Yöntem makalesi

Fare Kornealarından Tek Hücreli Süspansiyonun Hasat İçin Bir Protokol

DOI:

10.3791/69844

⸱

3 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, kollajenaz A ve tripsin ile ardışık sindirim yoluyla tüm fare kornealarından yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, yüksek RNA bütünlüğüne sahip geçerli tek hücreler sağlar ve bu da onları tek hücreli RNA dizileme ve akış sitometriy gibi sonraki uygulamalarla uyumlu kılar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Göz küreğinin en dış tabakası olan kornea, göz yüzeyinin homeostazını ve görüşünü korumada kritik bir rol oynar. Tek hücreli RNA dizilemesinde (scRNA-seq) son gelişmeler, korneal hücresel heterojenliğin yüksek çözünürlüklü analizini mümkün kılmıştır; ancak kornea dokusundan yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların hazırlanması, yoğun ve karmaşık yapısı nedeniyle hâlâ zordur. Bu çalışmada, tüm fare kornealarından tek hücreli süspansiyonlar üretmek için sağlam bir protokol oluşturduk. Bu işlem, korneaların ince parçalara doğranmasını ve ardından kollajenaz A ve tripsin kullanılarak ardışık enzimatik sindirimi içerir. Ortaya çıkan hücre süspansiyonu kalite açısından birden fazla metrikle değerlendirildi: hücre canlılığı ve sayısını değerlendirmek için tripan mavisi boyama kullanıldı; Pancytokeratin ve Keratocan için immünofluoresans boyama, başlıca kornea hücre tiplerinin tanımlanmasını ve nicelendirilmesini sağladı; ve RNA bütünlüğü bir biyoanalizör kullanılarak doğrulandı. Bu protokol, yüksek hücre sayıları, mükemmel canlılık (%94,6≥ ve yüksek oranda tek hücre oranı (%96,3) ile tek hücreli preparatlar sunar; bu da scRNA-seq dahil olmak üzere zorlu sonraki uygulamalarla uyumlu gereksinimleri karşılar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kornea, göz küresinin en dış katmanında yer alır ve beş farklı katmandan oluşan oldukça düzenli bir mimari sayesinde bariyer ve kırma işlevleri için gereklidir: epitelyum, Bowman tabakası, stroma, Descemet membranı ve endotel1. Kornea epitel, keratinizesiz tabakalı bir skuamöz yapıdır; dış patojenlere karşı fiziksel bir bariyer sağlar ve güçlü antimikrobiyal ve rejeneratif kapasiteler sergiler. Stroma, tam olarak hizalanmış kolajen fibrillerinden oluşur ve kornea şeffaflığını ve uniform bir kırılmaindisini 2 korur. Endotelyum, monohücreli bir tabakadır ve stroma ile sulu humor arasındaki sıvı transferini düzenleyerek kornea hidrasyonunu ve besin tedaminikorur. Buna rağmen, bu karmaşık yapısal ve hücresel karmaşıklık, kornea biyolojik fonksiyonlarının ve altında yatan mekanizmaların araştırılması için tarihsel olarak önemli zorluklaryaratmıştır 4.

Hücrelerarası etkileşimleri incelemek ve hücre tipine özgü belirteçleri belirlemek için, akış sitometrisisıralaması 5 ve tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq)6 gibi teknikler yaygın olarak kullanılmaktadır. Her iki yaklaşımda da ortak olan büyük teknik engel, yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasıdır. Toplam hücre verimi, tek hücre oranı ve hücre yaşamlılığı gibi parametreler, kornea hücresi fonksiyonunu ve yüzey işaretleyici ifadesini karakterize etmeye yönelik aşağı akış uygulamalarının güvenilirliği içinkritiktir 7. Önemine rağmen, tüm fare kornealarından tek hücreli süspansiyon üretmek için standart ve verimli protokoller eksikliği devam etmektedir.

Kornea dokusundan tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Kollajenaz A, tripsin veya TripLE kullanılarak ardışık enzimatik sindirim, hem insan hem de fare kornealarından tek hücreleri izoleetmek için kullanılmıştır 8. Kornea dissosiyasyonu için de tekrarlayan tripsinasyon⁷ kullanılmıştır. Ayrıca, Miltenyi Biotec'in ticari çoklu doku ayrıştırma kitleri, kornea tek hücreli süspansiyonlar üretmek için başarıylauygulanmıştır9. Önceki farklı kornea sindirim yöntemlerinin karşılaştırmalı çalışmasında, kollajenaz ve tripsinle ardışık tedavinin optimal yaklaşım olduğunu gösterdik. Bu yöntem sürekli olarak yüksek hücre sayıları, mükemmel canlılık (≥94,6%), yüksek tek hücre oranı (%96,3) ve iyi korunmuş RNAbütünlüğü 10 sağlar.

Bu protokolde, yerleşik deneyimimiz ve önceki bulgularımıza dayanarak, tüm fare kornealarından yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar üretmek için bu optimize edilmiş enzimatik sindirim stratejisini kullanarak ayrıntılı ve adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

6-8 haftalık dişi C57BL/6 (B6) fareleri, Guizhou Tıp Üniversitesi Deneysel Hayvan Merkezi tarafından temin edilmiştir. Hayvanlar, 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü altında ve yiyecek ile suya imkansız erişim sağlanıyordu. Tüm prosedürler, Guizhou Tıp Üniversitesi Deneysel Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış (Onay No. 2305185) ve ARVO Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Bildirisi ile uyumlu olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hazırlık

  1. Cerrahi aletlerin hazırlanması: İki çift oftalmik makas, iki çift oftalmik pens, bir çift doku forsepsi ve bir adet 2 mL santrifüj tüpünü çift damıtılmış su (DDW) ile iki kez durulayarak temizleyin. Aletleri ve tüpü buharlı otoklav kullanarak sterilize edin. Tüm ürünleri geleneksel bir fırında 65 °C sıcaklıkta gece boyunca kurutun.
  2. Çözelti hazırlığı
    1. Ek Hormonal Epitel Ortamı (SHEM): DMEM/F12 ortamına aşağıdaki bileşenleri ekleyerek SHEM hazırlayın: %5 (v/v) fetal sığır serumu (FBS), %0,5 (v/v) dimetil sülfoksit (DMSO), 10 ng/mL fare epidermal büyüme faktörü, 5,5 μg/mL transferrin, 0,5 μg/mL hidrokortizon, %1 (v/v) penisillin-streptomisin (100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin).
      NOT: SHEM, işleme sırasında hücrenin yaşamını korumak için kullanılır. En az %10 (v/v) FBS içeren bazal DMEM veya fosfatla tamponlu tuzlu su (PBS) gibi alternatif ortamlarla değiştirilebilir.
    2. Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS)
      1. 22,4 g PBS tozunu 2 L çift damıtılmış suda (DDW) manyetik karıştırıcı kullanarak çözündürerek 1× PBS elde edin.
      2. PBS çözümünü bir gün önceden otoklav edin ve soğumasına izin verin.
      3. Steril koşullarda, 47,5 mL steril 1× PBS 50 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 2,5 mL %1 (v/v) penisillin-streptomisin ekleyin.
        NOT: 1× PBS formülasyonu (2 L) 137 mM NaCl, 8 mM Na2HPO 4 ve 2 mM NaH2PO4, pH 7.2 içerir.
    3. Kollagenaz A çözeltileri
      1. Stok çözeltisi: 1 g kollajenaz A tozunu 40 mL DDW içinde çözüp çöz. Filtre 0.2 μm filtreyle sterilize edin ve -20 °C'de sakla.
      2. Çalışma çözeltisi: 1 mL kollagenaz A stok çözeltisini 4 mL steril DDW ile seyreltirin ve nihai konsantrasyon 5 mg/mL elde edilir.
    4. Tripsin çözeltisi: Kullanımdan önce ticari olarak bulunan %0,25 (w/v) tripsin/EDTA çözeltisi (0,91 mM EDTA içerir) buzda eritilebilir.
    5. Trypan Blue çözeltisi (%0,4): 0,4 g Trypan Blue'yu 100 mL DDW'de çözüp çözebilirsiniz. Filtre kağıdı ile filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: %0,4 Trypan Blue çözeltisi, toplam hücre sayısı, tek hücre oranı ve canlılık değerlendirmesi için kullanılır. Ticari canlı/ölü boyama kitleri veya otomatik hücre sayma sistemleri ile değiştirilebilir.

2. Fare kornealarının hazırlanması

  1. Diseksiya mikroskobu ve çalışma alanını %75 etanol ile silerek sterilize edin, ardından alanı biyolojik güvenlik dolabında 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın.
  2. Steril koşullarda şunları hazırlayın: 5 mL SHEM ortamı içeren bir 60 mm Petri kabı, her biri 5 mL 1× PBS içeren üç 60 mm Petri kabı ve %5 penisillin-streptomisin (P-S) takviyesi, her biri 5 mL düz 1× PBS içeren üç 60 mm Petri kabı ve bir steril 2 mL santrifüj tüpü
  3. Fareyi CO2 boğulması ve ardından servikal disloksiyon ile ötenazi yapın.
  4. Fare başını ve kapalı göz kapaklarını %5 P-S içeren PBS'ye üç kez batırarak iyice durulayın, ardından enukleasyona geçin.
  5. Oftalmik makas kullanarak, her göz küresinin arka kutbu boyunca bir kesi açın ve izole edilen gözleri buz gibi SHEM ortamı içeren Petri kabına dikkatlice yerleştirin (Şekil 1A).
    NOT: Hücre canlılığını maksimize etmek için tüm çözeltimler önceden 4 °C'ye soğutulmalı ve tüm diseksiyon adımları buz üzerinde yapılmalıdır.
  6. Petri kabını gözlü hemen biyolojik bir güvenlik dolabına aktarın. Göz küreklerini, %5 P-S içeren 1× PBS ile üç kez yıkayın, her yıkamada 5 dakika kuluçka yapın.
  7. Bir disseksiya mikroskobu altında, kornea dokusunu dikkatlice ayırın: Oftalmik makas ve pens kullanarak, arka kutuptan kornea limbusuna doğru bir kesi yapın. Korneayı skleradan ve konjonktivadan limbal sınır boyunca nazikçe ayırın. Lens ve irisi iki çift forseps kullanarak tamamen çıkarın (Şekil 1B).
  8. Oftalmik forseps kullanarak, kornea dokusunu 1× PBS içeren bir Petri kabına aktarın ve kalan kornea dışı doku ile antibiyotikleri çıkarmak için üç kez (her biri 5 dakika) yıkarsınız.
    NOT: İris genellikle korneaya sıkıca yapışır. Kontaminasyonu önlemek için penslerle nazikçe ve tamamen çıkarıldığından emin olun, sadece berrak kornea dokusu kalın.
  9. Oftalmik forseps kullanarak, temizlenmiş kornea dokusunu 2 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve 1 mL kollagenaz A çalışma çözeltisi (5 mg/mL) ekleyin.
  10. Oftalmik makas kullanılarak, kornea dokusunu tüpün içinde yaklaşık 0,5 mm × 0,5 mm parçalara doğran.
  11. Kornea parçalarını içeren tüpü ve kollagenaz A çözeltisini hücre kültürü inkubatöründe 37 °C'de 1 saat boyunca kuluçka yapın (Şekil 2A-C).
  12. Kollagenaz A sindirimi sırasında dokuyu her 10 dakikada bir izleyin. Büyük doku parçaları kalmadığında sindirimi santrifüjleme ile sonlandırın. Örneği 300 x g sıcaklıkta, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj ile santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice aspire edin.
  13. Pelleti %0,25 tripsin/EDTA çözeltisi olan 200 μL içinde yeniden süsküyünüz.
  14. Tüpü hücre kültüründe 37 °C'de 10 dakika boyunca kuluçka yapın ve kalan doku parçalarını sindirin.

3. Kornea tek hücrelerinin izolasyonu

  1. Karışımı (doku ve tripsin/EDTA çözeltisi) geniş delikli bir P1000 pipeti ile defalarca nazikçe tritüre ederek dokuyu tek hücreli süspansiyona ayırın.
  2. Hücre süspansiyonunu 300 x g ile 5 dakika santrifüjle yapın ve süpernatantı atın. Hücre pelletini, %0,04 sığır serum albümini (BSA) içeren 1 mL PBS içinde yeniden süspansiyon ile tek hücreli bir süspansiyon elde edin.
    NOT: Dizileme veya akış sitometrisi için tasarlanan hücreler için, serumsuz PBS'ye yeniden süzülün. Kültürlenecek hücreler için, %0,04 BSA ile takviye edilmiş 1x PBS kullanın.
  3. Hücre süspansiyonu, önceden ıslanmış 40 μm hücre süzgeciyle yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne filtreleyerek hücre kümelerini ve kalıntılarını çıkarır.
    NOT: Hücre süzgecini önceden PBS ile ıslatarak hücre kaybını en aza indirin. Gerekirse, filtrelenen hücreler tekrar santrifüjlenip konsantrasyon için istenen hacmde yeniden askıya alınabilir.

4. Hücre sayımı

  1. 9 μL hücre süspansiyonunu 1 μL %0,4 Trypan Blue çözeltisi ile birleştirin ve nazikçe karıştırın.
  2. Karışımı belirlenen yükleme kanalı üzerinden yavaşça hemositometre odasına yükleyin. Hücreleri toplam hücre sayısını, yaşamlılığını ve tek hücrelerin oranını belirlemek için dört dörtlü yöntemle sayın. En az iki teknik kopya yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücreli süspansiyonların kalitesi, toplam hücre verimi, tek hücre oranı ve hücre canlılığı temelinde değerlendirildi. Askılık, Trypan Blue ile boyanmış ve birden fazla alan boyunca faz kontrast mikroskopisi kullanılarak analiz edilmiştir (Şekil 3). Dört fare gözünden (sekiz kornea) toplamda 1,05 × 105 hücre elde edildi; ortalama hücre canlılığı %94,6 ve tek hücre oranı %96,3'ü geçti. Bu sonuçlar, hazırlanan hücre süspansiyonun, akış sitometris...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücreli RNA dizilemesinin tanıtılması, göz araştırmalarında genomik, transkriptomik, epigenetik ve proteomik teknolojilerin kullanımını belirgin şekilde artırmıştır 9,10,11,12. Sonuç olarak, yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların hazırlanması giderek kritik hale gelmiştir; çünkü bireysel hücreler arasındaki sinyal değişimlerinin tespit edilmesine olan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmada hücrelerine katkıda bulunan tüm hayvanlara minnettarlıklarını ve saygılarını ifade etmek isterler. Bu çalışma, kısmen Guizhou Eyalet Bilim ve Teknoloji Projeleri (QKHJC-ZK[2024]ZD043 [S.O.]) tarafından desteklenmiştir; Fujian Eyalet Bilim Fonu Seçkin Genç Akademisyenler için (2023J06053 [S.O.]); Çin Doğa Bilimleri Vakfı (No.82101084 [S.O.'ya]; Guizhou Eyaleti Temel Araştırma Programı (Doğa Bilimleri)(QKHJC-ZK[2025]MS-473) [S.O.'ya]; Guizhou Eyaleti Yüksek Kaliteli Sağlık Geliştirme Tıp Araştırma Birliği Fonu (2024GZYKYJJKM0043) [S.O.'ya].

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 594 eşek karşıtı tavşanAbcamAB150064
AntikeratinAbcamab230175
Anti-pansitokeratinThermo Fisher ScientificAE1/AE3, Alexa FluorTM 488
Otoklav sterilizatörüAn ShenLDZH-100KBS
Sığır Serumu Albümini VSolarbioA8020
Hücre filtresiNEST25836940 μ m
Santrifüj makinesiEppendorf AG22331 Hamburg
Kollagenaz ARoche10103578001
Konfokal mikroskop  OberkochenZeiss LSM 880
Sayma plakasıMARIENFELDM407859
Santrifüj tüpNEST6206112 mL, 50mL
Kapak KayışıMARIENFELDM407859
DAPISolarbioC0065
Diseksiyon mikroskobuCarl ZEISSVISU150
DMEM/F12  MedyaGibco11320033
DMSOSolarbioD8371
Fetal  sığır  SerumGibco16140071
HidrokortizonSolarbioIH0100
ITSGibco23337619
Fare epidermal büyüme faktörüInvitrogenPMG8041
Oftalmik Cerrahi  ForsepsDumot0208-5-PO
Oftalmik cerrahi makasFST15021-15
FırınAISITEDH6000 II
Penisilin & StreptomisinGibco15070063100mL
Petri kabıNEST70520160mm
Fosfat tamponlu tuzlu suSolarbioP1010
Termostatik kuluçka makinesiThermo Fisher Scientific3111
Triton-X 100SolarbioT8200
Trypan Blue SolarbioT8070
Tripsin/EDTA GibcoR001100
Ultra-temizlik masasıYou QiVS-840-2
%4 ParaformaldehitSolarbioP1110

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eghrari, A. O., Riazuddin, S. A., Gottsch, J. D. Overview of the cornea:structure, function, and development. Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 7-23 (2015).
  2. Delmonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. J Cataract Refract Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
  3. Zhang, X., et al. Dry eye management:targeting the ocular surface microenvironment. Int J Mol Sci. 18 (7), 1398(2017).
  4. Dou, S., et al. Molecular identity of human limbal heterogeneity involved in corneal homeostasis and privilege. Ocul Surf. 21, 206-220 (2021).
  5. Adan, A., et al. Flow cytometry:basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 37 (2), 163-176 (2017).
  6. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  7. Altshuler, A., et al. Discrete limbal epithelial stem cell populations mediate corneal homeostasis and wound healing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1248-1261.e8 (2021).
  8. Kaplan, N., et al. Single-cell RNA transcriptome helps define the limbal/corneal epithelial stem/early transit amplifying cells and how autophagy affects this population. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (10), 3570-3583 (2019).
  9. Collin, J., et al. A single cell atlas of human cornea that defines its development, limbal progenitor cells and their interactions with the immune cells. Ocul Surf. 21, 279-298 (2021).
  10. Liu, X., et al. Optimization of method for achieving a single-cell suspension from mouse corneas. Exp Eye Res. 233, 109544(2023).
  11. Espana, E. M., Birk, D. E. Composition, structure and function of the corneal stroma. Exp Eye Res. 198, 108137(2020).
  12. Topouzi, H., et al. Methods for the isolation and 3D culture of dermal papilla cells from human hair follicles. Exp Dermatol. 26 (6), 491-496 (2017).
  13. Zhang, T., et al. The effect of amniotic membrane de-epithelialization method on its biological properties and ability to promote limbal epithelial cell culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 3072-3081 (2013).
  14. Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods Mol Biol. 1430, 61-76 (2016).
  15. Chen, W., et al. Existence of small slow-cycling Langerhans cells in the limbal basal epithelium that express ABCG2. Exp Eye Res. 84 (4), 626-634 (2007).
  16. Song, Z., Tsai, C. H., Mei, H. Comparison of different methods to isolate mouse limbal epithelial cells. Exp Eye Res. 212, 108767(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare KorneasEnzimatik SindirimKollajenaz ATripsin Sindirimimm nofloresan BoyamaH cre Canl lRNA B t nlKornea H cre TipleriAk Sitometrisi

İlgili makaleler