Yöntem makalesi

Tekrarlanabilir Makro Ölçekli Doku Yapıları İçin İnsan ASC Tabanlı Biyofabrikatasyonun Biyolojik Standartlaştırması

DOI:

10.3791/69839

⸱

5 Haziran 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Eukaryotic Cell Biology (Labio), National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 2Post-graduation Program of Translational Biomedicine (Biotrans), UNIGRANRIO, 3Post-graduation Program in Biotechnology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 4Post-graduation Program in Science and Technology of Polymers, Laboratory of Catalysis for Polymerization, Recycling and Biodegradable Polymers (LCPRB), Institute of Macromolecules, Federal University of Rio de Janeiro, 5Post-graduation Program in Metrology and Technology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 6Campus of Duque de Caxias, Federal University of Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, yağ kök hücre sferoidleri ve 3D baskılı GelMA iskeleleri kullanılarak tekrarlanabilir bir biyofabrika iş akışı sunmaktadır. Mekânsal kontrol, füzyon kapasitesi ve kalite kontrol metriklerini sergileyerek rejeneratif tıpta potansiyel uygulamalara sahip nakledilebilir makro ölçekli doku yapıları ortaya çıkarır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuvarlar arasında standart protokollerin eksikliği, deneysel sonuçların karşılaştırılabilirliği ve biyofabrikatasyon teknolojilerinin verimli transferi önünde önemli bir engel oluşturmaktadır. Titiz biyolojik standartlaştırma sadece tekrarlanabilirliği artırmakla kalmaz, aynı zamanda doku mühendisliği stratejilerinin klinik dönüşümü için gerekli olan ulusal ve uluslararası düzenleyici çerçevelerle uyumu kolaylaştırır. Bu çalışma, hADSC'lerin tek katmanlı kültürü, sferoid oluşumu, Jelatin Metacryloyl (GelMA) iskelelerinin 3D baskısı ve sferoid biyomontajı içeren standartlaştırılmış bir biyofabrika iş akışını tanıtmaktadır. Tekrarlanabilirliği sağlamak için kalite kontrol metrikleri entegre edildi. 3D baskılı GelMA iskelesi, her biri yüzlerce küre barındırabilecek iki merkezi gözenekle tasarlandı. Baskı doğruluğu, iskele boyutlarının CAD modeliyle karşılaştırılmasıyla doğrulandı ve küçük anlamsız sapmalar vardı. hADSC'ler, agaroz mikrokalıplarında 24 saat içinde uniform sferoidler oluşturdu. İskele gözeneklerine tohumlandığında, sferoidler 72 saat boyunca sürekli füzyon geçirerek konfokal görüntüleme ile doğrulanan makro ölçekli yapılar oluşturur. İskele tasarımı ve baskı hassasiyeti yapısal desteği sağlarken, küresel tekdüzelik yapının öngörülebilir şekilde oluşmasını sağladı. İskele gözenekleri içindeki sferoidlerin birleşmesi, iskele ile ya da iskelesiz nakil için uygun doku yapıları ortaya çıkardı ve bu biyomontaj yaklaşımının çok yönlülüğünü ortaya koydu. Bulgular, canlı doku yapılarının biyofabrikatasyonu için tekrarlanabilir metodolojilerin ilerletilmesinde biyolojik standartlaşmanın kritik rolünü vurgulamaktadır ve rejeneratif tıpta gelecekteki klinik uygulamalar için umut vadeden sonuçlar doğurmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyomontaj ve biyoprinting, doku mühendisliğinde karmaşık dokular ve organların makro ölçekte inşasına odaklanan tamamlayıcı biyofabrika yaklaşımlarıdır ve otomatik teknolojiler 1,2,3,4 kullanılarak inşa edilir.

Sferoidler, biyomontaj yaklaşımları için esas olarak biyofabrikatasyona entegre edilmiştir5. Sferoidler, hücreler ile çevresindeki doku mikroçevresi arasındaki etkileşimleri in vivo olarak yeniden üreten mikrodokular olarak kabul edilir. Sferoid oluşumu için kullanılan hücre kaynakları arasında, yağ kök hücreleri (ADSC), izolasyonu kolaylığı, uzun vadeli kültür bakımı ve farklılaşma potansiyeli 6,7,8 ile öne çıkar.

Daha büyük agregalar oluşturma içsel kapasiteleri nedeniyle, sferoidler biyomontaj yaklaşımlarına maruz kaldıklarında daha karmaşık doku yapıları üretebilirler. Bu füzyon odaklı organizasyon, kök hücre sferoidlerinin rejeneratif ve farklılaşmapotansiyelini artırır 9,10.

Sferoid biyomontaj11 tarafından desteklenebilir veya hatta yönlendirilebilir, bu da bu stratejiyi ölçeklenebilir ve otomatik biyofabrika için uygunkılar 12,13.

Mevcut biyofabrika stratejileri, iskelesiz sferoid montaj yaklaşımları ve hidrojel gömülü biyoprint sistemleri olarak genel olarakkategorize edilebilir 2,5,14. İskelesiz yöntemler, içsel hücre-hücre etkileşimlerinden yararlanarak tamamen kendiliğinden hücresel kendi kendine birleşme ve sferoidler arası füzyona dayanır. Ancak, harici mimari rehberlik veya geometrik sınırlama olmadan gerçekleştikleri için, bu yaklaşımlar daha düşük mekânsal kontrol ve daha düşük yapısalöngörülebilirlik gösterir 5,15. Buna karşılık, hidrojel tabanlı kapsülleme yaklaşımları, hücreleri toplu matrislerin içine gömerek yapısal destek ve önceden tanımlanmış mimarisağlar 16,17; bu da erken füzyon aşamalarında doğrudan hücre-hücre temasını kısmen kısıtlayabilir ve hücre göçü dinamiklerinietkileyebilir 18. Bu çerçevede, Jelatin Metakriloyl (GelMA) gibi bastırılabilir biyomalzemeler hücre yapışma motifleri sunar ve küre biyomontajını kolaylaştırmak için iskeleolarak işlev görebilir 19. 3D baskılı GelMA iskelesi, küreler için geometrik sınırlama ve mekansal rehberlik sağlayacağı ve böylece daha büyük, yapısal olarak tanımlanmış yapılara füzyon yoluyla kontrollü doku oluşumunu teşvik ettiği varsayılmaktadır. Bu yaklaşım, iskele rehberli organizasyon ile tanımlanmış bir hidrojel mimarisi içinde sferoid füzyonu birleştirerek sferoid biyomontaj sırasında mekansal kontrolü ve yapısal tekrarlanabilirliği artırmayı amaçlamaktadır. Ancak mevcut iş akışı süreç standartlaştırması ve yapısal biyofabrika parametrelerine odaklanmakta olup, uzun vadeli doku olgunlaşması, fonksiyonel farklılaşma veya büyük ölçekli otomatik üretimi ele almıyor.

Biyolojik standartlaştırma sadece tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirliği sağlamak için değil, aynı zamanda biyofabrik dokuların işlevsel bütünlüğünü korumak için de gereklidir19,20. Sonuç olarak, mühendislik, geometrik ve yapısal parametrelerin hassas kontrolü kritik öneme sahiptir; çünkü bu faktörler doku fonksiyonu ve olgunlaşma dahil olmak üzere biyolojik performansı doğrudan etkiler 5,21. Standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir biyofabrika iş akışı sunulur ve aşağıdaki temel adımları kapsar: (1) ASC tek katmanlı kültür; (2) ASC küresel formasyonu; (3) GelMA iskelesinin 3D baskısı; ve (4) sferoid biyomontaj (Şekil 1). Bu iş akışı içinde, küre teklibesi ve sferikliği, baskı kalitesi ve iskele şekli bütünlüğü gibi nesnel kalite kontrol metrikleri belirlendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Agararoz mikrokalıplarının hazırlanması ve GelMA 3D baskılı iskelelerin üretimi

  1. %0,9 Sodyum Klorür (NaCl) çözeltisinde %2 agaroz mikro küfün üretimi (bkz. Şekil 2A)
    NOT: Tüm kimyasal atıklar, kurumsal kimyasal güvenlik düzenlemeleri ve tehlikeli atık yönergelerine uygun olarak ele alınmalı ve bertaraf edilmelidir.
    1. Ultrasaf suda %0,9 NaCl çözeltisi hazırlayın ve 121 °C'de 30 dakika otoklav yapın. Kullanıma kadar steril koşullarda saklayın.
    2. 1 g steril ultrasaf agarozu 50 mL %0,9 NaCl çözeltisiyle seyreltin. Agarozu mikrodalgada 10 saniyelik aralıklarla 3–5 döngü boyunca homojenize edip depolimerize edin, tamamen çözünene kadar.
    3. Biyolojik bir güvenlik dolabında, 81 dairesel girinti içeren ticari olarak bulunan silikon bir kalıpı steril gazlı bez üzerine yerleştirin.
    4. 600 μL agarozu silikon kalıbın ortasına dikkatlice biriktirin ve tam polimerizasyonu sağlamak için 40 dakika dinlendirin.
    5. Tam polimerize olan agaroz mikro kalıpı dikkatlice sökün ve 12 delikli bir mikrotiter plakanın bir kuyusuna aktarın.
    6. Agaroz mikro kalıbının konumunu ayarlayın ve 600 μL agaroz ile doldurarak kuyunun dibine sabitleyin.
    7. Mikroküfü Dulbecco'nun Modified Eagle Medium Low Glucose (DMEM, 2 mL/well) ile 15 dakika boyunca kuluçka geçirerek önceden kuluçka yapın. Bu işlemi iki kez tekrarlayın ve üçüncü kuluçkada, askorbin asit (50 μg/mL) takviyesi DMEM, insan serum albümini (1,25 μg/mL), penisillin-streptomisin (PS, 1×, 100× stok çözeltisinden) ve ITS takviyesi (1×, 100× stok çözeltisinden) içeren Üç Boyutlu (3D) kültür ortamı ile değiştirin.
      NOT: 3D kültür ortamı, tek katmanlı genleşme ortamından farklı olarak, fetal sığır serumunun (FBS) olmaması ve hücre-hücre etkileşimini ve hücre dışı matris desteğini destekleyen tanımlanmış takviyelerin dahil edilmesi ile doğru sferoid kendi kendine montaj ve stabilizasyonu destekler. Küf üretimi ve hücre kaplaması farklı günlerde yapılırsa, işlem ikinci DMEM kuluçkasından sonra duraklatılabilir ve kalıplar steril koşullarda, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde, 37 °C sıcaklıkta 5 güne kadar saklanmalıdır. 3D kültür ortamı ile üçüncü kuluçka sadece kaplama gününde yapılmalıdır. Hücreleri tohumlamadan önce, ortamı hem kuyunun hem de mikro küften tamamen çıkarın.
  2. Jelatin Metakriloyl (GelMA) hidrojelinin hazırlanması
    NOT: Tüm işlem karanlıkta yapılmalıdır, çünkü reaktifler fotoduyarlıdır. Bu çalışmada GelMA (jel gücü 300 g Bloom, %60 inşûnasyon derecesi) ve fotobaşlatıcı lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoylfosfinat (LAP) kullanıldı. %0,5 w/v LAP içeren %10 w/v GelMA çözeltisi 10 mL hazırlamak için:
    1. 50 mg LAP tozunu 1 mL DMEM'de çözerek pipetle nazikçe karıştırarak berrak ve homojen bir çözelti elde edilene kadar çözün.
    2. LAP çözeltiyi 9 mL DMEM içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve iyice karıştırın.
    3. Biyolojik bir güvenlik kabinde, ortaya çıkan çözeltiyi 0,22 μm filtreyle sterilize edersiniz.
    4. Çözeltiye 1 g GelMA ekleyin ve yaklaşık 3 saat boyunca 50 °C'de manyetik karıştırarak veya berrak ve homojen bir çözelti elde edilene kadar homojenleştirin. Çözeltinin görünür partiküllerden ve bulanıklıktan arındığından emin olmak için matayı ışığa doğru tutun.
    5. Ortaya çıkan hidrojeli sonraki baskı için 10 mL'lik bir şırıngaya yükleyin veya hemen kullanılmazsa, 2–8 °C sıcaklıkta, ışıktan korunarak saklanarak kullanılana kadar saklanın.
      NOT: GelMA ve LAP çözeltileri hazırlıktan yaklaşık 24 saat sonra kullanıldı. Bu çözümün uzun süre saklanması tavsiye edilmez. GelMA ve LAP tozları üreticinin talimatlarına göre 2–8 °C sıcaklıkta saklanmalıdır. LAP fotobaşlatıcısı, ABNT NBR 14725 ve Yönetmelik (EC) nº 1272/2008 gibi standartlara göre tehlikesiz olarak sınıflandırılmıştır. Ancak, üretici, solunum sistemi, cilt ve göz tahrişini önlemek için kişisel koruyucu ekipman kullanılmasını önerir. NIOSH (Ulusal İş Sağlığı ve Güvenliği Enstitüsü - ABD) veya EN 166 (EU) gibi ilgili devlet standartlarına uygun olarak test edilen ve onaylanmış güvenlik gözlüklerinin yanı sıra minimum 0,11 mm kalınlıkta nitril lastik eldivenlerin kullanılması önerilir. Solunum koruması yalnızca toz oluştuğunda gereklidir. Üreticinin filtreli solunum koruması önerileri, DIN EN 143, DIN EN 14387 ve kullanılan solunum koruma sistemiyle ilgili diğer tamamlayıcı standartlara dayanmaktadır. Üretici, P1 tipi bir filtre kullanmanızı önerir.
  3. 3D model tasarımı, dilimleme ve G-kod dosyasının oluşturulması
    NOT: 3D iskele modeli, çevrimiçi 3D bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı Tinkercad kullanılarak tasarlandı. Bu protokol için, 15 mm çapında, taban kalınlığında 1 mm ve her biri 5,50 mm çapında, derinliğinde 2 mm olan iki dairesel gözenekte silindirik bir iskele oluşturuldu.
    1. 3D model tasarımı tamamlandıktan sonra, bunu *.stl dosyası olarak dışa aktarın (Ek Dosya 1).
    2. Tasarlanan modeli dilimlemek için kullanılacak Repetier-Host V2.3.2 yazılımını açın.
    3. "Dilimleyici" sekmesinde istediğiniz dilimleyici seçeneğini seçin. Bu çalışmada CuraEngine kullanıldı.
    4. Uygun parametre profilini yapılandırın. Bu çalışmada, Hız 10 mm/s; Katman yüksekliği 0,2 mm; Dolgu Deseni: Izgara; Nozul çapı 0,41 mm kullanıldı.
    5. Yazdırılacak 3D modelin *.stl dosyasını yükleyin.
    6. "Dilimleyici" sekmesinde önceden oluşturulmuş yapılandırmayı seçin.
    7. "CuraEngine ile Dilimle" seçeneğine tıklayın. Dilimlenmiş 3D model daha sonra yazılım arayüzünde görselleştirilir.
    8. "Dosyaya Kaydet" seçeneğine tıklayarak G-kod dosyasını istediğiniz konuma kaydedin.
  4. Sferoid biyomontaj için Jelatin Metacryloyl (GelMA) hidrojel iskelelerinin 3D Baskısı
    NOT: 3D baskı steril koşullarda yapılmalıdır. Bu nedenle, baskı sürecine başlamadan önce, yazıcıyı barındıran biyolojik güvenlik kabininin açık olduğundan ve hava akışının düzgün çalıştığından emin olun. Dolap koruma camının yüksekliğinin ekipman sensörü işaretiyle aynı yükseklikte olduğunu doğrulayın.
    1. Biyoyazıcıdan güvenlik kilitlerini çıkarın.
    2. Cam plakayı metal klipsleri serbest bırakarak baskı yatağından çıkarın.
    3. Kültür plakasının baskı platformuna sabitlenmesini desteklemek için metal klipslerle uygun şekilli bir akrilik kılavuz takın.
    4. Yazıcıyı güç kaynağına bağlayın. Bu ekipmanın çift voltajı (110/220 V) desteklediğini unutmayın.
    5. Yazıcının USB kablosunu bilgisayara bağlayın.
    6. Yazıcıyı açmak için açma/kapatma düğmesine basın.
    7. Open Repetier-Host V2.3.2 yazılımı, 3D modeli görüntülemek ve yazdırmak için kullanılacak.
    8. Yazılım arayüzünde "Bağla" seçeneğine tıklayın.
    9. Yazılım manuel kontrolünü kullanarak ekstruderi (1 veya 2) seçin ve yazıcı kafasını ana konuma gönderin (X = 0, Y = 0, Z = 0).
    10. Seçilmiş ekstruderi doğru şırınga takılı olarak Repetier'deki manuel kontrol aracıyla ayarlayın.
    11. Şırıngayı dikkatlice ekstrudere yerleştirin; zaten hidrojel ile yüklenmiş ve ekstrüzyon nozuluna bağlıydı (bu çalışmada iç çapı 0,41 mm olan konik polipropilen nozul kullandık).
    12. Kültür plakasını baskı yatağına bağlı akrilik kılavuza takın.
    13. Z ana konumunu (Z = 0) biyoyazıcının sol tarafında bulunan Z endstop vidasını kullanarak ayarlayın. Yani, ekstrüzyon nozulu ile baskı yüzeyi arasındaki istenen mesafeyi ayarlayın. İdeal olarak, nozul bu çalışmada kültür plakası olan substrata hafifçe temas etmelidir.
    14. Baskı başını ana konumuna geri getirin.
    15. Daha önce oluşturulan G-kod dosyasını yükleyin.
    16. Yazılımdaki uygun manuel kontrol aracı kullanılarak, enjektörden hidrojelin bir kısmını dışarı çıkararak malzemenin memeden geçmesini sağlayın.
    17. Baskı sürecine başlayın.
    18. Baskıdan sonra, 3D biyoyazıcının UV ışık sistemi ile fotoçaplama işlemi yapılır; bu sistem 395-400 nm aralığında iki LED ile donatılmıştır. İskeleyi 5 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın (ışık yoğunluğu 20 mW/cm 2).
    19. Mikrokalıpların üretiminde kullanılan aynı depolimerize %2 agaroz çözeltisini, 3D baskılı iskeleleri 12 kuyuyla kültür plakasının kuyularına bağlamak için kullanın. Kuyunun dibine iskelelerin sabitlenmesi, daha fazla stabilite sağlamak ve küre tohumlama sırasında ve kültür boyunca yer değiştirmeyi önlemek için gereklidir.
      NOT: 4.16. adımı uygularken, hidrojelin ekstrüzyon sırasında sürekli bir filament oluşturup oluşturmadığını kontrol edin. Genellikle, jelatin çözeltisi şırıngaya sıvı haldeyken (yaklaşık 37 °C) yüklenir. Oda sıcaklığında (22–25 °C) birkaç dakika içinde bu biyomateryal jel benzeri bir kıvama dönüşmeye başlar. Ekstrüzyon sırasında malzeme damlamamalıdır, çünkü bu baskı kalitesini olumsuz etkiler. Ekstrüzyon sırasında sürekli filament oluşumu, hidrojelin baskı için optimal kıvama ulaştığını gösterir. DMEM'de seyreltilmiş GelMA ve LAP çözeltisi hafif turuncu bir renkte bulunur. UV kaynaklı fotoçapraz bağlamadan sonra, genellikle bir renk değişikliği gözlemlenir; malzeme beyazımsı veya saydam hale gelir; bu durum Şekil 3D,E'de gösterilmiştir. UV sistemi çalışırken, ultraviyole radyasyona karşı yeterli göz koruması sağlamak için güvenlik gözlüğü zorunludur.
  5. Baskı isabet analizi
    NOT: GelMA iskelelerinin 3D baskı isabet analizi aşağıdaki parametreleri dikkate alır: iskele çapı, gözenek çapı ve iskele kalınlığı. Ölçümler için ImageJ Sürüm 1.54 yazılımı kullanıldı.
    1. İlk olarak, iskelelerin stereomikroskopla görüntülenen görüntülerini yakalayın Referans olarak bir cetvel veya kaliper kullanın.
    2. Görüntüleri analiz etmeden önce, ölçümleri yapmak için ImageJ'de ölçeği kalibre edip ayarlayın.
    3. Ölçümleri yapmak için düz çizgi aracını kullanın.
    4. Hem iskele hem de gözenek şekilleri dairesel olduğundan, istatistiksel analiz için iskele ve gözenek çaplarının aritmetik ortalamasını kullanın.
    5. Baskı sadıklık analizi için, ImageJ tarafından basılan iskelelerden elde edilen ölçümleri, Tinkercad tarafından oluşturulan 3D modelde tanımlanan değerlerle karşılaştırın.
      NOT: Ölçülen basılmış iskele kalınlığı, Tinkercad'da projislenen gözenek derinliği ve taban kalınlığı değerlerinin toplamı ile karşılaştırılır.
    6. Elde edilen verilerin istatistiksel analizini gerçekleştirin. Bu durumda, ölçülen iskele değerlerini beklenen değerlerle karşılaştırmak için Mann-Whitney U testi (parametrik olmayan) kullanılabilir. Shapiro-Wilk testi normalliği değerlendirmek için kullanılır. Farklar istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edilir < p 0.05.

2. hADSC'lerin ve küre oluşumunun hazırlanması

NOT: Ticari olarak mevcut olan insan yağ kök hücreleri (hADSC), üretici önerilerine göre hücre spesifik büyüme ortamında kültürlenerek %80–%90 birleşimde geçiş yaptı. Bu protokol için hücreler 7. pasaja kadar kullanıldı. Tüm biyolojik atıklar bertaraf edilmeden önce doğru şekilde dezenfekte edilmeli veya sterilize edilmeli ve kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun şekilde işlenmelidir. Sonraki konfokal görselleştirme için, tek katman sferoid oluşumundan önce floresan bir boya ile etiketlenmeli ve üreticinin önerisine göre kuluçka yapılmalıdır. Sferoid oluşumu etiketlemeden 30 dakika sonra başlatılabilir.

  1. ASC monokatmanının tripsizasyonu
    1. Biyolojik bir güvenlik dolabında, kültür maşesini açın ve içindekileri bir atık konteynerine aktarın.
    2. Monolayerı 1× Fosfat-Tamponlu Salin (PBS) ile iki kez yıkayın ve çözeltiyi atın.
    3. Tek katmanı kapatacak kadar %0,125 tripsin/EDTA çözeltisi ekleyin. Matayı kapatın ve nemli bir kuluçka makinesinde 37 °C'de 5 dakikaya kadar kuluçka yapın.
    4. Tripsin/EDTA'yı %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenen eşit hacimde DMEM ekleyerek inaktive edin.
    5. Hücre süspansiyonunu serolojik pipet kullanarak toplayın veya santrifüj tüplerine aktarın. Oda sıcaklığında (20–25 °C) 400 x g boyunca 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    6. Süpernatantı dikkatlice at.
    7. Hücre pelletini DMEM'de yeniden süspansiyona alın ve homojenize edin. Hücre sayımı ve yaşamlılık değerlendirmesi için bir aliquot alın.
  2. Sferoid kültürü ( bkz. Şekil 2B)
    1. Her kalıp için uygun hücre sayısını 15 mL'lik santrifüj tüpüne ayırın. hADSC'ler için, 81 girintiye sahip her agaroz kalıbı 1 × 106 hücre almalıdır—her mikro kuyrukta bir sferoid oluşur ve her mikro kalıp başına 81 sferoid oluşur.
    2. 1× PBS ekleyin ve 500 x g sıcaklıkta oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı atıp 1× PBS ekleyin. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
    3. Üçüncü santrifüjlemeden sonra, süpernatantı dikkatlice atın ve tüp açıklığını steril gazlı bezle kurutmadan sonra dikey konuma getirin.
    4. Hücre peletini 120 μL 3D kültür ortamında sferoid kültür için yeniden süzülür ve homojenleştirir. Süspansiyon hacmini 200 μL'ye ayarlayın ve gerekirse ek 3D kültür ortamı kullanın.
      NOT: 81 rezeksiyonlu her kalıbın kapasitesi 200 μL'dir.
    5. 200 μL aspirasyon yapın ve kalıpın ortasına dikkatlice tabaka yerleştirin, böylece baloncuk oluşumunu önleyin.
      NOT: Bu adım, daha önce açıklandığı gibi robotik pipetleme sistemi kullanılarak otomatikleştirilebilir22.
    6. Plakayı biyolojik güvenlik dolabında 5 dakika bekletin ki hücreler rezeksiyona yerleşsin.
    7. Tabağı nemli bir kuluçka makinesine 40 dakika koyun.
    8. Bu dönemden sonra, her kuyuya dikkatlice 2 mL 3D Medium ekleyin. Plakayı nemlendirilmiş kuluçka makinesine 37 °C'ye geri getirin.
  3. Sferoidlerin ölçümü ve istatistiksel analizi
    1. Agarose mikrokalıbının iki çaprazı boyunca konumlanmış sferoidlerin görüntülerini yakalayın; dijital kamera ve 10× objektif ile donatılmış ters optik mikroskop kullanılarak "X" deseni oluşturulur. Çapları ölçmeden önce görüntü ölçeğini kalibre etmek için 100 μm ölçek çubuğunu kullanın.
    2. Sferoidlerin büyük ve küçük çaplarını belirlemek için, yazılımın "çizgi" aracını kullanarak fotoğraflanan her sferoid için yaklaşık 90° açı olacak şekilde iki dik ölçüm yapılabilir.
    3. Her küre çapını, daha önce ölçülen iki dik çapın aritmetik ortalaması olarak hesaplayın. Her kürede en büyük ile en küçük çapın oranı olarak sferikliği hesaplayın; değerler 1'e yakın daha yüksek bir tekdüzelik ve daha küresel bir şekli gösterir.
    4. Elde edilen çapta ve sferiklik değerlerinde istatistiksel analizler yapın.

3. GelMA iskelelerine küre füzyonu ve biyomontaj için sferoidlerin tohumlanması

  1. 24 saat küre oluşumundan sonra, geniş delikli uçlu bir pipet kullanarak agarose mikrokalıplarından topla ve 2 mL mikrotüplere aktarın.
  2. Sferoidler mikrotüplerin dibine yerleştiğinde, süpernatantı atın.
  3. Sferoidleri 50 μL 3D Medium ile yeniden süzülür.
  4. Geniş uçlu bir pipet kullanarak küreleri toplayın ve onları GelMA iskele gözeneklerine nazikçe yerleştirin.
    NOT: Yaklaşık 5,50 mm çapında ve 2 mm derinlikte bir GelMA destek gözenekinde, yaklaşık 480 ila 640 sferoid tohumu (her biri 200 ila 400 μm arasında değişen 81 sferoid üreten 6–8 agaroz mikrokalıbına karşılık) 50 μL'de tohumlanacaktır. Bu tahmin, gözenek hacmi ve ortalama küre çapına dayanıyordu; bireysel küre sayımıyla değil, transfer edilen tam mikro kalıp sayısıyla nicel ölçüm yapıldı; böylece gözenekteki sferoid yoğunluğunun pratik ve tekrarlanabilir bir tahmini sağlandı.
  5. Sferoidleri GelMA destek gözeneğine yerleştirdikten sonra, sferoidlerin yerleşmesini sağlamak için 20–40 dakika bekleyin. Her kuyuya 1 mL 3D ortam ekleyin.
  6. 24 saat sonra, her kuyuya 1 mL 3D ortam ekleyin.
  7. GelMA iskelelerinin gözenekleri içindeki sferoidlerin birleşmesini faz kontrast mikroskopisi ve stereomikroskopi ile izleyin. Görüntüleri her 24 saatte bir, 0. günden (tohumlamadan hemen sonra) 3. güne (72 saat) kadar edin.
  8. 72 saat sonra %4 paraformaldehitte biyolojik yapıyı konfokal mikroskopi ile görselleştirme için sabitleyin. Paraformaldehiti, toksik ve tahriş edici özellikleri nedeniyle uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) sertifikalı kimyasal bir hava davlumbazında ele alın ve atıkları kurumsal kimyasal güvenlik yönergelerine uygun olarak bertaraf edin. Konfokal gözlem için, hücreler sferoid oluşumdan önce monokatmanda floresan bir boya ile önceden etiketlenmelidir.
    NOT: Eğer analiz veya in vivo uygulama için GelMA gözeninden yapının çıkarılması gerekiyorsa, hassas cımbız veya uygun boyutta biyopsi punch ile dikkatlice alın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monotabakada kültürlenen insan yağ kök hücreleri (hASC), agaroz mikro kalıplarına tohumlandıktan sonra 24 saat içinde başarıyla sferoidler oluşturdu (Şekil 2D). Ortaya çıkan küreler kompakt ve iyi tanımlanmış bir morfoloji sergilemiştir. Morfometrik analiz, 24 saatte ortalama çapı 239,8 μm ± 87,0 μm (Şekil 2E) ve 1'e yakın bir sferiklik değeri (0,947 ± 0,123) (Şekil 2F)...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada gösterilen sonuçlar, tekrarlanabilirliği sağlamak için kalite kontrol metriklerinin standartlaştırılmış biyofabrika iş akışına başarılı entegrasyonunu vurgulamaktadır. Önceden belirlenmiş tasarımlara dayalı 3D baskılı iskelelerin kullanımı, küresel biyomontaj için yapısal desteksağlar 19,23. Bir konsept kanıtı olarak, yüksek yoğunluklu küresel yükleme ve yönlendirilmiş biyomontajı desteklemek üzere iki merkezi gözene...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BioRender.com (https://BioRender.com/x1lxn0y) figürlerdeki çizimler için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)Laboratuvarda hazırlanmış-
593iCAN 3D Bioprinter, Model 593 iCan2X Printhead593iCAN--
AgarozSigma-Aldrich16500-500-
Askorbik AsitSigma-AldrichA4544-100MG-
Carl Zeiss Microscopy GmbH PrimovertZeiss-415510-1101-000
CelldiscoverZeiss-LSM 900 with Airyscan 2
CelltrackerInvitrogenC7025-
SantrifüjEppendorf-5702
Sınıf II Biyolojik Güvenlik DolabıStreamline-Model SC2-4E3
Hücre kültürü için CO2 inkübatörüThermo Fisher Scientific-8000 WJ Serisi
Konik polipropilen nozul 0,41 mm593iCAN--
Dulbecco’nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı Düşük GlukozSigma-AldrichD2902-10L-
EDTASigma-AldrichE9884-
Fetal Bovin Serum (FBS)Gibco12657-029-
Jelatin metakriloil jel dayanıklılığı 300 g Bloom, ikame derecesi %60Sigma-Aldrich900622Lot/Parti numarası: MKCS2673. Her partinin belgeleri, Güvenlik Veri Sayfası (SDS) ve Analiz Sertifikası (CoA) üreticinin web sitesinden temin edilebilir.
GraphPad Prism 6.0 yazılımıGraphPad Inc--
Sıcak plaka manyetik karıştırıcıIKAZ671797Model C-MAG HS7
İnsan serum albümini 100 mg/mlFUJIFILM Irvine Scientific9988-
ITS (İnsülin-transferrin-sodyum selenit) takviyesi 100xSigma-AldrichI3146-5ML-
Lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP)Sigma-Aldrich900889
Luxoeo 4Z Stereozoom MikroskopLabomed--
MicroTissues® 3D Petri Kabı® mikro kalıp sferoitleriSigma-AldrichZ764019-
Penisilin-streptomisin 100xSigma-Aldrich15140122-
Poietics® insan adipoz türevi kök hücreler (ADSC)LonzaPT-5006
Sodyum Klorür (NaCl)Sigma-Aldrich71382-500G-
Tripsin/EDTAGibco27250018-

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spagnuolo, F. D., Kronemberger, G. S., Storey, K. J., Kelly, D. J. The maturation state and density of human cartilage microtissues influence their fusion and development into scaled-up grafts. Acta Biomater. 194, 109-121 (2025).
  2. Baptista, L. S., et al. Bioprinting using organ building blocks spheroids organoids and assembloids. Tissue Eng Part A. 30 (13–14), 377-386 (2024).
  3. Shojaei Barjuei, E., et al. Precision improvement of robotic bioprinting via vision-based tool path compensation. Sci Rep. 14 (1), 17764 (2024).
  4. Li, H., Zhou, H., Xu, C., Wei, Y., Tang, X. 3D bioprinting and scaffold-free strategies for fabrication of multicellular tissues or organoids. Int J Bioprinting. 9 (1), 135 (2023).
  5. Mironov, V. R., et al. Organ printing tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (11), 2164-2174 (2009).
  6. Côrtes, I., et al. Mimicking lipolytic adipogenic and secretory capacities of human subcutaneous adipose tissue using spheroids. Front Cell Dev Biol. 11, 1219218 (2023).
  7. Shi, Y., et al. Advances in culture of adipose-derived stromal stem cells. Front Endocrinol (Lausanne). 15, 1343255 (2024).
  8. Suchanecka, M., et al. Adipose-derived stem cells in regenerative medicine. Biomed Pharmacother. 186, 118036 (2025).
  9. Kim, E. M., et al. Fabrication of core shell spheroids for engineering vascularized tissues. Acta Biomater. 100, 158-172 (2019).
  10. Kronemberger, G. S., et al. Hypertrophic cartilage induction influences building block capacity of ASC spheroids. Artif Organs. 45 (11), 1208-1218 (2021).
  11. Caprio, N. D., Burdick, J. A. Engineered biomaterials guiding spheroid formation and function. Acta Biomater. 165, 4-18 (2023).
  12. Kopinski-Grünwald, O., et al. Scaffolded spheroids for cartilage tissue engineering. Acta Biomater. 174, 163-176 (2024).
  13. Mekhileri, N. V., et al. Automated 3D bioassembly of microtissues. Biofabrication. 10 (2), 024103 (2018).
  14. Groll, J., et al. Biofabrication reappraising the definition. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
  15. Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly of cells. Tissue Eng Part A. 14 (3), 413-421 (2008).
  16. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotechnol. 32 (8), 773-785 (2014).
  17. Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Advances in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
  18. Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Spheroids as building blocks in tumor microenvironment models. Int J Bioprinting. 7 (3), 444 (2021).
  19. Levato, R., et al. From shape to function in bioprinting. Adv Mater. 32 (12), 1906423 (2020).
  20. Moroni, L., et al. Biofabrication terminology and technology. Trends Biotechnol. 36 (4), 384-402 (2018).
  21. Sun, W., et al. The 2022 biofabrication roadmap. Biofabrication. 15 (1), 012001 (2023).
  22. Kronemberger, G. S., et al. Automated production of ASC spheroids for bioprinting. J Vis Exp. (181), e63430 (2022).
  23. Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
  24. Arguchinskaya, N. V., et al. Properties and printability of GelMA hydrogels. Int J Mol Sci. 24 (3), 2121 (2023).
  25. Compaired, P. M., García-Gareta, E., Pérez, M. &. #. 1. 9. 3. ;. Workflow for bioprinting optimization. Int J Bioprinting. 11 (3), 397-415 (2025).
  26. Gaglio, C. G., et al. GelMA synthesis and comparison for bioprinting. Front Bioeng Biotechnol. 12, 1383010 (2024).
  27. Gillespie, G. J., et al. Influence of printing parameters and cell density on bioink outcomes. Tissue Eng Part A. 26 (23–24), 1349-1358 (2020).
  28. Maggiotto, F., et al. Perfusable vascularized cancer niche via 3D bioprinting. Front Bioeng Biotechnol. 13, 1484738 (2025).
  29. Shie, M. Y., et al. Effects of GelMA concentration on properties and fibroblast behavior. Polymers (Basel). 12 (9), 1930 (2020).
  30. Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. Advanced bioinks for 3D printing. Adv Mater. 32 (12), 1902026 (2020).
  31. Pepelanova, I., Kruppa, K., Scheper, T., Lavrentieva, A. GelMA hydrogels for tissue engineering. Polymers (Basel). 10 (11), 1134 (2018).
  32. Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting from bench to translation. Adv Mater. 31 (23), 1805510 (2019).
  33. Kronemberger, G. S., Chattahy, K., Spagnuolo, F. D., Karam, A. S., Kelly, D. J. Bioassembly of fibrocartilage microtissues for meniscal grafts. Adv Healthcare Mater. 14 (32), e02208 (2025).
  34. Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting for regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
  35. Decarli, M. C., et al. Bioprinting stem cell spheroids for cartilage engineering. Adv Healthcare Mater. 12 (7), 2203021 (2023).
  36. Zhang, Z., Liu, Y., Tao, X., Du, P., Enkhbat, M., et al. Engineering cell microenvironments with spheroids and hydrogels. Polymers (Basel). 15 (9), 1925 (2023).
  37. Zuliani, C. C., da Cunha, J. B., Correa, R. F., Pinto, J. u. n. i. o. r. . E. A., d’Ávila, M. A., et al. Injectable hydrogel for delivery of MSC spheroids in cartilage regeneration. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 53 (1), 453-467 (2025).
  38. Unagolla, J. M., Jayasuriya, A. C. Hydrogel-based 3D bioprinting review. Appl Mater Today. 17, 100479 (2019).
  39. Kim, M. H., Singh, Y. P., Celik, N., Yeo, M., Rizk, E., et al. High-throughput bioprinting of spheroids. Nat Commun. 15 (1), 10083 (2024).
  40. Daly, A. C., Davidson, M. D., Burdick, J. A. Spheroid fusion within self-healing hydrogels. Nat Commun. 12 (1), 753 (2021).
  41. Prabhakaran, V., Melchels, F. P. W., Murray, L. M., Paxton, J. Z. Engineering bone tissues via spheroid fusion. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1308604 (2023).
  42. Gabriella, , et al. Probing multicellular tissue fusion of cocultured spheroids. Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2103320 (2021).
  43. Kim, S., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multicellular spheroids. Adv Healthcare Mater. 9 (12), 2000608 (2020).
  44. Zhang, J., Yun, S., Du, Y., Zannettino, A., Zhang, H. Hydrogel-based preparation of cell aggregates. Appl Mater Today. 20, 100747 (2020).
  45. Khajehmohammadi, M., Azizi Tafti, R., Nikukar, H. Effect of porosity on bioprinted scaffolds. J Biomed Mater Res A. 111 (2), 245-260 (2023).
  46. Kim, M., et al. Enhanced nutrient transport in engineered cartilage constructs. Acta Biomater. 58, 1-11 (2017).
  47. Chariyev-Prinz, F., et al. MSC response to hydrostatic pressure in chondrogenesis supportive environments. J Biomech. 154, 111590 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Human Adipose Stem CellsBiofabrication WorkflowTissue EngineeringSpheroid FormationGelMA Scaffold3D PrintingSpheroid BioassemblyScaffold DesignRegenerative Medicine

İlgili makaleler