Method Article

Pamuk Yaprak ve Bracteal Nektarlarının Dijital Mikroskopi Kullanılarak Puanlama Doğruluğunu ve Veri Korunmasını Artırmak İçin Görselleştirme

DOI:

10.3791/69832

⸱

February 6th, 2026

 , 
1Crop Genetics Research Unit, Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, pamuk bitkilerinde yaprak ve bracteal nektarların fenotiplenmesi için dijital mikroskopi ile oluşturulan görüntülerle adım adım süreçleri gösteriyoruz. Bu, pamuk yapraklarının ve braktlarının nektarlarını ölçmek için etkili bir yöntemdir; çünkü bilgiler dijital görüntüler şeklinde toplanıp korunabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nektarlar, birçok bitki türünde bulunan ayrı nektar üreten bezlerdir. Nektarlar çeşitli yapılar ve işlevler sergiler. Pamukta, geleneksel nekter özelliğin puanlanması hata yapmaya yatkın, güvenilmez ve bu özelliğin fenotipleri genellikle çıplak gözle görülemediği için sınırlamaları vardır. Nekter özellik ifadeleri genler, Ne1 ve/veya Ne2 tarafından kontrol edilir.Ayrıca, özellik ifadesi çevre ve büyüme aşamalarından etkilenebilir, bu da doğru puanlama yöntemlerinin gerekliliğini vurgular. Özellikle, dijital görüntülerle fenotipik puanlama, nektarların daha doğru bir puanlama yöntemi ortaya çıkarır. Bu yöntem, geleneksel puanlama sınırlamalarını aşarak yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir. Ayrıca, bu dijital görüntüleri gelecekte referans için korurken, nekter özellik ifadesinin ince farklılıklarının tanımlanmasını ve ayırt edilmesini kolaylaştırır. Burada tanımlanan bu fenotipleme puanlama yöntemi, bezler, tüyler ve renk gibi diğer bitki özelliklerini puanlamak için kolayca uyarlanabilir. Bu puanlama yöntemleri diğer bitki türlerine göre uyarlanabilir. Bu makalede, sahadan veya seradan örnekler nasıl toplanacağına, dijital mikroskopi ile gözlemlenecek şekilde disseksiye edileceğine ve bu görüntülerin gelecekteki puanlama analizi için nasıl korunacağına dair adım adım prosedürü açıklıyoruz. Bu yöntem için, örneğin pamuk bitkilerinin yaprak ve bracteal örneklerinin puanlanmasını kullanarak nektarların (tam gelişmiş, indirgenmiş ve kalıntı) varlığını ve nektarların yokluğunu ayırt edeceğiz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitkiler, çoğu angiospermde, bazı eğrelti otlarında ve bazı gymnospermlerde nektar üreten ve sentezleyen nektar olan nektarlar adı verilenözel bezlere sahiptir 1,2,3,4. Nektarlar, nektar5 üreten hücrelerin kökenine göre mezofiller, trikomatik ve epitel tipleri olmak üzere üç tipe ayrılır. Pamuktaki nektarlar, papillalar olarak bilinen bezler trikomlardan oluşan modifiye stomalardır ve trikomatiktip 5,6 olarak sınıflandırılır. Gossypium türlerinin çoğunun nektarları vardır; ancak bu cinste bulunan nektarların sayısı türdentüre 7 farklılık gösterir. Çiçeksel nektarlar (FN'ler), bitkilerde ekstrafloral nektarlardan (EFN) daha yaygındır8. Bu nektarlar,kökler 1,2 hariç bitkinin herhangi bir yerinde bulunabilir. Örneğin, Gossypium hirsutum hem çiçeksel hem de ekstrafloral nektarlargösterir 9. Ev pamuk bitkilerinde üç ekstra çiçekli ve bir çiçeklinektar 10 bulunur. Üç ekstra çiçekli nektar yapraklı, bracteal ve circumbractealnektarlar 11'dir. Yaprak nektarı vejetatiftir ve genellikle orta kaburganın alt tarafındaki yapraklarda bulunur; bracteal ve circumbracteal nektarlar ise üremeklidir ve bract tabanında ve abaksial çanaks yüzeyinde gelişir. Çiçek nektarı, çanaksın adaksiyal (üst) yüzeyinde gelişen bir çiçekle ilişkilidir. Bu nekter özellik, tek bir genlokusu 12 tarafından kontrol edilir. İki bağımsız araştırma grubunun çalışmaları, nekter özelliğin A genomunun Ne1 veya D genomunun Ne2 genleri tarafından kontrol edildiğini ve sırasıyla 12,13 kromozomlarına eşlenmiş olarak A genomunun Ne1 veya Ne2 tarafından kontrol edildiğini ortaya koydu. Bu özellik yalnızca çift çekinik bir durumda ifade edilir; bu da sadece homozigot çekinik bir durumun nektarissiz özelliği ifade edebileceği anlamına gelir.

Bu genlere ek olarak, çevresel koşullar ve büyüme aşamaları da ifade derecesinin kontrolünde rol oynar. Bu nedenle, bu özelliği puanlamak için doğru bir yöntem olması gerekir. Mevcut çalışma, pamukta yaprak ve bracteal nektarların fenotiplenmesine odaklanmaktadır. Görünür nektar üreten nektarlara sahip bitkiler nektarlı olarak puanlanırken, bu özelliğe sahip olmayan bitkilernektarisizler 1,2,3,4 olarak puanlanır. Bu makalenin ana amacı, dijital mikroskopi teknolojisi kullanarak nektar özelliğin doğru puanlama yöntemlerini sunmaktır. Geleneksel olarak doğrudan görsel gözlemle puanlama, nekter özelliğin in situ ile yerinde ifade farklılıklarını çıplak gözle kolayca tespit edemez. Nekter özellik ifadelerindeki bu ince farklılıklar dijital mikroskopi kullanılarak görselleştirilebilir. Örneğin, pamuk yaprağı nektarında, puanlama rubrikası standart 1-4 ölçeğini takip eder; burada 1 nektar yok, 2 damar fenotipinde bir çıkıntı, 3 nektarsız gelişmemiş pedler veya çıkıntılar ve 4 tam şekilli/tam nektarları temsil eder13. Bu fenotip puanlama, yaprak nektarlarının dijital görüntüleri kullanılarak oluşturuldu [yaprak orta kaburgunun abaksial (alt) tarafının dijital görüntüleri kullanılarak]. Genel olarak, nektarların yokluğu 0 olarak puanlanır, ancak istatistiksel anlamlılık için 0 değeri kullanılamaz ve 1 değeriyle değiştirilemez. Bu nedenle, fenotipleme puanlama aralığı standart 0-413 sınıflandırmasından 1-4'e değiştirildi. Çiçekler için puanlama rubriki de benzer bir 1-4 puanlama desenini takip eder; burada 1, nektarsız, ped veya çıkıntısız belirgin bezleri temsil eder; 2 nektarların sadece ince ped işaretleri olan ve nektarı olmayan gizlenmiş bezleri temsil eder; 3 zayıf şekilli çıkıntıları ve/veya pedleri olan kötü oluşmuş bezleri ve 4 tam forma olmuş nektarları temsil eder. Bu puanlama deseninde nektariyeli fenotipler (genlerden biri için homozigot/heterozigot baskın) 4, heterozigot gibi nekter özelliğin farklı ifadesi için 3, 2 ve nektarissiz (her iki gen için homozigot resesif) için 1 göstermektedir.

Benzer şekilde, çiçekler bu makalede adım adım açıklandığı şekilde toplanır ve parçalanır; böylece bracteal nektarların puanlanması için dijital görüntüler toplanır. Bu fenotip, dijital görüntüler şeklinde depolanabilen doğru puanlama için mikroskopla görselleştirilebilir. Pamukta, nektar özellikler sadece tozlayıcıları çekmekle kalmaz, aynı zamanda verim kaybına neden olan zararlıları da çeker14. Bu sorunu çözmek için, yetiştiriciler, kimyasal pestisit kullanmadan doğal olarak zararlıları kontrol etmek için nektarları (nektarsız) olmayan bitkileri seçti9,15. Nektarisz özellik başlangıçta Gossypium tomentosum to Gossypium hirsutum (yetiştirilen Upland pamuğu)8. Bu puanlama yöntemi, özellikle nektarı ebeveynlerin nektarissiz ebeveynlerle çaprazlanmasıyla oluşan popülasyonlarda nektarissiz özellik ayrımını belirlemek için faydalıdır. Bu farklı ebeveynlerin karışımı sonucunda, F2 (İkinci Övlad Nesil) farklı genotipler gösterir: homozigot nektariyeli, heterozigot nektarlı ve homozigot nektarisiz. Nekter özellik ifadesi için yalnızca bir baskın gen gereklidir; bu da 15:1 (9:3:3:1) ayrımcılık oranını takip eder. Dolayısıyla, 16'da 1, genotipli homozigot çekinik durumda nektarissiz özelliği ifade eder ne1ne1ne2ne2. Ancak, yetiştirme programlarındaki araştırmacılar, beklenen oran olan 16'da 1'den daha fazla nektarsız çizgi gözlemlemiştir. Bu, nekter özelliğin, genler şu şekilde ifade edildiğinde ifade edilir Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2. Homozigot nektarik popülasyonlarda nekter özellik ifadesinin çeşitli desenleri (Ne1Ne1Ne2Ne2), heterozigot nektarik (Ne1ne1Ne2ne2), ve homozigot nektarsız (ne1ne1ne2ne2) bitkiler, dijital görüntülerde görselleştirilen değişiklikler tespit edilerek mükemmel şekilde puanlanabilir12,13. Nektarı azalmış heterozigot bitkiler görsel olarak nektaris özellik göstermeyebilir ve nektarı olmayan nektarisz özelliğine benzeyebilir, bu yüzden görsel fenotipleme bu özelliğin güvenilir seçiminde zorluklar yaratır. Bu sorunlar, belirli pamuk çeşitlerinde nektarların bulunmadığı geç büyüme döneminde daha da artıyor. Heterozigot bitkiler ile homozigot nektarisizler arasındaki farklar dijital görüntülemeyle kolayca tespit edilebilir; çünkü heterozigot bitkiler küçük veya azalmış nektarlar gösterebilirken, homozigot bitkiler bu özelliği tamamen yoksundur. Fenotipik olarak, nektarın varlığı nektarize (en az bir baskın gen içeren homozigot/heterozigot), küçük veya kalıntı nektarların heterozigot olarak bulunması ve nektarların homozigot nektarisz bitkiler olarak yokluğu olarak sınıflandırılır. Dijital görüntü puanlama, heterozigot bitkilerin nektarisiz bitkiler olarak yanlış puanlanmasını azalttı. Benzer şekilde, maksimum özellik ifadesi olduğunda orta çiçeklenme aşaması tercih edilir. Bu nedenle, nekter özelliklerin doğru ve güvenilir şekilde puanlanması için bu fenotipleme puanlama deneylerini gerçekleştirmek amacıyla bu aşamada yaprak ve çiçek örnekleri toplanmıştır. Ayrıca, dijital mikroskopi kullanılarak nekter özelliklerin görselleştirilmesi, nekter özellikleri olmayan popülasyonların yanlış pozitiflerini önler/azaltır. Nektarik özelliğin bu fenotipik puanlaması, ayrıca nektarisizlerin belirtici destekli seçimi (MAS) için kullanabileceği nektarissiz özellikle ilişkili DNA belirteçlerini belirlemek için haritalama çalışmalarında da kullanılmaktadır13. Bu puanlama tekniği, bezler, tüyler ve renk gibi diğer özelliklerin incelenmesinin yanı sıra diğer bitki türlerine de uygulanabilir. Genel olarak, dijital görüntü puanlama, yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlayarak yanlış nekter özellik puanlama sorununu çözmekle kalmaz, aynı zamanda ince ifade değişikliklerini de tespit eder ve dijital görüntüleri gelecekte kullanmak üzere saklar. Nektarsız özellikli pamuk, zararlıların biyokontrolünde ve bu özelliğin faydalı böcek etkileşimlerini nasıl teşvik ettiğine dair araştırma sorularını yanıtlamak için kullanılabilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Yaprakların sera/tarla örneklemesi (Şekil 1)

  1. Örnek kimliklerle zip-lock çantaları hazırlayın. Numune poşetlerini kullanana kadar oda sıcaklığında sakla.
  2. Soğutucunu numune toplamadan bir gün önce buzdolabına koyun. Soğutucunun dibine dondurucudan bir buz paketi yerleştirin. Soğutucudaki buz paketinin üzerine plastik bir tepsi koyun.
    NOT: Bu amaçla herhangi bir taşınabilir soğutucu kullanılabilir. Buz paketini soğutucuda yerleştirin ve ardından plastik bir tepsi (bu ayrım, numunenin buzla doğrudan temas etmesiyle oluşan donma hasarını önler) ve ardından soğutucuyu numune toplama yerine taşıyabilirsiniz.
  3. Numune toplamak için soğutucu ve etiketli zip lock poşetlerini sera/tarlaya taşıyın. Saha bitkileri için haşere içermeyen örnekler toplamak için düzenli spreyler planlandı. Benzer şekilde, sera bitkileri için sağlıklı bitkiler için düzenli sprey ve gübre programları uygulandı.
  4. 8 ila 12 haftalık bir sera veya tarlada yetiştirilen pamuk bitkisinden genç yaprak dokusunu etiketli örnek torbalarında toplayın.
    1. Seçme için orta çiçeklenme aşamasını seçin, çünkü bu aşamada nektar özelliğin en yüksek ifadesi vardır. Bu gelişim aşamasında tüm bitkilerden genç yapraklar seçin. Genetik ve çevresel etkiye ek olarak, nektar özellik gelişim aşamasından da etkilenir.
    2. F2 popülasyonundaki farklı genotipler için karşılaştırma için gelişim aşamasını sabit tutmak için, bir aşamada yaprak örnekleri eşit şekilde toplayarak karşılaştırmayı bu aşamayla sınırlayın. 5 ila 7 cm arasındaki yaprak boyutunu ölçü çubuğu olarak kullanın, ancak tüm örneklerden aynı boyuttaki genç yapraklar toplanabilir. Eski yapraklar nekter özellik ifadesi gösterir, ancak bazı satırlarda nektar özellik gelişimin ilerleyen aşamalarında ifade edilmez. Bu varyasyonu önlemek ve veri toplama tutarlılığını artırmak için, örnekler toplarken bu talimatları takip edin.
  5. Örnek yaprak dokusunu topla ve ilgili örnek torbasına yerleştir. Her bitki örneği için en az 2 yaprak toplayın.
  6. Yaprak dokusu için, bitkinin üst dalından yaprak bıçağının 5 ila 7 cm boyunca sağlıklı yapraklar seçin.
    NOT: Tüm örnekler için üst dallarda bulunan genç yapraklar tercih edilir. Bu tür örnek toplama, sadece belirli bir gelişim aşamasına sınır getirmekle kalmaz, aynı zamanda örnek türünü sabit tutarak fenotiplemedeki hataları azaltır. Diğer parametreler arasında kolay erişim ve sağlıklı yapraklar bulunur. Aynı gelişim aşamasından birkaç bitki yaprağı toplandığında, popülasyondaki genotip temelli fenotipik farklılıklar belirlendiğinde tutarlı veri karşılaştırması yapılacaktır.
  7. Her mühürlü örnek poşetini yaprak dokusuyla birlikte soğutucuda yerleştirin. Soğutucuyu laboratuvara taşıyın.
  8. Bireysel örnekleri 4 °C soğutma koşullarını korumak için buzdolabına aktarın. Numuneleri buzdolabında saklayıp nektarın dijital görüntülemesine kadar kullanın. Yapraklar dijital görüntüleme için 2 güne kadar saklanabilir, ancak aynı gün veya ertesi gün çekilmek tercih edilir.
  9. Çok sayıda yaprak örneğinin taraması için, örnekleri toplu olarak toplayarak hasat yaptıktan sonraki 1 gün içinde görüntüleme tamamlanır. Doku hasarını veya dokunun bükülmesini önlemek için 10-20 kişilik gruplar halinde örnekler topla veya birden fazla soğutucu kullanın. İyi dijital görüntüler için örnek toplamada özen gösterilmelidir.

2. Sera/tarla çiçek örnekleri (Şekil 1)

  1. 1.1'den 1.6'ya kadar olan adımları takip edin. 8 ila 12 haftalık bir seradan veya tarlada yetiştirilen pamuk bitkisinden çiçekleri toplayın. Her bitki örneği için en az 2 çiçek toplayın.
    1. Bitkiler orta çiçeklenme aşamasındayken genellikle üst dallardan çiçekleri toplayın. Nektar özellik, en yüksek ifade orta çiçeklenme aşamasında görülür.
  2. Sağlıklı çiçekleri toplayın. Her mühürlü numune torbasını en az iki çiçekli soğutucuya yerleştirin. Soğutucuyu laboratuvara taşıyın.
  3. Bireysel örnekleri 4 °C soğutma koşullarını korumak için buzdolabına aktarın. Örnekleri buzdolabında saklayıp bracteal nektarların dijital görüntülemesine kadar kullanın.
    1. Numuneleri toplandıktan sonraki gün veya ertesi gün işleyin. Çiçek örnekleri toplayın, 4 °C'de saklanın ve aynı gün bracteal nektarları işleyin. Ertesi gün veya haftanın ilerleyen günlerinde üretilen çiçekleri toplayın ve aynı gün bracteal nektarların dijital görüntülemesi için işlem yapın.

3. Dijital mikroskop ilk kurulumu (Ek Şekil 1)

NOT: Diğer benzer mikroskoplar da görüntüleri dijital olarak yakalamak ve saklamak için kullanılabilir.

  1. Mikroskobu (VHX 600) açın ve ilk adımları tamamlayın. Mikroskop aşamasının boyutuna uygun yarı katlanmış A4 beyaz bir sayfa yerleştirin.
  2. Mikroskop platformunu/sahnesindeki ışığı konsol kontrolcüsündeki küçük ışık düğmeleriyle ayarlayın.
  3. Konsolun düğmesini (konsolda küçük düğme) maksimum ışık için maksimuma ve parlaklık anahtarını (konsolda büyük düğme) konsolun düğmesini 3/4 kadar çevirerek orta yüksekliğe çevirin.
  4. Dahili VHX 600 yazılımı, bilgisayar ekranında lens ayarlama seçeneklerini gösteriyor. Ekranda 10x lens seçeneğini seçerek lensi 10x büyütmeye ayarlayın. Bilgisayarın ön ekranındaki monitör güç düğmesini açın, ana menü açılır; lens ve kayıt görüntü seçenekleri seçeneklerini gösterir.
  5. Buzdolabından az sayıda (3 ila 5) örnek götürerek dijital görüntüleme için soğutucuya alın. Örneklerle birlikte soğutucuyu mikroskobin yanına yerleştirin.
  6. Kesme tahtası ve steril bıçağı tezgahın üzerinde mikroskopa yakın tutun. Soğutucudan bir örnek alın ve dijital görüntülemeye devam etmek için numune dokusunu çıkarın (Şekil 1).

4. Yaprak nektarı dijital görüntüleme ve puanlama (Şekil 2)

  1. 1. ve 3. adımları takip edin. Numune zip kilitli poşeti açın ve yaprak örneğini kesme tahtasına koyun. Yaprak sapını steril bir bıçakla kesin.
    NOT: Bıçakların güvenli kullanımı için eldiven takın ve bıçak keskin kenarlarını parmaklarınızdan uzak tutun; doku parmaklar arasında kesik yaparken konumlandırılsın.
  2. Yaprak dokusunu sahneye yerleştirilen önceden kesilmiş beyaz tabakaya aktarın. Mikroskop aşamasının ortasındaki yaprak dokusunu abaksiyal tarafı yukarı bakacak şekilde çevirin.
  3. Mikroskop düğmelerinin kaba ve ince ayarlarını nazikçe döndürerek yaprağın orta kaburgasına odaklanın. Görüntüde bulanıklık kalmayınca ayarlamaya devam edin.
  4. Nektar orta kaburganın alt ucunda bulunduğundan, orta kaburga ve ayrılan sonraki damarların gözlemlendiği yerde merkezde tutulur. Yaprağı sahnenin odaklı ortasında tutun.
    NOT: Ev pamuklarında sadece bir yaprak nektarı gözlemlenirken, yabani tiplerde orta kaburgada ve orta kaburganın her iki yanındaki her yan damarda olmak üzere üç nektar bulunur (toplam nektarlar :3).
  5. Dijital görüntünün netliğini artırmak için mikroskobun kaba ve ince ayarlarını ayarlayın. Tüm görüntü ayarlarını yaparak yaprağın nektar görüntüsünü yakalayın ve kaydedin.
    1. Dijital görüntüde ışık yansımasını önlemek için tüm ışıkları kapatın ve görüntüyü bilgisayar ekranına kaydedin. Odadaki tüm ışıkları kapatın ve her örneği işlemek için masa lambası kullanın. Tüm adımlar tamamlandıktan sonra, lambayı kapatın ve sadece mikroskop ışığı açık bırakın ve görüntüyü kaydedin.
  6. Program birkaç kaydetme seçeneği gösteren bir pencere gösterdiğinde görüntüyü kaydedin. Görüntüyü (her görseli etiketleyerek) örnekin ID numarasıyla kaydedin. Yaprak nektarı dijital görüntünü, nektarın fenotipine göre 1, 2, 3 ve 4 olarak puanlayın. Her örnek ID için puan tablosunu güncelleyin.

5. Bracteal nektarın dijital görüntülemesi ve puanlaması (Şekil 3)

  1. 2. ve 3. adımları takip edin. Az sayıda çiçek örneği (2-3) görüntü için transfer edin. Çiçek örneğini zip-lock torbasından çıkarın.
  2. Çiçekten braktları penss ile veya elle çıkarın. Çiçeği temiz kesme tahtası üzerine koyun. Çiçeğin sapını steril bir bıçakla kesin. Steril bir bıçak kullanarak çıkarılan bractların kenarında düz bir kesi yapın.
  3. Dokuyu ters (petiole yukarıya bakacak şekilde) mikroskop aşamasına konan önceden kesilmiş beyaz levhanın üzerine yerleştirin.
  4. Ekranda gösterilen görüntünün netliğini artırmak için kaba ve ince ayarlamalar kullanın. Tüm görüntü ayarlamalarını yapın ve konsol kontrolcüsündeki kayıt butonuna tıklayarak yaprak görüntüsünü yakalatın.
    1. Küçük düğme/ışık anahtarını maksimuma ve büyük düğme/parlaklık anahtarını orta yüksekliğe ayarlayarak (düğmeyi 3/4'e çevirerek) görüntü ayarları yapın. Sonra, mikroskobun kaba ve ince ayarlarını döndürerek görüntünün çözünürlüğünü artırın. Bu ayarlamaları sabit tutun ve tüm örnek seti için görüntüler kaydedilene kadar örnekleri değiştirin. Dijital görüntüde ışık yansımasını önlemek için tüm ışıkları kapatın ve görüntüyü bilgisayarda kaydedin.
  5. Sonra, program görüntüyü kaydetmek için tüm bilgisayar konumlarını gösteren bir pencere önerir. Dijital görüntüyü bilgisayarda örnekin ID numarasıyla kaydedin.
  6. Alınan dijital görüntülerde gözlemlenen fenotipe göre bracteal nektarları (Ek Şekil 2) 1, 2, 3 ve 4 ile puanlayın. Puanlama sayfasını örnek kimliği ve ilgili skorla güncelleyin, gelecekteki analiz için

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için tarlada 8 ila 12 hafta yetiştirilen pamuk bitkileri seçildi. Her bitki için doku tipi için en az iki teknik kopya toplanmıştır. Sağlıklı genç yaprak örnekleri, 5 ila 7 cm uzunluğunda yaprak bıçaklarıyla üst dallardan toplanır. Sağlıklı çiçek örnekleri, aynı gün açılacak açık çiçeklerden veya çiçek tomurcuklarından toplanır. Farklı bitki hatlarından yaprak ve çiçek örnekleri toplandı ve laboratuvarda her iki doku tipi için mikroskop kullanılarak dijital görüntüler oluşturuldu (Şekil 1). Örnek toplamadan görüntülemeye kadar olan süreçte yukarıda açıklandığı gibi tüm adımlar izlenmiştir (Şekil 2 ve Şekil 3'te açıklandığı gibi). Hem yaprak hem de bracteal nektarlar için temsil sonuçlar genellikle nektarın yokluğunu (1), ara fenotiplere sahip nektarların (2, 3) varlığını ve nektar üreten tam gelişmiş nektarların (4) olduğunu gösterir. Şekil 4'te oluşturulan veriler, iki farklı pamuk bitkisinden (nektarı ve nektarsız) elde edilen dijital görüntülerdir. Yaprak abaksiyal yüzeyinin (orta kaburganın alt tarafında) dijital görüntü puanlaması sonuçları, 1 (orta kaburgada nektar yok) ve 4 (tam gelişmiş nektar ile nektar; Şekil 4A,B). Benzer şekilde, çiçek örnekleri bracteal nektarlar için analiz edildiğinde, 1 (nektar içermeden) ve 4 (tam oluşmuş nektar üreten nektar; Şekil 4C,D). İdeal olarak, aynı bitkiden toplanan yapraklar ve çiçekler aynı deseni takip etmelidir; yani nektarisiz, yaprak ve nektarisz çiçek tek bir bitkiye, nektarize yaprak ve nektaryen çiçek aynı bitkiye aittir. Şekil 5, nektarı bitkilerin hem yaprak hem de bracteal nektarlarının 10x, 20x ve 40x boyutlarında dijital görüntüleri toplanarak nektar özellikleri net görselleştirilerek oluşturulmuştur. Ayrıca, bu puanlamanın nektarı ve nektarisiz, pamuksuz ebeveynlerin F2 popülasyonlarında nasıl ayrıldığını anlamak için, bu popülasyonlardan birinden yaprak dokuları toplandı ve her yaprak nektar örneği için dijital görüntüler üretildi. Standart format puanlamasına karşılık gelen 1, 2, 3 ve 4'e karşılık gelen seçilmiş yaprak dijital görüntüleri Şekil 613'te vurgulanmıştır. Yaygın ve kolayca tanımlanabilen desen nektarın yokluğu ve nektarın varlığıdır. Nektarın yokluğuna en düşük puan verilirken, tam gelişmiş nektarya en yüksek puan olan 4 puan verilir. 1 ile 4 arasındaki skor aralığı, yani 2, 3, normal nektarlardan daha az gelişmiş ve daha küçüktür. Bu desen homozigot nektarisiz, yani 1 (yok), heterozigot durum (2 ve 3 skorlarda (azalmış nektarlar) ve 4 (tam gelişmiş) nektarlarda gözlemlenebilir. Ayrıca, bu farklılıkları karşılaştırmak ve anlamak için popülasyonlarla birlikte nektarlı ve nektarisiz, ebeveyn hattları da yetiştirilebilir.

figure-results-1
Şekil 1: Örneklemeden dijital mikroskopiye kadar yaprak ve bracteal nektarların görselleştirme adımlarının genel görünümü. (A) Hem yaprak hem de çiçek örneği toplamak için orta çiçek aşaması pamuk bitkilerini seç. (B) Yapraktaki nektar özellikleri gözlemlemek için tarladan yaprak örnekleri toplamak. (C) Yaprağı çevirerek yaprakın abaksiyal tarafı yukarıya bakacak şekilde çevirin ve vurgulanmış siyah kutu bölgesinde nektar özelliği gözlemleyin. (D) Yaprağı mikroskop aşamasına yerleştirin ve odağı yaprak nektarının dijital görüntülerini kaydetmek için vurgulanan siyah kutu bölgesinde tutarsınız. (E) Çiçeklerin ortasında (A) tarladan toplayın. (F) Çiçeği bir kesme tahtası üzerine yerleştirip beyaz kutu bölgesinde ok yönünde düz bir çizgi çizerek çiçek tabanını ayırarak kesi yapar. (G) Oyulmuş bölümü, bracteal nektarların dijital görüntülemesi için mikroskop aşamasına yerleştirir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Pamukta yaprak nektarlarının dijital görüntüleme ve puanlanması için adımlı prosedür. 1. Yaprak malzemesini etiketli örnek torbalarına toplayıp bir soğutucuya yerleştirin 2. Örneklerle birlikte soğutucuyu laboratuvar 3'e taşıyın. Soğutucudan tek tek örnekler çıkarın 4. Örnek poşetini tek tek açın ve 5. yaprakı çıkarın. Yaprak sapını elle kesin veya bir bıçak kullanın. 6. Yaprağı önceden ayarlanmış mikroskop aşamasına abaxial (alt) tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. 7. Bilgisayar ekranındaki VHX 600 programında yakınlaştırmayı 10x olarak ayarlayın. Görüntünün en iyi çözünürlüğü için mikroskobun kaba ve ince ayarlarını ayarlayın. 8. Bilgisayar ekranında gözlemlenen görüntünün ayarları için bilgisayar ekranına bakın (küçük ve büyük düğmelerle kontrol edilen ışık ve parlaklığı bu düğmeleri döndürerek ayarlayın, en iyi görüntü çözünürlüğü için mikroskopta ince ve kaba düğmeler kullanın, yansımayı gidermek için diğer ışıkları kapatın vb.) yaprak nektarı 9. Dijital görüntüyü puanlama için saklayın. Yapraktaki nektarın etrafındaki çizgi dairesi, 8. ve 9. resimlerde yaprak nektarının bölgesini vurgular. Yaprak nektarlarını mikroskop altında 10x (100 μm) büyütmede gözlemleyin. Ev pamuğunda sadece bir yaprak nektarı gözlemlenmiştir (bu fotoğrafta görüldüğü gibi). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Pamukta bracteal nektarların dijital görüntüleme ve puanlanması için adımlı prosedür. 1. Çiçek örneklerini etiketli örnek torbalarına toplayıp soğutucuya koymak 2. Soğutucudan bir örnek çıkarın 3. Bir çiçek çıkar 4. Bractları çiçekten uzaklaştırarak manuel olarak çıkarın 5. Bracteal kenar boyunca düz bir çizgi boyunca keserek steril bir bıçak ile kesik yapın (bracteal nektarların dijital görüntülemesine geçmeden önce Şekil 1'de beyaz kutu gösterilmiştir) 6. Kesilmiş bölümü çevir 7. Oyma kısmını, yaprak sapı yukarıya bakacak şekilde mikroskobun 8. aşamasına yerleştirin. Mikroskopa bağlı konsoldaki ışık ve parlaklık anahtarlarıyla ışık ayarları yapın. İyi çözünürlüklü görüntüler toplamak için mikroskopta kaba ve ince ayarlamalar kullanın. Tüm görüntüler mikroskop altında 10x (100 μm) büyütme ile gözlemlenmektedir. Bracteal nektaryları puanlamak için dijital görüntüler toplayın. Bracteal nektarın dijital görüntülerindeki daireler nektarın varlığını vurgular ve ev pamuklarında 3 bracteal nektar bulunur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Pamuk yaprağı nektar ve bracteal nektar dijital görüntüler. (A) Nektarlı yaprak; (B) Nektarı olmayan yaprak; (C) Çiçekte 3 bracteal nektar gösterilir ve (D) Çiçekte bracteal nektarı yok. Hem yaprak hem de çiçek nektarlarını mikroskop altında 10x (100 μm) büyütme ile gözlemleyin. Çizgi daireleri, yaprak nektarı ve bracteal nektarlarda nektarın varlığını ve yokluğunu gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Yaprak ve bracteal nektarlar, dijital görüntülerde nektarların net tanımlanması için 10x, 20x ve 40x olarak büyütüldü. (A) Orta kaburgadaki nektar özelliği gözlemlemek için yaprak örnekleri toplayın. (B) Mikroskop altında orta damarlıktaki yaprak nektarını 10x büyütme ile gözlemleyin. (C) Mikroskop altında orta kaburga üzerindeki yaprak nektarını 20x büyütme ile gözlemleyin. (D) Mikroskop altında orta kaburga üzerindeki yaprak nektarını 40x büyütme ile gözlemleyin. (E) Bracteal nektarlar için çiçek kesimleri. (F) 10x büyütme ile mikroskop altında bracteal nektarları gözlemler. (G) 20x büyütmede mikroskop altında bracteal nektarları gözlemler. (H) 40x büyütmede mikroskop altında bracteal nektarları gözlemler. Her görseldeki ölçek çubukları, yaprak nektar veya bracteal nektar görüntülerin hangi büyütmede çekildiğini gösterir (burada 10x, 20x ve 40x olarak gösterilmiştir). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Yaprak nektarının standart puanlama desenleri, 1,2,3 ve 4 desenlerini takip eder. (A) Kesik dairelerle vurgulanan nektarı olmayan yaprak örneği (Nektar yokluğu için puan 1). (B) Gözlemlenen küçük yaprak nektarı, heterozigot bir durum desenini gösterir (nektarın kesik daire resmi 2 olarak puanlanır). (C) Yaprak nektarı, 3 puan ile, heterozigotun başka bir deseni. (D) Tam forma edilmiş nektarlar, 4 puan. 10x ölçek, görüntülerin çekildiği büyütmeyi temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Mikroskop kullanılmadan yaprak nektarı ve bracteal nektarlar. Figür, nektarların geleneksel puanlama ile nasıl göründüğünü gösterir. Bu rakam13'ten uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Popülasyonun olası genotipleri Şekil, F2 popülasyonlarının çeşitli ebeveynlerin (nektarlı ve nektarsız) çaprazından oluşan genotiplerini göstermektedir. Bu tablo13. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Dijital mikroskop kurulumu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Farklı sayıda bracteal nektar gözlemlendi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nektarlar, bitkilerde nektar üreten ve başarılı çapraz tozlaşma için uzmanlaşmış bezler trikomlardır. Bitkilerde hem vejetatif hem de üreme nektarları bulunur. Gossypium cinsi (pamuk) 50'den fazla türden oluşur ve çoğunluğunda yapraknektarları 16 bulunur. Ancak, pamuktaki bu özellik zararlıları da çeker ve bu da ek verim kayıplarına yolaçar 17. Yetiştiriciler, bu sorunu çözmek için G. tomentosum'da ilk kez keşfedilen doğal olarak var olan nektarsız özellikleri (nektarların yokluğu) seçtiler. Bu nedenle, bu nektarisz özelliği yetiştirilen yüksek arazipamuklarına dahil ettiler 17. Sonunda, nektarlı ve nektarissiz hatlar ebeveyn olarak seçilerek birkaç popülasyon oluşturuldu. Homozigot nektarisz ve heterozigot nektarizsiz popülasyonlar çıplak gözle gözlemlendiğinde herhangi bir fark göstermediğinden, bu bitkileri ayırt etmek için özel bir araç olmalıdır. Bu nedenle, dijital mikroskopi ile yapılan bu puanlama yöntemi, geleneksel puanlamanın aksine, ( Şekil 7'de gösterildiği gibi), sadece azalmış nektarları görselleştirmekle kalmaz, aynı zamanda heterozigot nektarisz bitkilerin homozigot nektarisz bitkiler olarak yanlış puanlanmasını da engeller.

Dijital görüntülerle fenotipik puanlama, örnek toplama zamanı, örnek seçimi, yaprak ve bracteal nektarlar için standart puanlama ölçeğinin kullanımı, olası genotip ve puanlama verilerinin sonraki uygulamalar için nasıl yorumlanabileceği gibi birkaç önemli faktöre bağlıdır. İlk olarak, nektar salgısının en yüksek olduğu büyüme mevsiminde, genellikle Temmuz ayında çiçek döneminin ortasında yaprak ve çiçek toplamak önemlidir. İkinci olarak, doğru boyut ve aşamada yaprak veya çiçek seçimi, fenotip puanlamasında kritik bir rol oynar. Yapraklar için, yaprak nektarları için 5 ila 7 cm uzunluğunda yaprak bıçaklı üst dallar tercih edilirdi. Benzer şekilde, bracteal nektarlar için de üst dallardan sağlıklı çiçekler seçildi. Belirli gelişim evrelerinde örnek seçimi, bir popülasyondaki tüm bitkileri karşılaştırırken bile gelişim aşamasına bağlı özellik ifadeleri hariç tutulurken yardımcı olacaktır ( Şekil 8'de gösterildiği gibi). Puanlamanın tekrarlanabilir olup olmadığını kontrol etmek için, her bitki başına doku başına en az iki örnek için dijital görüntüler oluşturuldu. Aynı bitkinin birden fazla kopyasının toplanması, tutarlı veri toplamaya yardımcı olur.

Yöntemin olası sınırlaması, örnekler toplanana kadar zararlılardan arındırılmış bitkilerin korunmasıdır. Haşere istilası alanları, dokulara bırakılan doku veya yumurta yamaları veya yaprak bitleri veya diğer böcekler tarafından tüketildiği için nektar görünümünün görünmediği siyah alanlarla tespit edilebilir. Bu, yüzlerce örnek taraması sırasında gözlemlendi. Bu tür durumlarda, sağlıklı yapraklar ve çiçekler tekrar toplanıp bu örneklerden tutarlı veriler elde etmek için analiz edilmiştir. Bu, düzenli haşere kontrol programlarının tutulması ve sağlıklı bitkiler elde etmek için gübre takviyesi ile çözülebilir. Açıklandığı gibi tüm kritik adımları takip etmek, fenotip puanlamasında sorun gidermeye yardımcı olacaktır.

Bu tekniğin, DNA belirteçlerini tanımlamak için haritalama gibi birçok uygulaması vardır; bu da yetiştiricilerin marker destekli seçim genotiplerini belirlemesine yardımcı olur. Bu fenotip puanlama, çevresel ve gelişim aşaması etkileri nedeniyle DNA belirteçlerinden doğrulama gerektirir; ayrıca bu özelliği kontrol eden genler de vardır. Bu nedenle, bu özelliğin dijital mikroskopi kullanılarak fenotiplenmesi, birkaç popülasyondan çok sayıda bitkiyi şüpheli nektarisz çizgilere daraltmak için bir başlangıç noktası olacaktır. DNA belirteçleri kullanılarak, bu çizgiler yeni geliştirilen çeşitlerde nektarsız özellik aracılı hastalık direnci geliştirmek için ıslah programlarında kullanılmak üzere daha da doğrulanmıştır. Bu yöntem, araştırmacıların bitkilerdeki nektar özelliğin rolünü ve faydalı böcek etkileşimlerini anlamalarına da yardımcı olabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar açıklama yapılmadığını belirtir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

USDA, eşit fırsat sağlayıcı, işveren ve kredi verendir. Bu araştırma çalışması USDA-ARS projesi 6066-21000-053-00D tarafından desteklenmiştir. Kritik teknik yardımları için Kayla Gines-Haggard ve Wille Norals'a teşekkür ederiz. Bu yayında ticari isimlerin veya ticari ürünlerin adı yalnızca belirli bilgi sağlamak amacıyla yapılır ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onay anlamına gelmez. Bu makaledeki bulgular ve sonuçlar yazar(lar)a aittir ve burada herhangi bir resmi USDA veya ABD Hükümeti kararı veya politikasını temsil etmemelidir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dijital MikroskopKeyence VHXVHX 600Diğer mikroskoplar da kullanılabilir
Farberware kesme tahtasıFarberwareModel no. 78892-1014''L X 11''B X 0.5''Th, Her marka kullanılabilir, bu model amazon.com
Igloos Laguna küçük 9 Qt soğutucuIglooParça numarası 00043567Proje ihtiyacına göre herhangi bir marka/boyut kullanılabilir
  Plastik poşetler (400 pc), 3 X 4 inçAubeco markasıNA4''L X 3''B X 0.01''H, herhangi bir marka kullanılabilir, tercih edilen plastik şeffaf renkli olanlar
Single  Kenar Tıraş Bıçakları, 100 paketWeupeNAHer marka kullanılabilir, bu model amazon.com

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morphology, anatomy, and relationship of extrafloral nectaries and hydathodes in two species of Impatiens (Balsaminaceae). Botan Gazette. 138 (2), 206-212 (1977).">Elias, T. S., Gelband, H. Morphology, anatomy, and relationship of extrafloral nectaries and hydathodes in two species of Impatiens (Balsaminaceae). Botan Gazette. 138 (2), 206-212 (1977).
  2. Remarkable nectaries: structure, ecology, organophyletic perspectives IV. Miscellaneous cases. Flora. 193 (3), 225-248 (1998).">Vogel, S. Remarkable nectaries: structure, ecology, organophyletic perspectives IV. Miscellaneous cases. Flora. 193 (3), 225-248 (1998).
  3. Nectaries in some neotropical species of Polypodium (Polypodiaceae): preliminary observations and analyses. Biotropica. 1982, 108-113 (1982).">Koptur, S., Smith, A. R., Baker, I. Nectaries in some neotropical species of Polypodium (Polypodiaceae): preliminary observations and analyses. Biotropica. 1982, 108-113 (1982).
  4. Nectar biodiversity: a short review. Plant Syst Evol. 238 (1), 7-21 (2003).">Pacini, E., Nepi, M., Vesprini, J. L. Nectar biodiversity: a short review. Plant Syst Evol. 238 (1), 7-21 (2003).
  5. The developmental basis of floral nectary diversity and evolution. New Phytol. 246 (6), 2462-2477 (2025).">Liao, I. T., Gong, Y., Kramer, E. M., Nikolov, L. A. The developmental basis of floral nectary diversity and evolution. New Phytol. 246 (6), 2462-2477 (2025).
  6. Anatomy of the floral, bract, and foliar nectaries of Triumfetta semitriloba (Tiliaceae). Canadian J Botany. 83 (3), 279-286 (2005).">Espolador, L. Anatomy of the floral, bract, and foliar nectaries of Triumfetta semitriloba (Tiliaceae). Canadian J Botany. 83 (3), 279-286 (2005).
  7. Metabolomes of potato root exudates: compounds that stimulate resting spore germination of the soil-borne pathogen Spongospora subterranea. J Agri Food Chem. 64 (40), 7466-7474 (2016).">Balendres, M. A., Nichols, D. S., Tegg, R. S., Wison, C. R. Metabolomes of potato root exudates: compounds that stimulate resting spore germination of the soil-borne pathogen Spongospora subterranea. J Agri Food Chem. 64 (40), 7466-7474 (2016).
  8. Review: Nectar biology: From molecules to ecosystems. Plant Sci. 262, 148-164 (2017).">Roy, R., Schmitt, A. J., Thomas, J. B., Carter, C. J. Review: Nectar biology: From molecules to ecosystems. Plant Sci. 262, 148-164 (2017).
  9. Effects of nectariless cottons on populations of three lepidopterous insects. J Econ Entomol. 53 (2), 242-244 (1960).">Lukefahr, M. J., Rhyne, C. Effects of nectariless cottons on populations of three lepidopterous insects. J Econ Entomol. 53 (2), 242-244 (1960).
  10. Nectar biosynthesis is conserved among floral and extrafloral nectaries. Plant Physiol. 185 (4), 1595-1616 (2021).">Chatt, E. Nectar biosynthesis is conserved among floral and extrafloral nectaries. Plant Physiol. 185 (4), 1595-1616 (2021).
  11. Systems analyses of key metabolic modules of floral and extrafloral nectaries of cotton. bioRxiv. , 857771(2019).">Chatt, E. Systems analyses of key metabolic modules of floral and extrafloral nectaries of cotton. bioRxiv. , 857771(2019).
  12. Genetic and evolution analysis of extrafloral nectary in cotton. Plant Biotechnol J. 18 (10), 2081-2095 (2020).">Hu, W. Genetic and evolution analysis of extrafloral nectary in cotton. Plant Biotechnol J. 18 (10), 2081-2095 (2020).
  13. Identification of simple sequence repeat (SSR) and single nucleotide polymorphism (SNP) that are associated with the nectariless trait of Gossypium hirsutum. Euphytica. 217 (4), 78(2021).">Park, S. H., Scheffler, J. A., Ray, J. D., Scheffler, B. E. Identification of simple sequence repeat (SSR) and single nucleotide polymorphism (SNP) that are associated with the nectariless trait of Gossypium hirsutum. Euphytica. 217 (4), 78(2021).
  14. Extrafloral nectar, honeydew, and sucrose effects on searching behavior and efficiency of Microplitis croceipes (Hymenoptera: Braconidae) in cotton. Environ Entomol. 26 (3), 617-623 (1997).">Oscar Stapel, J., Cortesero, M. A., De Moraes, C. M., Tumlinson, J. H., Joe Lewis, W. Extrafloral nectar, honeydew, and sucrose effects on searching behavior and efficiency of Microplitis croceipes (Hymenoptera: Braconidae) in cotton. Environ Entomol. 26 (3), 617-623 (1997).
  15. Duplicate Linkage of Glandless and Nectariless Genes in Upland Cotton, Gossypium hirsutum L. Crop Sci. 8 (5), 577-580 (1968).">Holder, D. G., Jenkins, J. N., Maxwell, F. G. Duplicate Linkage of Glandless and Nectariless Genes in Upland Cotton, Gossypium hirsutum L. Crop Sci. 8 (5), 577-580 (1968).
  16. Polyploidy and genome evolution in plants. Curr Opin Plant Biol. 8 (2), 135-141 (2005).">Adams, K. L., Wendel, J. F. Polyploidy and genome evolution in plants. Curr Opin Plant Biol. 8 (2), 135-141 (2005).
  17. New germplasm from crossing upland cotton (Gossypium hirsutum) with G. tomentosum. J Heredity. 69 (3), 183-187 (1978).">Meyer, V. G., Meredith, J. W. R. New germplasm from crossing upland cotton (Gossypium hirsutum) with G. tomentosum. J Heredity. 69 (3), 183-187 (1978).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cotton NectariesDigital MicroscopyLeaf Nectary ScoringBracteal NectariesPhenotypic ScoringImage PreservationPlant Trait PhenotypingSample CollectionMarker Assisted SelectionNectar Producing Glands

Related Articles