Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tek Antikor Etiketleme Kullanarak Zar Proteinlerinin Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskopisi

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69853

⸱

20 Mart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

Bu makalede

Özet

Bu protokol, plazma zarı proteinlerinin nano ölçekli mekânsal organizasyonunu çözmek için tek antikor etiketlemesini (SAL) tanımlar. Tek molekül düzeyinde kümülatif antikor-epitop etkileşimlerini kullanarak, membran SAL (mSAL), yerel epitop dağılımlarını haritalandırırken aynı zamanda doğal hücresel ortamda antikor bağlanma davranışını yakalar.

Özet

Plazma zarı hücre şeklini tanımlar ve hücrelerarası iletişimi yöneten arayüz olarak hizmet eder. Membran proteinleri, terapötik hedeflerin başlıca bir sınıfını oluşturur; Bu nedenle, hücre zarını yapısal proteinleriyle süper çözdürmek, hücre biyolojisi ve antikor tedavilerinin ilerlemesinde büyük umut vaat eder. Bu bağlamda, tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM), biyolojik yapılar üzerindeki protein organizasyonlarının nano ölçekli görselleştirilmesini mümkün kılar. Önemine rağmen, SMLM'yi plazma zarı proteinlerine uygulamak benzersiz zorluklar teşkil eder. Bu protokolde, membran SAL (mSAL) olarak adlandırılan zaman geçişli tek antikor etiketleme (SAL) kullanan etkili bir yaklaşım sunuyoruz. Nano ölçekli membran protein dağılımı ve membran morfolojisini çözmek için antikor konsantrasyonu, lazer güç yoğunluğu, aydınlatma dışı aralıkların süresi, görüntü yeniden yapılandırma ve yoğunluk tabanlı küme analizi gibi ayrıntılı adım adım talimatlar sunuyoruz. Tetraspanin proteini CD81'i model membran proteini olarak kullanarak, mSAL'ın hem yapışkan hem de süspansiyon memeli hücrelerinde yeteneğini gösteriyoruz. Hücre zarını ve membran proteinlerinin dağılımlarını süper çözdürmenin yanı sıra, tekniğimiz, doğal membran ortamında membran hedefleriyle etkileşime giren terapötik antikorların farmakodinamikinin araştırılmasını da mümkün kılar.

Giriş

Plazma zarı, hücre hareketliliği, yapışma, algılama ve hücreler arası iletişimi düzenleyen çeşitli protein dizilerine sahiptir. Plazma zarı proteinlerinin nanoölçekli dağılımını anlamak önemlidir, çünkü protein fonksiyonu genellikle sadece ifade seviyeleriyle değil, aynı zamanda membran 1,2 üzerindeki mekansal organizasyonlarıyla da yönetilir. Özellikle, birçok terapötik antikor membranproteinleri 3,4'ü hedef alır; bu da nano ölçekli araştırmaları, antikor etkileşimlerinin yerel membran protein organizasyonundan nasıl etkilendiğini anlamak için vazgeçilmez hale getirir. Ancak, zar protein dağılımının hassas haritalanması, bolluklarının tek moleküllü profillenmesi ve bağlanma partnerleriyle dinamik etkileşimlerinin gerçek zamanlı izlenmesi hâlâ zordur.

Yaygın olarak kullanılan tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) teknikleri, örneğin doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM)5,6 ve nanoölçekli topografide görüntüleme için DNA tabanlı nokta birikimi (DNA-PAINT)7, örnek etiketleme için immünofloresan (IF) boyama kullanır. ~ 10 nm yan çözünürlüklere ulaşmış ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2)8,9, CD2010, T hücrereseptörleri 11,12,13, programlanmış ölüm ligandı 114, B hücre reseptörleri 15,16,17 ve CD1917 dahil olmak üzere terapötik membran hedeflerinin nano ölçekli organizasyonu hakkında kapsamlı bilgiler sağlamışlardır.18. Örneğin, meme kanserinde rol oynayan anahtar reseptör olan HER2'yi doğrudan tespit etmek için terapötik monoklonal antikor Trastuzumab kullanılarak yapılan dSTORM çalışmaları, HER2 pozitif hastalar arasında belirgin kümelenmedurumları ortaya koymuştur 8; farklı terapötik antikorların HER2 kümelenmesini modüle ettiğigösterilmiştir 9. DNA-PAINT, kafes ışık levhası mikroskopisi ile birleştiğinde, B hücrelerinde CD20'nin oligomerik durumlarını ve etkileşim profillerini, terapötik monoklonal antikorlar rituximab, ofatumumab veobinutuzumab 10 ile aydınlatmıştır. Geleneksel SMLM, nano ölçekli organizasyon hakkında değerli bilgiler sağlasa da, tam potansiyeli geleneksel IF boyama yaklaşımlarıyla sınırlıdır. SMLM görüntüsünün kalitesi, IF boyamasına bağlıdır; bu boyama da etiketleme antikorunun özgülüğü ve eğilimiyle belirlenir. Geleneksel SMLM, genellikle üstün IF boyama ve görüntü kalitesi elde eden yüksek afiniteli antikorlar kullanır. Ancak, çoğu terapötik antikor, orta düzeyde afinitede olan canlı hücrelerin membran reseptörleriyle etkileşime girerek hedef dışı yan etkileri en azaindirir19. Örneğin, bispesifik T hücresi katılımcıları (TCE'ler) CD3'e daha düşük bir eğilim gösterir ve bu da TCRiçselleştirilmesini engeller 20,21,22. Bu tür etkileşimler geleneksel IF teknikleriyle doğru şekilde yakalanabilir.

Daha önce, tek moleküllü antikor-epitop etkileşimlerini doğrudan kullanan bir strateji geliştirdik; buna tek antikor etiketleme (SAL) deniyor. SAL, doğal bağlanma dengelerini korurken antikor-epitop etkileşimlerinin yüksek yoğunluklu haritalanmasınısağlar 23. Daha önce hücre içi sitoskelet ve mitokondriyal proteinler için bir protokolrapor etmiştik 24, ancak membran proteinlerinde SAL henüz gösterilmemiştir. Bu protokolde, hem süspansiyon hem de yapışkan hücrelerde rapor edilen terapötik hedefaday 25,26,27,28 olan tetraspanin CD81'in etiketlenmesiyle SAL'ın membran proteinlerine uygulanması için adım adım bir iş akışı sunuyoruz. Flüoresan olarak işaretlenmiş anti-CD81 antikorları kullanarak CD81'in U2OS ve Jurkat T hücrelerindeki mekansal dağılımını doğrudan inceleyerek, zar proteinlerinde SAL nano ölçekli çalışmaların uygulandığını gösteriyoruz. Bu stratejiye membran SAL (mSAL) adını verdik. Son olarak, hücre dışındaki izole tek molekül algılamalarını azaltmak için kümeleme temelli bir stratejiyi tanımlıyoruz.

Özünde, SAL bireysel antikor-epitop etkileşimlerini yakalamak için zaman geçişli tek molekül etiketlemesi kullanır ve ardından gelen tek emitör dekonvolüsyon, SMLM tabanlı süper çözünürlüklü bir görüntü elde eder. Antikor konsantrasyonunu ayarlayarak ve ardışık görüntü kareleri arasında uygun bir aydınlatma olmayan aralık (NII) seçerek, SAL antikor on-rate ile tek molekül tespit oranını eşleştirerek tek molekül lokalizasyonunu mümkün kılar. SAL, antikorların doğası gereği yavaş bağlanması nedeniyle daha uzun NII'ler gerektirir ve bu da görüntü alma sürelerini uzatır (~3-17 saat). SAL, epitopların hassas nano ölçekli haritalanması ve bireysel antikor-epitop etkileşim dinamiklerinin değerlendirilmesi gereken uygulamalar için en uygun uygundur. Daha düşük verimliliğine rağmen, SAL neredeyse fizyolojik koşullarda epitop organizasyonu ve antikor etkileşimi hakkında benzersiz bir bakış açısı sunar; bu da terapötik antikorların yerinde karakterizasyonu için özellikle değerli hale gelir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, yerleşik Jurkat E6.1 ve U2OS hücre hatlarını kullanır ve birincil insan veya canlı hayvan materyallerini içermez.

1. Hücre tohumlama/yerleştirme ve fiksasyon

NOT: Örnek hazırlama, farklı hücre tipleri arasında plazma zarı proteinlerinin alt hücre organizasyonunu korumak için optimize edilmiş standart immünofloresans (IF) boyama protokollerini takip eder. İlgilenen hedef için yerleşik bir immünboyama protokolü varsa, kullanıcılar bu protokolü örnek bloklama aşaması 1.2.14'e kadar takip edebilir. Tek antikor etiketleme (SAL), floresan etiketli antikorların antijenlerine tek molekül seviyesinde bağlanırken kümülatif olarak tespit edilmesine dayanır. Mikroskop aşamasındaki örneklere görüntüleme tamponunda seyreltilmiş floresan etiketlenmiş antikorlar eklenir ve görüntü alımı ilerledikçe floresan etiketleme dinamik olarak gerçekleşir. Numune hazırlama aşamasında floresan etiketleme yapılmaz.

  1. Daha önce yayımlanmışbir protokol 24'te tanımlandığı gibi, U2OS hücre hattı gibi yapışkan hücreleri hazırlayın.
  2. Hücre askıları
    1. Jurkat T hücrelerini, %5 ile %5 ile 100 μg/mL ile desteklenen nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 10mL tam RPMI ortamında (RPMI 1640, %10 (v/v) fetal sığır serumu ve 100 μg/mL streptomisin ile takviye edilmiş) 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde, %5CO2 ile takviye edilmiş şekilde 37 °C'de tutun.
      NOT: Önerilen 10 mL tam medya T25 termoları için geçerlidir; Kullanıcılar, farklı kültür kapları kullanırken hacmi buna göre ölçeklendirmelidir.
    2. Cam yüzeyini, 8 kuyruklu bir kapak camında kullanılmak üzere 200 μL %0,01 Poli-L-Lizin (PLL) çözeltisi ekleyerek hazırlayın. Gece boyunca 4 °C'de veya 2 saat boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
    3. Kültürden çıkan hücreleri hemositometre ile sayın, ardından 3,5 x 104 hücreyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Hücre sayısı, tek hücrelerin iyi bir dağılımı için ayarlanması gerekebilir. 30.000-60.000 Jurkat T hücresi tohumlama aralığı, tek hücrelerin birbirinden net ayrıldığı ve çok seyrek dağılım olmadan ideal bir yoğunluk elde eder. Hücre sayısının yeni bir hücre tipine göre ayarlanması gerekebilir.
    4. 300 x g boyunca 3 dakika boyunca santrifüj yapın ve hücre pelleti elde edin. Süpernatantı atın ve hücre pelletini 200 μL önceden ısıtılmış (37 °C) 1x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salini (DPBS) ile yeniden askıya alın. Ortaya çıkan hücre pelleti, mikrosantrifüj tüpünün dibinde küçük, beyaz bir birikinti olarak görünür olur.
      NOT: Biyotehlike atıkları kurumun yönergelerine ve ilgili tüm yerel, eyalet ve federal düzenlemelere uygun olarak bertaraf edin.
    5. PLL çözeltisini hazırlanmış odalı kapak camından aspire edin (adım 1.2.2). PLL kuluçkası gece boyunca 4 °C'de gerçekleşirse, 8 kuyruklu kapak camını 37 °C'ye kadar önceden ısıtarak çözeltiyi aspire et.
    6. Bölüm 1.2.4'ten hücre askısını ekleyin. PLL kaplamalı oda yuvasına geçti. Hücrelerin yüzeye tutunmasını sağlamak için 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde, %5CO2 ile 30 dakika boyunca kuluçka yapın. Hücre süspansiyonunu kaplamadan önce iyice karıştırın ve pipet yapın, böylece hücre kümeleri parçalanır ve kuyu boyunca eşit dağılımı sağlanır.
    7. Hücrenin cam yüzeye tutuşunu ışık mikroskobu ile kontrol edin. 10x büyütme altında, mikroskobu kapak camının altına odaklayın.
      NOT: Mikroskop altında gözlem yaparken kameralı kapak camına hafifçe dokunmak, hücrelerin yüzeye yapışıp yapışmadığını veya hâlâ yüzüyor olup olmadığını değerlendirmeye yardımcı olabilir.
    8. 200 μL fiksasyon tamponu (DPBS'de %4 paraformaldehit ve %0,1 glutaraldehit) hazırlayın ve su banyosunda 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
      NOT: Sağlanan fiksasyon tamponu CD81 için optimize edilmiştir ve genellikle membran proteinlerinin korunması için uygundur. Yeni membran protein hedefleri için, tampon bileşiminin optimal koruma sağlanması için ayarlanması gerekebilir. Kullanıcılar, yeni hedeflere özel fiksasyon koşulları için literatüre bakmaları teşvik edilir.
      DIKKAT: Paraformaldehit toksik ve kanserojendir. Glutaraldehit toksik ve aşındırıcıdır. Bu reaktifi kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyin. Cilt teması durumunda, etkilenen bölgeyi hemen sabun ve suyla iyice yıkayın. Reaktifi, kullanıcının kurum yönergelerine ve tüm geçerli yerel, eyalet ve federal düzenlemelere göre bertaraf etmelidir.
    9. Her örnek kuyusundan DPBS'yi (adım 1.2.6'dan itibaren) mikropipet kullanarak aspire edin.
      NOT: Hücrelerin kapak camından ayrılmasını önlemek için tüm çözüm değişim adımlarını yavaş yapmak kritik öneme sahiptir. Biyotehlike atığı, kullanıcının kurum yönergelerine ve tüm geçerli yerel, eyalet ve federal düzenlemelere uygun olarak bertaraf etmektir.
    10. Kuyunun bir köşesine 200 μL önceden ısıtılmış 37 °C fiksasyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın.
      DIKKAT: Paraformaldehit toksik ve kanserojendir. Glutaraldehit toksik ve aşındırıcıdır. Bu reaktiflerle çalışırken uygun PPE giyin. Cilt teması durumunda, etkilenen bölgeyi hemen sabun ve suyla iyice yıkayın. Reaktifi, kullanıcının kurum yönergelerine ve tüm geçerli yerel, eyalet ve federal düzenlemelere göre bertaraf etmelidir.
    11. Sabit hücreleri 3 kez 500 μL DPBS ile yıkayın. 1.2.12 adımına devam ediyorsanız bu adımı atlayın.
    12. İsteğe bağlı: Fiksasyon çözeltisini yavaşça çıkarın ve DPBS'ye 200 μL taze hazırlanmış %0,1 sodyum borohidrit ekleyin, ardından oda sıcaklığında 7 dakika kuluçka yapın. Bu adımı atlayın ve sodyum borohidrit indirgemesi kullanılmıyorsanız 1.2.14 adımına geçin.
      NOT: Sodyum borohidrit ile yapılan indirgeme, glutaraldehit tarafından üretilen otofloresansı soğutmaya yardımcı olur ve reaksiyona girmemiş aldehitleri nötralize eder. Sodyum borohidridin sulu çözelti ile reaksiyona girmesiyle hidrojen gazının salınması, kabarcıkların salınması olarak ortaya çıkar. Hidrojen gazı salınımı gözlemlenmezse, taze yapılmış sodyum borohidrid çözeltisi kullanın.
      DIKKAT: Sodyum borohidrit toksik ve aşındırıcıdır. Bu reaktifi kullanırken uygun PPE giyin. Cilt teması durumunda, etkilenen bölgeyi hemen sabun ve suyla iyice yıkayın. Reaktifi, kullanıcının kurum yönergelerine ve tüm geçerli yerel, eyalet ve federal düzenlemelere göre bertaraf etmelidir.
    13. Her kuyidan sodyum borohidrid çözeltisini aspire edin, ardından 500 μL DPBS ile üç kez yıkayın.
    14. 200 μL bloklama tamponu hazırlayın ve kuyuya ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın. Bir permeabilizasyon reaktifi (örneğin, TritonX-100, saponin) kullanmayın, çünkü bu membran proteinlerini çıkarabilir. Burada sunulan CD81 için sunulan membran SAL (mSAL) protokolünde bloklama aşaması bulunmamıştır.
      NOT: Yeni hedeflerle mSAL için DPBS'de %5 (w/v) sığır serum albümini (BSA) içeren bir bloklama tamponu önerilir. İkincil antikorlar kullanılırken, ilgili serum bloklama için kullanılır. Örneğin, keçi konakçısı ikincil antikor kullanıldığında DPBS'de %10 (v/v) keçi serumu var. Eğer belirlenmiş bir bloklama tamponu tarifi ve hedef için bir protokol varsa, kullanıcılar bu protokolü takip edebilir. Bloklayıcı tampon, isteğe bağlı olarak izotip kontrol antikorları veya serum kaynaklı antikorlarla desteklenerek antikorların hedef dışıbağlanmalarını azaltabilir 23,24. Antikor membran proteininin hücre içi epitopunu hedefliyorsa bloklayıcı tampona permeabilizasyon reaktifi eklemek mümkündür.
    15. Boyayla konjuge edilmiş primer antikorlarla mSAL için, doğrudan 1.2.20. adıma geçin.
    16. 150 μL primer antikor boyama çözeltisi (istenen konsantrasyonda antikor, bloklama tamponunda seyreltilmiş) hazırlayın. Boyayla konjuge edilmiş primer antikorlarla mSAL için bu adımı atlayın.
      NOT: Birincil antikor boyama için, önerilen durumlar için satıcının veri sayfasına bakınız. Konsantrasyon bilgisi verilmiyorsa, tam boy IgG23,24 için 4 μg/mL (27 nM) ile başlayın.
    17. Bloklayıcı tamponu birincil antikor çözeltisiyle değiştirin. Oda sıcaklığında 2 saat veya 4 °C'de gece boyunca nemli bir odada kuluçka yapın. Boyayla konjuge edilmiş primer antikorlarla mSAL için bu adımı atlayın.
    18. Örneği 400 μL DPBS ile 2 kez yıkayın. Kuyuya 200 μL bloklama tamponu ekleyin.
    19. İsteğe göre: Bloklama tamponunu 200 μL fiksasyon sonrası tampon (%4 paraformaldehit) ile değiştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Fiksasyon sonrası işlem, SAL23,24 için örnek bloklamanın korunmasına yardımcı olur. Ancak, epitopların erişilebilirliğini azaltıyorsa bu adım çıkarılmalıdır. Fiksasyon sonrası antikorların epitop tanıma üzerindeki etkisini değerlendirmek için, fiksasyon sonrası ve fiksasyon olmadan standart immünoflüoresans boyama yapılabilir ve boyama kalitesini karşılaştırır.
    20. İsteğe bağlı: Numuneyi DPBS ile 2 kez yıkayın.
    21. Her kuyuya 200 μL DPBS ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için kamerayı şeffaf bir film ile kaplayın. Örnekler 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir. Eğer mSAL işlemi hemen 1.2.14 veya 1.2.19 aşamasından sonra sabitleme sonrası yapılmadan yapılırsa, örneği engelleme tamponunda tutun ve doğrudan 2.2. adıma geçin.
      NOT: Numuneyi DPBS'de 5 mM sodyum azid takviyesi ile tutmak, depolama sırasında bakteri büyümesini önler.
      DIKKAT: Sodyum azid son derece toksiktir ve yutulduğunda ölümcül olabilir. Bu reaktifi kullanırken uygun PPE giyin. Cilt teması durumunda, etkilenen bölgeyi hemen sabun ve suyla iyice yıkayın. Reaktifi, kullanıcının kurum yönergelerine ve tüm geçerli yerel, eyalet ve federal düzenlemelere göre bertaraf etmelidir.

2. Görüntü Edinimi

NOT: Hem yapışkan hem de süspansiyon hücreleri için görüntüleme prosedürü benzerdir ve toplam iç yansıtma floresansı (TIRF) mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, görüntüleme koşulları her hücre tipi için optimize edilmelidir.

  1. Fotoğraflamadan önce depolanmış örneklerin (4 °C) oda sıcaklığına gelmesine izin verin, böylece camda yoğuşma oluşmasını önleyin. Numune hazırladıktan sonra doğrudan görüntülemeye geçiyorsanız bu adımı atlayın.
  2. Mikroskop sistemini çalıştırın: mikroskop, sCMOS kamera, lazer ünitesi ve görüntü alma yazılımına sahip bilgisayar. Mikroskop sisteminin beslendikten sonra 5-10 dakika stabil olmasına izin verin; böylece sistem bileşenleri çalışma sıcaklıklarına ulaşabilir ve termal kaymayı en aza indirebilir.
    NOT: mSAL, herhangi bir TIRF mikroskobu kurulumu ve uyumlu yazılım kullanılarak gerçekleştirilebilir. Sistemi cihazın talimatlarına göre aç.
  3. Daldırma yağı, TIRF objektefine (örneğin, 100x/1.49) uygulan ve odalı kap camını mikroskop aşamasına monte edin.
    NOT: Objektif düzeltme tasmasıyla donatılmışsa, kaplama camının doğru kalınlığında 23 °C olarak ayarlandığından emin olun. Bu çalışmada kullanılan örtü camının kalınlığı 0,13-0,17 mm arasındadır.
  4. Eğer takıldıysanız, Mükemmel Odak Sistemi (PFS) ile bağlantılı olun, ardından objektif dikkatlice kapak camına yükseltilin ve örneği netleme alın.
  5. Altın kolloidleri fiducial marker olarak hazırlayın (ultra-saf suda 1:2 seyreltme). Altın kolloidleri sonikle 3 dakika boyunca seyreldirin ve agregalar dağılır.
  6. Numune kuyusundan depolama tamponunu (DPBS veya bloklama tamponu) nazikçe aspire edin ve numuneye 200 μL altın kolloid çözeltisi ekleyin. 1 dakika kuluçka yapın ve çözeltiyi çıkarın.
  7. Çözeltiyi aspire etmeden önce yeterli miktarda altın kolloidinin biriktirildiğini doğrulamak için parlak alan aydınlatması kullanın. İdeal yoğunluk, belirlenen ilgi alanı (ROI) içinde 5 ila 10 altın kolloidinden oluşur.
    NOT: Alternatif olarak, floresan mikroküreler ( bkz. Materyal Tablosu) DPBS cinsinden 1:1.000 seyreltmede kullanılabilir.
  8. Fazla altın kolloidleri çıkarmak için 1 kez 500 μL ultra saf suyla yıkayın, ardından 200 μL DPBS ekleyin.
  9. Görüntüleme yazılımında, antikor probun floroforu için optik konfigürasyonu oluşturulur; uygun dikromik, lazer uyarılma dalga boyu ve güç yoğunluğu, kamera entegrasyon süresi, emisyon filtresi ve kamera piksel binleme (varsa) dahildir. Optimal çözünürlüğe ulaşmak için 150-160 nm piksel boyutu önerilir.
  10. Fotobeyazlama adımı için optik bir konfigürasyon oluşturun. 380 W/cm 2 veya daha yüksek lazer gücü ve 1 saniye kamera entegrasyon süresi önerilir.
    NOT: Alım sırasında fotobeyazlama, bireysel floresan antikor bağlanma olayları arasındaki örtüşmeyi en aza indirmeye yardımcı olur. Toplanan ışık, kamera doygunluğunu önlemek için eşleşmeyen bir dalga boylu emisyon filtresinden yönlendirilebilir.
  11. TIRF aydınlatması için lazer açısını ayarlayın. Parlak alan aydınlatması kullanılarak, mSAL için bir hücre belirleyin. Görüntü rekonstrüksiyonu sırasında aşama kaymasını düzeltmek için ROI içinde en az 5 altın kolloidin görünür olduğundan emin olun. Görüntüleme lazer güç yoğunluğunda altın kolloidlerden otofloresansı doğrulayın.
  12. Görüntüleme parametrelerini ayarlayın: aydınlatma gerektirmeyen aralık (NII), kare sayısı ve foto ağartma adımının (gerekirse) frekansı görüntü alma yazılımında. U2OS ve CD81 antikorlu Jurkat T hücrelerinde CD81 mSAL'ı için optimal ayarlar 5 saniyelik NII, toplam 2.000 kare ve her 5. karede bir fotobeyazlama adımıydı.
    NOT: Bu parametreler, ilgi çeken her protein, mSAL için kullanılan antikor ve hücre tipi için optimize edilmelidir. Optimizasyon hakkında daha fazla detay için adım 3'e bakabilirsiniz. Optimal çerçeve sayısı, antikor hedefi ile hücre tipi arasında değişebilir. Yeni hedef sistemler için başlangıç noktası olarak 2.000-3.000 kare yakalamak önerilir. NII'ler görüntü alım sürelerini uzatır. Örneğin, 20 saniyelik bir NII ile 3.000 kare mSAL satın alma, ~17 saat satın alma süresi sağlar.
  13. CD81 antikorun DPBS'de %5 BSA (w/v) içinde 200 μl konsantrasyonuna kadar 1 μg/mL konsantrasyonuna seyreltilerek görüntüleme tamponunu hazırlayın. CD81 mSAL'ı için nihai antikor konsantrasyonu Jurkat T hücreleri için 0,5 nM, U2OS hücreleri için ise 2 nM idi.
    NOT: Antikor konsantrasyonu, yerel substrat bolluğuna ve antikorun afinitesine bağlıdır. Her protein hedefi, görüntüleme için kullanılan her antikor ve her hücre tipi için antikor konsantrasyonlarının optimize edilmesi kritik öneme sahiptir. Optimizasyon hakkında daha fazla detay için adım 3.1'e bakınız.
  14. Hazırlanmış görüntüleme tamponunu kuyuya ekleyin ve satın almaya başlayın.

3. Görüntüleme parametre optimizasyonu

NOT: mSAL görüntüleme parametreleri, protein ifadesi, yerel organizasyonu ve görüntüleme için kullanılan antikor seçimi tarafından etkilenir. Görüntüleme parametrelerinin optimize edilmesinin amacı, mekansal olarak çözülen tek moleküllü olaylar üreten antikor konsantrasyonunu ve NII'yi belirlemek, epitop örneklemesini maksimize etmek için yeterli yoğunlukları korumaktır.

  1. Antikor konsantrasyonu
    1. Antikoru Jurkat hücreleri için 0,5 nM'e, U2OS hücreleri için 2 nM'e kadar seyreltin, DPBS'de %5 (w/v) BSA içeren 200 μL ile ve antikor çözeltisini kuyuya ekleyin. Optimal tek antikor etiketlemesi için, denge dissosiyasyon sabitinde veya yakınında (Kd) bir antikor konsantrasyonu kullanın; Kd bilinmiyorsa, 1 nM'den başlaması önerilir.
    2. mSAL için yapılandırılmış görüntüleme yazılımındaki canlı görüntü fonksiyonunu kullanarak antikor bağlanmasını izleyin.
    3. TIRF açısını ve görüntüleme parametrelerini ayarlayarak sinyal-gürültü oranı (SNR) ≥ 3 elde edin.
      NOT: Optimal bir TIRF açısı, görüntüleme tamponunda antikorların difüzyona uğramasından kaynaklanan odak dışı floresansı sınırlayarak SNR'yi iyileştirir. Başlangıçta 100-200 W/cm 2 lazer gücü yoğunluğu ve 50 ms kamera entegrasyon süresi kullanılabilir. SNR düşükse, lazer gücünü ve/veya kamera entegrasyon süresini kademeli olarak artırın ve SNR'deki değişiklikleri optimal değere ulaşana kadar izleyin.
    4. Görüntü alma yazılımında görüntüleme parametrelerini, en az 10 kare alımı ve 5 saniyelik NII elde etmek için yapılandırın (bkz. adım 2.12).
      NOT: Başlangıç noktası olarak 5 s NII önerilir. Yeni bir antikor-hedef sistemi için optimal NII belirlemek amacıyla bir NII taraması yapılmalıdır (adım 3.2).
    5. Satın alma işlemini başlatın. Kaydedilen filmin tek moleküllü lokalizasyonlarının seyrekliğini değerlendirin.
      NOT: Lokalizasyon yoğunluğunu elde etmek için ayrıntılı adımlar öncekibir yayında açıklanmıştır 24. 0.02 ile 0.15 olay/μm2 arasında tek moleküllü lokalizasyon yoğunluğu mSAL için optimal olarak bulundu.
    6. Görüntüleme tamponu eklendikten hemen sonra birden fazla örtüşen antikor bağlanma olayı gözlemlenirse veya kayıt ilerledikçe tek moleküllü lokalizasyonlar birikirse, alım sona erdirilir. Antikor konsantrasyonunu 2 kat azaltın ve yeni bir örnekte edinimi tekrarlayın. Bu antikor konsantrasyonunu 2 kat azaltarak bir birim alan başına olan olay sayısını tekrar değerlendirerek istenen tek moleküllü lokalizasyon olay yoğunluğu sağlanana kadar tekrarlanın.
      NOT: Örtüşen olaylar, yeni bir antikorun ilk antikorun kırınım sınırı içinde bağlanmasıyla daha parlak veya daha büyük hale gelen birden fazla büyük nokta olarak ortaya çıkar.
    7. Olay yoğunluğu seyrekse, görüntüleme tamponundaki antikor konsantrasyonunu 2 kat artırın ve yeni bir numunede alımı tekrarlayın. Bu antikor konsantrasyonunu 2 kat artırıp birim alan başına bağlanma olayları sayısını yeniden değerlendirerek istenen tek molekül lokalizasyon olayı yoğunluğu elde edilene kadar tekrarlayın.
      NOT: Sonraki lokalizasyon yoğunluk değerlendirmelerinde önceden bağlanmış antikorların potansiyel girişimini önlemek için her konsantrasyon optimizasyon denemesinde taze bir örnek kullanılması önerilir.
  2. NII optimizasyonu
    1. Görüntü alma yazılımında görüntü parametrelerini yapılandırarak 50 kare yakalama elde edin (bkz. adım 2.12). NII'yi 0'a (gecikme yok) ayarlayın.
    2. Görüntüleme tamponunu 3.1. adımdaki optimize edilmiş antikor konsantrasyonuna hazırlayın ve örnek kuyusuna ekleyin. Satın alma işlemini başlatın.
    3. 3.2.1-3.2.2 numaralı adımları tekrarlayın, NII'leri 1, 3, 5, 10 veya 20 saniyeye ayarlayın. Her bir edinimi yeni bir örnekle gerçekleştirin.
    4. Kaydedilen filmin tek moleküllü lokalizasyonlarının yoğunluğunu ve seyrekliğini değerlendirin (bkz. 3.1.5-3.1.7. adımlar). Optimal tek molekül olay yoğunluğuna sahip en düşük NII, optimal NII olarak belirlenir.
      NOT: Antikor konsantrasyonu, ilgili NII için optimal tek molekül lokalizasyon yoğunluğuna ulaşmak için daha da optimize edilmesi gerekebilir. Adım 3.1'e bak. Önceki raporlar, daha uzun NII'lerin (10-20 s) daha yüksek yoğunluklu bağlanma olaylarına karşı daha seçici olduğunu, ancak NII'nin 20 saniyenin ötesine uzatılmasının ek iyileşmesağlamadığını göstermektedir (23,24). Görüntü alımı ilerledikçe mekansal olarak örtüşen bağlanma olayları meydana gelirse, bağlı antikorlardan floresansı çıkaracak kadar aralıklı bir fotobeyazlama adımı uygulanır. Örneğin, beşinci karede örtüşen olaylar beliriyorsa, her beşinci karede fotobeyazlama uygulanır. Mekânsal olarak örtüşen olayların ortaya çıkışı, 3.1.6. adımın NOT'unda tanımlanmıştır.

4. Veri analizi

NOT: mSAL görüntü rekonstrüksiyonu, ücretsiz NIH yazılımı Fiji29'u ThunderSTORM30 eklentisi ile kullanır. Bu protokolde Fiji sürümü v1.54r ve ThunderSTORM sürüm 1.3 kullanılmıştır. Detaylı görüntü analizi önceki bir protokol 24'te tanımlanmıştır. Bu bölümde, özellikle mSAL için kullanılan analiz iş akışını özetliyoruz. Bu protokolte sunulan analizlerde, fotoelektron oranı A/D başına 0.98 ve kamera taban seviyesi 100 olan Prime95B sCMOS kamera (seri numarası A18B203004) kullanıldı. Görüntüleme piksel boyutu 147 nm olarak ayarlandı.

  1. Yeniden yapılandırma parametrelerini Çalıştırma Analizi penceresinde ayarlayın. CD81 mSAL görüntü rekonstrüksiyonları için kullanılan parametreler aşağıda açıklanmıştır. Önizleme fonksiyonu, tam analiz yapılmadan önce seçilen çerçevede tespit edilen tek moleküllü bağlanma olaylarını değerlendirmek için kullanılmalıdır.
    Görüntü Filtreleme:
    Filtre: Wavelet filtresi (B-spline)
    B-Spline sırası: 2
    B-Spline ölçeği: 4
    Moleküllerin yaklaşık lokalizasyonu:
    Yöntem: Yerel Maksimumu
    Zirve yoğunluk eşiği: std(Wave.F1)
    Bağlantı: 8-mahalle
    Moleküllerin alt piksel lokalizasyonu:
    Yöntem: PSF: Entegre Gauss
    Uyum yarıçapı [px]: 2
    Uyum yöntemi: Maksimum olasılık
    İlk sigma [px]: 0.75
    Çok yayıcı uyum analizi: seçilmedi
    Sonuçların görselleştirilmesi:
    Yöntem: Normalize Gauss
    Büyütme: 7.3
    Güncelleme sıklığı [kare]: 50
    Yan belirsizlik: 20
    NOT: Ön filtreleme parametreleri, arka plan üzerinde tek yayıcı algılamayı artırmak için kullanılır. Başlangıç noktası olarak hizmet veriyorlar ancak her veri seti için optimize edilmeli. Tek moleküllü bağlanma olayları için yaklaşık lokalizasyon ve algılama yöntemi parametreleri kullanılır. 8 mahalleli bağlantıyla yerel yoğunluk maksimumlarının kullanılmasının güvenilir performanssağladığı gösterilmiştir 31. Maksimum olasılıklı uyum sağlayan entegre Gauss yöntemi, yaygın olarak kullanıldığı ve tek moleküllü görüntüleme uygulamalarında nokta yayılım fonksiyonunun (PSF) güvenilir bir yaklaşımını sağladığı içinseçilmiştir (32,33,34,35). Bu protokolde kullanılan görselleştirme yöntemi Normalize Gaussian'dır. Kullanıcılar, verilerine en uygun görselleştirme yöntemini seçebilirler. Büyütme, antikor tabanlı etiketleme ile elde edilebilecek beklenen lokalizasyon hassasiyeti için uygun olan 20 nm yeniden oluşturulmuş piksel boyutu olacak şekilde ayarlanmıştır; burada bağlantı hatası ~10 nm civarındadır. 7.3 büyütme faktörü, kırınım sınırlı piksel boyutunun istenen yeniden oluşturulan piksel boyutuna bölünmesiyle hesaplandı (147 nm / 20 nm = 7.3). Güncelleme sıklığı, yeniden oluşturulan görüntünün işlem sırasında ne sıklıkla yenilendiğini belirler, ancak nihai sonucu etkilemez. Yanal belirsizlik 20'ye ayarlanmıştır (ancak zorla değil), böylece yeniden yapılandırma hesaplanan yerelleştirme belirsizliklerini içerir. Mevcut seçenekler hakkında ek bilgi için ThunderSTORM KullanıcıRehberi 30'a bakabilir veya giriş alanının yanındaki soru işaretine tıklayın.
  2. ThunderSTORM analizine başlangıç sigması 1.6 piksel ve uyum yarıçapı 3 ile başlayın. Parametreleri gerektiğinde daha iyi hale getirin. Çok yayıcı uyum kullanılmadı, çünkü olay yoğunlukları difraksiyon sınırlı görüntülerde örtüşmeden tutuldu.
  3. Yeniden yapılandırmayı çalıştırmak için Ok'a tıklayın. Tamamlandığında, sonuçlar penceresi otomatik olarak açılır.
  4. Grafik histogram fonksiyonunu kullanarak tepe sigmasını bulun. Bu değeri (nm) ham veri piksel boyutuna bölerek piksellere dönüştürün, ardından ThunderSTORM analizini yeni başlangıç sigma değeri ve uyum yarıçapı olarak 3x başlangıçsigma 30'a yakın bir tam sayı olarak yeniden çalıştırın.
  5. Seçilen güvenilir işaret24 kullanarak sürüklenme düzeltmesini belirleyin.
  6. Görüntü yeniden yapılandırmasını tam görüş alanında gerçekleştirin ve hesaplanan kayma düzeltmesini uygulayın.
  7. Görselin sonradan işlemesi için, sonuçlar penceresindeki Filtre sekmesine tıklayın. Kötü lokelize edilmiş olayları kaldırmak için filtreler uygulayın. CD81 için gösterilen sonuçlarda, sigma 200 nm'den büyük ve belirsizlik 20 nm'den büyük olan olaylar kaldırıldı. Sigma dağılımını incelemek ve uygun bir kesme noktasını belirlemek için Grafik histogramı fonksiyonunu kullanın.
    NOT: Büyük sigma değerlerine sahip tek moleküllü lokalizasyonlar genellikle düşük foton sayısına sahip lomut floroforlardan veya üst üste düşen yayıcılardan kaynaklanır. 20 nm'den büyük belirsizliğe sahip lokalizasyonlar da kaldırıldı; çünkü nihai piksel boyutunu aşan belirsizlik, yerelleştirme doğruluğunun düşük olduğunu gösterir. Filtreleme parametreleri hakkında ek rehberlik için ThunderSTORM KullanıcıRehberi 30'a bakınız.
  8. Aşağı akış analizleri için tek molekül lokalizasyon verileriyle sonuç tablosunu kaydederek Export seçeneğini seçin. Dışa aktarılan dosya .csv dosya formatında olacak ve bu protokolte mSAL.csv olarak adlandırılacaktır. Ortaya çıkan Normalize Gauss görüntüsünü kaydet.

5. Küme analizi

NOT: Epitop probasyonu sırasında, antikorlar hedef alan hedeflerle (spesifik etkileşimler) ve hedef dışı moleküllerle (spesifik olmayan etkileşimler) etkileşime girer. mSAL, tek antikor-antijen bağlanma olaylarının kümülatif tespitine dayandığı için, bazı spesifik olmayan etkileşimler kaçınılmaz olarak yeniden oluşturulan görüntüye katkıda bulunur. Antikor-epitop etkileşimleri, prensipte spesifik ve spesifik olmayan bağlanmanı ayırt edebilen belirgin kinetik parmak izleri gösterir; burada spesifik ve spesifik olmayan olaylar, tek moleküllü dwell times36 yerine yerel etkileşim yoğunluklarıyla ayrılır. Burada, gürültü analiziyle uygulamaların yoğunluk tabanlı mekânsal kümelenmesi (DBSCAN)37 tanımlanır; düşük yoğunluklu olayları ortadan kaldırır ve belirli antikor bağlanmasını yansıtma olasılığı daha yüksek olan yüksek yoğunluklu olayları korur. Ayrıca, yoğunluk tabanlı kümelenme, özellikle CD81 gibi tetraspanin zenginleştirilmiş mikrodomainlere doğal olarak kümeler halinde organize edildiği bilinen proteinlerin nano ölçekli mekansal organizasyonuna nicel olarak da nicel bilgiler sağlayabilir. Sağlanan DBSCAN analizi MATLAB 2025a kullanılarak gerçekleştirilmiştir. MATLAB'a erişimi olmayan kullanıcılar için, Python veya R 43,44,45 gibi açık kaynak alternatiflerle benzer DBSCAN analizleri yapılması önerilir. Bu protokolde kullanılan kod şu adresten alınabilir: https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main.

  1. Kodun çalıştırılması
    1. MATLAB dosyasını yukarıdaki GitHub bağlantısından indirin.
    2. MATLAB'ı başlat ve kodu aç. 37 ve 38. satırlarda, küme parametreleri için minimum puan sayısı (minPTS) ve epsilon ayarlanır. Aşağıdaki parametreler kullanılmıştır:
      Jurkat T hücreleri:
      dakikalar: 7
      Epsilon: 60
      U2OS hücreleri:
      dakikalar: 7
      Epsilon: 80
      NOT: Bu parametrelerin optimize edilmesiyle ilgili daha fazla detay için adım 5.2'ye bakınız.
    3. MATLAB yazılımında dosya yolunu, yeniden oluşturulan mSAL.csv dosyasını içeren klasöre ayarlayın.
    4. Kodu çalıştırın, Çalıştır'a tıklayın. Kod, kullanıcıya bir dosya seçmesini önerir. mSAL.csv dosyasını seçin ve Aç'a tıklayın.
    5. Kümelenmiş veriler, kod içinde belirlenen dosya yolunda otomatik olarak MATLAB Data adlı klasöre kaydedilir. Bu dosyayı ThunderSTORM'da Eklentiler > ThunderSTORM > İçe/İcra > İç Aktar sonuçlarına tıklayarak açın.
    6. Ortaya çıkan tek moleküllü lokalizasyon mikroskopik görüntüsünü kaydedin.
  2. Kümeleme girdilerinin optimizasyonu
    NOT: DBSCAN algoritmasının iki giriş parametresi minPTS ve epsilon'dur. Epsilon, bir noktanın çevresini belirlemek için etrafındaki yarıçapı tanımlarken, minPTS yoğun bir bölge oluşturmak için gereken o mahalledeki minimum nokta sayısını belirtir. Bu yoğunluk gereksinimini karşılayan noktalar çekirdek noktalar olarak sınıflandırılır ve onların komşulukları kümeye özyinelemeli olarak eklenir. Yoğunluk gereksinimini karşılamayan ancak çekirdek noktanın çevresine düşen noktalar sınır noktaları olarak etiketlenirken, kalan tüm noktalar gürültü noktası olarak kabul edilir.
    1. Analizi, yukarıda açıklanan girdiler (adım 5.1.2) kullanılarak başlangıç noktası olarak çalıştırın. Gürültü lokalizasyonlarının sayısından daha yüksek ama hücredeki lokalizasyon sayısından daha düşük bir MinPTS değeri seçin. MinPTS seçildikten sonra, epsilon'u ayarlayın ki bu sayıda lokalizasyon komşu yarıçapında temsil eden hücre içi bölgeler için yakalanabilir.
      NOT: MinPTS ve epsilon birbirinden bağımsız olarak ayarlanabilir. Bu parametreleri seçmenin pratik bir yaklaşımı, hücre dışındaki gürültü noktalarının saçılım grafikini incelemek ve bunları hücrede benzer boyuttaki alanlarda gözlemlenen lokalizasyon sayısıyla karşılaştırmaktır.
    2. Kümelenmiş verileri gösteren Şekil 2 işaretli pencereyi değerlendirin. Eğer veriler, hücre dışında en aza indirilmiş lokalizasyonlarla beklenen fenotipi içeren hücrede kümeler tutarsa, kümeleme girdileri yeterlidir.
      NOT: Kümelenmiş veriler, mSAL kullanılarak elde edilen verilerin yapısını korumalıdır. Kümeler küçük görünüyorsa, orijinal verinin çok yüksek yoğunluklu bölgelerine lokalize görünüyorsa ve beklenen fenotiple ilişkili önemli sayıda bağlanma olayını hariç tutuyorsa kümeleme parametreleri çok kısıtlayıcı olabilir. Hücre dışındaki spesifik olmayan bağlanma büyük kümelerle yeterince indirgenmezse, kümeleme parametreleri çok kapsayıcı olabilir.
    3. Kümeleme parametreleri çok kısıtlayıcıysa, minPTS'yi azaltın ve epsilon'u kümelenmiş veriye daha fazla nokta dahil edecek şekilde artırın. Kümeleme parametreleri çok kapsayıcıysa, minPTS'yi artırın ve epsilon'u azaltın.
    4. MinPTS ve epsilon ayarlarını yaptıktan sonra kodu tekrar çalıştırın. Optimal kümeleme sağlanana kadar 5.2.2-5.2.3 numaralı adımları tekrarlayın.

6. Antikor bağlanmasının hedefe doğrulanması

NOT: İyi tanımlanmış morfolojisi olmayan membran proteinleri için, çözülen yapıların doğruluğunu doğrulamak zor olabilir. Antikorların özgüllüğünü doğrulamak için, kullanıcılar hedef proteinin floresan protein (FP) füzyonu ifade edebilir. İlk kontrol olarak, FP füzyonu eksprese eden hücrelerde geleneksel immünoflüoresans boyama yapılabilir. Yeni antikorlar değerlendirilirken daha hassas doğrulama için, FP eksprese eden hücrelerde mSAL yapılarak lokalize bağlanma olaylarının floresan etiketlenmiş hedefe karşılık geldiğini doğrulayabilir. Burada, U2OS hücrelerinin CD81-mStayGold ile transfect edilmesi için bir protokol örnek olarak tanımlanır ve CD81 mSAL lokalizasyonlarının hücre yüzeyindeki FP etiketli CD81'e karşılık geldiğini doğrulamayı sağlar. Kullanıcılar, yayımı doğrulanan antikorun floresan kanalıyla örtüşmediği sürece uygun herhangi bir floresan proteini değiştirebilirler.

  1. U2OS hücrelerini 8 kuyu odasında süzülerek ~%70 birleşime kadar büyütün. 200 μL tam büyüme ortamında hücreler bulundurun (DMEM, %10 (v/v) fetal sığır serumu takviyesi, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin takviyesi).
  2. Proteini kodlayan 100 ng DNA yapısını floresan bir raporlayıcı ile 5 μL Lipofectamine 2000 ile birleştirin. 30 saniye girdabla geçirin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın.
    NOT: Bu çalışmada CD81 mStayGold ile birleştirilmiştir. DNA plazmidlerinin üretiminde standart moleküler klonlama teknikleri kullanılmıştır, ancak bunlar bu protokolde açıklanmamıştır. Sağlanan DNA: Lipofektamin oranları, 8 delikli oda slaytlarında tohumlanmış hücreler için optimize edilmiştir ve üreticinin diğer örnek formatları için talimatlarına göre ayarlanması gerekebilir.
  3. Hücrelere 5 μL DNA/Lipofektamin çözeltisi ekleyin. Oda kaydırmasını 37 °C'de 4 saat kuluçkalayın, nemli bir ortamda %5 CO2 ile takviye edilsin.
  4. Medyayı önceden ısıtılmış tam büyüme ortamıyla değiştirin. Protein ekspresyonunun tespit edilebilir seviyelerini sağlamak için nemli ortamda %5CO2 ile takviye edilerek 37 °C'de > 8 saat kuluçka yapın.
  5. Hücrelerdeki floresans ekspresyon seviyelerini floresan mikroskobu veya görüntüleyici kullanarak değerlendirin. Transfeksiyon verimliliği %30≥ önerilir. Floresans ekspresyon seviyeleri optimal değilse, üreticinin yönergelerine göre DNA: Lipofektamin oranını optimize edin.
    NOT: Transfeksiyondan sonraki 24-48 saat içinde geçici olarak eksprese eden hücreler antikor doğrulaması için kullanılmalıdır.
  6. Hücreleri düzeltmek için lütfen 1.2.8-1.2.13 adımlarını izleyin.
  7. Sabit örnekleri görüntülemeye hazır olana kadar 5 mM sodyum azid ile 200 μL DPBS içinde depolayın. Örnekler 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.
    DIKKAT: Sodyum azid son derece toksiktir ve yutulduğunda ölümcül olabilir. Bu reaktifi kullanırken uygun PPE giyin. Cilt teması durumunda, etkilenen bölgeyi hemen sabun ve suyla iyice yıkayın. Reaktifi, kullanıcının kurum yönergelerine ve tüm geçerli yerel, eyalet ve federal düzenlemelere göre bertaraf etmelidir.
  8. Mikroskobu kurmak ve örneği monte etmek için 2.1-2.12 numaralı adımları takip edin. Floresans sinyali kullanarak ilgilenilen proteini ifade eden bir hücreyi tespit edin.
  9. Referans olarak, hücrenin TIRF görüntüsünü yakalayın. Eğer mSAL antikoruyla aynı görüntüleme kanalında bir floresan protein kullanılırsa, floresan proteinin fotobeyazlatılması gerçekleştirilir. Proteini fotobeyazlaştırmak için, maksimum lazer gücünü > 10 dakika boyunca kullanın, ta ki sinyal gözlemlenmeyene kadar.
  10. Hazırlanmış görüntüleme tamponunu kuyuya ekleyin ve görüntülemeye başlayın. Analiz, daha önce açıklandığı gibi tamamlanmalıdır (adım 4).
  11. MSAL alımından önce alınan floresan proteinin hem yeniden oluşturulan görüntüsünü hem de TIRF görüntüsünü açın. Difraksiyon sınırlı TIRF görüntüsünde gösterilen ekspres proteinin görünümünü ve lokalizasyonlarını mSAL görüntüsüyle karşılaştırarak mSAL antikor bağlanma konumlarını değerlendirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolte tanımlanan mSAL tekniği, tek antikor bağlanma olaylarının karşılık gelen plazma zarı protein hedeflerine görselleştirilmesini sağlar ve böylece membran protein dağılımının süper çözünürlüklü bir haritası oluşturulur. CD81 burada temsili bir örnek olarak kullanılır, ancak yaklaşım diğer zar proteinlerine kolayca uyarlanabilir.

Jurkat T hücrelerinin hücreler arasında yeterli aralıkla immobilize edilmesi, antikorlar ve cam yüzeyi ile membran epitopu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Plazma zarı proteinlerinin organizasyonu, hücre fonksiyonunun düzenlenmesinde hayati bir rol oynar. Geleneksel floresan mikroskopisi teknikleri, ışığın kırınım sınırı ile sınırlıdır ve nano ölçekli organizasyonlarını gizler. SMLM, bu sınırlamayı 10-20 nm47 uzamsal çözünürlüklere ulaşarak aşarak nano ölçeklimontajlarının 10,48,49 karakterizasyonunu sağlar. SMLM'deki kümele...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar, açıklayacak çıkar çatışmaları olmadığını belirtir.

Teşekkürler

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü tarafından Ödül Numarası R35GM146786 altında ve Illinois Üniversitesi Chicago Liberal Sanatlar ve Bilimler Fakültesi tarafından desteklenmiştir. İçerik tamamen yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini mutlaka yansıtmaz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
anti-CD81 Alexa Fluor 488 AntikorThermo Fisher ScientificMA5-44132Görüntüleme antikoru
Tezgah üstü santrifüjEppendorf5424
Sığır serum albüminiMilliporeSigmaA7906-100G
Odalı kapak camı, 8-kuyuCellvisC8-1-N
DMEM medyasıThermo Fisher Scientific11960069
Dulbecco'nun Fosfatla Tamponlu Tuzlu SonuThermo Fisher Scientific14190-144
Fetal sığır serumuMilliporeSigmaF0926-500ML
Glutaraldehit %10Elektron Mikroskopi Bilimleri16120
Altın kolloidler, 100 nmTed Pella15711 ve eksi; 20Fiducial işaret
Daldırma yağı Cargille Laboratuvarları16245
Ters mikroskop  TIRF modülü ile donatılmıştırNikon InstrumentsTutulma Ti2-EMikroskop
Jurkat E6.1 hücre hattıMilliporeSigma88042803-1VLAskı hücreleri
Lazer Fırlatma, 6 hatOxxiusL6CC-CS8-1511Uyarılma lazeri
Lipofektamin 2000Thermo Fisher Scientific11668019Transfeksiyon reaktifi
Mikrosantrifüj tüpü, 1.5 mL VWR89000-028
Mikroskopik görüntüleme yazılımıNikon InstrumentsNIS-Elements İleri AraştırmalarGörüntü alma yazılımı
Objective, 100x/1.49 CFI APO TIRF Nikon InstrumentsMRD01991Mikroskop amacı
Paraformaldehit %16Elektron Mikroskopi Bilimleri15710
Penisillin-StreptomisinThermo Fisher Scientific15140-122Antibiyotikler
Poli-L-Lizin çözeltisi, %0,01 & nbsp;MilliporeSigmaP4707-50ML
Prime 95B sCMOS KameraTeledyne Vision Çözümleri01-PRIME-95B-R-M-16-CKamera
RPMI 1640 medyaThermo Fisher Scientific11875-093Askı hücreler için ortam
Sodyum azidThermo Fisher Scientific19038-1000
Sodyum borohidridMilliporeSigma213462-25G
T25 kültür şişeleriThermo Fisher Scientific169900
TetraSpeck mikrosferleriFiducial işaret
Doku kültürü kabı, 100 mm Corning353003
U2OS hücre hattıATCCHTB-96Yapışkan hücreler

Kaynaklar

  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulation of membrane protein structure and function by their paralipidomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (2), 107(2022).
  3. Stephens, A. D., Wilkinson, T. Discovery of Therapeutic Antibodies Targeting Complex Multi-Spanning Membrane Proteins. Biodrugs. 38 (6), 769(2024).
  4. Chan, A. C., Martyn, G. D., Carter, P. J. Fifty years of monoclonals: the past, present and future of antibody therapeutics. Nat Rev Immunol. 25, 745-765 (2025).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  7. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  8. Tobin, S. J., et al. Single molecule localization microscopy coupled with touch preparation for the quantification of trastuzumab-bound HER2. Sci Rep. 8 (1), 15154(2018).
  9. Wakefield, D. L., et al. Using quantitative single molecule localization microscopy to optimize multivalent HER2-targeting ligands. Front Med. 10, 1064242(2023).
  10. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  11. Lillemeier, B. F., et al. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11 (1), 90-96 (2010).
  12. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  13. Rossboth, B., et al. TCRs are randomly distributed on the plasma membrane of resting antigen-experienced T cells. Nat Immunol. 19 (8), 821-827 (2018).
  14. Civita, S., et al. Nanoscale engagement of programmed death ligand 1 (PD-L1) in membrane lipid raft domains of cancer cells. FEBS J. 292 (22), 5979-5997 (2025).
  15. Lee, J., Sengupta, P., Brzostowski, J., Lippincott-Schwartz, J., Pierce, S. K. The nanoscale spatial organization of B-cell receptors on immunoglobulin M- and G-expressing human B-cells. Mol Biol Cell. 28 (4), 511(2017).
  16. Ferapontov, A., et al. Antigen footprint governs activation of the B cell receptor. Nat Commun. 14 (1), 976(2023).
  17. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  18. Nerreter, T., et al. Super-resolution microscopy reveals ultra-low CD19 expression on myeloma cells that triggers elimination by CD19 CAR-T. Nat Commun. 10 (1), 3137(2019).
  19. Slaga, D., et al. Avidity-based binding to HER2 results in selective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3. Sci Transl Med. 10 (463), eaat5775(2018).
  20. Haber, L., et al. Generation of T-cell-redirecting bispecific antibodies with differentiated profiles of cytokine release and biodistribution by CD3 affinity tuning. Sci Rep. 11 (1), 14397(2021).
  21. Abdelmotaleb, O., Schneider, A., Gassner, C., Märsch, S., Klein, C. The impact of CD3 affinity-attenuation on T cell engaging bispecific antibodies: is it really that simple. Expert Opin Drug Discov. 20 (8), 943-949 (2025).
  22. Dang, K., et al. Attenuating CD3 affinity in a PSMAxCD3 bispecific antibody enables killing of prostate tumor cells with reduced cytokine release. J Immunother Cancer. 9 (6), e002488(2021).
  23. Gunasekara, H., et al. Superresolution Imaging with Single-Antibody Labeling. Bioconjugate Chem. 34 (5), 825-833 (2023).
  24. Perera, T., Gunasekara, H., Hu, Y. S. Single-Molecule Localization Microscopy Using Time-Lapse Imaging of Single-Antibody Labeling. Curr Protoc. 3 (10), e908(2023).
  25. Küppers, R. CD81 as target for B cell lymphomas. J Exp Med. 216 (7), 1469-1470 (2019).
  26. Vences-Catalán, F., et al. CD81 is a novel immunotherapeutic target for B cell lymphoma. J Exp Med. 216 (7), 1497-1508 (2019).
  27. Vences-Catalán, F., et al. Targeting the tetraspanin CD81 reduces cancer invasion and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (24), e2018961118(2021).
  28. Bailly, C., Thuru, X. Targeting of Tetraspanin CD81 with Monoclonal Antibodies and Small Molecules to Combat Cancers and Viral Diseases. Cancers. 15 (7), 2186(2023).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  31. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. Image analysis for single-molecule localization microscopy. In: Super-Resolution Imaging in Biomedicine. , 79-94 (2016).
  32. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  33. Stallinga, S., Rieger, B. Accuracy of the Gaussian point spread function model in 2D localization microscopy. Opt Express. 18 (24), 24461-24476 (2010).
  34. Huang, F., Schwartz, S. L., Byars, J. M., Lidke, K. A. Simultaneous multiple-emitter fitting for single molecule super-resolution imaging. Biomed Opt Express. 2 (5), 1377-1393 (2011).
  35. Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nat Methods. 7 (5), 373-375 (2010).
  36. Chatterjee, T., et al. Direct Kinetic Fingerprinting and Digital Counting of Single Protein Molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (37), 22815-22822 (2020).
  37. A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Int Conf Knowledge Disc Data Mining, 240, 226-231 (1996).
  38. Termini, C. M., Gillette, J. M. Tetraspanins Function as Regulators of Cellular Signaling. Front Cell Dev Biol. 5, 242379(2017).
  39. Levy, S., Shoham, T. Protein-protein interactions in the tetraspanin web. Physiology. 20, 218-224 (2005).
  40. Rubinstein, E., et al. CD9, CD63, CD81, and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins. Eur J Immunol. 26 (11), 2657-2665 (1996).
  41. Schmidt, S. C., Massenberg, A., Homsi, Y., Sons, D., Lang, T. Microscopic clusters feature the composition of biochemical tetraspanin-assemblies and constitute building-blocks of tetraspanin enriched domains. Sci Rep. 14 (1), 2093(2024).
  42. Zuidscherwoude, M., et al. The tetraspanin web revisited by super-resolution microscopy. Sci Rep. 5, 12201(2015).
  43. Comparative performance analysis of K-means and DBSCAN clustering algorithms on various platforms. Shahriar, N., Akib Al Faisal, S. M., Pinjor, M. M., Sharif Zobayer Rafi, M. A., Rahman Sarkar, A. Proceedings of the 22nd International Conference on Computer and Information Technology (ICCIT), , 1-6 (2019).
  44. Hahsler, M., Piekenbrock, M., Doran, D. dbscan: Fast Density-Based Clustering with R. J Stat Softw. 91 (1), 1-30 (2019).
  45. Pedregosa, F., et al. Machine Learning with PyTorch and Scikit-Learn: Develop machine learning and deep learning models with Python. J Mach Learn Res. 12, 2825-2830 (2011).
  46. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Sci Rep. 1, 28(2011).
  47. Bond, C., Santiago-Ruiz, A. N., Tang, Q., Lakadamyali, M. Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes. Mol Cell. 82 (2), 315-332 (2022).
  48. Garcia-Parajo, M. F., Cambi, A., Torreno-Pina, J. A., Thompson, N., Jacobson, K. Nanoclustering as a dominant feature of plasma membrane organization. J Cell Sci. 127 (23), 4995-5005 (2014).
  49. Tan, H. L., Bungert-Plümke, S., Kortzak, D., Fahlke, C., Stölting, G. Determination of oligomeric states of proteins via dual-color colocalization with single molecule localization microscopy. eLife. 11, e76631(2022).
  50. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  51. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  52. Shivanandan, A., Deschout, H., Scarselli, M., Radenovic, A. Challenges in quantitative single molecule localization microscopy. FEBS Lett. 588 (19), 3595-3602 (2014).
  53. Endesfelder, U., Heilemann, M. Art and artifacts in single-molecule localization microscopy: beyond attractive images. Nat Methods. 11 (3), 235-238 (2014).
  54. Lambert, T. J., Waters, J. C. Navigating challenges in the application of superresolution microscopy. J Cell Biol. 216 (1), 53-63 (2017).
  55. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Quantitative photo activated localization microscopy: unraveling the effects of photoblinking. PloS One. 6 (7), e22678(2011).
  56. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  57. Unterauer, E. M., Jungmann, R. Quantitative Imaging With DNA-PAINT for Applications in Synaptic Neuroscience. Front Synaptic Neurosci. 13, 798267(2021).
  58. Stein, J., Stehr, F., Jungmann, R., Schwille, P. Calibration-free counting of low molecular copy numbers in single DNA-PAINT localization clusters. Biophys Rep. 1 (2), 100032(2021).
  59. Youn, Y., et al. Quantitative DNA-PAINT imaging of AMPA receptors in live neurons. Cell Rep Methods. 3 (2), 100408(2023).
  60. Yin, H., Flynn, A. D. Drugging Membrane Protein Interactions. Annu Rev Biomed Eng. 18, 51-76 (2016).
  61. Jin, S., et al. Emerging new therapeutic antibody derivatives for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 39(2022).
  62. To'a Salazar, G., Huang, Z., Zhang, N., Zhang, X. -G., An, Z. Antibody therapies targeting complex membrane proteins. Engineering. 7 (11), 1541-1551 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Plazma MembranıSüper Çözünürlüklü MikroskopiCD81 ProteiniYoğunluk Tabanlı KümelemeAntikor BağlanmasıKayma DüzeltmeTerapötik Antikorlar
Tek Antikor Etiketleme Kullanarak Zar Proteinlerinin Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskopisi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.