Sıçanlarda arka uzuv lokomotor kinematiklerinin nesnel nicelendirilmesi için derin öğrenme tabanlı çok eklemli senkron izleme

Summary

Bu protokol, derin öğrenme odaklı çok eklemli yörünge otomatik etiketleme ile işaretçisiz koşu bandı testi kullanarak sıçan arka ayağı kinematik değerlendirme boru hattı oluşturur; bu da tekrarlanabilir hareket niceliğini sağlar.

Abstract

Fare yürüyüşünün doğru ve objektif değerlendirilmesi, sinirbilim ve kinesiyoloji araştırma alanları için gereklidir. Geleneksel sistemler, dolaylı yürüyüş çıkarımı için genellikle ayak izi görüntülemesine dayanır; bu da arka uzuv çok eklemli kinematikleri tam olarak yakalayamaz. Bu çalışma, kemirgenler için işaretsiz koşu bandı tabanlı yürüyüş analiz sistemi kurmakta; özel derin öğrenme algoritmalarını programlanabilir ağırlık destekleyici koşu bandı ile entegre ederek birden fazla alt uzuv eklemini gerçek zamanlı takip etmeyi ve çok boyutlu kinematik nicelik sayını sağlamaktadır. Sistem, modüle edilmiş hız (0-300 mm/s), eğim (±30° gradyan) ve kademeli ağırlık desteği (0-500 g) koşullarında yürüş döngüsü parametrelerini, eklem yörüngelerini, kuvvet dağılımlarını ve hareket düzgünlüğünü otomatik olarak çıkararak nöromüsküler davranış araştırmaları için objektif bir değerlendirme aracı sunar. Omurilik yaralanması (SCI) modelleri kullanılarak, sonuçlar sistemin eklem hareket aralığı, yörünge sürekliliği, itici güç çıkışı ve hareket düzgünlüğündeki çok boyutlu farkları tespit etmedeki hassasiyetini göstererek hastalık ayrımcılığı ve derecelendirme yeteneklerini doğrulamaktadır. Geleneksel öznel puanlar veya ayak izi yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu platform kişisel önyargıyı ve düşük boyutlu veri sınırlamalarını ortadan kaldırırken, derin öğrenme odaklı mimari ve yüksek verimli veri toplama avantajlarını birleştirir. Merkezi veya periferik sinir hasarı, nörodejeneratif hastalıklar, kas-iskelet sistemi bozuklukları ve yaşlanma süreçleri ile ilgili araştırmalar için geçerlidir. Nöroelektrofizyoloji modüllerinin senkron entegrasyonu sayesinde, sistem yürüyüş ve sinir sinyallerinin zamansal bağlanmasını daha da mümkün kılarak, merkezi-çevresel kontrol mekanizmalarını ayrıştırmak ve nöromodülasyon stratejileri geliştirmek için metodolojik bir çerçeve oluşturur.

Introduction

Günümüz sinirbilimi ve lokomotor araştırmalarda, nesnel yürüyüş niceliği artık sinir-kas fonksiyonlarının incelenmesi, hastalık mekanizmalarının aydınlanması ve rehabilitasyon stratejilerinin değerlendirilmesi için gereklidir^. Yüksek uzaylı-zamansal çözünürlüğü, sinir komutları, kas aktivasyon profilleri ve iskelet mekaniği arasındaki ince sinerji varyasyonlarının yakalanmasını sağlar ve böylece supraspinal yollar, çevresel geri bildirim ve mekanik bağlamların koordinasyonunu araştırmak için ampirik bir temel oluşturur. Tekrarlanabilir kinematik metrikler, lezyonlar, dejeneratif değişiklikler ve terapötik etkiler için algılama hassasiyetini artırır ve ilaç ile cihaz geliştirme sürecini^{hızlandırır 2}.

CatWalk, DigiGait veya basitleştirilmiş ayak izi analizleri gibi geleneksel değerlendirme platformları, plantar temas desenlerine dayalı olarak eklem kinematiklerini dolaylı olarak çıkarır. Bu yaklaşımlar, arka uzuv çok eklemli kinematik^{karmaşıklığı 3,4} yakalayamayan düşük çözünürlüklü ve tutarsız metrikler sunar. Yöntemimizin genel amacı, kemirgen modelleri için özel olarak tasarlanmış yüksek hassasiyetli, işaretsiz ve ağırlık destekli bir yürüyüş analiz sistemi kurmaktır. Bu nedenle, yeni bir çerçeve oluşturuyoruz: (i) sürekli çoklu eklem görüntüleme sırasında kontrollü eksenel yük altında (%0-100 vücut ağırlığı) kemirgenleri dik pozisyonda tutar, (ii) sağital düzlemin anatomik simgelerini yanal bakış analizinden derin öğrenme yoluyla doğrudan lokalize ederek 2D mekansal yörüngeler oluşturur, (iii) Zamanla çözülmüş eklem açılarını ve segmental kinematikleri istatistiksel modelleme için ihraç^{eder 5}. Temelde, bu çerçeve bilgisayar görme görevlerine derin öğrenme uygulamasına dayanır ve bu da video verilerinden sağlam ortak özelliklerin çıkarılmasını sağlar.

Mevcut sistemlere kıyasla bu platform dört temel avantaj sunmaktadır. İşadersiz çalışması, yansıtıcı veya implant etiketlerini ortadan kaldırırken, prosedürel karmaşıklığı ve hareket artefaktlarını önemli ölçüde azaltır⁶. Entegre kuvvet-geri besleme süspansiyon sistemi, hassas dereceli vücut ağırlığı desteği (%0-100) sağlar ve ticari koşu bandlarında bulunmayan tam yükleme-boşaltma sürekliliği boyunca kapsamlı yürüyüş değerlendirmesini^{kolaylaştırır 7}. Derin öğrenme mimarisi, yeni suşlar, yaşlar veya patolojik durumlar için hızlı yeniden eğitim sağlar ve ölçeklenebilirlikte manuel izlemeyi geride^{bırakır. 8}. Yüksek hassasiyetli çok eklemli uzamsal koordinatlar, eklemler arası kinematiklerin ince taneli analizini ve anormal yürüyüş desenlerinin nicel profilini mümkün kılar.

Bu protokol yaygın olarak uygulanabilir. Supraspinal kontrol, proprioseptif geri besleme döngüleri ve kas sinerjilerinin modüle edilmiş mekanik gereksinimler altında^{incelenmesini sağlar 9}. Patofizyolojik olarak, omurilik yaralanması (SCI), felç, nörodejenerasyon, periferik nöropatiler ve nöromüsküler bozukluklar için hassas lokomotor biyobelirteçler^{sağlar 8,10}. Terapütik olarak, farmakolojik veya cihaz tabanlı müdahalelerin uzunlamasına değerlendirmesini destekler ve yüksek çözünürlüklü kinematiklerden elde edilen istatistiksel^{güçle desteklenir.} Modüler mimari, elektromiyogram (EMG) veya beyin sinyalleri gibi tamamlayıcı platformlarla sorunsuz entegrasyon sağlar ve alt uzuv hareketlerinde sinirsel korelatların mekanik olarak çözülmesini kolaylaştırır.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri, Pekin Beyin Araştırmaları Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Yönergelerine uygun olmuştur. İşlemle ilgili herhangi bir yan etki gözlemlenmedi.

1. Ekipman hazırlığı

1. Koşu bandı sisteminin güç kaynağını açın ve dokunmatik ekranda Hız Kontrolü düğmesini seçin.
2. Koşu bandı kayışının sapıp sapmadığını görmek için kemeri düşük hızda 30 saniye çalıştırın.
3. Eğim Kontrol butonunu seçin, eğimi 0°'ye ayarlayın, Zero'ya tıklayın ve gösterilen değerin düz balonuyla örtüştüğünü doğrulayın.
4. Süspansiyon arayüzüne girin, 10 g ağırlığı asın ve gerilim okumasının 0.10 N'ye yakın olup olmadığını kontrol edin.
5. Endüstriyel Kişisel Bilgisayarı (IPC) açın ve video alım ve analiz yazılımına girin.
6. Günün deneyi için bir dizin oluşturun; deney adı, hayvan kimliği, deney grubu, hız, eğim ve kilo azaltma yüzdesi gibi bilgileri içeriyor.
7. Yüksek hızlı endüstriyel kamerayı (UC70, çözünürlük: 1280X1024, kare hızı: 60 fps), manuel odaklama lensiyle (f = 12 mm) donatılmış ve alüminyum profil braketinde tamir edin. Kamera lensini, koşu bandının boylamasına eksenine dik konumlandırarak tamamen yan görünüm elde edin ve koşu bandı kemer düzleminden yatay çalışma mesafesi 15 cm kalın.
8. Lensi yatay olarak bir baloncuk seviyesi kullanarak yerleştirin ve farenin gövdesinin çerçevenin ortadaki üçte 2/3'ünü kapladığından emin olun. Odak ve diyaframı arka cetveldeki (1 cm ızgara) ölçek çizgileri net görünene kadar ayarlayın.
9. Takip olmadığını ve arka plan parlaklığının eşit olduğunu doğrulamak için Önizlemeye tıklayın. Görüntü çok koyu ise, parlaklığı artırmak için ışık yayan bir diyot (LED) arka ışık kullanın; Aşırı pozlama durumunda, kazancı azaltın ve diyaframı uygun şekilde daraltın.
10. Veri kaydı kalitesini test etmek için Kayıt Başlat'a tıklayın. Kaydı Durdur seçeneğine tıklayın ve veri depolama yolunu ayarlayın. Yukarıdaki ekipman testlerini tamamladıktan sonra hayvan testlerine başlayın.

2. Hayvan hazırlığı ve koşu testi

1. Fareyi orijinal kafesiyle birlikte deney odasına taşıyın ve 10 dakika dinlendirin. Bu süre zarfında, yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlanır.
2. Vücut ağırlığını elektronik bir tartı ile (0.1 g doğruluğunda) kaydedin. Vücut boyutunun kafa karıştırıcı etkilerini en aza indirmek için vücut ağırlığı (±10 g) uyumlu fareleri dahil edin.
3. Arka uzuvların kürk rengi arka planla yeterince kontrast oluşturmuyorsa, eklem tanıma doğruluğunu artırmak için elektrikli tıraş makinesi kullanarak uyluğun dış tarafında ve alt bacağın arkasında 1 cm genişliğinde bir kürk şeridi nazikçe çıkarabilirsiniz.
4. Daha sonra yumuşak bir bant kullanarak kalçadan ayak bileğine kadar olan düz çizgi mesafesini (mm) ölçün; bu, sonraki adımların normalizasyonu için temel oluşturacaktır.
5. Eldiven giyin, fareyi tutun ve elastik göğüs kayışını ön koltuk altına dolayarak ayarlanabilir kayma rayına takın. Kayışın hayvanın nefes alışını etkilemeden bir parmağını sokacak kadar gevşek olduğundan emin olun.
6. Ekrandaki gerilim değerini gözlemleyerek süspansiyon kolu kolunu yavaşça döndürerek hedef ağırlık azaltma oranına kademeli olarak yükseltin. Farenin arka uzuvlarının hâlâ tamamen yere temas ettiğini doğrulayın.
7. Grip çubuğunun yüksekliğini ayarlayın. Üst kolu gevşedin ve ön tutuş çubuğunu farenin burun ucunun biraz altına yerleştirin; böylece hayvan başını fazla geriye eğmeden ya da eğilmeden kolayca tutabilsin.
8. Dokunmatik kontrol ekranında hızı 150 mm/s ve eğimi 0°'ye ayarlayın. Hayvanı belirli vücut ağırlığı destek seviyesine uyarlamak için 10 dakikalık bir alışma seansı yapın. Fareyi donma, dışkılama gibi stres belirtileri için izleyin.
   1. Yürüyüş düzensiz kalırsa ([>3 kesinti/dakika] olarak tanımlanırsa), süreyi 2 dakikalık artışlarla en fazla 20 dakikaya kadar uzatın.
9. Alışma, sıçan en az 60 saniye boyunca sürekli ve tekiz adımlarını sürdürürse başarılı sayılır ve kuyruk doğal olarak sertlik olmadan sarkılar. Maksimum uyum süresinden sonra bu kriterleri karşılamayan hayvanlar hariç tutulur.
10. Biçimsel deney için gereken parametreleri girin. İstenilen hızı (0-300 mm/s arasındaki herhangi bir değer) ve eğimi (−30° ile +30°) dokunmatik ekranda sıralı girin ve koşu bandı kayışının yönünü seçin.
11. Koşu bandına başladıktan sonra, farenin yürüme duruşunu gözlemleyin. Eğer orta 1/3 bölgeden sapırsa, sağ taraf duvarına yumru ile nazikçe bir kez dokun. Çoğu hayvan kendi pozisyonlarını düzeltir. Eğer ardışık iki düzeltme etkisiz kalırsa, fareyi yeniden konumlandırın ve denemeyi yeniden kaydedin.
12. Sabitlemeden sonra, Kayda Başlat tuşuna tıklayın ve en az beş tam yürüyüş döngüsünü sürekli olarak yakalayın.
13. Her denemenin sonunda hızı hemen 0'a düşürün, göğüs kemerini açın ve fareyi ilgili kafese geri döndürün.
14. Dinlenme zamanında, denemeler arasında en az 3 dakika su verin.
15. Aynı koşullar altında en az üç deneme kaydedin. Bir hayvan altı denemeden fazla süreyle sürekli koşuyorsa, birikimli yorgunluğu önlemek için ek 2 dakikalık bir dinlenme ekleyin.
16. Resmi deneyden önce beş gün ardışık ön eğitim yapın: günde 10 dakika boyunca 150 mm/s hızda, 0° eğimde ve sıfır ağırlık kaybı ile yürüyün, yürüyüşünüzü gözlemleyin.

3. Yürüyüş verisi çıkarımı

1. İlk olarak, hedef yürüyüşü içeren segmentleri çıkarın; genellikle yaklaşık 10 saniye civarında, bu en az 10 analiz edilebilir kararlı yürüyüş döngüsü içermelidir.
2. .mov dosyasını analiz yazılımına aktarın ve sıçanların bireysel bilgilerini, kimlik numarası, grup ve deneysel koşullar dahil olmak üzere kaydedin.
   NOT: Sistem, yüksek performanslı poz tahmini için optimize edilmiş son teknoloji bir sinir ağı olan YOLO-NAS Pose mimarisini kullanır.
   Veri Seti Oluşturma: Model, 6.000 video karesinden oluşan sağlam bir veri seti üzerinde eğitilmiştir. Bu çerçeveler, DeepLabCut grafik kullanıcı arayüzü kullanılarak beş ana arka uzuv eklemlerinin (iliak arma, kalça, diz, ayak bileği ve parmak) koordinatlarıyla manuel olarak notlandırıldı; böylece yer doğruluğu doğruluğunu sağladı.
   Eğitim: Ağ, YOLO-NAS Pose ağırlıklarını fare arka uzuvunun özel özelliklerine uyarlamak için NVIDIA RTX 3080 GPU üzerinde transfer öğreniminden geçti.
   Başlatma: Yazılımda, önceden eğitilmiş 'Rat_Hindlimb_YOLO_v1' modelini seçin ve düşük kesinlikli anahtar noktaları hariç tutmak için Güven Eşiği'ni 0.8'e ayarlayın.
   Analiz aşamasında, YOLO-NAS Pose modeli video akışını kare kare işler. Arka plan çıkarma yöntemine dayanan geleneksel bilgisayar görme yöntemlerinin aksine, bu derin öğrenme mimarisi fareyi doğrudan lokalize eder ve sınırlayıcı kutu içindeki ortak koordinatları tahmin eder.
   Post-Processing: Algoritma, olasılık haritalarından x ve y koordinatlarını çıkarır. Yüksek frekanslı titremeyi azaltmak için, ham yörüngelere bir Median filtre (pencere boyutu: 3 çerçeve) uygulanır.
   Çıkış: Sistem, video çerçevesindeki beş hedef eklemi başarıyla kilitler ve tüm yürüyüş dizisi için zamanla çözülen mekânsal koordinatlar oluşturur. Bu veriler, kinematik hesaplama için otomatik olarak .csv dosyası olarak dışa aktarılır. Aynı anda elde edilen arka tahta cetvelini (1 cm ızgara) kullanarak sistem bir dönüşüm ilişkisi kurar, ölçeklendirme faktörünü otomatik olarak hesaplar ve piksel koordinatlarını milimetreye toplu olarak dönüştürür.
3. Her eklemin zaman içindeki mekânsal konum koordinatlarını sonraki indeks hesaplaması için .csv dosyası olarak dışa aktarın.
   NOT: Yazılım, adımların uzunluğunu, basamak sıklığını ve ayak yüksekliğini otomatik olarak hesaplar ve beş alt uzuv ekleminin zaman içindeki mekansal konum ve açılarındaki değişiklikleri dışa aktarır. Parmak yüksekliğine göre, yazılım her adımı otomatik olarak salınım fazı ve duruş aşamasına ayırır ve her yürüyüş döngüsünde salınım fazı ve duruş fazının oranını hesaplar.

4. Gruplar arası kinematik karşılaştırmalar

1. Grup içindeki her yürüyüş döngüsünü %0'dan %100'e (tekrar aynı ayak teması) normalleştirerek farklı döngü uzunluklarını birleştirin, böylece grup ortalaması ve karşılaştırma kolaylaşır. Yürüyüş dinamiklerini göstermek için oluşturulabilecek görüntü türleri Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.

5. İstatistiksel analiz

1. Tüm istatistiksel analizleri GraphPad Prism yazılımı ile gerçekleştirin.
2. Shapiro-Wilk testini kullanarak veri dağılımının normalliğini doğrulayın.
3. Kinematik doğrulama ve vücut kütle indeksi (BMI) gösterim karşılaştırmaları için, verileri Ortalama ± SEM olarak sunun.
4. İki deneysel koşul arasındaki farkları eşleşmemiş bir Öğrenci t-testi kullanarak değerlendirin.
5. İstatistiksel anlamlılık eşiklerini *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.005 olarak tanımlayın. Bu pilot doğrulama çalışmasında toplam n = 3 fare dahil edildiğini unutmayın.

6. Elektrofizyolojik modülün gömülmesi

1. Hayvan modellemesi tamamlandıktan sonra, elektrofizyolojik kayıt cihazını implante edin.
2. Sinir kaydı için, kafatası yüzeyine, epidural boşluğa veya beyin korteksine elektrotlar yerleştirilerek beyin sinyallerini kaydedebilirsiniz.
3. Omurilik kaydı için, kayıt elektrotlarını omurgalar arası foramenin epidural boşluğuna yerleştirin.
4. EMG kaydı için, kas elektriksel aktivitesini kaydetmek amacıyla kaslara bipolar gümüş teller gömülür.
5. Implantasyondan sonra, hayvanın iyileşmesine 5-7 gün boyunca izin verin; yara ve yürüyüş şekli her gün kontrol edilip enfeksiyon veya ağrı belirtisi olmadığından emin olun, ardından koşu bandı deneyine geçin.
6. Ekipman ve hayvan hazırlıklarını yukarıda açıklandığı gibi tamamla.
7. Elektrofizyolojik parametreler ve hareket videolarının toplanmasını senkronize ederek elektrofizyolojik ve video verilerinin aynı zaman damgasını paylaşmasını sağlayın.
8. Veri toplandıktan sonra, analiz sırasında sinir sinyallerini video kareleriyle hizalayarak yürüyüş döngüsünün farklı evrelerindeki elektrofizyolojik desenleri sezgisel olarak gözlemleyin; bu da merkezi-çevresel bağlantı mekanizmasının doğrudan araştırılması için kanıt sağlar.

Results

Koşu bandı sisteminin yapısının şematik diyagramı ve gerçek fotoğrafı sırasıyla Şekil 1A,B'de gösterilmiştir. Cihaz, işaretleyici olmadan yüksek kontrastlı yan görüntüler elde edebiliyor. Koşu bandı, hız, eğim, yön ve ağırlık azaltma ayarlarını destekler ve sayısal bir kontrol paneliyle donatılmıştır. Eşlik eden yazılım arayüzü, gerçek zamanlı izleme ve erişim arayüzü ile video yükleme ve yürüyüş çıkarma analiz arayüzü içermektedir. Otomatik...

Discussion

Bu protokol, fareler için koşu bandı tabanlı yürüyüş analiz sistemi ve operasyonel prosedürlerini tanımlarak, nöromüsküler davranış araştırmaları için çok boyutlu ve objektif bir değerlendirme aracı sunar. Örnek çalışmada SCI ile sağlıklı fareler arasındaki yürüyüş parametrelerinin gruplar arası karşılaştırmalarında gösterildiği gibi, sistem sürekli yüksek kare hızında yürüyüş videografisi ve yapay zeka odaklı otomatik çoklu eklemli notasyon algoritması aracılığıyla deneklerin alt uzuvla...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yürüyüş Yapay Zeka Açıklaması & Satın alma Yazılımı	Şanghay ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MouseAI	MouseAI, MOVEMETRICS koşu bandı için entegre analiz yazılımıdır; video kaydı, meta veri kaydı ve otomatik yürüyüş analizini tek bir iş akışında birleştirir.
Mekanik darbe ve nbsp;	RWD Yaşam Bilimleri, Shenzhen, Çin
Çok kanallı elektrofizyo-mantıksal kayıt sistemi	Kedou (Suzhou) beyin-bilgisayar Teknolojileri Şirketi,	KedouBC RHD128A	KedouBC RHD128A, küçükten büyük laboratuvar hayvanlarına yüksek çözünürlüklü sinir kaydı için tasarlanmış kompakt, 128 kanallı bir in elektrofizyoloji toplama sistemidir. Hafif, plug-and-play headstage (≤ 1.3 g), 16-bit A/D dönüşüm ve programlanabilir amplifikatorları entegre eden bu cihaz, EEG, ECoG, LFP, spike, EMG ve 0.1 Hz'den 30 kHz'e kadar olan EKG sinyallerini &le ile yakalar; 2.4 µ V sistemi gürültüsü ve > 10 GΩ Giriş empedansı. RHD128A, beyin-makine arayüzleri, nörodejenerasyon ve rehabilitasyon alanlarında çalışmaları hızlandırmak için sağlam, kullanıcı ölçeklenebilir sinir verileri sunar.
Koşu bandı	Şanghay ClinAITrial Technology Co., Ltd.	HAREKET METRIKLERI	MOVEMETRICS, gelişmiş kemirgen yürüyüş analizi için yüksek hassasiyet enstrümantlı bir koşu bandıdır.