Bütün Caenorhabditis elegans L4 larvalarda kromatin erişilebilirlik profili

Özet

Burada, sadece 30 μL solucan pelleti kullanılarak L4-aşama Caenorhabditis elegans tüm solucanında uygulanacak hızlı ve basit bir ATAC-seq protokolünü sunuyoruz.

Özet

Kromatin erişilebilirliği, transkripsiyon, DNA onarımı ve kromozom ayrımında hayati roller oynar. Aşırı erişilebilir bölgeler genellikle aktif promotörler ve güçlendiricilerle korelasyon yapar, transkripsiyon faktörünün bağlanmasını ve düzenleyici aktiviteyi kolaylaştırır. Transpozaza erişimi için dizileme (ATAC-seq) kullanılarak yapılan test, çok az hücreyle kromatin erişiminin genom çapında profillenmesini sağlar. Ancak, Caenorhabditis elegans'ta uygulanması, nematodun zengin kolajen kütikülü nedeniyle hücre ayrışmasını zorlaştırır. Burada, L4 aşamasında tüm solucanlarda ATAC-seq uygulamak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. İşlem, senkronize kültürlerle başlar ve kutikül bozulması, enzimatik ayrışma ve hücre süspansiyon hazırlığını içerir. Permeabilize çekirdekler daha sonra Tn5 transpozisyonuna tabi tutulur, ardından polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu ve yeni nesil dizileme (NGS) hazır kütüphanelerin arındırılması yapılır. Bu protokol, 30 μL solucan pelleti gerektirir, bir günde tamamlanabilir ve Bristol N2 referans suşunda 5.000–9.000 erişilebilirlik zirvesi oluşturur. Bu sadeleştirilmiş iş akışı, diğer gelişim aşamalarına veya FACS ile arındırılmış hücre popülasyonlarına uyarlanabilir. C. elegans'ta ATAC-seq'e yönelik teknik engelleri azaltarak, bu yöntem, genetik ve çevresel bozulmalara yanıt olarak genom çapında kromatin erişilebilirliğini tüm organizma bağlamında inceleme fırsatlarını genişletir.

Giriş

Ökaryot genomlar hücre çekirdeği içinde yoğun şekilde yerleşmiştir. Mekânsal kısıtlamalarla başa çıkmak için DNA, farklı fil¹ arasında yüksek derecede korunan sekiz histondan oluşan çok proteinli kompleksler olan nukleozomların etrafına sıkıca sarılır. Kromatin erişilebilirlik desenleri, bir dokudaki hücresel duruma ve gene özgü ^{kalıplara bağlı olarak değişir 2,3,4}. Nükleozom erişilebilirliği, özellikle produktörler ve transkripsiyon faktörleri gibi zenginleştiriciler gibi distal düzenleyici bölgelerde aktif transkripsiyonla güçlü bir şekilde^{ilişkilidir 5}. Açık kromatin bölgeleri ayrıca DNA onarımı, çoğaltımı ve kromozom ayrımında önemli roller^{oynar 3}. Buna karşılık, azalmış erişilebilirlik genellikle susturulmuş heterokromatin ve tekrarlayan dizilerle^{ilişkilidir 6,7}.

Kromatin erişilebilirliğini haritalamak, gen düzenlemesini anlamak için güçlü bir yaklaşım olmuştur. Kromatin erişimini sorgulamak için farklı teknikler kullanılmıştır. En erken yöntemler arasında, mikrokokk nükleazı (MNaz) ve DNase I sindirimi, belirli ^8,9 lokuslarında nükleozom konumu ve erişilebilirliğini haritalamak için kullanılmıştır. Bu teknikler daha sonra genom çapında çalışmalar için yeni nesil dizileme (NGS) ile birleştirildiğinde ^{uygulanmıştır10,11}. Ancak, bu tekniklerin başarılı uygulanması için enzim konsantrasyonu ve reaksiyon süresinin ve önemli sayıda hücrenin dikkatli kalibrasyonu gereklidir.

2013 yılında Greenleaf laboratuvarı, düşük sayıda hücre kullanılarak genom genelinde kromatin erişimini sorunsuzca haritalamak için transpozaza erişimi testini (ATAC-seq) kullanarak^uyguladı. ATAC-seq, ticari olarak mevcut Tn5 transpozazından yararlanarak, genellikle nükleozom içermeyen açık kromatin bölgelerine kısa DNA dizilerini (yani barkodları) tercihli olarak yerleştirir ve aktif promotörler ve güçlendiricilerle korelasyon yapar. Protokol, hücre permeabilizasyonu ve çekirdek izolasyonu gerektirir, ardından aşırı erişilebilir kromatinin etiketlenmesi için Tn5 ile sınırlı sindirim yapılır. Daha sonra, PCR sırasında tamamlayıcı indeksler dahil edilir ve NGS¹³ öncesinde örnek çoklamasını kolaylaştırır. ATAC-seq, aynı zamanda in silico transkripsiyon faktörü ayak izini de mümkün kılan sağlam bir protokol olduğunu kanıtlamış ve tek hücre^{çözünürlükleri 14,15,16,17} için uygulanmıştır. Fare ve insan örneklerinin yanı sıra, ATAC-seq çeşitli sistemlerde uygulanmıştır; bunlar arasında zebrabalık ve Drosophila gibi omurgasızlar ile Caenorhabditis elegans^18,19,20 nematodu bulunmaktadır.

On yıllardır C. elegans, gelişim, hücre biyolojisi ve sinirbilim gibi alanlarda güçlü bir model sistemi olmuş, mikro RNA'ların tanımlanması ve RNA girişiminin (RNAi) tanımlanması gibi temel keşiflere yol ^{açmıştır21,22}. Kompakt 100 MB genomuna sahiptir ve ~20.000 protein kodlayan^{gen 23}. Gen düzenlemesi, ATAC-seq ile farklı dokular, gelişim evreleri ve yaşlanma zaman noktaları arasında haritalanmış promotor aktivitesi ve distal güçlendiriciler aracılığıyla^{gerçekleşir 24,18}. Kromatin erişilebilirliği profilleme, böylece C. elegans'ta gen düzenlemesini anlamak için değerli bir araç haline gelmiştir. Sonuç olarak, ATAC-seq, farklı çevresel koşullar veya yabani izolasyonlar üzerindeki epigenetik manzaraları incelemek için özel umut vererek çeşitli transkripsiyonel yanıtları ortaya çıkarır. Ayrıca, diğer patojenik ve patojenik olmayan nematodların kromatin mimarisi hakkında içgörüler sağlayabilir.

C. elegans'taki başlıca metodolojik zorluklardan biri, tüm solucanlardan homojen hücre süspansiyonu elde etmek için ayrılması gereken kolajen açısından zengin bir^{kütikülün varlığıdır 25}. Bu zorluğu çözmek için, nematodları parçalamak ve ardından C. elegans 18,26'da ATAC-seq yapmak üzere farklı protokoller derleyip optimize ettik. L4 larva evresinin kullanılması tercih edilir; çünkü bu gelişim aşamasında hayvanlar transkripsiyonel olarak aktif bir germ hattına sahiptir ve bu da açık kromatine dönüşür; bu da somatik hücrelerde kromatin erişimi için tutarlı ve bilgilendirici bir kaynak sağlar. Burada, solucan ayrışması ve hücre süspansiyonu üretimi için hızlı ve verimli bir protokol sunuyoruz; bu protokol C. elegans'ta ATAC-seq'i mümkün kılmaktadır. Yöntemimiz L4 evresi solucanlar için optimize edilmiştir ve 30 μL kadar az solucan pelleti gerektirir; bu da diğer gelişim aşamalarına veya FACS ile saflaştırılmış hücreler gibi daha küçük örneklere uyarlanabilir. Bu protokol, farklı C. elegans suşları ve koşullarında uygulanabilir ve Bristol-N2 referans suşunda 5.000–9.000 kromatin erişim zirvesinin tanımlanmasını sağlar ve sonraki kromatin erişilebilirlik analizlerinin temelini oluşturur.

Protokol

Her zaman eldiven takmak önerilir.

NOT: 1. Gün: Senkronize solucan popülasyonunun hazırlanması. Tüm solucanlar, E. coli OP50 ile tohumlanmış NGM plakalarında yetiştirildi. Başlamadan önce gereken şeyler: (örnek veya suş başı), bir 90 mm veya iki adet 60 mm yetişkin solucan plakası, bir 90 mm veya iki adet 60 mm tabak, M9 steril^{tampon 27} (3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄, 5 g NaCl, 1 ml 1 M_{MgSO 4}, H₂O ile 1 L. Otoklavlama ile sterilize edilen)

1. Solucan Koleksiyonu

1. Solucanın yetişkin popülasyonunu içeren 90 mm (veya iki 30 mm) plaka alın.
2. Solucanları M9 tamponu ile geri alın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
3. Plaka(lar)daki tüm solucanları geri almak için önceki adımı tekrarlayın.
4. Solucanların 15 mL'lik tüpte bir dakika yerleşmesine izin verin ve M9 tamponunu dikkatlice çıkarın.
5. ~1 mL solucan olduğundan emin olun.

2. Ağartma

1. 5 mL M9 tampon + 650 μL NaOH 5M + 1.300 μL Ev çamaşırı suyu (%5 NaClO çözeltisi) ekleyin.
2. Girdap maksimum hızda 1–2 dakika (2,5 dakikadan fazla olmamalıdır).
3. 1.000 x g sıcaklıkta RT (oda sıcaklığında) 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
4. Süpernatantı çıkarın ve 9 mL M9 tamponu ekleyin.
5. 2.3 ve 2.4 bölümlerini beş kez daha tekrarlayın.
6. Embriyoları 7 mL M9 tampon içinde yeniden süzülür.
   NOT: Ağartma protokolü, sıcaklık veya ticari ağartıcı türüne bağlı olarak verimlilik^{açısından değişiklik gösterebilir.}

3. M9 (sıvı) yumurtaların gece boyunca çatlaması

1. Ağartılmış yumurtaların olduğu toplama tüpünün düzgün şekilde kapatıldığından emin olun.
2. Tüpü 20 °C'de yavaş harekete geçirin (örneğin, 20 °C'de bir odanın içindeki bir shaker'da).
3. Solucanlar gece boyunca yumurtadan çıkar ve L1'de durur.
   NOT: Tüpü 12 saatten fazla bırakma.

4. 2. Gün: solucan büyümesi: L1 solucanlarının iyileşmesi.

1. Shaker'dan tüpü alın ve mikroskop altında L1 solucanlarının olduğunu doğrulayın.
2. Tüpü RT'de yaklaşık 1 saat dikey olarak oturtsun.
3. Üst yüzeyi çıkarın ve ~300 L1 solucanı bir 90 mm ya da iki adet 30 mm tabakta besle aktarın.
4. Onları 20 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin ve L4 aşamasına ulaşana kadar 26 saat büyümelerine izin verin.

5. 3. Gün: Stok çözelti hazırlanır: Sonraki çözeltiler 4. gün için yeni çözümler üretilmelidir

NOT: Bu 2. veya 3. günde yapılabilir.

1. 1 mL %10 SDS.
2. 50 mL 1M HEPES pH 8 (otoklav).
3. 250 ml %20 sukroz (otoklav).
4. 100 mL 2M NaCl: hazırlanma (otoklav).
5. 50 mL 2M KCl (otoklav).
6. 10 mL 1M CaCl₂ (otoklav).
7. 10 mL 1M MgCl₂ (otoklav).
8. 100 mL 1M Tris, pH 7.4.
9. 5 mL 5M NaCl (otoklav).
10. 500 μL %10 Tween-20.
11. 500 μL %10 Nonidet P40/IGEPAL içerir.
12. 100 μL %5 Digitonin (çözünmesi için 65 °C'ye kadar ısıtılması gerekir).
13. %10 BSA (0,22 μm'lik filtre) 500 μL 4 °C'de depolanmıştır.
    4. Gün: ATAC için L4 evre solucanlar
    NOT: Başlamadan önce, 25 °C'de bir kuluçka makinesi, 4 °C santrifüj hazır bulundurduğunuzdan emin olun, Digitonin'i 65 °C'ye ısıtın (taze tampon hazırlığı için), steril M9 tampon, steril H2O ve 20 μm filtreler bulundurun.

6. Çözelti hazırlığı

1. Yeni çözeltiler hazırlayın ( bkz. Tablo 1). L-15, %10 FBS ve yumurta tamponu hepsini steril koşullarda kullan ve soğuk tut.

Tablo 1: Taze çözelti hazırlığı için stoklar. Nematod ayrışması ve hücre askıya alma protokolü için stok hazırlığı tarifleri (6. ve 7. bölümler). Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

7. Nematod ayrışması ve hücre askıya alma protokolü

NOT: Bir 90 mm veya L4 senkronize solucan popülasyonuna sahip iki 30 mm plaka gerekecektir.

1. 20 °C kuluçka makinesinde 26 saat sonra, solucanların çoğunun L4 aşamasında olduğunu mikroskop altında doğrulayın.
2. Tüm solucanları plakalardan M9 tamponu ile geri alın ve 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
3. Solucanların yerçekimiyle yerleşmesini sağlayarak 1 mL steril_{H 2O}ile 5 kez yıkayın.
4. Solucanlarla birlikte tüpü 25 °C'lik bir kuluçka makinesine 30 dakika boyunca aktararak bağırsak yiyecek kalıntılarından kurtulun.
5. 50 μL solucan pelletini alıp yeni bir tüpe yerleştirin.
6. 200 μL SDS-DTT taze tamponu ekleyin ve tam 5 dakika (daha uzun değil) bir tüp rotatorunda karıştırın.
7. 1 ml soğuk yumurta tamponu ekleyin ve süpernatantı çıkarmak için bir picofuge üzerinde bir döndürün . 6 kez tekrarlayın.
8. 80 μL taze hazırlanmış pronaz (15 mg/mL) ekleyin.
9. 200 μL pipetle (filtreli uçlarla), solucan-pronas karışımını 70 katı karıştırın ve RT'de 15 dakika kuluçka yapın.
10. 800 μL L-15 %10 FBS ortamı ekleyin ve 5 dakika boyunca 500 x g sıcaklıkta 4 °C'de santrifüj yapın.
11. 1 mL L-15 %10 FBS ortamı ekleyin ve santrifüjasyonu tekrarlayın.
12. Önceki adımı iki kez daha tekrarlayın.
13. Süpernatantı çıkarın ve 900 μL L-15 %10 FBS ortamında tekrar askıya alın.
14. 20 μm filtreli filtre.

8. Çekirdek izolasyonu ve kromatin etiketlenmesi

NOT: Pipet filtreli uçlar kullanın. Başlamadan önce: Tn5 Tamponunu çıkarın, erimesine izin verin, termobloku 37 °C'ye ayarlayın, PCR ürün arıtma kitini çıkarın (Malzeme Tablosu), EB Buffer'ı 37 °C'ye koyun, Kolonların santrifüjlenmesi RT'de yapılmalıdır.

1. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 500 x g ve 4 °C'de santrifüj yapın.
2. Üst maddeyi çıkarın, kalına ~50 μL kalır.
3. 45 μL Lysis Buffer (taze hazırlanmış) ekleyin ve dikkatlice tekrar süzülün.
4. Dikkatlice 50 μL Yıkama Tamponu ekleyin (karıştırmayın).
5. 5 dakika boyunca santrifüj, 4 °C'de 500 x g içinde. Üst yüzeyi çıkarın. Buzun içinde tutun.
6. Dönme sırasında, her reaksiyon (Rx) için numune başına şu Tn5 karışımını hazırlayın: 25 μL Tn5 Buffer²⁹, 24.8 μL Nukleazsız H₂O, 0.2 μL Tn5 enzim. Birden fazla örnek için bir master mix hazırlayın.
7. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı çıkarın. Çekirdekleri buzda tutun. Çekirdek pelletine 50 μL Tn5 karışımı ekleyin ve yavaşça yedi kez pipetleyin. 37 °C'de termoblokta 30 dakika kuluçka yapın. Her 10 dakikada bir tüplere küçük dokunuşlar verdiğinizden emin olun.
   NOT: PCR arıtma kitini çıkarın ve EB Buffer'ı 37 °C bir kuluçka makinesine yerleştirin. Sonraki 5 adımda bu Kit'in tamponları kullanılacak.
8. Tn5 kuluçkasından sonra, setten 300 μL PB tamponu (Sarı) ekleyin ve maksimum hızda 25 saniye boyunca bir girdap karıştırın.
9. Tüpten tüm hacmi alıp spin kolonuna (mor, 4 °C'de saklanan) aktarın ve RT'de maksimum hızda 1 dakika santrifüj yapın.
   NOT: Sütun DNA'yı tutar, böylece süpernatant güvenle atılabilir.
10. Spin kolonuna 750 μL PE Buffer ekleyin ve RT'de maksimum hızda 1 dakika santrifüj yapın.
11. Üst yüzeyi toplama tüpünle birlikte atın. Kolonu yeni bir 1,5 mL tüpe yerleştirin ve santrifüjasyonu tekrarlayın; 1.5 mL tüpü at.
12. Kolonu yeni, etiketli 1,5 mL tüpte yerleştirin ve kolonun ortasına 37 °C'de 10 μL EB Buffer ekleyin. Sütuna dokunmamaya dikkat edin. RT rejiminde 1 dakika bekle.
13. RT frekansında maksimum hızda 1 dakika santrifüj; 4 °C'de asla sıcaklık yok.
14. Son 2 adımı tekrarlayarak EB tamponunda toplam 20 μL elusyona ulaşın.
    NOT: Isteğe bağlı duraklama: Durursanız, numune(ler) -20 °C'de saklanabilir. Burada, etiketlenmiş kromatin 20 μL hacimdedir.

9. Kütüphane amplifikasyonu

1. ATAC kütüphanesi amplifikasyonu için, doğru döngü amplifikasyon sayısını tahmin etmek için gerçek zamanlı bir PCR yapılmalıdır ( bkz. Tablo 2). Bunu bir PCR plakasında yapın.
2. Son amplifikasyon için döngü sayılarını tahmin etmek için, amplifikasyon eğrisinin ilk üçte birine karşılık gelen döngü sayısı alınmalıdır. Döngü numarasının 15'i geçmemesi idealdir. Her örnek için döngü numarası tahmin edilmelidir.
   NOT: qPCR'den sonra etiketlenmiş DNA 18 μL hacimde bulunur. Isteğe bağlı duraklama: Durmak istiyorsanız, örnekler -20 °C'de saklanabilir.
3. ATAC Kütüphanesi son amplifikasyonu:
   1. Her örnek farklı bir karavan primerine sahip olmalı (not alın).
   2. Her örnek, her biri için tahmin edilen döngü sayısı (N) için amplifikasyon yapılmalıdır.
   3. Bu PCR 200 μL tüplerde yapılabilir (bkz. Tablo 3).
   4. Burada 8 μL etiketlenmiş DNA ve 50 μL amplifikasyon ATAC kütüphanesi vardır
   5. İsteğe bağlı duraklama: Durmak isterseniz, örnekler -20 °C'de saklanabilir.

Tablo 2: İlk kütüphane güçlendirme talimatları. İlk kütüphane amplifikasyonu için tarif ve PCR programı (bölüm 9). Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: ATAC Kütüphanesi son güçlendirme talimatları. Son kütüphane amplifikasyonu için tarif ve PCR programı (bölüm 9). Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

10. Kütüphane arındırması

NOT: Başlamadan önce, oda sıcaklığına alışmaları için boyut seçimi boncuklarını (AMPure, SPRIselect veya ev yapımı kalibre edilmiş boncuklar) buzdolabından çıkarın. Boncukları her seferinde vortex kullanarak şiddetle karıştırın.

1. 1 mL %80 etanol (moleküler kalitede) hazırlayın.
2. Örnek tüpüne (50 μL olduğu yerde) 25 μL (0,5 vol) boncuk ekleyin ve pipetle karıştırın.
3. RT'de 10 dakika kuluçka yapın.
4. Tüpleri manyetik rafa 5 dakika koyun.
5. Süpernatantı (70 μL) yeni, temiz bir 200 μL tüpe aktarın.
   NOT: Bu adımda, <200 bp'lik DNA parçaları atılır.
6. 65 μL (1.3 vol) boncuk ekleyin ve 10 kez karıştırın.
7. RT'de 10 dakika kuluçka yapın.
8. Tüpleri manyetik rafa 5 dakika koyun.
9. Üst yüzeyi atın (tüpü manyetik raftan almadan).
   NOT: Bu noktada, boncuklar >200 bp ve <1000 bp DNA parçalarını tutuyor.
10. Tüp hala manyetik rafta iken, 200 μL taze hazırlanmış %80 etanol boncukların üzerine doğrudan ekleyin ve pipeti birkaç kez yukarı aşağı yıkayarak yıkayın.
11. Etanolü çıkarın ve 200 μL etanol ile tekrar yıkayın.
12. Etanolü atın, ardından boncukları kapağı açık tutarak ~2–5 dakika kurutun (çok fazla kurumasına izin vermeyin).
13. Numune(ler)i manyetik raftan çıkarın. 50 μL steril H₂O ile tekrar süzülün. Tüm boncukları tüpün duvarlarından yıkaydığınızdan emin olun.
14. Son olarak, tüp(ler) manyetik rafta 5 dakika kuluçka yapın.
15. Süpernatantı yeni temiz bir tüpe aktarın. Burada, güçlendirilmiş ve arındırılmış ATAC Kütüphaneleri depolanır.
    NOT: Kütüphaneler -20 °C'de kısa süreli (en fazla dört hafta) veya daha uzun süreler için -80 °C'de saklanabilir.

11. Parça boyutu dağılımı

1. Son amplifikasyon tamamlandıktan sonra, parça boyutu dağılımını görebilmek için numunenin bir kısmının kapiller elektroforezden geçirilmesi tavsiye edilir.

Sonuçlar

Etiketleme sonrası kalite kontrol, doğru kütüphane hazırlığını sağlar
Protokol sırasında, kromatin etiketlemesinden sonra yapılan qPCR'ye özel dikkat etmek önemlidir (bölüm 9), çünkü bu, DNA kalitesinin ve deneyin performansının değerlendirilmesi için hayati bir adımdır. Şekil 1A , iki amplifikasyon eğrisini gösterir; sol olan (15 döngüden alt) her şeyin bu noktaya kadar başarılı olduğunu gösteren kaliteli materyali temsil ediyor, bu yüzden devam etmek sorun değil. Sağdak...

Tartışma

Burada, tüm L4-evre Caenorhabditis elegans solucanlarında ATAC-seq ile genom çapında kromatin erişimini profillemek için optimize edilmiş bir protokolü tanımlıyoruz. Kromatin erişilebilirliği gen ifadesi, DNA onarımı, çoğaltma ve rekombinasyonu doğrudan etkiler ve ATAC-seq hücre ve doku örnekleri için standart bir yaklaşım haline gelmiş olsa da, sağlam organizmalara uygulanması özellikle geçirimsiz, kollajen açısından zengin kütiküle sahip nematodlarda benzersiz teknik zorluklar...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
250 mL, 0.22 µm PES	Ultra Curz	sc-200253
Agar	BD	214010
Agencourt AMPURE XP	Nalgene	A63886
Bovine Serum Albumin	Maplica	200100
Calcium Chloride	Sigma	C5670-100G
CellTrics 20 µm	Sysmex	04-0042-2315
Cholesterol	Sigma	C8503-25G
Digitonin	Sigma	D141-500 mg
Tek kullanımlık eldivenler	Microflex	94-243
DL-Ditiyotroitol	sigma	D0632-10G	Zararlı
Etil alkol, saf	Sigma	1003661421
Fetal Bovine Serum	biowest	S181S-500
HEPES	Sigma	H3375-250 G
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (büyük Kit)	Illumina	20034211
Kapa Syber 50 mL	Sigma	KK4618
L-15 Medium (Leivobitz)	sigma	L4386-10L
Magnezyum Klorid anhidrat	Sigma	M8266-100G
Magnezyum Sülfat Heptahidrat	Sigma	M1880-500G
Magnezyum Sülfat Heptahidrat	Sigma	M1880-500G
MinElute PCR Purifikasyon Kiti (50 prep)	Qiagen	28004
NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master Mix	NEB	M0541S
Nonidet P40 Substitüt	Sigma	74835-1L
Pen Strep	Gibco	15140-122
Pepton	BD	211677
Petri kabı 60 mm	Tritech	T3308
Petri kabı 90 mm	Interlux	C9015-2C
Pipet uçları 10 µL, filtre	Cellpro	800108
Pipet uçları 20 µL, filtre	Cellpro	800708
Pipet uçları 200 µL, filtre	Cellpro	800608
Potasyum Klorür	Sigma	P9541 -500G
Potasyum Fosfat Dibazik Toz	J.T. Baker	3252-01
Potasyum Fosfat Monobazik, Kristal	J.T. Baker	3246-01 500G
Sodyum Klorid	JT Baker	3624-01
Sodyum dodesil sülfat	sigma	L4509-100G
Sodyum Hidroksit	Macron	7708-10
Sodyum Hipoklorit	Cloralex	544394479
Sodyum Fosfat Dibazik 7-Hidratlı Kristal	J.T. Baker	3824-01
SPRIselect	Beckman	B23318
Sükroz	Sigma	S0389-500G
Sıring Filtre PVDF 0.22 µm	Ultra Curz	Sc-358812
Trizma bazı	Sigma	T1503 1KG
Tween 20	Sigma	P9416-50ML