Method Article

Tek Antikor Etiketleme Kullanarak Zar Proteinlerinin Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskopisi

DOI:

10.3791/69853

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, plazma zarı proteinlerinin nano ölçekli mekânsal organizasyonunu çözmek için tek antikor etiketlemesini (SAL) tanımlar. Tek molekül düzeyinde kümülatif antikor-epitop etkileşimlerini kullanarak, membran SAL (mSAL), yerel epitop dağılımlarını haritalandırırken aynı zamanda doğal hücresel ortamda antikor bağlanma davranışını yakalar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazma zarı hücre şeklini tanımlar ve hücrelerarası iletişimi yöneten arayüz olarak hizmet eder. Membran proteinleri, terapötik hedeflerin başlıca bir sınıfını oluşturur; Bu nedenle, hücre zarını yapısal proteinleriyle süper çözdürmek, hücre biyolojisi ve antikor tedavilerinin ilerlemesinde büyük umut vaat eder. Bu bağlamda, tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM), biyolojik yapılar üzerindeki protein organizasyonlarının nano ölçekli görselleştirilmesini mümkün kılar. Önemine rağmen, SMLM'yi plazma zarı proteinlerine uygulamak benzersiz zorluklar teşkil eder. Bu protokolde, membran SAL (mSAL) olarak adlandırılan zaman geçişli tek antikor etiketleme (SAL) kullanan etkili bir yaklaşım sunuyoruz. Nano ölçekli membran protein dağılımı ve membran morfolojisini çözmek için antikor konsantrasyonu, lazer güç yoğunluğu, aydınlatma dışı aralıkların süresi, görüntü yeniden yapılandırma ve yoğunluk tabanlı küme analizi gibi ayrıntılı adım adım talimatlar sunuyoruz. Tetraspanin proteini CD81'i model membran proteini olarak kullanarak, mSAL'ın hem yapışkan hem de süspansiyon memeli hücrelerinde yeteneğini gösteriyoruz. Hücre zarını ve membran proteinlerinin dağılımlarını süper çözdürmenin yanı sıra, tekniğimiz, doğal membran ortamında membran hedefleriyle etkileşime giren terapötik antikorların farmakodinamikinin araştırılmasını da mümkün kılar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazma zarı, hücre hareketliliği, yapışma, algılama ve hücreler arası iletişimi düzenleyen çeşitli protein dizilerine sahiptir. Plazma zarı proteinlerinin nanoölçekli dağılımını anlamak önemlidir, çünkü protein fonksiyonu genellikle sadece ifade seviyeleriyle değil, aynı zamanda membran 1,2 üzerindeki mekansal organizasyonlarıyla da yönetilir. Özellikle, birçok terapötik antikor membranproteinleri 3,4'ü hedef alır; bu da nano ölçekli araştırmaları, antikor etkileşimlerinin yerel membran protein organizasyonundan nasıl ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yerleşik Jurkat E6.1 ve U2OS hücre hatlarını kullanır ve birincil insan veya canlı hayvan materyallerini içermez.

1. Hücre tohumlama/yerleştirme ve fiksasyon

NOT: Örnek hazırlama, farklı hücre tipleri arasında plazma zarı proteinlerinin alt hücre organizasyonunu korumak için optimize edilmiş standart immünofloresans (IF) boyama protokollerini takip eder. İlgilenen hedef için yerleşik bir immünboyama protokolü varsa, kullanıcılar bu protokolü örnek bloklama aşaması 1.2.14'e kadar takip edebilir. Tek antikor etiketleme (SAL), floresan etiketli antikorların antijenlerine ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolte tanımlanan mSAL tekniği, tek antikor bağlanma olaylarının karşılık gelen plazma zarı protein hedeflerine görselleştirilmesini sağlar ve böylece membran protein dağılımının süper çözünürlüklü bir haritası oluşturulur. CD81 burada temsili bir örnek olarak kullanılır, ancak yaklaşım diğer zar proteinlerine kolayca uyarlanabilir.

Jurkat T hücrelerinin hücreler arasında yeterli aralıkla immobilize edilmesi, antikorlar ve cam yüzeyi ile membran epitopu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazma zarı proteinlerinin organizasyonu, hücre fonksiyonunun düzenlenmesinde hayati bir rol oynar. Geleneksel floresan mikroskopisi teknikleri, ışığın kırınım sınırı ile sınırlıdır ve nano ölçekli organizasyonlarını gizler. SMLM, bu sınırlamayı 10-20 nm47 uzamsal çözünürlüklere ulaşarak aşarak nano ölçeklimontajlarının 10,48,49 karakterizasyonunu sağlar. SMLM'deki kümele.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar, açıklayacak çıkar çatışmaları olmadığını belirtir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü tarafından Ödül Numarası R35GM146786 altında ve Illinois Üniversitesi Chicago Liberal Sanatlar ve Bilimler Fakültesi tarafından desteklenmiştir. İçerik tamamen yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini mutlaka yansıtmaz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-CD81 Alexa Fluor 488 AntikorThermo Fisher ScientificMA5-44132Görüntüleme antikoru
Tezgah üstü santrifüjEppendorf5424
Sığır serum albüminiMilliporeSigmaA7906-100G
Odalı kapak camı, 8-kuyuCellvisC8-1-N
DMEM medyasıThermo Fisher Scientific11960069
Dulbecco'nun Fosfatla Tamponlu Tuzlu SonuThermo Fisher Scientific14190-144
Fetal sığır serumuMilliporeSigmaF0926-500ML
Glutaraldehit %10Elektron Mikroskopi Bilimleri16120
Altın kolloidler, 100 nmTed Pella15711 ve eksi; 20Fiducial işaret
Daldırma yağı Cargille Laboratuvarları16245
Ters mikroskop  TIRF modülü ile donatılmıştırNikon InstrumentsTutulma Ti2-EMikroskop
Jurkat E6.1 hücre hattıMilliporeSigma88042803-1VLAskı hücreleri
Lazer Fırlatma, 6 hatOxxiusL6CC-CS8-1511Uyarılma lazeri
Lipofektamin 2000Thermo Fisher Scientific11668019Transfeksiyon reaktifi
Mikrosantrifüj tüpü, 1.5 mL VWR89000-028
Mikroskopik görüntüleme yazılımıNikon InstrumentsNIS-Elements İleri AraştırmalarGörüntü alma yazılımı
Objective, 100x/1.49 CFI APO TIRF Nikon InstrumentsMRD01991Mikroskop amacı
Paraformaldehit %16Elektron Mikroskopi Bilimleri15710
Penisillin-StreptomisinThermo Fisher Scientific15140-122Antibiyotikler
Poli-L-Lizin çözeltisi, %0,01 & nbsp;MilliporeSigmaP4707-50ML
Prime 95B sCMOS KameraTeledyne Vision Çözümleri01-PRIME-95B-R-M-16-CKamera
RPMI 1640 medyaThermo Fisher Scientific11875-093Askı hücreler için ortam
Sodyum azidThermo Fisher Scientific19038-1000
Sodyum borohidridMilliporeSigma213462-25G
T25 kültür şişeleriThermo Fisher Scientific169900
TetraSpeck mikrosferleriFiducial işaret
Doku kültürü kabı, 100 mm Corning353003
U2OS hücre hattıATCCHTB-96Yapışkan hücreler

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulatio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationMembrane ProteinsSingle Antibody LabelingPlasma MembraneSuper Resolution MicroscopyCD81 ProteinDensity Based ClusteringAntibody BindingDrift CorrectionTherapeutic Antibodies

Related Articles