Research Article

Digitonin-permeabilize BE(2)-C nöroblastom hücrelerinde oksidatif fosforilasyon bağlanmasının kolinergik ligand-bağımlı modülasyonu

DOI:

10.3791/69789

⸱

April 28th, 2026

 , 
1Department of Psychology and Neuroscience, College of Psychology, Nova Southeastern University, 2Capillus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazma zarını seçici olarak geçirimli hale getiren bir protokol sunuyoruz; böylece kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu (OXPHOS) değerlendirmek için substratlar ve inhibitörlerin hedefli şekilde teslim edilmesini sağlıyoruz ve genellikle bu tür analizleri engelleyen plazma zarı taşıma engellerini aşıyoruz. Bu teknikle, OXPHOS fonksiyonunun muskarinik agonistler ve antagonistler tarafından nasıl modüle edildiğini gösterdik.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın amacı, tanımlanmış substrat-inhibitör kombinasyonları kullanılarak kültürlenmiş hücrelerde oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) fonksiyonunu değerlendirmek, izole mitokondriyal preparatlarda kaybedilen hücresel yapı ve sitozolik bağlamı korumaktı. Sağlam hücreler birkaç Krebs döngüsü ara maddesine karşı zayıf geçirimli olduğundan, spesifik elektron taşıma zinciri (ETC) giriş noktaları aracılığıyla substrat destekli solunumun doğrudan değerlendirilmesi sınırlıdır. Bunu aşmak için, digitonin aracılı seçici plazma zarı geçirimliliği uyguladık ve BE(2)-C nöroblastom hücrelerinde ekstraselüler akı analizörü tabanlı bağlanma ve elektron akışı testleri yaptık. Hücre tipi bağımlılığını belirlemek için, digitonin HEK293 hücrelerinde ve primer fare dorsal kök ganglionu (DRG) nöronlarında süksinat + rotenon kullanılarak Kompleks II–IV kaynaklı solunumu izole etmek için ampirik olarak titrlendi.

Kompleks I inhibisyonlu suksinat destekli solunum, permeabilize edilmiş hücrelerde permeabilize olmayan hücrelere kıyasla Kompleks II–IV kaynaklı oksijen (O₂) tüketiminin arttığını gösterdi ve bu, membran imperforlu bir substratın mitokondrilere erişiminin artmasıyla uyumlu oldu. Buna karşılık, endogen taşıma yolları (örneğin, piruvat/malat) yoluyla giren substratlarla desteklenen solunum, koşullar arasında daha küçük farklar gösterdi. Bu platformu muskarinik ligandları test etmek için kullanarak, bağlanma testinde O₂ tüketiminde agonist ile antagonist ilişkili farklılıkları gözlemledik; elektron akışı testi ise test edilen koşullarda minimal ligand ilişkili etkiler gösterdi. Bu bulgular, tespit edilebilir ligand etkilerinin, maksimum elektron transfer kapasitesine göre bağlanma ile tanımlanan solunum durumları seviyesinde daha belirgin olduğunu göstermektedir. Genel olarak, seçici permeabilizasyon, kültürlü hücre biyoenerjik testlerinde substrat erişilebilirliğini artırır ve mitokondriyal solunumun farmakolojik modülasyonunun analizini mümkün kılar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal enerji metabolizmasının arızalanması veya yeniden programlanması, nörodejenerasyon, kanser, iltihap hastalıklar, kardiyometabolik durumlar ve çeşitli genetik bozukluklar gibi geniş bir hastalık yelpazesinin merkezinde yer alır. Mitokondriyal metabolizmanın hastalık patogenezindeki rolünü daha iyi anlamak için birkaç analitik strateji geliştirilmiştir. Bunlar arasında O2 tüketim oranı (OCR), hücre dışı asitleşme oranı (ECAR), ATP niceltilmesi, substrat kullanımı, profilleme veya Krebs döngüsü metabolit analizi ve izotopizleme 1 ölçümleri yer alır. Bu teknikler arasında OCR, mitokondriyal solunumun anahtar bir göstergesi olarak hizmet verir ve Yüksek Çözünürlüklü Respirometri (HRR; örneğin, Oroboros O2k)2, Clark tipi elektrot veya ekstrasellüler akı analizörü gibi aletlerle değerlendirilebilir

Oroboros O2k sistemi, Clark tipi polarografik O2 sensörü (POS)3,4,5 kullanılarak kapalı bir odada O2 konsantrasyonunu ölçer ve izole mitokondriler, permeabilize hücreler ve doku homojenleri gibi örnekler için uygundur. Bir altın/platin katod, bir gümüş anot ve bir KCl elektrolit rezervuarından oluşur; bu rezervuar örnekten 25 μm O2 geçirgenli ve kimyasal olarak dirençli bir Florenli Etilen Propilen membranı (FEP) ile ayrılır. Clark tipielektrot 3 ayrıca kapalı bir odada çalışır, O2 konsantrasyonundaki değişiklikleri O2 hassasiyetli bir elektrot aracılığıyla algılar ve genellikle izole mitokondri veya hücre süspansiyonları için kullanılır. Buna karşılık, hücre dışı akı analizörü, mikroplakalara gömülü floresan sensörler kullanarak canlı yapışkan hücrelerde veya izole mitokondrilerde OCR ve ECAR'ı nicelikle ölçüyor ve yüksek verimli metabolik profilleme imkanı sağlıyor. Hücre dışı akı analizör platformunun pratik avantajlarından biri, birden fazla koşulda paralel olarak otomatik, çok parametrik değerlendirmedir; kapalı odalı sistemler (örneğin HRR veya Clark tipi elektrotlar) ise genellikle daha düşük veri verimliliği sağlar ve daha fazla manuel işlem gerektirir.

Ekstraselüler flux analizör, mikroplakanın alt kısmında yerleşen sağlam yapışkan hücrelerde veya süspansiyon hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesinde özellikle faydalıdır. Sağlam yapışkan hücrelerle yapılan testlerde, mitokondriyal enerji metabolizması glikoz veya piruvat6 gibi substratlar kullanılarak profillenebilir. Alternatif olarak, küçük miktarlarda zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonlar kullanılarak yapılan testler, bazal solunum, ADP ile uyarlanan solunum (Durum 3), dinlenme solunumu (Durum 4) ve substratlar ile inhibitörlerin kombinasyonları kullanılarak ayrılan uyarılısolunumun ardışık ölçümlerine olanak tanır 7. Ancak, sağlam hücre sistemlerinde, hücre geçirgenliği olmayan Trikarboksilik asit (TCA) döngüsü metabolitleri metabolizmalarını doğrudan değerlendirmek için kullanılamaz. İzole mitokondriler, plazma zarı bariyerlerinin olmaması nedeniyle bu metabolitlerin kullanımına izin verir. İzole zenginleştirilmiş mitokondriyal biyoenerjez yaklaşımının analizinin sınırlamaları vardır: izolasyon sırasında mitokondriyal yapı değişebilir ve mitokondriyal metabolizmayı ve metabolit taşınımını etkileyen sitozolik faktörler azalır veya yoktur. Buna göre, seçici geçirimlilik yaklaşımları genellikle hücresel mimarinin bazı yönlerini koruyan ve mitokondrilere kontrollü erişim sağlayan bir uzlaşma olarak kullanılır. Metabolik testlerde sağlam hücreler veya izole mitokondriler kullanmanın sınırlamalarını aşmak için, bu protokol yapışkan nöroblastom (BE(2)-C) hücrelerini digitonin kullanarak geçirimlileştirme yöntemini tanımlar. Bu yaklaşım, aksi takdirde hücre permeant olmayan metabolitlerin plazma zarı boyunca ithalatını kolaylaştırırken, tanımlanmış substratlar ve inhibitörlere fonksiyonel mitokondriyal yanıtları korur.

Digitoninin seçiciliği, membran lipid bileşimindeki farklılıklara dayanır: plazma zarı kolesterol açısından zenginken, mitokondriyal zarlar — özellikle iç mitokondriyal zar — çok az kolesteroliçerir 8. Düşük konsantrasyonlarda, digitonin (veya saponin) yüksek kolesterol içeriği nedeniyle plazma zarını seçici ve tamamen geçirimli hale getirirken, mitokondriyal zarlar yalnızca daha yüksekkonsantrasyonlarda (9,10) etkilenir. Digitonin, kolesterole bağlanır ve plazma zarında gözenekler oluşturur; böylece TCA döngüsü gibi küçük moleküller, doğru optimize edildiğinde mitokondriyal yapı veya işlevi bozulmadan sitozole girebilir. Bu yaklaşım, ekstrasellüler akı analizör mikroplakasında yapışkan monotabakalar olarak tekrarlanabilir şekilde üretilebilen kültürlenmiş hücreler için en uygundur ve her hücre tipi ile tohumlama yoğunluğu için digionin konsantrasyonunun ampirik titrasyonu gerektirir. Korunmuş mitokondriyal bütünlüğün operasyonel göstergeleri arasında sağlam, inhibitör-duyarlı OCR yanıtları (örneğin, rotenon/antimisin A ile beklenen azalmalar ve askorbat/TMPD ile sağlam Kompleks IV kaynaklı solunum) ve aşırı geçirimliliği sinyal verecek OCR çökmemesinin olmaması yer alır. Bu nedenle, dijîtonin optimizasyonu deneysel karşılaştırmalardan önce yapılmalı ve kültür koşulları veya hücre yoğunluğu değiştiğinde tekrarlanmalıdır. Ayrıca, optimal digitonin konsantrasyonu hücre tipine göre değişir ve inhibitörlere duyarlı mitokondriyal fonksiyonu koruyarak impermeant substratlarının (örneğin süksinat) girmesine izin veren bir permeabilizasyon penceresi oluşturmak için ampirik olarak belirlenmelidir. Bu çalışmada, digitonini sadece BE(2)-C hücrelerinde değil, aynı zamanda HEK293 hücrelerinde ve birincil fare dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarında da optimize ederek bu prensibi gösteriyoruz.

Bu protokol, başlangıçta nöroblastoma hastası erkek hastanın beyninden izole edilen BE(2)-C nöroblastom hücreleri kullanılarak gösterilmiştir. BE(2)-C hücreleri, özellikle kolinerajik reseptör muskarinik tip-1 (CHRM1) olmak üzere çeşitli muskarinik reseptörleri ifade eder. Önceki çalışmalarımızda, CHRM1'in hem kültürlenmiş fare dorsal kök ganglion nöronlarının hücre gövdelerinde hem de nöritlerinde, ayrıca CHRM1 ile transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinde mitokondrilerle ilişkiliolduğunu göstermiştik. Ayrıca, farelerde Chrm1'in genetik silinmesi, mitokondriyal yapı ve fonksiyonun birçok yönünüdeğiştirir 12,13. Bu nedenle, BE(2)-C hücrelerinin muskarinik ligandların OXPHOS fonksiyonu üzerindeki modülatör etkilerini araştırmak için kullanılabileceğini varsayıyoruz. Bu gösterimde, agonist asetilkolin, önyargılı antagonist pirenzepin14 ve antagonist atropin dahil muskarinik ajanların mitokondriyal solunum üzerindeki etkilerini, substrat olarak süksinat veya piruvat/malatın varlığında inceledik ve etkilerini karşılaştırdık.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Erime ve ilk kaplama

NOT: BE(2)-C hücreleri için temel ortam, ATCC tarafından formüle edilmiş Eagle's Minimum Essential Medium ve F12 Ortamının 1:1 karışımıdır ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilir.

  1. 37 °C su banyosunda kriyovialdan dondurulmuş BE(2)-C hücrelerini eritin. Çözüldükten sonra, hücreleri 200 × g santrifüjle ederek kriyoprotektantı çıkarmak için 5 dakika boyunca kullanılır.
  2. Hücre pelletini tam büyüme ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri 10 cm boyutunda bir hücre kültürü kabına yerleştirin. Kültür, hücreler alt birleşime ulaşana kadar %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka içinde 37 °C'de kuluçka yapın.

2. Alt kültürleşme

  1. Hücreleri 2–3 geçiş boyunca alt kültüre geçirerek stabil bir üstel büyüme aşamasına ulaşmalarını sağlar.

3. Tripsinasyon ve tek hücreli süspansiyon hazırlığı

  1. Kültür %60–80 birleşmeye ulaştığında, hücreler tripsinize edilir. Hücre süspansiyonunu, parlatılmış uçlu ince uçlu transfer pipetlerinden birkaç kez geçirerek kümeleri ayırarak tek hücreli süspansiyon elde edin.
  2. Tripsini nötralize etmek için FBS içeren taze ortam ekleyin. Hücreleri 200 × g ile 5 dakika boyunca santrifüjle ederek pellet yapın.

4. Hücre dışı akı analizöründe kullanılan 24-kuyu hücre kültürü mikroplakaları için hücre tohumlama protokolü

  1. Pellet, 100 μL başına 10.000 hücre konsantrasyonunda tam ortamda yeniden askıya alın.
  2. Hücreleri optimize edilmiş yoğunlukta tohumlayarak 1–2 gün içinde tam birleşmeye ulaşmasını sağlayın. Deneysel tasarıma bağlı olarak dört köşe kuyusunu ya da tek bir köşe kuyusunu boş bırakın. Bu kuyular arka plan kontrolü olarak hizmet edecek.
    NOT: Bu, medya hacmi ve zamanlamasında ayarlamalar da dahil olmak üzere deneme yanılma gerektirebilir.
  3. Kültürde ortam rengindeki değişiklikleri izleyin—sararma pH düşüşünü gösterir ve hücre sağlığını korumak için hemen taze ortamla değiştirilmesini gerektirir.

5. Ekstrasellüler akı analizörü tabanlı teste hazırlık

NOT: Burada kullanılan bağlanma ve elektron akışı testi formatları, yerleşik mikroplaka tabanlı mitokondriyal solunum işakışlarını takip eder 7; BE(2)-C hücrelerinin digitonin titrasyonu ile permeabilizasyonu ve muskarinik ligand tedavi koşulları gibi değişiklikler içerir.

  1. Stok çözeltileri ve 2x Mitokondriyal Analiz Çözeltisi (MAS) hazırlayın. Önceden 2 adet MAS karışımı ve çalışan reaktif (substratlar ve inhibitörler) stok çözeltileri hazırlayın ( bkz. Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3).
  2. Tüm stok çözeltilerini ve MAS'ı gelecekte kullanmak üzere -20 °C'de saklayarak verimli test kurulumu sağlanır.
    GÜVENLIK: Rotenon, antimisin A, oligomisin, FCCP, digitonin ve TMPD tehlikelidir ve kurumsal güvenlik yönergelerine uygun olarak ele alınmalıdır. Tüm inhibitör stok çözeltileri, uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, nitril eldiven ve göz koruması) takılırken sertifikalı kimyasal bir buhar davlumunda hazırlanmalı ve tutulmalıdır. Bu reaktifleri içeren çözeltiler ile DMSO içeren atıklar, kurumsal ve yerel düzenlemelere uygun olarak tehlikeli kimyasal atık olarak toplanmalı ve bertaraf edilmelidir. Çalışma yüzeyleri kullanımdan sonra dezinfekte edilmelidir.
  3. Sensör kartuşunun nemlendirilmesi
    1. Deneyden önceki gece, her kuyuya 1 mL sensör kartuş kalibrasyon tamponu veya fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS, pH 7.4) ekleyerek hücre dışı akı analizör sensör kartuşunu hidretleyin. Sensör kartuşunu oda sıcaklığında (20–25 °C) gece boyunca (12–18 saat) bekletin.
      NOT: CO₂ içermeyen bir kuluçka makinesinde 37 °C'de kuluçka yapmak gerekli değildir, çünkü kartuş yükleme sürecinde oda sıcaklığında dengelenir. Kalibrasyon için ekstrahücre akı analizörüne yerleştirildiğinde, kartuş yaklaşık 15 dakika içinde 37 °C'ye ulaşır.

6. Deney günü

NOT: Tüm çözelyeleri taze hazırlayın, gerekirse pH ayarlayın ve kullanıma kadar buzda kalın.

  1. Donmuş substrat stoklarını ve 2x MAS oda sıcaklığında (20–25 °C) 15–30 dakika veya 37 °C su banyosunda 5–10 dakika eritin.
  2. Tüm substrat ve enjeksiyon çözeltilerini hazırlayın ( bkz. Tablo 4, Tablo 5, Tablo 6 ve Tablo 7) ve pH'ın 7.4 olduğunu doğrulayın. Gerekirse ayarlama yapın ve çözeltileri kullanana kadar buzda tutun. Bağlantı testi için Tablo 4 ve Tablo 5'i kullanın. Elektron akışı testi için Tablo 6 ve Tablo 7 kullanabilirsiniz.
  3. İnhibörü ve substratları uygun sensör kartuş portlarına yükleyin ve testi çalıştırmaya hazırlanın. Analiz türüne bağlı olarak—bağlanma testi veya elektron akışı testi 7 —gerektiğinde sırasıyla Tablo 4 ve Tablo 5 veya Tablo 6 ve Tablo 7'ye bakabilirsiniz.
  4. Tüm substrat ve inhibitör çalışma çözeltilerini tanımlanmış nihai hacimlere (toplu karışımlar: 15 mL; kartuş enjeksiyon karışımları: port başına 2 mL) hazırlamak). Enjeksiyondan sonra istenen nihai kuyu içi konsantrasyonları (nihai kuyu hacmi: Port D'den sonra 700 μL) elde etmek için konsantrasyonları hesaplayın.
  5. Muskarinik ligandlar içeren 24 kuyruklu ekstraselük akı analizör plakasının her kuyusuna 450 μL hazırlanmış analiz çözeltisi eklenin (nihai ligand konsantrasyonu: 1 μM; toplam kuyu hacmi: 500 μL). Her kuyunun zaten 50 μL 1x MAS tamponu ve su altında batmış hücreler olduğundan emin olun.
    NOT: Bu adımı plakayı analizöre yüklemeden hemen önce yapın.
  6. Her hazırlanmış reaktifan 50 μL'sini sensör kartuşunun ilgili enjeksiyon portuna yükleyin.

7. Enstrüman programlama ve Tahlil uygulaması

  1. Deneyden en az 1–2 saat önce hücre dışı akı analizörünü açın, böylece iç kuluçka makinesi 37 °C'de stabil hale getirebilir. Kalibrasyon ve analiz işlemi boyunca odayı 37 °C'de tutun.
  2. Analizörü, Tablo 8'e göre uygun karıştırma, bekleme ve ölçüm döngülerini gerçekleştirecek şekilde programlayın.
  3. Yazılımdaki kuyrukları ve deneysel grupları deneysel tasarıma göre etiketler.
  4. Test çalışmasına başlayın. Aletin sensör kartuşunu kalibre etmesine izin verin (~15 dakika).
  5. Kartuş kalibrasyonu sırasında test plakasını yüklemeye hazırlayın. Gerekirse yüklemeyi geciktirin; sensör kartuşu, cihazın içinde 37 °C sıcaklıkta sabit kalacaktır.
  6. Port D enjeksiyonundan sonraki son ölçüm döngüsü tamamlandığında testi tamamla. Hemen test sonrası normalizasyon ve veri analizine geçin.

8. Hücre plakası hazırlanması, ekstrasellüler akı analizörü testi için

  1. Sensör kartuşunu kalibrasyon için analizöre yerleştirdikten hemen sonra hücre plakasını hazırlamaya başlayın. Her bir yapışkan hücre içeren her kuyuya 700 μL 1x MAS tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında (20–25 °C) 1 dakika kuluçka yapın.
  2. Bağlı hücreleri rahatsız etmeden tamponu dikkatlice aspire edin. Yıkama adımını en az 3 x 1 dakika tekrarlayarak kalıntı kültür ortamını çıkarın ve tüm yıkamaları 10 dakika içinde tamamlayın.
  3. Görsel hacim referansı oluşturmak için belirlenmiş bir arka plan yuvasına (hücresiz) 50 μL 1x MAS tamponu ekleyin.
  4. Deneysel kuyulardan aspirasyon tamponu ile her kuyiyada yaklaşık 50 μL kalıntı tampon bırakılır.
  5. Plakayı su banyosunda 37 °C'de kuluçka yapın, buharlaşmayı önlemek için plakayı su yüzeyinin üzerinde tutun. Yüklemeden önce 10 dakika (en fazla 20 dakika) 37 °C'de tutun.
  6. Plakaya yüklenmeden hemen önce, her kuyuya uygun substratları içeren 450 μL 1x MAS tamponu eklenerek nihai hacmi 500 μL elde edilir.
  7. Plakayı ekstrasellüler akı analizörüne yerleştirin.

9. Analiz ve veri analizinin sonu

  1. Çalışma tamamlandıktan sonra hücre plakası ve sensör kartuşunu analizörden çıkarın.
  2. Kuyu başına OCR değerlerini toplam protein niceliği veya toplam hücre sayısı kullanarak normalleştirin. Hücreleri RIPA tamponu ile lize edin ve Bradford testi veya başka bir spektrofotometrik protein testi ile toplam proteini nicelikle ölçüler.
  3. OCR değerlerini analiz yazılımını kullanarak normalleştirin ve gerektiğinde verileri dışa aktarın.
  4. Aşağıdaki kabul kriterlerini uygulayın: temel OCR stabilitesini (≤iki ardışık ölçüm döngüsünde %15 kayma) onaylayın ve rotenon, oligomisin veya antimisin A enjeksiyonu sonrası ≥%60 OCR düşüşünü onaylayın.
  5. Bu kriterlere ulaşmayan çalışmalar hariç tutulur ve gerektiğinde permeabilizer konsantrasyonu veya hücre tohumlama yoğunluğunu yeniden optimize eder.

10. Sonuçların dışa aktarılması

  1. Bir USB sürücüsü cihazın içine takın.
  2. Test verilerini dışa aktarın.

11. Veri işleme

  1. Verileri enstrüman yazılımı kullanarak analiz edin.
  2. İşlenen verileri tercih ettiğiniz analiz yazılımlarıyla uyumlu formatlarda dışa aktarın; böylece daha fazla analiz ve görselleştirme sağlanır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BE(2) C için digitonin konsantrasyonunun optimizasyonu Bağlama testinde hücre permeabilizasyonu
Bu protokolün başında, mitokondriyal solunumu tehlikeye atmadan etkili hücre permeabilizasyonu için gereken optimal digitonin konsantrasyonunu standartlaştırdık. Bu protokolde, başlangıç konsantrasyonları olarak 5 μM ve 10 μM digitonin test ettik ve bir bağlantı testi yaptık. Bu test, ETC ile OXPHOS mekanizması arasındaki bağlantı derecesini değerlendirerek ETC- ile OXPHOS ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, kültürlenmiş nöroblastom hücrelerinde OXPHOS'un muskarinik ligand aracılı modülasyonunu değerlendirmek için hızlı ve maliyet etkin bir protokol tanıtmaktadır. Seçici plazma membranı permeabilizer digitonin'i tanımlanmış substrat-inhibitör çiftleriyle birlikte kullanarak, suksinat gibi metabolik substratların doğrudan mitokondrilere hedefli olarak iletini mümkün kıldık. Bu yaklaşım, genellikle temel TCA döngüsünün ara maddelerine erişimi kısıtlayan sağlam hücre zarlar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Manitoba Üniversitesi, Winnipeg, Kanada'daki St. Boniface Hastanesi Araştırmaları'nı takdir etmektedir; ve Nova Southeastern Üniversitesi (NSU), Fort Lauderdale, Florida, ABD, finansman ve altyapı desteği için ödüllendi. Yazarlar ayrıca California, San Diego'daki Alzo Biosciences ve ABD, Florida, Miami'deki Capillus'a fon desteği için teşekkür etmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Asetilkolin klorürMilliporeSigmaA6625Muskarin agonisti
ADPMP Biomedicals, IncICN19014901Elektron alıcısı, ATP sentezi için substrat.
Antimisin AAAJ63522MATermo BilimselMitokondriyal kompleks III'ü inhibe eder
AtropinMilliporeSigma1044990Muskarinik antagonist
Be2C hücreleriAmerikan Tip Kültürü KoleksiyonuCRL-2268Nöroblastoma hastası erkek hastanın beyninden izole edilen bir nöroblast hücresi, muskarinik reseptör ifade eder
DigitoninMilliporeSigmaD141Hafif deterjan, membran geçirici.
D-MannitolTermobilimsel KimyasallarAA3334236Ozmotik stabilizasyon ve zar koruması için kullanılan metabolize edilmeyen bir şeker alkolüdür
EGTAMilliporeSigmaE0396Kalsiyum Şelasyonu, mitokondriyal proteinleri bozabilecek kalsiyuma bağlı proteazların ve diğer enzimlerin aktivasyonunu önler.
yağ asidi içermeyen BSAMilliporeSigma126575Kontrolsüz yağ asidi etkilerini önler, mitokondrileri stabilize eder
FCCPCayman ChemicalNC0904863Mitokondrilerde oksidatif fosforilasyonun bir protonoforu ve ayrıcırıcısı
HEPESMilliporeSigma391340pH tamponlama, mitokondriyal fonksiyonla uyumluluk
L-AskorbatTCI AmerikaA053925GTCA döngüsü ara, OXPHOS'un substratı
Magnezyum klorürMilliporeSigmaM8266İyonik denge için, enzimatik aktivite desteği
N1,N1,N1,N1-tetrametil-1,4-fenilen diamin (TMPD)Elektron Donöründen Sitokrom c'ye, kompleks IV fonksiyonunun Kompleks I ve II'yi atlayarak değerlendirilmesi, TMPD/askorbat, Kompleks IV-bağımlı oksijen tüketiminin doğrudan ölçülmesini sağlar
OligomisinMilliporeSigma1404-19-9Mitokondriyal ATP sentezini engeller, Kompleks V
Pirenzepine dihidroklorürMilliporeSigmaP7412Muskarinik önyargılı agonist
Piruvik asitTermobilimsel KimyasallarAC132155000TCA döngüsü altlığı
RotenoneMilliporeSigma557368Mitokondriyal kompleks I'i inhibe eder
Seahorse XF24 V7 PS Hücre Kültürü MikroplakalarıÇevik102340-100Hücre kültürü mikroplakaları
Seahorse XFe24 AnalizörüÇevikS7801BRAgilent Seahorse XFe24 Analizörleri, 24 kuyu plaka formatında canlı hücrelerin oksijen tüketim oranını (OCR) ve hücre dışı asitlenme oranını (ECAR) ölçer.
Suksinik asitFisher ChemicalAC158742500TCA döngüsü ara, OXPHOS'un substratı
XFe24 sensör kartuş kalibrasyon tamponuÇevik102340100PBS tampon pH 7.2
XFe24 sensör kartuşlarıÇevik102340-100OCR ve ECAR ölçümü için sensör

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yin, Y., Shen, H. Common methods in mitochondrial research (review). Int J Mol Med. 50 (4), 148(2022).
  2. Walsh, M. A., Musci, R. V., Jacobs, R. A., Hamilton, K. L. A practical perspective on how to develop, implement, execute, and reproduce high-resolution respirometry experiments: the physiologist's guide to an Oroboros O2k. FASEB J. 37 (12), e23280(2023).
  3. Severinghaus, J. W., Astrup, P. B. History of blood gas analysis. IV. Leland Clark's oxygen electrode. J Clin Monit. 2 (2), 125-139 (1986).
  4. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. Drug-induced mitochondrial dysfunction. , 325-352 (2008).
  5. Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
  6. Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 cell mito stress test. STAR Protoc. 2 (1), 100245(2021).
  7. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  8. Subczynski, W. K., Pasenkiewicz-Gierula, M., Widomska, J., Mainali, L., Raguz, M. High cholesterol/low cholesterol: effects in biological membranes: a review. Cell Biochem Biophys. 75 (3-4), 369-385 (2017).
  9. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  10. Fan, H. Y., Heerklotz, H. Digitonin does not flip across cholesterol-poor membranes. J Colloid Interface Sci. 504, 283-293 (2017).
  11. Sabbir, M. G. Cholinergic receptor muscarinic 1 co-localized with mitochondria in cultured dorsal root ganglion neurons, and its deletion disrupted mitochondrial ultrastructure in peripheral neurons: implications in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 98 (1), 247-264 (2024).
  12. Sabbir, M. G., Swanson, M., Speth, R. C., Albensi, B. C. Hippocampal versus cortical deletion of cholinergic receptor muscarinic 1 in mice differentially affects post-translational modifications and supramolecular assembly of respiratory chain-associated proteins, mitochondrial ultrastructure, and respiration: implications in Alzheimer's disease. Front Cell Dev Biol. 11, 1100854(2023).
  13. Sabbir, M. G., Swanson, M., Albensi, B. C. Loss of cholinergic receptor muscarinic 1 impairs cortical mitochondrial structure and function: implications in Alzheimer's disease. Front Cell Dev Biol. 11, 1158604(2023).
  14. Sabbir, M. G., Fernyhough, P. Muscarinic receptor antagonists activate ERK-CREB signaling to augment neurite outgrowth of adult sensory neurons. Neuropharmacology. 143, 268-281 (2018).
  15. Sabbir, M. G., Taylor, C. G., Zahradka, P. CAMKK2 regulates mitochondrial function by controlling succinate dehydrogenase expression, post-translational modification, megacomplex assembly, and activity in a cell-type-specific manner. Cell Commun Signal. 19 (1), 98(2021).
  16. Sabbir, M. G., Calcutt, N. A., Fernyhough, P. Muscarinic acetylcholine type 1 receptor activity constrains neurite outgrowth by inhibiting microtubule polymerization and mitochondrial trafficking in adult sensory neurons. Front Neurosci. 12, 402(2018).
  17. Facino, R. M., Carini, M., Stefani, R., Aldini, G., Saibene, L. Anti-elastase and anti-hyaluronidase activities of saponins and sapogenins from Hedera helix, Aesculus hippocastanum, and Ruscus aculeatus: factors contributing to their efficacy in the treatment of venous insufficiency. Arch Pharm (Weinheim). 328 (10), 720-724 (1995).
  18. Dervishi, M., et al. Sterols govern membrane susceptibility to saponin-induced lysis. bioRxiv. , (2025).
  19. Mhada, M., Metougui, M. L., El Hazzam, K., El Kacimi, K., Yasri, A. Variations of saponins, minerals and total phenolic compounds due to processing and cooking of quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) seeds. Foods. 9 (5), 660(2020).
  20. Fasciani, I., et al. The C-terminus of the prototypical M2 muscarinic receptor localizes to the mitochondria and regulates cell respiration under stress conditions. PLoS Biol. 22 (4), e3002582(2024).
  21. Skok, M. Mitochondrial nicotinic acetylcholine receptors: mechanisms of functioning and biological significance. Int J Biochem Cell Biol. 143, 106138(2022).
  22. Felmlee, M. A., Jones, R. S., Rodriguez-Cruz, V., Follman, K. E., Morris, M. E. Monocarboxylate transporters (SLC16): function, regulation, and role in health and disease. Pharmacol Rev. 72 (2), 466-485 (2020).
  23. Wohlrab, C., Phillips, E., Dachs, G. U. Vitamin C transporters in cancer: current understanding and gaps in knowledge. Front Oncol. 7, 74(2017).
  24. Rovini, A. Tubulin-VDAC interaction: molecular basis for mitochondrial dysfunction in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. Front Physiol. 10, 671(2019).
  25. Heuck, A. P., Moe, P. C., Johnson, B. B. The cholesterol-dependent cytolysin family of gram-positive bacterial toxins. Subcell Biochem. 51, 551-577 (2010).
  26. Murase, K. Cytolysin A (ClyA): a bacterial virulence factor with potential applications in nanopore technology, vaccine development, and tumor therapy. Toxins (Basel). 14 (2), 107(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oxidative PhosphorylationCholinergic LigandsDigitonin PermeabilizationBE 2 C CellsNeuroblastoma CellsExtracellular Flux AnalyzerMitochondrial RespirationComplex II RespirationPlasma Membrane PermeabilizationElectron Transport Chain

Related Articles