SOD1-ASO'nun moleküler düzeyde hedef etkileşimini değerlendirmek için, disseksiye edilmiş servikal ve torasik omurilik dokularında ters transkripsiyon nicel PCR (RT-qPCR) uyguladık. Toplam RNA, yüksek saflık (A260/A280>1.8) sağlamak için kolon tabanlı bir protokol kullanılarak çıkarıldı, ardından rastgele heksamer primingiyle cDNA sentezi yapıldı. İnsan SOD1 transkriptlerini hedefleyen nicel PCR amplifikasyonu, GAPDH'ye normalleştirilmiş olarak, BT teslimatından sonra ortalama %60 ve ICV sonrası %35 düşüş göstermiştir; her ikisi de aktif olmayan ASO kontrollerine göre anlamlıdır (her ikisi < 0.0001 olur). Teslimat yolları arasındaki doğrudan karşılaştırma, BT teslimatında anlamlı şekilde daha fazla knockdown (p < 0.0001) göstermiştir; bu da doğrudan omurilik erişimi yoluyla omurilikte daha etkili hedef etkileşimini gösterir (Şekil 3). Diğer CNS bölgelerinde hedef etkileşimini değerlendirmek için daha fazla çalışma gereklidir.

Bu kapsamlı veriler, IT enjeksiyonlarını, fare modellerinde ASO'ların merkezi sinir sistemine (CNS) iletmek için kesin, tekrarlanabilir ve minimal invaziv bir teknik olarak güçlü doğrulama sunmaktadır. BT yönetimi, nörolojik fonksiyonun (CMAP) sürekli korunması, hastalıkla ilgili biyobelirteçlerin normalizasyonu (pNFH) ve hedeflenen CNS bölgelerinde insan SOD1 transkriptlerinin sağlam moleküler etkisi dahil olmak üzere geniş bir sonuç ölçütleri yelpazesinde ICV teslimatıyla eşdeğer terapötik etkinlik gösterdi. Bu bulgular, IT sunumunun CNS hedefli ASO tedavileri için klinik olarak çevrilebilir bir yol olarak çok yönlülüğünü vurguluyor; ICV'ye eşdeğer etkinlik sunarken, prosedürel sadeliği ve azaltılmış invazivliği korur. Bu nedenle, BT ve ICV uygulaması, CNS hedefli müdahaleler için eşit derecede uygulanabilir yaklaşımlardır ve anatomik erişilebilirlik, prosedürel fizibilite ve terapötik bağlama bağlı olarak preklinik ortamlarda esneklik sunar. Bu durum, BT sunumunu gelecekteki CNS hedefli tedaviler için umut vadeden bir çeviri platformu olarak konumlandırıyor. Translasyonel çalışmaları desteklemek için, beyin omurilik sıvısı, çeşitli CNS bölgeleri ve hedef hücre alımı içindeki farmakokinetik dağılımın değerlendirilmesi için floresans in situ hibritizasyon veya immünoflüoresans gibi tekniklerle daha fazla preklinik çalışmalar yapılmasını öneriyoruz.

Şekil 1
Şekil 1: Yetişkin farelerde intratekal enjeksiyon sonrası Evans mavi boya dağılımının görselleştirilmesi. Evans Blue Dye (%0,5) yetişkin farelere doğrudan intratekal (IT) enjeksiyonla uygulanarak omurilik dağılımını niteliksel olarak değerlendirdi. Üç farklı boya hacmi 20 μL, 30 μL ve 50 μL ayrı deneysel gruplarda (n = hacim koşulu başına 1 fare) teslim edildi. Enjeksiyondan sonra, omurilik hücreleri alındı ve boya nüfuzu değerlendirilerek doku boyunca lekelenme yoğunluğuna göre değerlendirildi. Omurilik dokusunun görüntüleri, her enjeksiyon hacmiyle ilişkili boya dispersiyasının boyutunu gösterir; bu da omurilik boyunca kapsayıcı ve boyama yoğunluğunda doz hacmine bağlı bir artış göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2
Şekil 2: SOD1 hedefleyen antisens oligonukleotid tedavisi, farelerde motor fonksiyonu geri kazandırır ve patolojik nörofilament seviyelerini azaltır. Yetişkin SOD1-G93A transgenik fareler, 5 haftalıkta intratekal (IT) veya intracerebroventriküler (ICV) enjeksiyonla aktif SOD1 hedefleyen antisens oligonukleotid (SOD1-ASO) ya da IT enjeksiyonu ile aktif olmayan kontrol ASO almıştır. Terapötik etki 10 haftalıkta, tedavi sonrası 5 haftaya karşılık gelen 10 haftalıkta değerlendirildi. (A) Tedavi edilen hayvanlarda nöromüsküler fonksiyonu değerlendirmek için bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP) kayıtları alındı. SOD1-ASO ile tedavi edilen gruplar (n = 5 - 6 kişi) kontrol grubuna göre CMAP düşüşünde tersine dönüş gösterdi ve bu fonksiyonel iyileşmeyi gösterdi. (B) 10. haftada toplanan serumdan (n = 5 - 8) nörodejenerasyonun bir biyobelirteç noktası olan fosforile nörofilament ağır zincirinin (pNFH) çevresel seviyeleri nicele edildi. SOD1-ASO tedavisi, dolaşımdaki pNFH seviyelerinde kontrol seviyesine kıyasla anlamlı bir azalmaya yol açtı ve hastalıkla ilişkili nöron hasarının zayıflamasına işaret etti. Tüm veriler ortalama SD ± olarak sunulmuştur. İstatistiksel anlamlılık tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile belirlenmiştir; ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi uygulanmıştır; p-değerleri ≤ 0.0001 tedavi grupları arasında sağlam farklılıkları göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3
Şekil 3: SOD1-ASO uygulaması, transgenik SOD1-G93A fare omuriliğinde insan SOD1 mRNA ifadesini önemli ölçüde bastırır. SOD1 hedefleyen antisens oligonukleotidin (SOD1-ASO) hedefleme etkinliğini değerlendirmek için, intratekal (IT) veya intracerebroventriküler (ICV) enjeksiyonla verilen SOD1-G93A transgenik farelerinden alınan omurilik dokumasının servikal/torakik kesiti ters transgenik farelerden (uygulamadan 5 hafta sonra) insan SOD1 mRNA ekspresyonu için ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) kullanılarak analiz edildi. İnsan SOD1 transkript seviyeleri, inaktif ASO ile tedavi edilen grupta ekspresyona göre nicelendirildi ve normalleştirildi. Şekil, her tedavi grubu için insan SOD1 mRNA'sında (GAPDH olarak normalleştirilmiş olarak) katlama değişimini (n = grup başına 5-7 fare) göstermekte olup, SOD1-ASO uygulamasına yanıt olarak önemli bir düşüş olduğunu vurgulamaktadır. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmaktadır. Gruplar arasındaki istatistiksel farklılıklar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak belirlenmiştir; ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi uygulanmıştır; p-değerleri ≤ 0.0001 tedavi grupları arasındaki sağlam farklılıkları göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

BileşenFWToplama Miktarı (L veya kg başlıkta)Birimler
Sodyum Fosfat Monobazik Dihidrat0.034g
Sodyum Fosfat Dibazik Ansusuz1420.111g
Sodyum Klorür58.448.766g
Potasyum klorür74.560.224g
Kalsiyum klorür dihidrat147.020.206g
Magnezyum klorür heksahidrat0.163g
Su (Milli-Q)993g
Poloksamer 1880.01g

Tablo 1: aCSF bileşimi.

Ek Şekil 1: Bel intratekal enjeksiyonu için fare konumlandırması. Karın altına yerleştirilen kavisli bir spatula veya scoopula omurgayı büker, omurgalar arası boşluğu genişletir. Enjeksiyon, gösterildiği gibi omurganın medial ekseni boyunca doğru hizalanarak L4-L5 veya L5-L6 seviyesini hedefliyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: ASO dizisi ve kimyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada sunulan doğrudan intratekal (IT) enjeksiyon tekniği, özellikle fare gibi küçük kemirgen modellerinde merkezi sinir sistemine (CNS) terapötik ajanların iletmek için minimal invaziv ancak son derece etkili bir yöntemi temsil eder. Bu kör çubuk prosedürü teknik olarak zordur ancak eğitimli bir enjektör tarafından uygulandığında hem tekrarlanabilir hem de klinik olarak anlamlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntem, kateterizasyon gerektirmeden hızlı CNS erişimi sağlamak için hassas anatomi ve verimli teknik kullanır; bu, preklinik çalışmaların genişletilmesi için önemli faydalar sağlayan önemli bir basitleştirmedir; Ancak, çeviri önemi, daha fazla nicel değerlendirme ve standartlaştırılmış metodolojik doğrulama 5,8,10 ile fayda sağlayacaktır.

Başarılı bir BT enjeksiyonu birkaç önemli adıma bağlıdır. Titiz hayvan hazırlığı şarttır: anestezi önce bir odayla indüklenir ve burun konusuyla tutulur, ardından bel bölgesi tıraş edilir ve hayvan rahatlığını sağlamak için analjezikler uygulanır. Farenin doğru konumlanması, karın altına kavisli bir spatula yerleştirilerek omurgaların arası boşluğu genişletilerek omurga bükülür (Ek Şekil 1). Burada tarif edilen intratekal enjeksiyonun amacı, iğneyin eğimi lomber sarnıç içinde uygun omurga seviyesinde laminalar arasında ilerleterek konumlandırmaktır. L4 ve L5 laminaları veya tercihen L5 ve L6 laminaları arasındaki omurgalar arası boşluğun doğru hedeflenmesi, subaraknoid 5,10 alanına erişim için kritiktir. Subarachnoid alan, aynı zamanda intratekal uzay olarak da adlandırılır, araknoid ile pia mater39 arasında yer alır. Omurilik kanalından daha kısa olduğundan, kaudal omurilik segmentleri, karşılık gelen omurga seviyelerine göre daha rostral konumdadır. Belirsizliği önlemek için, enjeksiyon noktaları omurilik seviyesi yerine omurgalar arası boşlukla tanımlanır. Özellikle, farelerde hem suş40 içinde hem de arasında bel omur segmentasyonunda önemli değişkenlik vardır. Enjeksiyon, lateral sapmayı önlemek için omurganın orta hattı boyunca yapılmalıdır; bu da arka uzuv parezisi veya ağır durumlarda omurilik yaralanması nedeniyle felç olabilir. Doğru anatomik konumda yapıldığında, doğrudan omurilik yaralanması riski minimaldır. Ancak, sinir kökü tahriş veya hasar riski küçük bir şekilde devam etmektedir; bu da olumsuz sonuçları en aza indirmek için yeterli operatör eğitimi ve prosedürel yeterliliğin önemini vurgular. Kuyruk fırlatma refleksi, iğnenin başarılı yerleştirilmesinin faydalı bir göstergesi olarak hizmet eder; enjektörün derinliği ölçmesini ve yüzeysel veya aşırı derin penetrasyondan kaçınmasını sağlar. Bu tekniği ustalaştırmak pratik gerektirir; derinlik, açı ve enjeksiyon hacminin düzenli kontrolünü gerektirir; böylece geri akış ve çevre dokulara sızıntı önlenir. Enjeksiyon hacminin ≤10 μL tutulmasını önersek de, yan etkiler olmadan 20 μL'ye kadar değerlendirme yaptık. Önceki çalışmalar, ilaç teslimatı için optimal olarak 10 μL intratekal enjeksiyonhacmini tespit etmişti 38. Bu,41,42 farelerde toplam CSF hacminin %25-30'unu temsil etse de, yetişkin farelerde maksimum tolere edilebilir intratekal enjeksiyon hacminin 30μL 10 olduğu bildirilmiştir. Önerilen sınırları aşan enjeksiyon hacimleri, beyin omurilik sıvısı (CSF) dinamiklerini bozabilir, bu da BOS basıncının değişmesine ve yan etkilerin artmasına yol açabilir. Farelerde toplam CSF hacmi 35-40 μL olarak tahmin edilir ve günde 12-13 kezdöner 41,42, bu da yaklaşık her 1,8 saat42,43 tam yenilenmeye karşılık gelir. Hızlı BOĞS değişimi ve ampirik gözlemler ile 20-30 μL'ye kadar intratekal enjeksiyon hacimlerinin komplikasyon olmadan güvenli kullanıldığını gösteren önceki çalışmalar göz önüne alındığında, 10 μL enjeksiyon hacminin yan etkiler yaratmasıbeklenmemektedir 10,44.

Ölçeklenebilirlik bu tekniğin önemli bir avantajıdır. Ustalaştıktan sonra, eğitimli enjektörler saatte 10-12 hayvanı tedavi edebilir; böylece kateter implantasyonu veya daha invaziv cerrahi yaklaşımların lojistik yükü olmadan daha büyük preklinik çalışmaları kolaylaştırır. Bu prosedür, karmaşık enstrümantasyondan kaçınır, hayvan stresini azaltır ve kronik kateterizasyona kıyasla iyileşme sürelerini kısaltır; bu da tekrar tekrar dozlama gerektiren uzunlamasına çalışmalar için uygundur. Klinik dozlama rejimlerini simüle etmek için, farelerde seri BT uygulamalarını doğruladık ve sekiz hafta arayla dört doza kadar verdik. Bu enjeksiyonlar iyi tolere edildi, herhangi bir rahatsızlık, davranış değişikliği veya hastalık belirtisi bulunmadan; önceki çalışmalar, birden fazla BT tedavisi sonrası CSF dinamikleri veya omurilik mimarisinde anlamlı değişiklikler olmadığını bildiren çalışmalarlauyumlu (34,45). Bu nedenle, çalışmalarımız, sürekli hedef etkileşiminin terapötik fayda için gerekli olduğu insan tedavi paradigmalarıyla uyumlu olarak, uygun aralıklarla tekrarlanan BT dozlarının mümkün olduğunu doğrulamaktadır. Deneyimimize göre, bu tekrarlanan IT enjeksiyonları 5 ila 29 haftalık geniş yaş aralığında başarıyla gerçekleştirilmiştir. Yaş ve vücut kütlesinin artması, daha fazla deri altı dokusu nedeniyle omurilik erişimini biraz değiştirebilirken, başarılı uygulama, teknikte ve iğne yerleştirme hissine aşina olan yetenekli bir operatörle mümkün olmaya devam eder. Ancak, enjeksiyon bölgesi ve bolus hacminin ötesinde, özellikle enjeksiyon hızı ve enjekte edilen çözeltinin fiziksel özellikleri, örneğin CSF'ye göre yoğunluk, CNS içindeki çözüntücü maddelerin dağılımını önemli ölçüde etkileyebildiğini belirtiyoruz. Bu parametreler doğrudan ölçülmemiş veya manipüle edilmemiş olsa da, Linninger ve ark. (2023) tarafından yapılan son çalışmalar, mekanik farmakokinetik model aracılığıyla bu faktörlerin intratekal antisens oligonukleotid (ASO) biyodağılımını ve46 hedefli doku hedeflemesini önemli ölçüde etkilediğini göstermektedir. Buna göre, bunu çalışmamızın bir sınırlaması olarak kabul ediyor ve enjeksiyon hızı ile çözelti özelliklerini, CNS sunumunu ve translasyonel ilgiyi optimize etmek için gelecekteki araştırmalar için önemli değişkenler olarak vurguluyoruz. Bu sonuçlar birlikte, çoklu doz preklinik paradigmalarda tekrarlanan BT dozunun güvenilirliğini ve uygulanabilirliğini vurgularak, bunun insan tedavi rejimlerinin sürdürülebilir hedefe katılımı ve translasyonel modellenmesi için kullanımını desteklemektedir.

BT yaklaşımı ayrıca terapötik testlerde esneklik sağlar. ASO'lar, küçük moleküller, peptidler ve viral vektörler dahil olmak üzere geniş bir modalite yelpazesini barındırır ve MSS'ye yönelik müdahalelerin doğrudan değerlendirilmesini sağlar. Bel sarnışına hassas ve kontrollü miktarda tedavi verilebilme yeteneği, etkili omurilik ve daha geniş MSS maruziyetini sağlarken, sistemik yayılmayı sınırlar. Kuyruk fırlatma refleksi ve diğer prosedürel ipuçları, başarılı intrathecal teslimatın gerçek zamanlı doğrulanmasını sağlar, bu da tekrarlanabilirliği artırır ve deneysel başarısızlıkoranlarını azaltır 5,6,8,47.

SOD1-G93A farelerinde yapılan önceki çalışmalar, hastalık patolojisinin özellikle bel bölgesini, kortekse kıyasla omuriliği belirgin şekilde etkilediğinigöstermiştir 29,48. Bu nedenle, bu teknik özellikle süperoksit dismutaz 1 (SOD1) genindeki mutasyonlar nedeniyle oluşan ALS'nin genetik bir formu olan SOD1-ALS bağlamında önemlidir. Bu mutasyonlar, motor nöronlar içinde toksik bir fonksiyon kazanımına yol açan yanlış katlanmış SOD1 protein agregasyonları üretir ve ilerleyici nöromüskülerdüşüşe yol açar 49,50. Bu çalışmada, hedef mRNA ve fonksiyonel iyileşme ile başarılı etkileşim göstermek için SOD1 hedefleyen ASO'ları kullandık. RT-qPCR analizi, IT uygulaması sonrası omurilikte insan SOD1 transkriptlerinin anlamlı baskılandığını gösterirken, CMAP kayıtları motor nöron işlev bozukluğunun tersine döndüğünü gösterdi. Ayrıca, serum analizi, nörodejenerasyonun bir biyobelirteci olan fosforile nörofilament ağır zincir (pNFH) seviyelerinde azalma gösterdi ve bu da terapötik stratejinin etkinliğini pekiştirdi.

Bu modelin klinik önemi, SOD1-ALS35 tedavisinde SOD1 mRNA'yı hedeflemek üzere tasarlanmış bir ASO olan tofersen (QALSODY®) adlı yakın zamanda FDA'nın onayı ile vurgulanmaktadır. Tofersen, SOD1-ALS ile yaşayan kişilerde intratekal olarak uygulanır ve toplam CSF SOD1 protein seviyelerinde (hedefe bağlanmanın dolaylı belirteci) ve plazma NfL'de (aksonal hasar ve nörodöjenerasyon belirteci) azalmalar gibi belirgin farmakodinamik aktivite göstermiştir. Faz 3 VALOR çalışması ve OLE'nin entegre analizlerinde, tofersen ile tedaviye daha erken başlama, klinik fonksiyon, güç ve yaşam kalitesi ölçütlerinde azalma ile ölüm eşdeğeri olay riskinin azalmasıylailişkilendirilmiştir 35. Bu veriler, intratekal yolu CNS'ye yönelik ASO tedavisi için güçlü bir yol olarak doğruluyor ve benzer uygulama stratejileri kullanan preklinik çalışmalara güçlü bir translasyon ağırlık katıyor.

ALS'deki faydasının yanı sıra, BT yolu spinal kas atrofisi (SMA)14,51,52'de başarı göstermiştir; burada BT tarafından uygulanan ASO Nusinersen (Spinraza®) ilk onaylanmış tedaviolmuştur 14,51,52. IT enjeksiyonları, kan-beyin bariyerini aşar ve yaygın CNSbiyodağılımını mümkün kılar; bu da diffüz nöron patolojisiyle karakterize edilen hastalıklar için kritik öneme sahiptir. Tekrar dozlama lojistik ve tolere edilebilirlik açısından zorluklar yaratsa da, formülasyon ve teslimat tekniklerindeki gelişmeler BT uygulamasının uzun vadeli tedavi için daha uygulanabilir hale gelmesini sağlamaya devam etmektedir.

BT yönetimi, insan klinik uygulamalarına ICV enjeksiyonlarından daha fazla translasyonel önem sunar. Yetişkin farelerde ICV ve IT enjeksiyonları, öncelikle MSS içindeki hedef konumları ve verilen maddenin dağılımı ile etkileri açısından farklılık gösterir. ICV enjeksiyonları, maddeleri beynin lateral ventriküllerindeki beyin omurilik sıvısına (CSF) doğrudan ulaştırır ve öncelikle supraspinal bölgeleri hedef alır. Buna karşılık, BT enjeksiyonları öncelikle omuriliği hedefleyerek omurga subaraknoid boşluğundaki CSF'ye madde taşır. Her iki yöntem de kan-beyin bariyerini atlayarak doğrudan CNS dağıtımına izin verirken, BT uygulaması bazı bileşikler için daha uzun bir etkisüresine yol açabilir ve genellikle omurilikte daha güçlü transdüksiyona yol açarken, ICV lateral ventriküle bitişik beyin bölgelerinde yüksek lokal konsantrasyonlar eldeedebilir 54. Ancak, omurga SK bölgesine uygulanan bileşiklerin beyne ulaşabileceğini belirtmek önemlidir; ancak taşıma hızı çokyavaştır 1. Bu farklılıklar prosedürel risklerde de yansımaktadır. ICV enjeksiyonları, sterillik bozulursa daha yüksek kontaminasyon potansiyeline sahiptirken, BT enjeksiyonları risksiz olmasa da cihazla ilgili daha az güvenlik açıklığına sahiptir. İşlem sonrası, BT enjeksiyonları geçici rahatsızlık veya arka uzuvla ilgili reaksiyonlara yol açabilirken, ICV enjeksiyonları daha az acil rahatsızlıkla ilişkilendirilir, ancak lokal kafa tahrişi hâlâ mümkündür.

Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları mevcut preklinik çalışmaların ötesine geçmektedir. BT sunumu, gen düzenleme araçları (örneğin CRISPR/Cas sistemleri), RNA girişim modaliteleri ve viral vektör tabanlı gen tedavileri dahil olmak üzere yeni nesil CNS hedefli tedavileri değerlendirmek için kullanılabilir. Yaklaşım, birden fazla CNS yolunu hedefleyen kombinasyon tedavileri için uyarlanabilir olup, farmakodinamik etkileşimlerin gerçek zamanlı değerlendirilmesinisağlar 55,56. Ayrıca, BT yönetimi, görüntüleme yöntemleriyle entegre edilip dağılımı ve hedefe katılımı in vivo olarak takip edilebilir ve translasyon boru hatlarını hızlandırır. Teknik ayrıca, nörolojik hastalıkların genetik olarak tanımlanmış fare modellerinde hassas tıp stratejilerini incelemek için bir platform sağlar; biyobelirteç keşfini, uzunlamasına fonksiyonel değerlendirmeleri ve klinik çeviri öncesi güvenlik değerlendirmelerini kolaylaştırır.

Sonuç olarak, izofloran anestezi kullanılarak doğrudan bel enjeksiyonu tekniği, fare sinir sindrosuna terapötik uygulamak için minimal invaziv, hızlı ve klinik olarak aktarılabilir bir yöntemdir. SOD1-ALS modellerinde başarılı uygulaması ve seri dozlama ile uyumluluğu, translasyonel sinirbilim araştırmalarında daha geniş bir uygulama için güçlü bir temel sağlar. Alan, CNS gen modülasyonu, RNA hedefli tedaviler ve hassas tıbba giderek daha fazla vurgu yaparak ilerledikçe, BT yolu preklinik modelleri klinik başarıyla birleştiren önemli bir ilaç teslimat stratejisi olmaya devam edecektir.

Açıklamalar

SM ve S-C L, Biogen, Inc.'in mevcut çalışanlarıdırken, TC, DF, YL, JD ve MZ şirketin eski çalışanlarıdır. Bu makalede tartışılan antisens oligonukleotidler, yazarlara Ionis Pharmaceuticals tarafından sağlanmıştır. Tofersen (QALSODY), Biogen ve Ionis Pharmaceuticals tarafından ortaklaşa geliştirilen bir üründür.

Teşekkürler

Makalede açıklanan ASO'ları sağladığı için Ionis Pharmaceuticals'a teşekkür etmek istiyoruz. Biogen'den Ryan Gamble, Steve Garafalo, Adria Martig, Isabel Isaza, Taras Tuczkewycz ve David Koske'ye uzman katkıları için minnettarız; bu katkılar makaleyi önemli ölçüde geliştirdi; bu katkılar önemli ölçüde geliştirildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BT enjeksiyonu için 0.3 mL 29 G, 1/2 inç insülin şırıngasıSmiths Tıp4429-3
0,5 mm çapında steril matkap buruGüzel Bilimler Araçları (FST) veya eşdeğeri1900705
5-0 Prolene Monofilament DikişEthicon 8870H 
Alkol sürüntü çubuklarıDynarex1203
Alkol sürüntü çubuklarıDynarex1203
Analjezik- Buprenorfin Uzatılmış salınımlıReçete Gereklidir
Hayvan makasıWahl08787-450A
Applied Biosystems Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon KitiFisher Scientific43-688-14
Bead Ruptor 24 HomojenizerOmni International, Inc.19-070
Kan toplama ve serum ayırma tüpleriBeckton Dickinson (BD)365967
Kalsiyum klorür dihidratJT Baker1335
Dijital şırınga pompasıHarvard Aparatı70-4507
Ella Otomatik İmmünoanaliz SistemiR& D Sistemleri600-100
Göz Merhemi-PuralubeDecra17033-211-38
Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
Germinator 500 Kuru sterilizatörBraintree Scientific veya eşdeğeriGER 5287-120V
Hamilton şırıngası ve iğneli (26s/2"/2 (uçlu stili)Hamilton8030026s/2"/2:                                                                                              26s: 26 G;                                                                                                             2" uzunluk;                                                                                                                             2: Nokta Stili
Sert Doku Homojenleştirici Karışım 2.8 mm Seramik (2 mL takviyeli tüpler) (50/pk)Fisher Scientific50-280-9286Tedarikçi: Revvity Health Sciences Inc
Isıtma PediK& H Üretimi1060
ICV platformuStoelting502063
İzofloran odası ve temizleyici sistemiVetEquip901820
Magnezyum klorür heahidratEMD Kimyasalları1.05832
Metzenbaum MakasıGüzel Bilimler Araçları (FST) veya eşdeğeri14016-14
Fare GAPDH TaqMan Test Kimliği Mm99999915_g1ThermoFisher Scientific4331182
CMAP için İğne Elektrotları, 28 GNatus Medical (Teca markası)#902-DMF25-TP
NutraGel: Tam beslenmeBio ServNGB-2
Olsen-Hegar İğne TutacağıGüzel Bilimler Araçları (FST) veya eşdeğeri12502-12
Poloksamer 188Mutchler
Potasyum klorürJT Baker3045
Ön amplifikatör (CMAP için)Dünya Hassas Aletleri (WPI)SYS-DAM50
ProteinSimple pNFH kitiR& D SistemleriSPCKB-PS-000519
Providone-Iodide sürüntü çubuklarıDynarex1201
QIAzol Liz Reagenti Qiagen79306
QuantStudio 12K Flex sistemiUygulamalı Biyosistemler4471087
ScoopulaFisherbrand01-257-567
Signal v6.04Cambridge Elektronik TasarımıSeri No. 061144CMAP Yazılımı 
Küçük hayvan kurtarma odasıTermocare Taşınabilir Hayvan Yoğun Bakım Üniteleri Model FW-1FW-1 
Dijital ekran konsollu küçük hayvan stereotaksik çerçevesiKOPFModel 940 
SOD1 G93A fareleriJackson LaboratuvarıStok # 004435
Sodyum KlorürEMD Kimyasalları1.16224
Sodyum Fosfat Dibazik AnsusuzSigma Aldrich55136
Sodyum Fosfat Monobazik DihidratSigma Aldrich3819
Steril tek kullanımlık bistürMed Vet International veya benzeriMIL4410
Steril perdeDynarex4410
Steril gazlı bez pedlerDynarex veya eşdeğeriDRX-3354
Steril salinThermoFisher Scientific14190094
Steril cerrahi eldivenlerAnsell veya eşdeğeri20277290
Uyarıcı İzolatör (CMAP için)Dünya Hassas Aletleri (WPI)SYS-A365D
Stoelting Micro Matkap Stoelting58610
Cerrahi kavisli forseps (Graefe Penseps - Titanyum)Güzel Bilimler Araçları (FST) veya eşdeğeri11652-10
Cerrahi dik penseps (Graefe penseps - Titanyum)Güzel Bilimler Araçları (FST) veya eşdeğeri11650-10
Cerrahi bantDynarex veya eşdeğeri3572
Analjezik enjeksiyonu için deri altı enjekte için şırıngeBD309582
TaqMan Hızlı İleri Master MixThermoFisher Scientific4444556
Su (Milli-Q)
TartıMettler Toledo                                        Model XSR2002S23-112795
Vahşi tip C57BL/6J fareleriJackson LaboratuvarıStok # 000664

Kaynaklar

  1. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).
  2. Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice. J Vis Exp. (144), e58565(2019).
  3. Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 Suppl 1 (Suppl 1), S3(2009).
  4. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2 (1), 3-14 (2005).
  5. Ajeeb, R., Clegg, J. R. Intrathecal delivery of macromolecules: clinical status and emerging technologies. Adv Drug Deliv Rev. 199, 114949(2023).
  6. Bennett, C. F., Swayze, E. E. RNA targeting therapeutics: molecular mechanisms of antisense oligonucleotides as a therapeutic platform. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 50, 259-293 (2010).
  7. Corey, D. R. Nusinersen, an antisense oligonucleotide drug for spinal muscular atrophy. Nat Neurosci. 20 (4), 497-499 (2017).
  8. Bey, K., et al. Efficient CNS targeting in adult mice by intrathecal infusion of single-stranded AAV9-GFP for gene therapy of neurological disorders. Gene Ther. 24 (5), 325-332 (2017).
  9. Kennedy, Z., Gilbert, J. W., Godinho, B. Intrathecal delivery of therapeutic oligonucleotides for potent modulation of gene expression in the central nervous system. Methods Mol Biol. 2434, 345-353 (2022).
  10. Stavrou, M., Georgiou, E., Kleopa, K. A. Lumbar intrathecal injection in adult and neonatal mice. Curr Protoc. 4 (6), e1091(2024).
  11. Zou, Z. Y., Liu, C. Y., Che, C. H., Huang, H. P. Toward precision medicine in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Transl Med. 4 (2), 27(2016).
  12. Quemener, A. M., et al. The powerful world of antisense oligonucleotides: from bench to bedside. Wiley Interdiscip Rev RNA. 11 (5), e1594(2020).
  13. Rook, M. E., Southwell, A. L. Antisense oligonucleotide therapy: from design to the Huntington disease clinic. BioDrugs. 36 (2), 105-119 (2022).
  14. Neil, E. E., Bisaccia, E. K. Nusinersen: a novel antisense oligonucleotide for the treatment of spinal muscular atrophy. J Pediatr Pharmacol Ther. 24 (3), 194-203 (2019).
  15. Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).
  16. Kingwell, K. Double setback for ASO trials in Huntington disease. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 412-413 (2021).
  17. Mead, R. J., Shan, N., Reiser, H. J., Marshall, F., Shaw, P. J. Amyotrophic lateral sclerosis: a neurodegenerative disorder poised for successful therapeutic translation. Nat Rev Drug Discov. 22 (3), 185-212 (2023).
  18. Gros-Louis, F., Gaspar, C., Rouleau, G. A. Genetics of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1762 (11-12), 956-972 (2006).
  19. Valentine, J. S., Hart, P. J. Misfolded CuZnSOD and amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3617-3622 (2003).
  20. Rotunno, M. S., Bosco, D. A. An emerging role for misfolded wild-type SOD1 in sporadic ALS pathogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 253(2013).
  21. Winkler, D. D., et al. Structural and biophysical properties of the pathogenic SOD1 variant H46R/H48Q. Biochemistry. 48 (15), 3436-3447 (2009).
  22. Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
  23. Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
  24. Bruijn, L. I., et al. Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent from wild-type SOD1. Science. 281 (5384), 1851-1854 (1998).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  26. Peggion, C., et al. SOD1 in ALS: taking stock in pathogenic mechanisms and the role of glial and muscle cells. Antioxidants (Basel). 11 (4), 614(2022).
  27. Beers, D. R., et al. Endogenous regulatory T lymphocytes ameliorate amyotrophic lateral sclerosis in mice and correlate with disease progression in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 134 (Pt 5), 1293-1314 (2011).
  28. Marchetto, M. C., et al. Non-cell-autonomous effect of human SOD1 G37R astrocytes on motor neurons derived from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 649-657 (2008).
  29. Filipi, T., et al. Cortical glia in SOD1(G93A) mice are subtly affected by ALS-like pathology. Sci Rep. 13 (1), 6538(2023).
  30. Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
  31. Smith, R. A., et al. Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. J Clin Invest. 116 (8), 2290-2296 (2006).
  32. Simonini, C., et al. Neurodegenerative and neuroinflammatory changes in SOD1-ALS patients receiving tofersen. Sci Rep. 15 (1), 11034(2025).
  33. Naseri Kouzehgarani, G., et al. Harnessing cerebrospinal fluid circulation for drug delivery to brain tissues. Adv Drug Deliv Rev. 173, 20-59 (2021).
  34. Duan, C., et al. Intrathecal administration of a novel siRNA modality extends survival and improves motor function in the SOD1(G93A) ALS mouse model. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (1), 102147(2024).
  35. Miller, T. M., et al. Trial of antisense oligonucleotide tofersen for SOD1 ALS. N Engl J Med. 387 (12), 1099-1110 (2022).
  36. McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. J Clin Invest. 128 (8), 3558-3567 (2018).
  37. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. (75), e50326(2013).
  38. Bhusal, A., Suk, K. Protocol for delivering proteins, peptides, and shRNAs via the intrathecal route in the experimental allergic encephalomyelitis mouse model. STAR Protoc. 5 (3), 103219(2024).
  39. Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. Epidural and intrathecal drug delivery in rats and mice for experimental research: fundamental concepts, techniques, precaution, and application. Biomedicines. 11 (5), 1413(2023).
  40. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  41. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
  42. Law, V., et al. A murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease. J Vis Exp. (167), e62033(2021).
  43. Christensen, J., Li, C., Mychasiuk, R. Choroid plexus function in neurological homeostasis and disorders: the awakening of the circadian clocks and orexins. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (7), 1163-1175 (2022).
  44. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  45. Shi, L., et al. Repeated intrathecal administration of plasmid DNA complexed with polyethylene glycol-grafted polyethylenimine led to prolonged transgene expression in the spinal cord. Gene Ther. 10 (14), 1179-1188 (2003).
  46. Linninger, A. A., Barua, D., Hang, Y., Iadevaia, S., Vakilynejad, M. A mechanistic pharmacokinetic model for intrathecal administration of antisense oligonucleotides. Front Physiol. 14, 1130925(2023).
  47. Chen, Y., et al. Intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system. J Vis Exp. 152, e60274(2019).
  48. Molnar-Kasza, A., et al. Evaluation of neuropathological features in the SOD1-G93A low copy number transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Front Mol Neurosci. 14, 681868(2021).
  49. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  50. Une, M., et al. SOD1-interacting proteins: roles of aggregation cores and protein degradation systems. Neurosci Res. 170, 295-305 (2021).
  51. Gidaro, T., Servais, L. Nusinersen treatment of spinal muscular atrophy: current knowledge and existing gaps. Dev Med Child Neurol. 61 (1), 19-24 (2019).
  52. Hoy, S. M. Nusinersen: first global approval. Drugs. 77 (4), 473-479 (2017).
  53. Metz, T., et al. Biodistribution of radioactively labeled splice-modulating antisense oligonucleotides after intracerebroventricular and intrathecal injection in mice. Nucleic Acid Ther. 34 (1), 26-34 (2024).
  54. Adank, D. N., et al. Comparative intracerebroventricular and intrathecal administration of a nanomolar macrocyclic melanocortin receptor agonist MDE6-5-2c (c[Pro-His-DPhe-Arg-Trp-Dap-Ala-DPro]) decreases food intake in mice. ACS Chem Neurosci. 11 (19), 3051-3063 (2020).
  55. Sharma, A., et al. Multiple doses of cell therapy and neurorehabilitation in amyotrophic lateral sclerosis: a case report. Clin Pract. 10 (3), 1242(2020).
  56. Modol-Caballero, G., et al. Gene therapy overexpressing neuregulin 1 type I in combination with neuregulin 1 type III promotes functional improvement in the SOD1(G93A) ALS mice. Front Neurol. 12, 693309(2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

SOD1 Antisense Oligon kleotidleriALS Fare ModeliSerebrospinal S v UygulamasOmurilik Enjeksiyonuntraserebroventrik ler EnjeksiyonElektrofizyolojik De erlendirmeN rofilament BiyobelirteciKantitatif PCR
İnsan SOD1-G93A ALS farelerinde hassas CNS hedefleme ve öngörücü etkinlik için SOD1-ASO'ların bel intratekal enjeksiyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.