Fitokimyasal Profilleme, Gaz Kromatografisi–Kütle Spektrometrisi Analizi ve Terminalia mantaly'nin Sıçanlarda In Vivo Aktivitesi

Özet

Burada, Terminalia mantaly'nin anti-inflamatuar, analjezik ve antipiretik aktivitelerini değerlendirmek için fitokimyasal analiz, gaz kromatografisi–kütle spektrometrisi karakterizasyonu ve doğrulanmış in vivo testleri entegre eden bir protokol sunuyoruz; bu da tıbbi bitkilerin farmakolojik değerlendirmesi için tekrarlanabilir bir çerçeve sağlıyor.

Özet

İltihaplanma, ağrı ve ateş için sentetik ilaçlar etkilidir ancak genellikle yan etkilere yol açar ve bitkisel kaynaklı tedavi alternatiflerine olan ilgiyi artırır. Afrika tıbbında geleneksel olarak kullanılan Terminalia mantaly H. Perrier, sınırlı bilimsel doğrulamaya sahiptir. Bu çalışma, fitokimyasal tarama, fenolik ve flavonoid bileşiklerin nicel analizi, gaz kromatografisi–kütle spektrometrisi (GC-MS) karakterizasyonu ve in vivo farmakolojik testleri birleştirerek T. mantaly'nin metanolik ekstraktının terapötik potansiyelini değerlendiren entegre deneysel bir protokol sunmaktadır. Fitokimyasal tarama, birden fazla biyoaktif sınıfın varlığını doğruladı ve GC–MS analizi, yağ asitleri, fitosteroller, tokoferoller ve bilinen anti-inflamatuar ve antioksidan özelliklere sahip diğer biyoaktif bileşikler dahil olmak üzere yirmi bileşen tespit etti. Sıçanlarda yapılan in vivo farmakolojik değerlendirme, karragenan kaynaklı pençe ödemi modelinde doza bağlı anti-enflamatuar aktivite, kuyruk daldırma testinde ağrı-yoksunluk gecikmesinin önemli uzaması ve maya kaynaklı pireksiya azalması gösterdi. Daha yüksek dozlarda, ekstrakt diklofenak ve parasetamol gibi standart ilaçlarla karşılaştırılabilir etkiler göstermiştir. Akut toksisite ve sitotoksisite değerlendirmeleri, test edilen doz aralığında olumlu bir güvenlik profili göstermiştir. Bu bulgular birlikte, T. mantaly'nin etnomedikal kullanımını doğrular ve fitokimyasal bileşimi farmakolojik aktiviteyle ilişkilendirmek için tekrarlanabilir bir deneysel çerçeve ortaya koyar. Protokol, tıbbi bitkileri araştıran araştırmacılar için pratik bir metodolojik referans sağlar ve iltihap ile ateşli durumların yönetimi için bitki kaynaklı ajanların geliştirilmesini destekler.

Giriş

İltihaplanma, ağrı ve ateş, çok çeşitli akut ve kronik hastalıkların temelini oluşturan birbirine bağlı patolojik süreçlerdir. Steroid olmayan anti-inflamatuar ajanlar, kortikosteroidler ve parasetamol gibi sentetik ilaçlar tedavinin temel taşı olmaya devam etmesine rağmen, uzun süreli kullanımı genellikle gastrointestinal tahriş, böbrek komplikasyonları, hepatotoksisite ve diğer yan etkilerle ilişkilidir¹. Bu sınırlamalar, iltihap ve ateşli hastalıkların yönetimi için daha güvenli ve sürdürülebilir alternatifler olarak tıbbi bitkilere olan ilginin artmasına yol açmıştır. Doğal ürünler, modern ilaç geliştirme için öncül rol oynayan biyoaktif moleküllerin zengin çeşitliliğiyle iyi tanınır. Bu bağlamda, Combretaceae familyasından T. mantaly, Afrika geleneksel sistemlerinde enfeksiyonlar, gastrointestinal hastalıklar ve inflamatuar bozuklukların tedavisinde etnomedikal kullanımı nedeniyle dikkat^{çekmiştir 2,3}. Geleneksel önemine rağmen, terapötik potansiyelini doğrulayan sistematik farmakolojik çalışmalar sınırlı kalmaktadır. Özellikle, fitokimyasal tarama, in vivo biyolojik değerlendirmeler ve GC–MS gibi gelişmiş kimyasal profilleme yöntemlerini entegre eden kapsamlı araştırmaların kıtlığı vardır. Bu boşluğun ele alınması, folklorik uygulamalarını bilimsel olarak doğrulamak ve ilaç kullanımı için potansiyel kurşun bileşikleri belirlemek için kritik^{öneme sahiptir 4}. Mevcut çalışmada, T. mantaly'nin metanolik ekstraktı ayrıntılı fitokimyasal ve farmakolojik değerlendirmeye tabi tutulmuştur. Ön analizler, fenolikler, flavonoidler, tanenler, saponinler ve terpenoidler gibi temel metabolitlerin varlığını doğruladı; bunların hepsinin anti-inflamatuar, analjezik ve antioksidan etkilere katkıda bulunduğu^{bilinmektedir 5}. Nicel testler, ekstraktın referans standartlarına benzer değerlerde fenolik ve flavonoid bileşikleri içerdiğini ve bunun güçlü bir antioksidan potansiyeline işaret ettiğini ortaya koydu.

Hayvan modelleri kullanıldı çünkü değerlendirilen farmakolojik yanıtlar, in vitro çoğaltılamayan entegre inflamatuar, sinir ve termoreguyatör yolları içeriyordu. In vivo testler, biyoaktiviteye dair açık farmakolojik kanıtlar sağladı. Anti-inflamatuar (karragenan tarafından indüklenen pençe ödemi), analjezik (kuyruk daldırması) ve antipiretik (maya tarafından indüklenen pireksi) özellikleri sıçanlarda test edildi ve daha yüksek dozlarda diklofenak sodyuma benzer doz bağımlı anti-enflamatuar aktivite gösterdi. Benzer şekilde, ekstrakt sıçanlarda kuyruk daldırma gecikmesini artırarak analjezik etkinliğini doğrularken, maya kaynaklı pireksiya modelleri^{parasetamol 6} ile yakından uyumlu belirgin antipiretik etkiler gösterdi. GC–MS analiziyle kimyasal profilleme, biyoaktif bileşimi hakkında daha derin bilgiler sağladı. Toplam 20 bileşik tanımlandı; bunlar arasında 3,5-dihidroksi-6-metil-2,3-dihidro-4H-pyran-4-one, linoleik asit, γ-sitosterol, skualen ve vitamin E bulunmaktadır. Bu bileşikler, antioksidan, anti-inflamatuar ve kardiyoprotektif özellikleri açısından iyi belgelenmiştir ve gözlemlenen farmakolojik sonuçları^{desteklemektedir 7,8}. Önemli olarak, toksisite değerlendirmeleri sitotoksik etkilerin önemsiz olduğunu ortaya koydu ve test edilen dozlarda güvenliğini vurguladı. Bir arada, bu çalışma T. mantaly'nin tıbbi değerine dair hem fitokimyasal hem de farmakolojik kanıtlar sunarak kritik bir boşluğu ele almaktadır. Bulgular, sadece geleneksel uygulamalarını doğrulamakla kalmıyor, aynı zamanda iltihap ve ilgili hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için doğal bir kurşun bileşik kaynağı potansiyelini de vurgulamaktadır. Bu çalışmada kullanılan deneysel modeller öncelikle akut inflamatuar ve nosiseptif yanıtları yansıtmakta olup, kronik terapötik etkinliğin doğrudan göstergesi yerine ön farmakolojik kanıt sunmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için uluslararası yönergeler doğrultusunda gerçekleştirildi ve OECD tavsiyelerine uydu. Çalışma protokolü, Multan'daki Bahauddin Zakariya Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. (Onay No: 3 /UREC/2025). Tüm çabalar hayvan acısını en aza indirmek ve kullanılan hayvan sayısını azaltmak için gösterildi.

1. T. mantaly tam metanolik özdünün (TMWM) hazırlanması

1. T. mantaly'nin taze saplarını, köklerini ve yapraklarını toplayın, bitki materyalini doğrulayın ve tanınmış bir herbaryuma kupon örneği verin.
   NOT: Bu çalışmada kullanılan bitki materyali, 12 Kasım 2023'te Multan'daki Mattital Road'daki Punjab Fidanlığı'ndan toplanmıştır. Toplama alanının coğrafi koordinatları 30.2236° K, 71.4755° D'dir. Bitki, taksonomik olarak taksonomik olarak Prof. Dr. Zafar Ullah Zafar, Bahauddin Zakariya Üniversitesi, Multan botanik profesörü ve bir kupon örneği (www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2434420) Multan'daki Bahauddin Zakariya Üniversitesi herbaryumuna yerleştirildi. Bitki, uygun çevresel koşullarda doğal yaşam alanından toplandı ve koleksiyon alanı fotoğraflarla belgelendi.
2. Bitki malzemesini musluk suyuyla yıkayıp ardından damıtılmış su ile kirleticileri temizleyin, ardından 25–30 °C'de 7–10 gün gölgede kurutularak sabit ağırlık sağlanana kadar.
3. Kurutulmuş malzemeyi kalın toz haline getirin ve analitik bir denge kullanarak 500 g ağırlığında olsun. Tozu temiz bir cam kaba aktarın ve 2,5 L metanol ekleyin.
4. Karışımı oda sıcaklığında 72 saat boyunca aralıklı olarak her 6–8 saatte bir çalkalayarak sererasyonla geçirin. Whatman No.1 filtre kağıdından filtreleyin.
5. Filtreyi 39 °C'de döner evaporatör kullanarak azaltılmış basınçta konsantre edin, ardından kurutulmuş ekstraktı oda sıcaklığında hava geçirmez kaplarda saklayın.
   DIKKAT: Metanol toksik ve yanıcıdır. Eldiven ve koruyucu gözlük takarak bir duman kapüşonunun içinde müdahale yapın. Çözücü atıklarını kurumsal kimyasal güvenlik yönergelerine göre bertaraf et.
   NOT: Kurutulmuş öz, daha fazla analiz yapılmadan önce oda sıcaklığında birkaç hafta boyunca hava geçirmez kaplarda saklanabilir.

2. Toplam fenolik içeriğin tahmini (Folin–Ciocalteu yöntemi)

1. 10 mg gallik asitin 100 mL metanolde çözülmesiyle gallik asit stok çözeltisi (100 μg/mL) hazırlanır ve 1–10 μg/mL arasında seri seyreltmeler hazırlanır.
2. 10 mg ekstraktı 10 mL metanolde çözerek 1 mg/mL bir çözelti elde edin. Her standart veya numuneden 0,5 mL test tüplerine aktarın.
3. 2,5 mL Folin–Ciocalteu reaktifini suyla 1:1 oranında seyreltirin, ardından 2,0 mL %7,5 sodyum karbonat çözeltisi ekleyin. 25 ± 2 °C'de 30 dakika boyunca karıştırıp kuluçka yapın.
4. 765 nm'de reaktif boşluğuna karşı absorbansı ölçün ve toplam fenolik içeriği g ekstraktı başına mg gallik asit eşdeğeri olarak hesaplayın.

3. Toplam flavonoid içeriğinin tahmini (Alüminyum klorür yöntemi)

1. Rutini metanolde çözerek rutin stok çözeltisi (1000 μg/mL) hazırlayın, ardından 10–80 μg/mL aralığında seri seyreltmeler hazırlanın.
2. 0,5 mL standart veya ekstrakt çözeltisi test tüplerine aktarın ve 1,5 mL metanol, 0,1 mL %10 alüminyum klorür (AlCl₃) çözeltisi, 0,1 mL 1 M potasyum asetat çözeltisi ve 2,8 mL damıtılmış su ekleyin.
3. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın ve 415 nm'de soğurgunluk ölçün. Sonuçları g ekstraktı başına mg rutin^{eşdeğerleri olarak ifade edin 9}.

4. Gaz kromatografisi–kütle spektrometrisi (GC–MS) analizi

1. 10 mg ekstraktı 1 mL HPLC kalitesinde metanolde çözün ve 0,22 μm şırınga filtresinden GC şişesine filtreleyin.
2. Bir Agilent 7890B GC ile HP-5MS kapiler kolonlu (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm 0,25 μm) ile birleştirilmiş bir 5977A MS kullanılarak analiz yapın. Helyumu taşıyıcı gaz olarak 1.0 mL/dakika ile enjektör sıcaklığı 250 °C ile kullanın.
3. İyon kaynağı sıcaklığını 230 °C'de ve dörtlü sıcaklığı 150 °C'de tutun. Fırını 60 °C'den (2 dakika bekleme) 10 °C/dakikada 180 °C'ye ve ardından 5 °C/dakikada 280 °C'ye programlayın, son tutma süresi 10 dakika olur.
4. Filtrelenmiş ekstrakttan 1 μL bölme modunda (10:1) enjekte edin ve 40–600 m/z aralığında kromatografi kaydedilir. Numune enjeksiyonundan önce bir çözücü boşluğu çalıştırın.
5. Spektrumları NIST kütle spektral kütüphanesiyle karşılaştırarak bileşikleri belirleyin ve tutma süresi ile zirve alan normalizasyonu kullanarak kimlikleri doğrulayın.

5. Anti-inflamatuar aktivite (karragenan kaynaklı pati ödemi)

1. 180–220 g ağırlığındaki sağlıklı Albino Wistar fareleri kullanın ve 7 gün boyunca alışma yapın. Deneyden önce gece boyunca hızlı hayvanlar ile serbest suya erişim.
2. Hayvanları rastgele beş gruba ayırın (n = 5 her grup). Kontrollere normal salin verilmesi; tedavi gruplarına oral olarak 100, 200 ve 300 mg/kg uygulanır; ve standart gruba diklofenak sodyum (40 mg/kg, deri altı olarak) verilecektir.
3. 1 saat sonra, sağ arka patinin subplantar bölgesine taze hazırlanmış %1 karragen enjekte edilsin.
4. 0, 1, 2, 3 ve 4 saat içinde dijital vernier kaliper kullanarak pati kalınlığını ölçün ve artışı taban değerine göre hesaplayın.
5. Ödemin inhibisyon yüzdesini kontrol grubu^{ile karşılaştırın: 10}.
   DIKKAT: Karragen tozu tahrişe neden olabilir. Soluma ve cilt temasından kaçının ve biyolojik atıkları kurumsal biyogüvenlik prosedürlerine uygun olarak bertaraf edin.

6. Analjezik aktivite (kuyruk daldırma testi)

1. 12 saatlik ışık/karanlık döngü altında tutulan alışkanlık Albino Wistar farelerini ücretsiz yiyecek ve suya erişimi olan kullanın.
2. Hayvanları beş gruba ayırın (n = 5). Kontrollere damıtılmış su verilmesi, tedavi gruplarına 100, 200 ve 300 mg/kg oranlarında oral olarak ekstraksiyon ve standart gruba parasetamol (20 mg/kg) verilmelidir.
3. Su banyosunu 55 ± 1 °C'de tutun. Distal kuyruğun 1–2 cm kısmını daldırın ve 15 saniyelik bir kesme süresiyle başlangıç çekilme gecikmesini kaydedin.
4. İşlemden sonra 30, 60, 90 ve 120 dakika sonra ölçümleri tekrarlayın, her seferinde aynı kuyruk kısmının suya daldığından emin olun.
5. Gecikmedeki yüzde artışı hesaplayın ve sonuçları SD ± ortalama olarak ifade edin.

7. Antiferetik aktivite

1. Alışmış sıçanları kullanın ve normal rektal sıcaklığı yağlanmış dijital termometre ile kaydedin.
2. %20 bira maya süspansiyonunu damıtılmış suya hazırlayın ve dorsuma 10 mL/kg ile deri altına enjekte ederek ateş oluşmasını sağlar.
3. 18 saat sonra tekrar rektal sıcaklık ölçülür ve en az 0,5 °C artışı olmayan hayvanları hariç tutun.
4. Ateşli sıçanları rastgele beş gruba ayırın (her grup başına n = 5). Kontrol grubuna normal tuzlu seriş, tedavi gruplarına oral olarak 100, 200 ve 300 mg/kg oranlarında bitki ekstraktı ve standart gruba parasetamol (150 mg/kg) verilmelidir.
5. Tedaviden 0, 1, 2 ve 3 saat sonra rektal sıcaklığı ölçün ve¹¹ temel değere göre azalmayı hesaplayın.
   DIKKAT: Brewer's maya süspansiyonları biyolojik malzemedir ve standart biyogüvenlik önlemleriyle işlenmelidir. Kullanılmayan askı ve kirlenmiş malzemeleri biyolojik atık olarak bertaraf edin.
   NOT: Maya enjeksiyonundan sonra, hayvanlar kafeslere geri döndürülebilir ve sıcaklık ölçümüne kadar standart koşullar altında tutulabilir.

8. Akut toksisite çalışmaları

1. Çalışmayı, Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü (OECD) 423 yönergesine uygun olarak, her iki cinsiyetten de 180–220 g ağırlığındaki sağlıklı Albino Wistar fareleri kullanılarak yapılmalıdır.
2. Hızlı hayvanları dozdan önce gece boyunca rastgele gruplara ayırın (n = 5 grup başı).
3. Tedavi hayvanlarına vücut ağırlığında 5 g/kg ağızdan tek doz ekstrakt ve kontrol hayvanlarına damıtılmış su (1 mL/kg) verilmelidir.
4. Dozdan sonraki ilk 4 saat boyunca hayvanları kesintisiz gözlemleyin, ilk 24 saat boyunca periyodik olarak ve 14 gün boyunca her gün gözlemleyin.
   NOT: Gözlem kriterleri arasında cilt ve tüy durumu, göz ve mukoza zarlarındaki değişiklikler, solunum düzeni, tükürük akıntısı, titremeler, krampsiyonlar, hareketli aktivite ve genel davranışsal tepkiler yer alır.
5. 0. gün, 7. ve 14. gün toksisite, ölüm ve vücut ağırlığı gibi klinik belirtileri kaydedin.
6. Hayatta kalma oranı ve gözlemlenen davranışsal veya fiziksel değişikliklere dayalı güvenliği^{değerlendirin 12}.
   NOT: Davranışsal puanlama, duruş, yürüyüş, aktivite seviyesi, bakım davranışı, dış uyaranlara yanıt ve halsizlik veya hiperaktivite belirtilerinin izlenmesini içerir.

9. İstatistiksel analiz

1. Tüm deneysel verileri derleyin ve sonuçları ortalama ± standart sapma olarak n = 5 hayvan olarak ifade edin.
2. Verileri GraphPad Prism yazılımına sütun formatında girin.
3. Karşılaştırmalı analiz uygulamadan önce Shapiro–Wilk testi kullanarak veri normalliğini değerlendirin.
4. GraphPad Prism yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın: Tek yönlü ANOVA → Tukey çoklu karşılaştırmalarını analiz →.
5. Gruplar arasındaki istatistiksel anlamlılığı belirlemek için tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey'nin post hoc çoklu karşılaştırma testini gerçekleştirin.
6. P < 0.05'te istatistiksel olarak anlamlı farkları ele alın.

Sonuçlar

Bu çalışmada tanımlanan deneysel yaklaşımlar, T. mantaly'nin metanolik ekstraktının hem fitokimyasal bileşimi hem de farmakolojik aktivitelerinin değerlendirilmesini mümkün kılan tekrarlanabilir in vitro ve in vivo veriler üretmiştir. Tüm deneysel ölçümler kopyalarda yapıldı ve sonuçlar ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunuldu. Gruplar arasındaki istatistiksel anlamlılık tek yönlü ANOVA ile belirlendi ve ardından Tukey'nin post hoc testi yapıldı; p < 0.05 anlamlı olarak değerlendirildi.

Tartışma

Bu çalışmada, fitokimyasal karakterizasyon ve in vivo farmakolojik modellerin birleşimi, T. mantaly'nin metanolik ekstraktının anti-inflamatuar, analjezik ve antipiretik potansiyeli değerlendirilmiştir. Kullanılan deneysel modeller, doğal ürün araştırmalarında yaygın olarak kullanılır ve biyolojik aktivitenin ön değerlendirmesi için pratik bir çerçeve sağlar.

Bileşiklerin tekrarlanabilir tutma süreleri, ekstraktın kimyasal karmaşıklığını destekler ve ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Albino Wistar fareleri	Kurumsal hayvan evi	Yok	Deneysel hayvanlar
Alüminyum klorür	Sigma-Aldrich	237051	Flavonoid testi
Brewer' mayaması	Sigma-Aldrich	YSC2	Pyrexia indüksiyonu
Carrageenan	Sigma-Aldrich	C1013	Paw ödemi indüksiyonu
Santrifüj	Eppendorf	5810R	Örnek işleme
Diklofenak sodyum	Sigma-Aldrich	D6899	Anti-inflamatuar standart
Dijital rektal termometre	Omron	MC-246	Rektal sıcaklık ölçümü
Dijital vernier kaliper	Mitutoyo	500-196-30	Paw kalınlığı ölçümü
Distile su	Şirket içi	Yok	Çözücü
Folin– Ciocalteu reaktifi	Sigma-Aldrich	F9252	Fenolik test
Gallik asit	Sigma-Aldrich	G7384	Fenolik standart
GC–MS sistemi	Agilent Teknolojileri	7890B– 5977A	Fitokimyasal profilleme
GraphPad Prizması	GraphPad Yazılımı	Sürüm 8.0	İstatistiksel analiz yazılımı
Metanol (HPLC sınıfı)	Merck	106009	Ekstraksiyon çözücüsü
Oral garaj iğnesi	Instech	FTP-20-38	Sözlü uygulama
Parasetamol	Sigma-Aldrich	P0300000	Analjezik ve antipiretik standart
Potasyum asetat	Merck	104820	Flavonoid testi
Döner evaporatör	Bü chi	R-200	Ekstrakt konsantrasyonu
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143	Flavonoid standardı
Sodyum karbonat	Merck	106392	Fenolik test
UV– Görünür spektrofotometre	Shimadzu	UV-1800	Soğurma ölçümü
Su banyosu (termostatik)	Memmert	WNB14	Kuyruk daldırma testi