$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Roma marulunda (Lactuca sativa L. var. Paspartu) su stresi toleransını artırmadaki mikrobiyal aşılamaların etkinliğini değerlendirmek için deneysel iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir. Protokol, kesin sulama rejimlerinin sürekli izlenmesini periyodik fizyolojik ve termal verilerin toplanmasıyla birleştirdi. İki ayrı mikrobiyal ürün kullanıldı: (I) PGPR, aktinomisetler ve faydalı mantarlardan oluşan 67 suştan oluşan karmaşık bir konsorsiyum, kök kolonizasyonu ve ekzopolisakkarit (EPS) salgılanması yoluyla fizyolojik tampon görevi için tasarlanmış; ve (II) Trichoderma harzianum, sistemik direnç yaratmayı ve kök mimarisini değiştirmeyi amaçlayan tek suşlu bir inokulanttır. Kullanılan reaktifler, ekipman ve yazılımlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Mikrobiyal aşılama
Her iki mikrobiyal tedavi için de standartlaştırılmış bir aşılama rejimi uygulandı; bu uygulama, rizosferi hedef alan ve yüksek hassasiyetli mikropipetlerle sahada ölçekli dozajları simüle etmek için altı toprakla ıslatılmış uygulamadan oluştu. İlk aşama, ekimden 5 ve 15 gün sonra fide aşamasında gerçekleşmiştir (DAS). 30 DAS'ta, fideler daha büyük boşluk tepsilerine dikildi, ikinci aşı aşaması ekimden 1 gün sonra yapıldı (DAT), ardından ardışık uygulamalar 7, 15 ve 20 DAT'ta yapıldı.
Mikrobiyal konsorsiyum için dozajlar bitki fenolojisine göre ayarlandı: İlk iki uygulama 500 g/ha (3 mL/bitki) uygulandı, ardından nakil sırasında 2 kg/ha yüksek konsantrasyonlu doz uygulandı ve sona eren üç bakım dozu olan 300 g/ha oldu. Benzer şekilde, T. harzianum ilk iki aşamada 1 L/ha, naklette 3 L/ha ve son üç uygulamada 1 L/ha olarak uygulanmıştır. Bu aşamalı yaklaşım, sağlam kök kolonizasyonunu sağlamak ve mikrobiyal popülasyonun kritik büyüme ve stres-indüksiyon dönemleri boyunca fizyolojik bir tampon rolünü korumak için tasarlanmıştır.
2. Ürün hazırlığı
Sertifikalı Roma marul tohumları (Lactuca sativa L. var. Paspartu), 1 cm derinlikte profesyonel seviyede turba yosunu bazlı bir alt yüzey kullanılarak 311 boşluklu polistirol tepsilerde (boşluk başına 11 mL) çimlendirilmiştir. Çimlenme, 15 °C ile 22 °C arasında sıcaklık aralığında ve %60–%70 arasında göreli nemde tutulan kontrollü biyoklimatik bir odada gerçekleştirildi. %90 çimlenmeye ulaştıktan sonra (ekimden yaklaşık 3–5 gün sonra), fideler 55 mL kök topu kapasitesine sahip daha büyük tepsilere dikilir ve böylece kök gelişimi sınırsız olur (Şekil 2 ve Şekil 3). Deneme, tamamen rastgele bir tasarımda (CRD) organize edildi; 9 deneysel birim (tepsi) ve her tepside 20 fide vardı. Bu düzen, 3 × 3 faktöriyel düzeni (3 mikrobiyal tedavi × 3 sulama rejimi) barındıracak şekilde yapılandırılmıştır. Ayrıntılı substrat fiziksel-kimyasal özellikleri ve spesifik biyoklimatik odaprogramlaması 14, Şekil 3, Ek Tablo 1, Ek Tablo 2 ve Ek Tablo 3'te sunulmaktadır.
Deneysel tepsiler, kenar etkilerini ortadan kaldırmak ve eşit bir maruziyet sağlamak için biyoklimatik odada tamamen rastgele bir düzenle dağıtıldı. Oda, açık alan termal stresini taklit etmek için yüksek sıcaklık rejimi kullanarak dinamik alan benzeri koşulları simüle etmek üzere programlanmıştır. Vejetatif aşamada, çevresel parametreler değişken bir göreli nem aralığında tutuldu ve yüksek yoğunluklu LED aydınlatma ile (yeterli fotosentetik aktif radyasyon sağlamak için maksimum kapasitenin %50'sinin üzerine ayarlanmış) 9 saatlik bir fotoperiyot sağlandı.15. Kuruluş aşamasından sonra, çevresel program, kademeli atmosferikgeçişler 15'te gösterildiği gibi, su açığı arıtmalarının artan gereksinimlerini yansıtacak şekilde ayarlanmıştır (Şekil 4 ve Şekil 5). Sıcaklık, nem ve ışık yoğunluğu için gündüz/gece için özel ayar noktaları, ana protokolü kolaylaştırmak için Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2'de detaylandırılmıştır.
Döllenme stratejisi, Roma marulunun spesifik fenolojik gereksinimlerini karşılamak ve vejetatif döngü boyunca dengeli besin akışını korumak üzere tasarlanmıştır. Fide aşamasında (12 ila 24 DAS), besinler Potasyum Nitrat (KNO3), Monopotasyum Fosfat (KH2PO4) ve Kalsiyum Nitrat (Ca(NO3)2) hedefli uygulamalarıyla sağlandı. Erken oluşumu artırmak için, ilk 24 gün boyunca ticari bir biyostimulyator takviyeedildi 16.
26 DAS'tan 76 DAS'taki nihai değerlendirmeye kadar, güreleme programı, mikrobiyal aşıların spesifik etkilerini izole etmek için biyostimulyatanın eliminasyonla yapılan bir bakım rejimine geçti. Tüm uygulamalar, rizosfer içinde optimal elektrik iletkenliğini (EC) ve pH'ı korumak için kalibre edilmiştir. Mineral konsantrasyonlarının ve spesifik dozlamahacimlerinin tam kronolojik çizelgesi 16, Ek Tablo 3'te detaylandırılmıştır.
3. Mikroorganizmalarla tedavi
Biyolojik müdahalelerin hidruk strese karşı etkinliğini değerlendirmek için üç farklı tedavi oluşturuldu: (I) Bitki Büyümesini Teşvik Eden Rizobakteriler (PGPR), Aktinomisetler ve mantarlar dahil olmak üzere 67 faydalı suştan oluşan yüksek çeşitlilikli mikrobiyal konsorsiyum; (II) Trichoderma harzianum'un özel tek suşlu formülasyonu T. harzianum; ve (III) aşılanmamış bir Control. Bu tedaviler, öncelikle kök mimarisi modifikasyonu, ACC-deaminaz üretimi ve ekzopolisakkarit (EPS) salgılanması gibi mekanizmalar aracılığıyla İndüklenmiş Sistemik Tolerans (IST) potansiyellerine göre seçilmiştir.
Aşılama aşamalı stratejik bir yaklaşımla izlendi. İlk uygulama (bitki başına 3 mL) ikinci gerçek yaprak aşamasında yüksek hassasiyetli mikropipet ile doğrudan rizosfere yapıldı ve erken kök kolonizasyonu sağlandı. Sonraki uygulamalar ise saha ölçekli eşdeğerlere kalibre edildi (75.000 bitki yoğunluğu simüle edilerek) her hektar denkliğinde. T. harzianum için 2 l/ha konsantrasyon uygulanırken, mikrobiyal konsorsiyum 1 kg/ha uygulandı. Bu formülasyonlar sulama suyunda çözünür ve vejetatif döngü boyunca stabil bir mikrobiyal popülasyonu fizyolojik tampon olarak korumak için her 15 günde biruygulanır.
4. Farklı sulama tedavileri
L. sativa'nın fizyolojik ve agronomik plastisitesini değişken hidrasyon koşullarında değerlendirmek için, ürün buharlaştırma (ETc) yerine koyulmaya dayalı üç sulama rejimi uygulandı. Hacimsel su içeriği, hassas gerilme indüksiyonu sağlamak için substratın alan kapasitesine (FC) göre kalibre edilmiştir. Rejimler şu şekilde tanımlandı: (I) Kontrol/İyi sulanmış (CC-%100 ETc), tam evapotranspirasyonun yenilendiği; (II) Orta Su Açığı (%75 ETc), ara hidrolik sınırlamayı tetiklemek için tasarlanmıştır; ve (III) Ciddi Su Açığı (%50 ETc), kritik su stresi yaratmayı amaçlamaktadır. Sulama işlemleri, kademeli pipetlerle termal görüntüler alındıktan sonra günlük olarak uygulandı; böylece buharlaştırma yoluyla kaybedilen suyun hacminin doğru şekildedeğiştirilmesini sağladı18.
5. Veri ve görüntü kaydı
Santrallerin termal dağılımı ve su durumunu değerlendirmek için, deney dönemi boyunca Pazartesi'den Cuma'ya kadar her gün kızılötesi termal görüntüler alındı. Tüm fotoğraf kayıtları, maksimum transpirasyon ve güneş yoğunluğu döneminde ölçümleri standartlaştırmak için 12:00 ile 14:00 arasında gerçekleştirilmiştir. Bu görüntüleri, bitkilerin önceki 24 saatlik döngüde yaşadığı kümülatif su stresini kaydetmek için günlük sulama işlemlerinden hemen önce almak çok önemlidir. Görüntü almak için kızılötesi termal kamera mobil bir cihaza bağlanmış ve marul bitkilerinin arkasına göre 60–70 cm mesafede dik bir konum sağlamıştır. Yazılım, sıcaklık gradyanlarının en düşükten en yükseğe doğru temsil edildiği çok renkli termal paletle yapılandırıldı: mordan (en soğuk) başlayıp kraliyet mavisi, turkuaz, yeşil (orta nokta), sarı, turuncu ve son olarak kırmızıya (en sıcak) geçiş yapıyordu. Yazılım arayüzünde, tesis örtüsünü içeren özel tepsi alanı termal verileri yakalamak için manuel olarak seçiliyordu. Bu renk skalası, fizyolojik bir gösterge olarak hizmet verir: iyi nemlendirilmiş bitkiler, aktif transpirasyon nedeniyle daha serin örtük sıcaklıkları (mor/mavi) gösterirken, kurutulmuş bitkiler stomatal kapanma ve azalmış evaporatif soğuma nedeniyle daha yüksek örtük sıcaklıkları (turuncu/kırmızı) gösterir. Daha sonra, bu yüksek çözünürlüklü görüntüler, belirli ilgi alanları üzerinde üç noktalı ölçüm fonksiyonu (ROI) kullanılarak Ürün Su Stres Endeksi (CWSI) hesaplaması için kesin örtü sıcaklığı (Tc) değerleri elde edilerek işlendi.
Eğer CWSI ise:
0, o zaman ürün su stresi altında değildir
1 o zaman ürün ciddi su stresi altındadır
Burada:
Tc , kızılötesi görüntüleme ile ölçülen tarım örtüsünün sıcaklığıdır. Tw, su stresi olmayan koşullarda kanopinin sıcaklığıdır. Td , maksimum su stresi koşullarında tendirsıcaklığı 19.
Bitki büyümesi, gelişimi ve fizyolojik durum göstergeleri, örneğin yükseklik, yaprak sayısı ve yaprak sıcaklığı gibi kızılötesi termografiyle değerlendirilmiş, deneyde kullanılan çalışma değişkenleri ve kavramsal ve operasyonel tanımlarla birlikte Ek Tablo 4'te gösterilmiştir. Bu değişkenlerin birleşimi, deneysel tedavilerin her bitkinin fizyolojik performansı ve gelişimi üzerindeki etkisinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağladı.
6. Veri analizi
Fizyolojik ve morfolojik veriler, her sulama rejimi için Tek Yönlü ANOVA kullanılarak analiz edilerek farklı mikrobiyal işlemlerin etkisini belirledi. Tüm istatistiksel işlemler istatistiksel yazılım kullanılarak gerçekleştirildi. Çıkarımsal analiz yapılmadan önce, sonuçların güvenilirliğini sağlamak için parametrik istatistiklerin temel gereksinimleri doğrulandı. Kalıntıların normalliği Anderson-Darling testi ile doğrulandı (p > 0.100), bu da normalliği gösterdi. Ayrıca, varyansların homojenliği Levene testi (p = 0.989) kullanılarak doğrulandı ve gruplar arasında yüksek homoskedastisite doğrulandı. Her iki varsayım da karşılandığı için, Tedavi ortalamaları arasında anlamlı farkları (p < 0.05) belirlemek için Tukey HSD (Honestly Significant Difference) sonrası testi kullanıldı. Bireysel tesis, tüm istatistiksel değerlendirmeler için deneysel birim olarak tanımlanmıştır.
