Method Article

RNA analizi için paraformaldehit sabitli fare karaciğer dokusunun lazer yakalama mikrodiseksiyonu

DOI:

10.3791/69814

⸱

April 17th, 2026

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Southern Medical University, 2School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 3School of Pharmaceutical Science, Southern Medical University, 4Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co., Ltd., 5The Seventh Affiliated Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, paraformaldehit sabitlenmiş, Optimal Kesme Sıcaklığı bileşen gömülü fare karaciğer dokusunun tanımlı histolojik bölgelerinden RNA'yı lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanarak izole etme yöntemini tanımlar; böylece hedefe yönelik aşağı akım gen ekspresyonu analizi mümkün olur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM), karmaşık dokular içindeki belirli hücre popülasyonlarına yerinde görselleştirme ve izolasyon yoluyla mekânsal erişim sağlar. Sabit dokuda histolojik olarak tanımlanmış bölgelerin transkriptomik analizini mümkün kılmak için, paraformaldehit (PFA) sabitli, Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşik gömülü fare karaciğer kesitlerinden RNA ekstraksiyonu için ayrıntılı bir LCM protokolü sunulmaktadır. Protokol, doku fiksasyonu, sukroz dehidrasyonu, OCT gömülmesi, kriyoseksiyon, hematoksilin boyama ve hedeflenen histolojik alanların lazerle yakalamasını içeren bir iş akışı aracılığıyla mikro ölçekli örneklerin (yaklaşık 1.000 hücre) tanımlanması ve toplanmasını detaylandırıyor. Bu yöntemle yüksek saflıkta bir RNA (A260/A280: 1.9-2.1) elde edildi. RNA bütünlük numarası (RIN) 6.7 ± 0.9 idi; bu da PFA fiksasyonuyla ilişkili beklenen parçalanmayı yansıtıyordu. Ancak, β-aktinin nicel PCR'si 17-19 arasında Ct değerleri verdi ve parçalanma optimize edilmiş kütüphane hazırlığı kullanılarak yapılan RNA dizilemesi yüksek kaliteli okumalar üretti; bazların %>90'ı Q20 ve Q30 eşiklerini karşıladı ve RNA'nın hassas sonraki analizler için uygun olduğunu doğruladı. Bu nedenle, bu protokol, PFA sabit karaciğer dokusunun belirli histolojik bölgelerinden tanımlanmış saflık ve bütünlükte RNA sağlayarak mekânsal olarak çözülmüş, hedeflenmiş gen ifade analizini mümkün kılar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekansal olarak çözülmüş gen ifade profillerinin doğru edinimi, sağlık ve hastalıkta doku heterojenliğini anlamak için çok önemlidir. Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) yüksek hücresel çözünürlük 1,2 sunar, ancak doğal mekansal bağlamı kaybeder ve doku ayrışması sırasında transkripsiyon profillerinideğiştirebilir 3,4. Kamuya açık tanımlanmış spesifik belirteçleri olmayan hücre tipleri için, immünoflüoresans tabanlı sıralama veya immünomanyetik izolasyon kullanarak saf popülasyonlar elde etmek zordur 5,6. Visium ve GeoMx gibi mekansal transkriptomik teknolojileri, yüksek verimli gen ifade verilerinin yerinde yakalamasına izin verir, ancak mekansal çözünürlükleri tek hücre veya subhücreseviyesinde 7,8 sınırlıdır. Buna karşılık, görüntüleme tabanlı uzamsal transkriptomikler nanometre seviyesinde çözünürlüğe ulaşabilir ancak gen algılama verimliliğisınırlıdır 9. Bu, belirli morfolojik bölgelerin hipotez odaklı analizinde kalıcı bir boşluk olduğunu ortaya koymaktadır.

Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM), gözlemlenebilir fenotipe dayalı olarak doku kesitlerinden veya canlı hücre kültürlerinden belirli hücrelerin mikroskop rehberliğinde seçilip izole edilmesini sağlar. Bu yaklaşım hücresel yapıyı ve mekansal bilgiyikorur 10. Bu teknik, karaciğer hastalıkları araştırmalarında sonraki analizlerde yaygın olarak uygulanmıştır. Örneğin, LCM, karaciğer biyopsilerinden safra epitel hücrelerinin primer bilyer kolanjitinde immünoregülatif rolünü aydınlatmak içinkullanılmıştır 11. Ayrıca, deneysel modellerden γ-glutamil transferaz (GGT) pozitif doku izole etmek için kullanılmıştır ve siteye özgü Ggt1 genifadesi 12'yi doğrulamaktadır. Ancak bu çalışmalar çoğunlukla klinik açıklamalar veya uzun vadeli takip eksikliği olan taze dondurulmuş dokularaodaklanmıştır 13. Buna karşılık, kimyasal olarak sabit dokular histopatolojik tanı için avantajlarsunar 14. LCM tabanlı RNA dizilemesi (RNA-Dizi) arşivlenmiş, büyük ölçekli formalin sabitli ve parafinli (FFPE) karaciğer örneklerinde başarılı bir şekildeuygulanmıştır 15. Ancak, paraformaldehit (PFA) sabit ve Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşik gömülü karaciğer dokularından alınan mikro ölçekli örnekler için özel sağlam bir LCM tabanlı gen ifade profilleme protokolü eksiktir.

Bu karşılanmamış ihtiyacı karşılamak için, PFA sabitli, OCT-gömülü kriyoseksiyonlar kullanılarak kapsamlı bir protokol optimize edildi. Bu protokol, hassas LCM-RNA uygulamaları için FFPE iş akışlarının (örneğin, uzun işlemler ve sert kimyasallar) sınırlamalarınıele alır 16. Buna karşılık, PFA ile sabitlenmiş, OCT gömülü örnekler için fiksasyon ve gömme süreci nispeten daha basit ve esnektir; bu da hem RNA bütünlüğünü hem de doku morfolojisini koruyan yüksek kaliteli kesitlerin hızlı hazırlanmasını sağlar. Ayrıca, bu protokol ultraviyole (UV) lazer tabanlı LCM sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. Kızılötesi sistemlere kıskandığında, UV-LCM daha hassas kesim çözünürlüğü sağlar ve doğrudan temassız numune toplama imkanı sağlar, böylece kirlenme en aza indirilir ve karmaşık doku mimarilerinden mikro ölçekli bölgelerin hassas izolasyonuna uygunhale gelir 17,18. Bu nedenle, bu protokolün operasyonel değeri, PFA ile sabitlenmiş karaciğer kesitlerinden mikro ölçekli bölgelerin (~1.000 hücre) morfolojini koruyan yakalama yeteneğinde yatmaktadır. Bu yöntem, hedefli gen ekspresyonu analizine uygun RNA elde eder ve histopatolojik özellikler ile yerel transkriptomik profiller arasında doğrudan korelasyon sağlar.

Burada, PFA ile sabitlenmiş, OCT gömülü fare karaciğer kesitlerinden mikro ölçekli dokunun (~1.000 hücre) lazerle yakalama mikrodiseksiyonu protokolünü tanımlıyoruz; ardından RNA çıkarımı ve nicel ters transkripsiyon PCR ile sonraki analizi yapılıyor. Bu işlemler beş gün içinde tamamlanabilir.

Bu protokolün uygulanabilirliğini değerlendirmede okuyuculara rehberlik etmek için, temel kapsam ve sınırlamalar aşağıda özetlenmiştir. Bu protokol, PFA sabitli, OCT gömülü dokulardan belirli histolojik bölgelerin hipotez odaklı, morfoloji rehberli örnekleme için özel olarak optimize edilmiştir ve birincil uygulaması fare karaciğerinde gerçekleşir. Mekânsal olarak çözülmüş transkriptomik verileri sabit örneklerde korunan hassas histopatolojik özelliklerle ilişkilendirmek isteyen araştırmacılar için uygundur. İş akışı, özellikle arşivlenmiş veya klinik olarak notlanmış sabit dokularla çalışırken değerlidir; taze dondurulmuş örnekler mevcut değildir. Ancak, bu protokol, yüksek bütünlüklü, parçalanmamış RNA (örneğin, RNA bütünlük numarası (RIN) >8) gerektiren çalışmalar için ideal değildir; çünkü kimyasal fiksasyondan kaynaklanan doğal parçalanma, tam uzunlukta transkriptlere bağlı uygulamalarda kullanımını sınırlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan bakımı ve bakımı için tüm prosedürler, etik yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve Southern Medical University Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı. Tanımlanan yöntem, yetişkin erkek C57BL/6J farelerini kullandı ve metabolik ilişkili steatohepatiti (MASH) modellemek için yüksek yağlı, yüksek şekerli, kolin eksikliği içeren bir diyetle tutuldu. Karaciğer dokusu toplanmadan önce hayvanlar kafası kesilerek ötenazi edildi.

1. PFA ile sabit numunenin hazırlanması

  1. Taze karaciğer dokusu örnekleri (bireysel loblar, 5 mm kalınlığında veya daha az) 30 mL soğuk 4% PFA (taze hazırlanmış) ile 4 °C'de 24 saat sabitleyin.
    NOT: Karaciğerin fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS, 1×, genellikle 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ ve 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4) çözeltisiyle 1× konsantrasyonda 5 dakika perfüzyon fiksasyonu yapılması önerilir. Alternatif olarak, doku %10 formalin çözeltisiyle de sabitlenebilir.
    UYARI: PFA fiksantivi toksiktir. Tüm PFA atıkları, kurumsal ve yerel düzenlemelere uygun olarak belirlenmiş, doğru şekilde etiketlenmiş kimyasal atık konteynerinde toplanmalıdır.
  2. Sabit doku örneklerini RNase içermeyen 1× PBS çözeltisi ile 5 dakika boyunca 3× kez yıkayın.
  3. Sabit karaciğer dokusunu 50 mL %30 sakaroz (steril 1× PBS içinde taze hazırlanmış) içeren 50 mL tüpe yerleştirin. Örnekleri 10-12 saat boyunca 4 °C'de tutun.
  4. Sakroz çözeltisinden doku örneklerini çıkarın. Örnekleri kolayca işlenebilen bloklar elde etmek için kesin (yaklaşık 5 mm × 3 mm × 5 mm), ardından örnekleri OCT bileşiği içeren bir kriyomolda (7 mm × 7 mm × 5 mm) gömülün.
    NOT: Gerekirse doku yönünü forseps ile ayarlayın.
  5. Üzerine OCT bileşiği ekleyin ve doku örneklerini tamamen kaplayın, ardından OCT gömülü doku bloğunu hemen sıvı azot veya kuru buz üzerine yerleştirerek OCT bileşiğini hızla dondurup katı bir blok oluşturun. Bu hızlı dondurma, yüksek kaliteli kriyoseksiyon elde etmek için gereklidir.
    DIKKAT: Kriyojenik malzemelerle elleri korurken elleri korumak için kriyojenik dirençli eldivenler giyin.
  6. OCT gömülü blokları kriyobölüme kadar -80 °C'ye yerleştirin.

2. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu için kriyobölümleme

  1. Polietilen naftalat (PEN) membran slaytlarını 30 dakika UV ışığına maruz bırakın, ardından slaytları 0,1 mg/mL poli-L-lizin ile kaplayın ve ardından hava ile kurutma işlemi yapılır. Sonra, PEN membran sürgüsünün kenarlarını nötr bir montaj ortamı ile kapatın.
    NOT: PEN membran slaytlarının UV ışınlanması ve poli-L-lizin tedavisi, doku örneklerinin PEN membran slaytlarına yapışmasını artırabilir. Çevrenin nötr montaj ortamıyla mühürlenmesi, zarın altında suyun sızmasını veya baloncuk oluşumunu engeller; bu da LCM verimliliğini korumak için kritik öneme sahiptir.
    DIKKAT: Cildi ve gözleri UV ışığından koruyun. UV engelleyici güvenlik gözlüğü veya yüz kalkanı (UV koruması için derecelendirilmiş) takın, ayrıca laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler ve açıkta kalan cildi kapatmak için uzun kollu giyin.
  2. Kriyostatın tüm erişilebilir yüzeylerini ve tüm aletleri RNase dekontaminasyon ajanı ile silin ve fırçayı %75 etanol ile temizleyin.
    DIKKAT: Kullanılmış etanol mendilleri ve çözeltilerini yerel kurumsal çevre sağlığı ve güvenliği protokollerine uygun olarak bertaraf edin.
  3. Cihazın −20 °C'ye ulaşıp stabilizasyonuna izin verin.
  4. Karaciğer örneklerini -80 °C'den alın ve en az 15 dakika boyunca kriostata yerleştirin.
  5. Numune aşamasının yüzeyine ince bir OCT bileşiği tabakası (2-3 mm) uygulayın. Örnek aşamasını hızlı dondurma rafına (veya kriyostat odasına) yerleştirerek OCT tabakasını önceden katı hale getirin.
  6. Numune aşamasındaki önceden katılaşmış OCT tabakasına az miktarda OCT uygulayın. Dengelenmiş doku bloğunu (2.4. adımdan itibaren) alın ve bloğu hemen bu OCT'ye yatay olarak yerleştirin, kısmi donma ve yapışma için 10-15 saniye yerinde tutun. Sabitlendikten sonra, örnek aşamasını (bağlı doku bloğuyla birlikte) kriyostat numune başlığına monte edin.
  7. Bıçağı dikkatlice kriyostatın bir tarafındaki kısma plakaları ile arka plakalar arasına yerleştirin ve ardından sıkıcı kolu sıkıştırın.
  8. Kriyostatın kalınlığını 10 μm'ye ayarlayın.
    NOT: Doku için gerektiği gibi dilim kalınlığını ayarlayın, ancak kalınlığı 5-15μm 19 arasında tutun.
  9. Kesimleri doğrudan önceden işlenmiş PEN membran slaytlarına kesin ve -20 °C sıcaklıkta tutulan kriostat odası içindeki PEN membran slaytlarına monte edin.
    NOT: Her PEN membran slaytı 6-8 doku kesitini barındırabilir. Tüm kesitleme sürecinin 1 saat içinde tamamlanması önerilir. Kesitleme süresinin sınırlandırılması, doku ortam koşullarına maruz kalmayı en aza indirerek, RNA bozulması, doku kurutması ve morfolojik artefaktlar riskini azaltır; bunlar LCM ve sonraki analizler için RNA kalitesini ve histolojik bütünlüğünü korumak açısından kritik öneme sahiptir.

3. Lazerle yakalama mikrodiseksiyonu için hematoksilin boyama

  1. Sürgüleri kullanmadan önce oda sıcaklığında (RT) 20 dakika eritin.
  2. Slaytları RNase-free 1× PBS ile (3 kez, her biri 10 saniye) yıkayın.
  3. Doku slaytlarını filtrelenmiş Mayer'in hematoksilin çözeltisine (1.0 g/L hematoksilin, 0.2 g/L sodyum iyodat, 50 g/L alüminyum amonyum sülfat dodekahidrat, 50 g/L kloral hidrat ve 1.0 g/L sitrik asitten oluşan) 5-10 saniye boyunca daldırın.
    NOT: Hematoksilin çalışma çözeltisini boyamadan önce 0.22 μm şırınga filtre membranından geçirin.
  4. Slaytları RNase içermeyen suyla (3 kez, her biri 10 saniye) yıkayarak kalan hematoksilin çözeltisi çıkarılır.
  5. Boyama kalitesini mikroskop altında değerlendirin.
    NOT: Optimal şekilde boyalı çekirdekler, net bir arka planda net mavi-mor görünmelidir. Yetersiz boyama soluk çekirdekler oluştururken, aşırı boyama hücresel detayları gizler. Yalnızca bu optimal boyama kriterlerini karşılayan slaytlar bir sonraki adıma geçmelidir.
  6. Slaytları emici kağıtla kurutun ve ardından tamamen hava ile kurutma (10-15 dakika).
    NOT: LCM ile devam etmeden önce slaytların tamamen kuruduğundan emin olun. Sonra sürgüleri 50 mL'lik santrifüj tüplerine yerleştirin ve LCM yapılana kadar geçici olarak buzda saklayın.

4. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu

NOT: Her slayt için LCM deneyinin süresi 30 dakika ile 1 saat arasında tutulmalıdır. Tüm LCM deneyinin 4 saat içinde tamamlanması önerilir. Bu sınır, RT'de RNA bozulmasını en aza indirmek ve tüp kapağındaki toplama tamponunun buharlaşmasını önlemek için ayarlanmıştır; bu da verimli örnek alımı için kritik öneme sahiptir. Pratikte, morfolojik olarak tanımlanmış bölgelerden yaklaşık 1.000 hücre hedef verimi 4 saat içinde güvenilir şekilde hasat edilebilir.

  1. Laboratuvar tezgahının yüzeylerini RNase dekontaminasyon ajanı ile silin.
  2. Kontrolciyi açın ve mikroskobun başlatma işlemini tamamlamasına izin verin.
  3. Lazer sistemini başlatmak için anahtarı saat yönünde Kapalı konumdan Açık pozisyona döndürün.
    NOT: Lazer sistemi ısınmak için yaklaşık 10 dakika sürer.
  4. Bilgisayarı açın, LCM yazılımını açın, ardından başlatma sürecinin tamamlanmasını bekleyin.
  5. Toplama cihazına steril bir 0.2 mL PCR tüpü (toplama tüpü) takın.
  6. PCR tüpünün kapağına 10 μL proteinaz K sindirim tamponu ( Materyal Tablosu'na bakınız) ekleyin.
    NOT: Proteinaz K sindirim tamponunun toplam hacmi, tam liz prosedürünün bir parçası olarak bir sonraki adımda (bkz. Adım 5.4.1) 150 μL'ye çıkarılacaktır.
  7. Toplama cihazını mikroskobun örnek tutucusuna yükleyin.
  8. Koleksiyoncu Cihazını Değiştir penceresinde önce Referans Noktasına Taşın butonunu seçin. Sonra, referans noktasının net bir görünümünü sağlamak için kamera odakını ayarlayın. Gerekirse, penceredeki okları kullanarak referans noktasını görüş alanında ortala.
  9. Numune tutucuya bir doku bölümü yükleyin, doku bölümü yüzü aşağı konumlanmış ve etiket sağa doğru konumlandığından emin olun.
  10. 10× objektif merceği seçin, mikroveziküler steatoz gibi belirli patolojik özellikler gösteren ilgi alanlarını belirleyin ve belirleyin (çok sayıda küçük, net sitoplazmik vakuollere ve merkezi konumda bulunan çekirdeklere sahip hepatositlerle karakterizedir). Sonra, Lazer menüsüne gidin ve Kalibrasyon butonuna tıklayın. Ekrandaki mesajı Evet' seçerek onaylayın ve kalibrasyona devam edin.
    NOT: 10× objektif lens mikrodiseksiyon için özel değildir; Diğer büyütme lensleri (örneğin, 20×) örnek netliği ve istenen çözünürlüğe göre seçilebilir.
  11. Lazer kontrol panelinde, kesme parametrelerini şu şekilde ayarlayın: Lazer Gücü = 50, Diyafram (lazer ışını çapı) = 5 ve Hız = 9.
    NOT: Yukarıda listelenen parametre değerleri, bu protokolte kullanılan doku örnekleriyle UV-LCM sistemi için referans olarak hizmet eder. Diğer UV-LCM sistemlerinin kullanıcıları bunları başlangıç noktası olarak değerlendirmeli ve muhtemelen ayarları ampirik olarak ayarlamaları gerekecek. Optimal ayarlar doku tipi, kesit kalınlığı ve diğer LCM sistemlerine göre değişebilir.
  12. Grafik araç çubuğu kullanarak hedef alanın etrafında bir daire çizin. Tek Şekili seçin, LCM yapmak için Başlat Kesim butonuna tıklayın ve ardından diseksiyon edilen dokuyu toplamak için toplama cihazını konumlandırın.
    NOT: Başarılı ayrılma, seçilen alanın ayrılmasıyla gösterilir; genellikle görünür bir boşluk veya parça hareketi vardır. Tutarlılık için, her örneklem için önceden tanımlanmış sayıda benzer büyüklükte bölge toplayın. Hedef alan otomatik ayrılmazsa, fareyi kullanarak örneği manuel olarak kesmek için Move and Cut butonuna tıklayın. Hücre sayısının daha hassas bir tahmini için LCM yazılımı toplam kesim alanını otomatik olarak kaydedebilir. Bu değer, hedef hücrenin ortalama kesit alanına bölünerek yakalanan toplam hücre sayısını yaklaşık olarak elde edebilir.
    DIKKAT: LCM işlemi sırasında, lazer ışınına maruz kalmaktan kaçınmak için doğrudan lazer ışınına bakmayın.
  13. Isteğe bağlı olarak, Dosya menüsünden Görüntüyü Kaydet komutunu seçerek diseksiyon alanının Öncesi ve Sonrası görüntüsünü yakalayabilirsiniz. Diyalog kutusunda, bir konum, dosya adı ve tercih edilen bir formatta (örneğin .tif) kaydetmeyi seçin.
  14. İstenilen hücre sayısını topladıktan sonra, koleksiyoncunu sahneden çıkarmak için Boşaltma düğmesine tıklayın. PCR tüpünü mühürlemeden önce, kapataki proteinaz K sindirim tamponu hacminin 10 μL olarak kaldığını doğrulayın; LCM sırasında buharlaşma gerçekleşirse tamponu yenileyin (bkz. Adım 4.6).
    NOT: Tampona 10 μL eklenmesi, kapağın yüzeyinin tamamen ıslanmasını sağlar; bu da santrifüjleme sırasında mikro-diseksiyon doku pelletinin verimli transferini kolaylaştırır.
  15. Toplama tüplerini iyice girdablandırın.
  16. Toplama tüplerini kısa bir süre döndürün ve örnek tüplerini -80 °C'de RNA çıkarana kadar saklayın.
    NOT: Bir sonraki örnek için 4.5'ten 4.16'ya kadar olan adımları tekrarlayın. Protokol, RNA çıkarımı yapılana kadar duraklatılabilir.

5. Mikro disseksiyon edilen örneklerin toplam RNA ekstraksiyonu

  1. Laboratuvar tezgahının yüzeylerini RNase dekontaminasyon ajanı ile silin.
  2. LCM örneklerini -80 °C dondurucudan buz banyosuna aktarın. Istenirse, aynı yakalanan örneklerden farklı partileri topla.
  3. Mikro disseksiyon edilen örnek tüplerini 42 °C'de 30 dakika boyunca ters çevirin.
    NOT: Bu ters çevirme, kısa santrifüjleme (Adım 4.16) sonra kapağa yapışan dokuların sindirim tamponuna salınmasını sağlar. Bu, hacim ayarından önce ampona maksimum örnek transferini ve Adım 5.4.1'de yüksek hızlı santrifüjasyondan önce sağlar.
  4. LCM örneklerinden sabit dokular için optimize edilmiş standart bir RNA çıkarma kiti kullanarak toplam RNA'yı izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Her örnek tüpündeki hacmi proteinaz K sindirim tamponu ile son 150 μL'ye ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Tüpleri 11.000 × g ( 1 dakika) döndürün, ardından örnekleri steril 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
    2. Her tüp başına 10 μL proteinaz K (20 mg/mL) ekleyin, ardından örnekleri tekrar tekrar pipetle nazikçe karıştırın. Bu, sindirim reaksiyonunda 160 μL nihai hacim ve sindirim reaksiyonunda yaklaşık 1,25 mg/mL nihai proteinaz K konsantrasyonu elde etmesiyle sonuçlanır.
    3. İki aşamalı bir örnek kuluçka işlemi yapın: önce 56 °C'de 15 dakika, ardından 80 °C'de 15 dakika. Her kuluçkada tüpleri her 5 dakikada bir kısa bir girdabla girdirin.
      NOT: En iyi iş akışı için iki önceden ısıtılmış su banyosu kullanın. Tek bir banyo kullanıyorsanız, 56 °C kuluçkadan sonra duraklayın: örnekleri RT'de tutun, banyo 80 °C'ye kadar ısınırken devam edin.
    4. Örnekleri 3 dakika buzun üzerine yerleştirin, ardından 20.000 × g (15 dakika) değerinde santrifüj yapın.
    5. Temizlenmiş süpernatantı yeni bir 1.5 mL tüple aspire edin, pelletten kaçınmaya özen gösterin.
    6. Her örnekle 16 μL DNaz kuluçka tamponu ve 10 μL DNaz I enzimi (2,73 birim/μL, Materyal Tablosu'na bakınız) ekleyin. Sonra, tüpleri nazikçe ters çevirerek içeriği iyice karıştırın. Bu, sindirim reaksiyonunda 186 μL nihai hacmi ve sindirim reaksiyonunda yaklaşık 0,15 birim/μL DNaz I konsantrasyonu elde eder.
    7. Tüp duvarlarından kalan sıvıyı toplamak için hızlı bir dönüş yapın.
    8. Örnek tüplerini RT rejiminde 15 dakika kuluçka edin.
    9. Her numuneye 320 μL yüksek tuzlu yıkama tamponu (bkz. Malzeme Tablosu) aktarın ve örnekleri iyice karıştırın. Bu, örnek başına 506 μL nihai hacim elde etmesini sağlar.
    10. Her tüpte 720 μL mutlak etanol aktarın, örnekleri pipetle karıştırın (santrifüj olmadan) ve hemen devam edin. Bu, örnek başına nihai hacmin 1.226 μL olmasına yol açar.
      DIKKAT: Mutlak etanol son derece yanıcıdır. Atık etanol uygun bertaraf için belirlenmiş halojensiz organik çözücü atık konteynerinde toplanın.
    11. Örnek karışımının 700 μL'sini bir arıtma kolonuna aktarın (2 mL'lik toplama tüpüne yerleştirilir, Malzeme Tablosu'na bakınız). Kapağı nazikçe kapatın ve 8.000 × g (15 s) sıcaklığında santrifüj yapın.
    12. Toplama tüpünün akışını at. Arındırma sütununu koruyun.
    13. 5.4.11'den 5.4.12'ye kadar olan adımları tekrarlayın.
    14. Her örnek tüpüne 500 μL etanol bazlı yıkama tamponu ( Malzemeler Tablosu'na bakınız) ekleyin. Kapakları nazikçe kapatın ve 8.000 × g ( 15 s) seviyesinde santrifüj yapın. Sonra, toplama tüpünün akışını at.
    15. 5.4.14. adımı tamamlayarak tekrarlayın; tek değişiklik ise santrifüj süresini 8.000 × g'de 2 dakikaya çıkarmaktır.
    16. Her arıtma kolonunu yeni bir 2.0 mL tüpe aktarın. 14.000 × g (5 dakika) sıcaklıkta kapağı açık iken santrifüj yapın, ardından tüpü ve kalan sıvıyı atın.
    17. Her arıtma kolonunu yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın. RNase-içermeyen 16 μL suyu membrana pipetleyin, kapağı kapatın ve toplam RNA'nın elütasyonunu kolaylaştırmak için 14.000 × g (5 dakika) seviyesinde santrifüj yapın.
      NOT: Tüm elutlanmış RNA örneklerini bozunmayı önlemek için 5.5 ve 5.6. adımlar için buz üzerinde tutun.
  5. RNA örneklerini nicelikle ölçün ve saflığı (A260/A 280 oranı) spektrotometri ile kontrol edin.
    NOT: Bu adımda konsantrasyon ve saflık ölçümü (A 260/A 280 oranı) ile birlikte Step 5.6'daki bütünlük değerlendirmesi, başarılı RNA geri kazanımı için kesin nicel kontrol noktası olarak hizmet eder. Net bir RNA elüatı bekleniyor.
  6. %1 jel konsantrasyonunda agaroz jel elektroforezi yapılacak ve RNA kalitesini değerlendirmek için bir Biyoanalizör sistemi kullanarak RNA bütünlük sayısını (RIN) belirleyin.
  7. RNA örneklerini -80 °C'de saklayıp qRT-PCR veya RNA-Seq uygulanana kadar.

6. RNA analizi

NOT: qRT-PCR Adım 6.1 ve 6.2'de, RNA-Seq ise Adım 6.3'te tanımlanmıştır.

  1. Ters transkripsiyon reaksiyonu karışımını hazırlayın ve buz üzerinde her reaksiyon için 50 ng toplam RNA ekleyin. Verilen talimatlara göre termal döngücü kullanarak ters transkripsiyon reaksiyonuna devam edin (bkz. Malzemeler Tablosu).
  2. Buz üzerinde, üreticinin talimatlarına göre β-aktin için nicel PCR master karışımı hazırlanın (primer dizileri için Malzeme Tablosu'na bakınız). Üreticinin önerdiği döngü protokolünü kullanarak gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu gerçekleştirin; her reaksiyon başına 10 ng cDNA ile nicel PCR amplifikasyonu yapılın.
  3. Düşük girişli zincirli bir kit kullanarak (bkz. Materyaller Tablosu), toplam RNA'nın 50 ng'sinden RNA-Seq kütüphaneleri oluşturulur. Kütüphane boyutunu ve konsantrasyonunu bir biyoanalizör sistemiyle belirleyin ( bkz. Materyaller Tablosu) ve ardından yüksek verimli bir platformda eşleştirilmiş uçlu dizileme yapın (bkz. Materyal Tablosu).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PFA fiksasyonu, %30 sukroz dehidrasyonu, OCT gömülmesi ve kriyobölümleme, hematoksilin boyama, hedef bölgenin (~1.000 hücre) LCM ile tanımlanması ve hassas toplanması, hücre lizisi, RNA izolasyonu, RNA kalite kontrol metrikleri ve iki temel analitik uygulamayı içeren deneysel iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir. PEN slaytında hematoksilin boyalı karaciğer bölümü, mikroskop altında gösterilmiştir (Şekil 2A) ve sonra (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LCM'nin gücü, seçilmiş hücrelerin veya doku bölgelerinin kesin, yerinde yakalamasında, heterojen bir doku içindeki belirli alanların incelenmesini kolaylaştırmasında yatmaktadır. Ancak düşük örnek verimi, zaman alıcı süreci, yüksek maliyeti ve özel ekipmana olan ihtiyacı, bu tekniğin laboratuvarlarda yaygın uygulamasınısınırlamaktadır 23. Bu çalışmada, LCM-RNA protokolü temel tarihsel sınırlamaları aşmak için kuruldu. Bu protokol, hızlı bir hematoksilin b...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82070589), Guangdong Doğa Bilimleri Vakfı (2022A1515010218) ve Prof. Yan Wang'a verilen Guangzhou Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (206077078001) hibeleriyle desteklendi. Southern Medical University Biyomedikal Araştırma Merkezi'ne teknik destek ve lazer yakalama mikrodiseksiyon sistemine erişim için minnettarız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Malzeme
0.2 ml İnce Duvarlı TüplerAxygenPCR-02-CLCM koleksiyonu için tüpler
1.5 mL santrifüj tüpüAxygen339653
%4 paraformaldehitLeageneDF0135
50 mL santrifüj tüpüThermoFisher Scientific339653
DEPC (dietil pirokarbonat)SigmaD-5758
DNase I sindirim setiQiagen73504RNeasy FFPE Kit'in bir bileşeni, DNase I stok çözeltisi ve DNase Booster Buffer içerir
Etanol (%100)Thermo Fisher ScientificBP2818Moleküler biyoloji için arındırılmış
Etanol bazlı yıkama tamponuQiagen73504Buffer RPE (RNeasy FFPE Kit'inin bir bileşeni)
Yüksek tuzlu yıkama tamponuQiagen73504Buffer RBC (RNeasy FFPE Kit'inin bileşeni)
Düşük profilli mikrotom bıçaklarıLeica Biosystems819
Mayer' s hematoksilinLeageneDH0001
OCT bileşiğiSakura4583
PEN membran kaplı sürgüLeica11505188
Fosfat tamponlu tuzlu suLeageneCC0010DNaz/RNase-free
Poli-L-lizinMacklinP875131S
proteinaz K sindirim tamponuQiagen73504Buffer PKD (RNeasy FFPE Kit'inin bileşeni)
Arındırma sütunuQiagen73504RNeasy MinElute spin sütunu (RNeasy FFPE Kit'in bir bileşeni)
Nicel PCR master karışımıTakara BiyografisiRR820ATB yeşil premix ex taq II (Tli RNaseH Plus)
Ters transkripsiyon kitiQiagen205411QuantiNova Ters Transkripsiyon Kiti
RNA çıkarma kitiQiagen73504RNeasy FFPE Kiti
RNA Dizileme Kiti (Düşük Girişli, Zincirli)Takara Biyografisi634412SMARTer zincirli total RNA-seq kiti - pico input mammalian v2
RNase dekontaminasyon ajanıSolarbioSR0040Temizlik
SucroseMacklinS818049
Hayvanlar ve Diyet
Fare: C57BL/6JGuangdong Eyaleti Laboratuvar Hayvan Merkezi03
özel diyet ve içme susu
Yüksek yağlı, kolin eksikliği içeren diyet (Baz diyet)TROPHIC Hayvan Yemi Yüksek Teknoloji Şirketi, Ltd.TP36310MMakro besinler: protein, %14 kcal; karbonhidratlar %26 kcal; yağ, %60 kcal)
Şeker takviyeli içme suyuMacklinKayıtsız (kendi kurum içinde hazırlanıyor)D-glukoz (Macklin, Cat# F87500) ve D-fruktoz (Macklin, Cat# S818049) karışımı, otoklavlanmış içme suyuna son konsantrasyon 42 g/L ile eklendi ve glikoz-fruktoz oranı 55:45 (w/w) idi
Fare Primerleri
β-actin (İleri: AGAGGGAAATCGTGCGTGAC )BGI DizilemesiÖzelleştirilmişHPLC arındırılmış
β-actin (Tersine: CAATAGTGATGACCTGGCCGT)BGI DizilemesiÖzelleştirilmişHPLC arındırılmış
Ekipman
Kriyostat mikrotomuLeica BiosystemsCM3050 S
Biyoanalizör sistemiÇevikG2939BA
Yüksek verimli dizileme platformuIllumina; Inc.NovaSeq 6000 sistemi
Lazer Yakalama Mikrodiseksiyon sistemiLeica MicrosystemsLeica LMD6500
Nicel PCR sistemiUygulamalı BiyosistemlerQuantStudio 5 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi
SpektrofotometreThermoFisher ScientificNP80NanoDrop
Termal DöngücüBioRadT100
Software
Adobe Illustrator CC 2019 (sürüm 23.0.2)Adobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad Prism (sürüm 8.3.0)GraphPad Yazılımıhttps://www.graphpad.com

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  2. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 543 (7647), 352-356 (2017).
  3. Aizarani, N., et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  4. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  5. Baron, C. S., et al. Cell Type Purification by Single-Cell Transcriptome-Trained Sorting. Cell. 179 (2), 527-542.e19 (2019).
  6. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  7. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  8. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  9. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  10. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).
  11. Baba, N., et al. Gene expression profiling in biliary epithelial cells of primary biliary cirrhosis using laser capture microdissection and cDNA microarray. Transl Res. 148 (3), 103-113 (2006).
  12. Mena, J. E. T., et al. Laser capture microdissection after γ-glutamyl transferase histochemistry: An optimization for gene expression analysis. Anal Biochem. 447, 126-132 (2014).
  13. Liu, Y., et al. Next-generation RNA Sequencing of Archival Formalin-fixed Paraffin-embedded Urothelial Bladder Cancer. Eur Urol. 66 (6), 982-986 (2014).
  14. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Arch. 460 (2), 131-140 (2012).
  15. Mägel, L., Bartels, S., Lehmann, U. Next-Generation Sequencing Analysis of Laser-Microdissected Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue Specimens. Methods Mol Biol. 1723, 111-118 (2018).
  16. Von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA Quality from FFPE Samples. PLoS One. 2 (12), e1261(2007).
  17. Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. Am J Pathol. 151 (1), 63-67 (1997).
  18. Schütze, K., et al. Cut out or poke in--the key to the world of single genes: laser micromanipulation as a valuable tool on the look-out for the origin of disease. Genet Anal. 14 (1), 1-8 (1997).
  19. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histol Histopathol. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  20. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565(2010).
  21. Ge, S. J., Gan, W. Q., Karlinsey, K., Zhou, B. Y., Pachter, J. S. Immuno-laser capture microdissection of perfusion-fixed mouse brain tissue coupled to RNA-seq. J Neurosci Methods. 423, 110548(2025).
  22. Takahashi, K., Beltran, W. A., Sudharsan, R. An optimized workflow for transcriptomic analysis from archival paraformaldehyde-fixed retinal tissues collected by laser capture microdissection. Exp Eye Res. 246, 109989(2024).
  23. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods Mol Biol. 1723, 1-17 (2018).
  24. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Converg. 4 (1), (2017).
  25. Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nat Protoc. 4 (6), 902-922 (2009).
  26. Pan, D. Y., et al. Laser Capture Microdissection-Based RNA Microsequencing Reveals Optic Nerve Crush-Related Early mRNA Alterations in Retinal Ganglion Cell Layer. Transl Vis Sci Technol. 9 (11), 30(2020).
  27. Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482(2019).
  28. Phan, H. V., et al. High-throughput RNA sequencing of paraformaldehyde-fixed single cells. Nat Commun. 12 (1), 5636(2021).
  29. Thomsen, E. R., et al. Fixed single-cell transcriptomic characterization of human radial glial diversity. Nat Methods. 13 (1), 87-93 (2016).
  30. Lin, X. J., et al. A comparative analysis of RNA sequencing methods with ribosome RNA depletion for degraded and low-input total RNA from formalin-fixed and paraffin-embedded samples. Bmc Genomics. 20 (1), 831(2019).
  31. Luzzi, V., Mahadevappa, M., Raja, R., Warrington, J. A., Watson, M. A. Accurate and reproducible gene expression profiles from laser capture microdissection, transcript amplification, and high density oligonucleotide microarray analysis. J Mol Diagn. 5 (1), 9-14 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionParaformaldehyde Fixed TissueMouse Liver TissueRNA ExtractionCryosectioningHematoxylin StainingOCT EmbeddingRNA SequencingHepatocyte ProfilingReal Time PCR

Related Articles