Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
* These authors contributed equally
Bu çalışma, Kanser Genomu Atlası verilerini kullanarak akciğer skuamöz hücreli karsinomunda (LUSC) 10-lncRNA oksidatif stresle ilişkili bir imza tanımlamaktadır. Doğrulama sınırlı klinik öngörücü performans gösterse de, imza olarak farklılaşan bağışıklık mikroortam desenleri ve in vitro testler, LINC01615 göç istilası ile ilgili bir aday olarak daha ileri mekanik araştırmalar için destekledi.
Uzun zincirli kodlamayan RNA (lncRNA), akciğer skuamöz hücre karsinomunun (LUSC) prognostik değerini ve bağışıklık sızmasını önemli ölçüde etkiler. Bu çalışma, oksidatif stresle ilişkili lncRNA'ların akciğer skuamöz hücre karsinomunu (SCC) nasıl etkilediğini göstermeyi amaçladı. Kanser Genomu Atlası (TCGA) veri seti, LUSC için transkriptom bilgisi ve ilgili klinik verileri topladı. Prognostik bir model oluşturmak için, OS geninin tümör ve sağlıklı dokulardaki anormal ekspresyonunu ve malignite ile ilişkisini karşılaştıran bir dizi biyoinformatik analiz kullanılarak 10 prognostikle ilgili gen tanımlandı. Katılımcılar, 10 genlik imzadan elde edilen medyan risk puanına göre yüksek ve düşük riskli gruplara ayrıldı. Matematiksel risk modeli, doğrulama kohortunda (AUC ~ 0.5) sınırlı bağımsız öngörücü performans gösterse de, fonksiyonel ve immünolojik değerlendirmeler risk katmanları arasında tümör mikro ortamında (TME) önemli farklılıklar ortaya koydu. Özellikle, yüksek riskli hastalar, düşük riskli hastalarına kıyasla belirgin bağışıklık infiltrasyon profilleri ve değişen immünolojik skorlar sergilemiştir. Bu nedenle, doğrudan bir klinik tahmin aracı olmaktan ziyade, bu oksidatif stresle ilişkili lncRNA imzası LUSC'nin bağışıklık yapısına dair değerli biyolojik içgörüler sağlar ve daha fazla mekanik araştırma için potansiyel terapötik hedefleri ortaya koyar.
Akciğer kanseri, kanserler arasında en yüksek küresel insidans ve ölüm oranını gösterir1. Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) histolojik varyantları içinde, akciğer skuamoz hücreli karsinomu (LUSC) baskın bir alt tiptir ve genellikle olumsuz klinik sonuçlarla ve akciğeradenokarsinomu 2'ye kıyasla çok etkili hedefli tedavilerin eksikliğiyle ilişkilidir. Birincil terapötik yaklaşımlar cerrahi müdahale, radyoterapi ve kemoterapiyi kapsarken, ileri LUSC'li hastalar sıklıkla terapötik dirençgösterir 3. Sonuç olarak, prognostik tabakalaşmayı iyileştirmek ve LUSC4 için keşif terapötik stratejilerini yönlendirmek amacıyla sağlam moleküler biyobelirteçlerin belirlenmesi acil bir ihtiyaç vardır.
Reaktif oksijen türlerinin (ROS) patolojik birikimi ile karakterize edilen oksidatif stres, tümörün başlanması, büyümesi ve metastazında kritik bir rol oynar. Verimli ROS temizleme mekanizmalarının olmamasında, yüksek ROS seviyeleri DNA hasarı ve genotoksisiteye yol açar ve sonuçta kanser gelişimine katkıda bulunan çeşitli genomik değişikliklere yol açar. Özellikle, çalışmalar özellikle akciğer kanseri patogenezi 5,6 içinde ROS seviyeleri ve oksidatif streste bir yükseliş göstermiştir. Son araştırmalar, oksidatif stresle bağlantılı gen kümelerinin akciğer malignitelerde prognostik biyobelirteç olarak işlev görebileceğini daha da ortayakoymuştur 7. Uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), gen ifadesinin kritik düzenleyicileri olarak ortaya çıkmış ve çeşitli malignitelerde umut verici prognostik biyobelirteçleri temsil etmektedir. Daha önceki önemli birçalışma 7, akciğer adenokarsinomu (LUAD) için oksidatif stresle ilişkili lncRNA prognostik modelini başarıyla kurmuş olsa da, bu tür lncRNA'ların LUSC'deki spesifik prognostik yapısı ve bağışıklık etkileri büyük ölçüde keşfedilmemiştir.
Bu araştırmada, yazarlar TCGA veri setlerini sistematik olarak analiz ederek LUSC için özel olarak tasarlanmış yeni bir oksidatif stresle ilgili lncRNA imzası oluşturdular. Ayrıca, tamamen biyoinformatik analizlerin aksine, mevcut çalışma anahtar tanımlanmış lncRNA'ların (örneğin, Linc01615) biyolojik fonksiyonel rolünü doğrulamak için in vitro deneysel doğrulama içermektedir. Tanı ve tedavi kararları için anında klinik uygulanabilirlik iddiası yapmak yerine, bu araştırma öncelikle LUSC'deki oksidatif stresin potansiyel mekanizmalarını ve bunun tümör bağışıklık mikroçevresiyle ilişkisini araştırmayı amaçlamaktadır. Bu bulgular, değerli biyolojik içgörüler sağlamayı ve gelecekteki mekanik araştırmalar için potansiyel terapötik hedefleri vurgulamayı amaçlamaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Veri edinimi ve ön işleme
Bu çalışmada analiz edilen tüm veriler, Materyaller Tablosu'nda listelenen halka açık TCGA veritabanından elde edilmiştir. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Genomik Veri Paylaşım Politikası ve TCGA tarafından sağlanan yayın yönergelerine sıkı sıkıya bağlı kalmıştır. Veri setleri, kimliği silinmiş, kamuya açık klinik ve çoklu omik verilerden oluştuğu için, bu çalışma ek Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onayı dışında tutuldu. LUSC için transkriptom verileri ve ilgili klinik bilgiler Kanser Genomu Atlası (TCGA) veritabanından indirildi. Başlangıçta kohort 551 örnekten oluşuyordu (502 tümör ve 49 normal). Bu prognostik modelin sağlamlığını sağlamak için, tam genel sağkalma (OS) verileri, sağlık durumu veya temel klinik özellikleri olmayan hastalar sonraki sağkalma analizinden dışlandı. Bu sıkı filtreleme sürecinin ardından, 470 LUSC hastasından oluşan son bir analitik kohort oluşturuldu. Bu 470 hasta, risk modeli oluşturma ve doğrulama için rastgele bir eğitim seti (n = 235) ve test seti (n = 235) olarak ayrıldı. GeneCards veritabanı üzerinden toplam 792 oksidatif stresle ilgili gen, Materyaller Tablosu'nda listelenen ve dahil etme kriteri ≥ 7 olan bir alaka puanı kullanılarak toplanmıştır. Limma paketi (sürüm 3.66.0), farklı ekspresyel oksidatif stres genlerini taramak için kullanıldı. Volkan haritaları ggplot2 paketi (sürüm 4.0.2) kullanılarak üretilmiştir. Eğitim grubu ile test grubu arasında klinik özelliklerde kayda değer bir farklılık yoktu (p > 0.05). Eğitim seti model yapımı için kullanıldı ve test seti iç doğrulama için kullanıldı.
Risk modelinin inşası ve doğrulanması
Oksidatif stresle ilişkili lncRNA'ları belirlemek için Pearson ortak ekspresyon analizi yapıldı. Yazarlar, TCGA-LUSC veri setindeki farklı olarak ifade edilen oksidatif stresle ilişkili genlerin ifade profilleri ile tüm notasyonlu lncRNA'lar arasındaki korelasyonu değerlendirdi. Birlikte eksprese edilen lncRNA'ların seçilmesi için korelasyon kriterleri, korelasyon katsayısı |R| > 0.4 ve p-değeri < 0.001. Bu eşiklere dayanarak, toplamda 6.088 aday oksidatif stresle ilgili lncRNA türetilip çıkarıldı. Daha sonra, bu 6.088 aday lncRNA LASSO regresyonu ve tamamlayıcı analitik yaklaşımlarla değerlendirilerek prognostik risk modeli oluşturuldu. İşlenen veriler kullanılarak hasta katılımcılar yüksek ve düşük riskli katmanlara ayrıldı.
Bağımsız faktörler ve ROC eğrileri
Bağımsız prognostik değişkenleri belirlemek için tek değişkenli ve çok değişkenli Cox regresyon modelleri kullanılmıştır. Özellikle, çoklu tek değişkenli Cox regresyon analizleri sırasında aile bazında hata oranını kontrol etmek için (n = 236 test) Bonferroni düzeltmesi uygulandı ve sıkı şekilde ayarlanmış anlamlılık eşiği p < 0.00021 (0.05 / 236 olarak hesaplandı) olarak belirlendi.
Hayatta kalma analizi ve ana bileşen analizi
Hayatta kalma paketi (sürüm 3.8-6) genel sağkalma (OS) oranlarını hesaplamak için kullanıldı ve risk modelinin dayanıklılığını değerlendirmek için ana bileşen analizi (PCA) kullanıldı.
Nomogram
Uyum indeksi, nomogramın güvenilirliğini değerlendirmek için R'deki rms paketi kullanılarak değerlendirildi. Tümör mutasyonel yükü (TMB), maftools paketi (sürüm 2.22.0) kullanılarak değerlendirildi ve görselleştirildi. Bağışıklık sızmasını tespit etmek için ssGSEA dahil algoritmalar kullanıldı. Ayrıca, risk grupları arasındaki bağışıklık kontrol noktalarını karşılaştırmak için ggpubr paketi (sürüm 0.6.3) kullanıldı. ESTIMATE algoritması tümör mikroçevresini (TME) karakterize etmek için kullanıldı.
Fonksiyonel analiz
R sürümdeki clusterProfiler paketi (sürüm 4.14.6) zenginleştirme analizi için kullanıldı. Fonksiyonel yolları daha fazla incelemek için GSEA analizi yapıldı. Cytoscape kullanılarak, gözlem için bir ortak ifade ağı oluşturuldu.
Deneysel yöntemler
Hücre kültürü koşulları ve gruplama
NCI-H520 insan akciğer skuamöz hücreli karsinom hücre hattı (RRID: CVCL_1566; Materyal Tablosu'nda listelenmiştir) %10 (v/v) fetal sığır serumu ve %1 penisillin-streptomisin ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamında kültürlenmiştir. Log-faz hücreler 6 kuyu kültür plakalarına tohumlanmıştır. Başarılı bir şekilde yapışma sağlandıktan sonra, hücreler rastgele olarak üç farklı deneysel gruba ayrıldı: standart kültür koşullarında tutulan boş kontrol grubu, hedefsiz siRNA ile transfekte edilen negatif kontrol grubu (si-NC) ve LINC01615-spesifik siRNA ile transfekte edilen deneysel knockdown grubu (si-LINC01615).
Hücre transfeksiyonu
Si-LINC01615 ve si-NC reaktifleri buz üzerinde çözüldü. Transfeksiyon kompleksi hazırlığı için, 95 μL serumsuz RPMI-1640 ortamı steril santrifüj tüplerine pipet edildi, ardından ilgili siRNA'dan 3 μg ve Lipo3000 transfeksiyon reaktifinden 5 μL ardışık olarak eklendi. Aynı prosedür hemsi LINC01615 hem de siNC grupları için uygulandı. Çözeltiler nazikçe karıştırıldı ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka hale getirilerek karmaşık oluşumu kolaylaştırdı; böylece tüp başına toplam hacim yaklaşık 200 μL elde edildi. Daha sonra, bu karışım 800 μL RPMI-1640 bazal ortamı içeren belirlenmiş kültür kuyularına eşit şekilde dağıtıldı. 37 °C'de 6 saatlik kuluçka döneminin ardından, transfeksiyon ortamı dikkatlice aspirasyon edilip taze, tam kültür ortamı ile değiştirildi.
Yara iyileştirme (çizik) testi
Yara iyileşme testi için, logaritmik olarak büyüyen NCI-H520 hücreleri (RRID: CVCL_1566) 5.6 × 105 hücre/kuyu yoğunluğunda 6 delikli kültür plakalarına tohumlanmıştır. %95–100 birleşime ulaşıldığında, steril 200 μL pipet ucu kullanılarak hücre monotabakası kuyunun ortasında dikey olarak çizilerek yapay olarak doğrusal bir yara oluşturuldu. Kuyular daha sonra ayrılmış hücreler ve hücresel kalıntılar çıkarılması için PBS ile üç kez yıkanmış ve ardından serumsuz RPMI-1640 ortamında kuluçka yapılmıştır. Aynı yaralı bölgelerin görüntüleri 0, 24 ve 48 saatte ters mikroskop kullanılarak çekildi. Yara iyileşme alanı, ImageJ (RRID: SCR_003070; Materyal Tablosu'nda listelenmiştir) kullanılarak boşluk mesafesi ölçülerek nicelendirildi ve göç oranı 0 saat içindeki başlangıç yara alanına göre hesaplandı.
Transwell göçü ve işgal testleri
Hücresel göç ve istila kapasiteleri, Materyaller Tablosu'nda listelenen 8,0 μm gözenek boyutunda polikarbonat membran insertleriyle donatılmış 24 kuyruklu Transwell odaları kullanılarak değerlendirildi. İstila testi için, apikal odalar 50 μL Matrigel ile önceden kaplanmış (serumsuz ortamda 1:8 seyreltilmiş; Malzemeler Tablosu'nda listelenmiştir) ve polimerize hale için 37 °C'de 2 saat kuluçka hale getirilmişti; göç testinde ise kaplamasız insertler kullanılmıştır. Hücre transfeksiyonu ve 24 saatlik serum açlık döneminin ardından, NCI-H520 hücreleri hasat edildi, serumsuz RPMI-1640 ortamında yeniden süspansiyona getirildi ve 200 μL'de 1.8 × 10.5 hücre/kuyu yoğunluğunda apikal odalara tohumlandı. Bazal odalar, kemoatçekan olarak %10 FBS takviyesi olan 600 μL RPMI-1640 ortamı ile dolduruldu. %5 CO₂ ile 37 °C'de 48 saatlik kuluçkadan sonra, insertler çıkarıldı ve PBS ile üç kez yıkandı. Membranın apikal yüzeyinde kalan hücreler ıslak pamuk çubukla nazikçe temizlendi. Basolateral yüzeye göç eden veya işgal eden hücreler, %4 paraformaldehit ile 20 dakika sabitlendi ve oda sıcaklığında Malzeme Tablosu'nda listelenen Giemsa çözeltisi ile 30 dakika boyandı. Göç edilen ve istila edilen hücreler, her bir girişte rastgele seçilmiş üç optik alan boyunca 40x büyütme ile ters seçilmiş bir mikroskop kullanılarak görselleştirildi ve sayıldı.
İstatistiksel analiz
Tüm istatistiksel analizler ve veri görselleştirmeleri R yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi (sürüm 4.1.2; RRID: SCR_001905; Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir). Bu çalışmada kullanılan tüm R paketlerinin özel versiyon numaraları, ilgili metodolojik alt bölümlerinde açıkça belirtilmiştir. Anlamlı bir değer, aksi bildirilmedikçe geleneksel olarak p < 0.05 olarak tanımlanırdı. Birden fazla karşılaştırma yapıldığında (örneğin, çoklu tek değişkenli Cox regresyonları), Bonferroni yöntemi aile bazında hata oranını (FWER) korumak için sıkı bir şekilde uygulandı ve tam ayarlanmış eşik (örneğin, p < 0.00021) ilgili metodolojik alt bölümde detaylandırıldı. Kantitatif in vitro veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi ve uygun olduğunda Student's t-testi veya tek yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Oksidatif stres için farklı şekilde ifade edilen genlerin tanımlanması
İş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. 470 LUSC hastasından oluşan nihai analitik grubun klinik özellikleri Tablo 1'de detaylandırılmıştır. Tanımlanmış 7 alaka puanı ≥eşiğine dayanarak, yazarlar GeneCards veritabanından (Ek Dosya 1) toplam 792 oksidatif stresle ilgili gen elde ettiler. Normal ve LUSC örnekleri ara...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Akciğer skuamöz hücreli karsinomu (LUSC), küçük hücreli olmayan akciğer kanserinin baskın ve son derece agresif bir histolojik alt tipidir; genellikle kötü hayatta kalma oranları ve geleneksel tedavi yöntemlerine dirençlekarakterize edilir 8,9. Ortaya çıkan kanıtlar, oksidatif stresin çeşitli kanserlerin patogenezi ve ilerlemesinde temel bir itici güç olduğunu vurgulamaktadır. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) patolojik birikimi v...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir. El yazması hazırlığı sırasında yapay zeka (YD) araçları veya yapay zeka destekli teknolojiler kullanılmadı; Tüm bilimsel içerik, analizler, ham veriler ve sonuçlar bağımsız olarak oluşturulmuş, incelenmiş ve yazarlar tarafından onaylanmıştır.
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 8200430) tarafından desteklenmiştir. Kaynakları ve destekleri için Hunan Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi ve Hunan Geleneksel Çin Tıbbı Bağlı Hastanesi dahil olmak üzere katkıda bulunanlara ve kurumlara içtenlikle teşekkür ediyoruz. Ayrıca, bu çalışmaya katkıda bulunan tüm araştırmacılara ve katılımcılara teşekkürlerimizi sunarız.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehit | Beyotime | P0099 | Hücre sabitlemek için kullanılır |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | Eş-ekspresyon ağı oluşturma için kullanılır |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Son konsantrasyon %10 (v/v) |
| GeneCards veritabanı | GeneCards İnsan Gen Veritabanı | https://www.genecards.org/ | Oksidatif stresle ilgili genlerin taranması |
| Giemsa Boyası | Sigma-Aldrich | GS500 | Göç etmiş/işgal eden hücrelerin boyanması için kullanılır |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Yara boşluğu ölçümü için kullanılır |
| Lipo3000 Transfeksiyon Reaktifi | GLPBIO | GK20006 | SiRNA transfeksiyonu için kullanılır |
| Matrigel | Corning | 356234 | Serum içermeyen ortamda 1:8 seyreltilir |
| NCI-H520 insan akciğer skuamöz hücreli karsinomu | ATCC | HTB-182 | In vitro doğrulama testleri için kullanılır |
| PBS (Fosfat Tamponlu Salin) | Gibco | 10010-023 | Hücre yıkama için kullanılır |
| Penisilin-Streptomisin (1%) | Gibco | 15140-122 | Hücre kültürü antibiyotik takviyesi |
| R yazılımı (v4.1.2) | R Foundation | https://www.r-project.org/ | İstatistiksel analiz ve görselleştirme |
| RPMI-1640 Ortamı | Gibco | 11875-093 | Hücre kültürü ortamı |
| The Cancer Genome Atlas (TCGA) | Genomic Data Commons | https://portal.gdc.cancer.gov/ | Transkriptom ve klinik veri kaynağı |
| Transwell Odaları (8.0 μm) | Corning | 3422 | Göç ve istila testleri için kullanılır |