Yöntem makalesi

Farelerde hem kısmi karotis ligasyonu hem de PCSK9'un aşırı ekspresyonuyla indüklenen ateroskleroz modeli

548 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69862

⸱

27 Şubat 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Department of Pathophysiology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Qinghai Cardio-Cerebrovascular Specialty Hospital, Qinghai High Altitude Medical Research Institute, 4Research Center of High Altitude Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Tekrarlanabilir bir fare modeli, PCSK9 adeno-ilişkili virüsü (PCSK9-AAV) - yüksek yağlı diyet aracılı hiperkolesterolemi ve kısmi sol karotis ligasyonu (PCL) ile insan patofizyolojisini birleştirerek karotis aterosklerozu indükler ve insan patofizyolojisini yeniden ortaya koyar. Bu yöntem, genomik düzenleme olmadan vahşi tip farelerde insan benzeri karotis aterosklerotik lezyonların hızlı bir şekilde indüklenmesini sağlar ve karotis ateroskleroz araştırmalarını kolaylaştıran standart bir araç sağlar.

Özet

Vahşi tip farelerde hızlı ve tekrarlanabilir karotis spesifik ateroskleroz modellerinin eksikliği, plak biyolojisi ve tedavilerinin translasyonel çalışmalarını sınırlar. Bu protokol, adeno-ilişkili virüs (AAV) aracılı PCSK9 aşırı ekspresyonu, aterojenik yüksek yağlı diyet ve sol kısmi karotis ligasyonu (PCL) kombinasyonuyla C57BL/6 farelerinde tekrarlanabilir karotis aterosklerozu indüklemek için genomik olarak düzenlenmemiş, zaman verimli bir yöntemi tanımlar. Amaç, genetik olarak değiştirilmiş hayvanlara ihtiyaç duymadan insan karotis hastalığının temel patofizyolojik özelliklerini - hiperlipidemi ve bozuk akışı - yeniden üreten standartlaştırılmış bir iş akışı sağlamaktır. Yöntemler arasında PCSK9-AAV dozlama ve uygulaması, perioperatif hazırlık, sol karotis bölgesinin adım adım cerrahi ligasyonu, ameliyat sonrası bakım, diyet rejimi, doku toplama ve Yağlı Kırmızı O ile Verhoeff-Van Gieson boyama dahil histolojik değerlendirme yer alır. Sonuçlar, referans değerlere kıyasla dolaşımdaki kolesterol ve düşük yoğunluklu lipoprotein seviyelerinin yükseldiğini göstermektedir. Sol ligated karotis arterde belirgin aterosklerotik plaklar gelişir; sağ ligasyonsuz kontrol arterine göre belirgin şekilde artan lipid birikimi ve önemli arterial intima-media kalınlaşması görülür. Bu standartlaştırılmış protokol, karotis plak oluşumu, ilerlemesi, müdahale stratejileri üzerinde çalışan araştırmacılar için tekrarlanabilirliği ve erişilebilirliği artırır ve deneysel tedavilerin laboratuvarlar arası karşılaştırmalarını kolaylaştırır.

Giriş

Kardiyovasküler hastalıklar (KARDI-DV) küresel ölümlerin başlıca nedeni olmaya devam eder; ateroskleroz bunların ortak patolojik temelinioluşturur 1. Karotis arteri, aterosklerotik lezyonlar için kritik bir yerdir; Karotis aterosklerozun incelenmesi, YÖĞÜ-SÜĞ hastalıklarının patogenezini anlamak ve terapötik stratejiler geliştirmek için gereklidir2. Hayvan modelleri, in vivo ateroskleroz araştırmaları için vazgeçilmez araçlardır, ancak mevcut modellerin kolaylık ve insan patofizyolojik özelliklerini yeniden yansıtma yeteneği açısından sınırlamaları sıklıkla vardır.

Diğer arter bölgelerindeki ateroskleroza (örneğin, aorta, femoral arter) kıyasla, karotis aterosklerozun oluşumu hemodinamikten daha güçlü şekilde etkilenir. Karotis arter yüksek kayma stresi (10-15 dyn/cm², dynes per santimetre) yaşar; bu stres sadece koroner arter (6-45 dyn/cm²)3 sonra gelir. Özellikle karotis bifurkasyonunda, bozuk ve salınımlı kesme gerilimiyle karakterize edilen girdap akışı meydana gelir. Bu anormal hemodinamik ortam, yerel endotel hücrelerinin sürekli pro-inflamatuar aktivasyonunu tetikler; bu da yapışma moleküllerinin ve kemokinlerin yukarı regulasyonlu ekspresyonuyla karakterize edilir; bu da monositlerin katılımını kolaylaştırır veaterosklerozun başlamasını sağlar 3. Ayrıca, yüksek riskli insan karotis aterosklerotik lezyonlarında genellikle %70'in üzerinde bir stenoz oranı bulunur; bu, plak nedeniyle oluşan luminal çapın yüzde azalmasıolarak tanımlanır. 4. Bu nedenle, şiddetli aterosklerotik stenoz oluşturabilen hayvan modelleri önemlidir.

Kısmi karotis ligasyon (PCL) modeli, kalıcı kan akışı bozukluğu nedeniyle indüklenen ateroskleroz modelidir ve kısa modelleme süresi ile şiddetli lezyonlar avantajlarına sahiptir5. Apolipoprotein E (ApoE), dolaşımdaki kolesterol ve trigliserit açısından zengin lipoproteinlerin metabolizması ve temizlenmesinde rol alan kilit bir proteindir ve plazma lipid homeostazının korunmasında kritik rol oynar. Ancak, ApoE-knockout (ApoE⁻/⁻) fareleri kullanan geleneksel PCL modeli,5 fare oluşturmak zor ve maliyetlidir. Hedef gen etkisi gerektiğinde, hem hedef gen hem de ApoE geninin çift genli bayıltılması gereklidir ve bu da modelleme sürecini daha da karmaşıklaştırır. Buna karşılık, PCL için yalnızca vahşi tip C57BL/6 fareleri kullanıldığında, model insan aterosklerozu için temel bir risk faktörü olan hiperkolesterolemi içermez ve nadiren belirgin lipid açısından zengin aterosklerotik lezyonlaroluşturur 6,7. Yüksek yağlı diyetle (HFD) beslenen ApoE⁻/⁻ veya LDLR-knockout (LDLR⁻/⁻) fareleri gibi diğer modeller, ateroskleroz araştırmalarında aort aterosklerozunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna rağmen, bu modeller bozulmuş kan akışının etkisini dikkate almamakta ve kısa sürede şiddetli ateroskleroz oluşturamaz. Önceki çalışmalar, 3 aylık HFD beslenmesinden sonra, ApoE⁻/⁻ veya LDLR⁻/⁻ farelerinde sadece aort veya brakiosefalik arter bölgelerinde hafif aterosklerotik plaklar geliştirdiğini, oysa karotis arterlerde belirgin plaklezyonları oluşmadığını göstermiştir 8,9.

Proprotein dönüştürücü subtilisin/kexin tip 9 (PCSK9), düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol (LDL-C) metabolizmasının önemli bir düzenleyicisidir: LDL reseptörlerinin bozulmasını teşvik eder ve böylece serum LDL-Cseviyelerini 10 artırır. PCSK9 (PCSK9-AAV) eksprese eden rekombinant adeno-ilişkili virüs, WT farelerinde genetik modifikasyonlara gerek kalmadan doz kontrollü hiperkolesterolemi sağlar11. PCSK9-AAV kaynaklı hiperkolesterolemi, HFD (lipid metabolizması bozukluklarını daha da kötüleştiren) ve PCL (lokal hemodinamik bozukluğu indükleyen) birleştirilmesi, insan aterosklerozu için iki ana risk faktörünü içeren bir hayvan modelinin oluşturulmasına olanak tanır: hiperkolesterolemi ve akış bozukluğu.

Önceki araştırmailerlemesi 12 üzerine inşa edilen bu protokol, C57BL/6 farelerinde karotis aterosklerozu indüklemek için standartlaştırılmış bir yöntem oluşturur. Mevcut model protokolleriyle karşılaştırıldığında, üç temel avantaj sunar: (1) Patofizyolojik önem: Aynı anda hiperkolesterolemi ve akış bozukluğunu tekrar eder; bu da orta-geç evre insan aterosklerozuna benzer özellikler gösteren karotis lezyonlarına yol açar; (2) Tekrarlanabilirlik: AAV dozajı, cerrahi prosedürler ve diyet kontrolünün ayrıntılı parametrizasyonu, laboratuvarlar arası değişkenliği azaltır; (3) Zamanlılık: Toplam modelleme süresi 5 haftadır ve model kurulumu için gereken süreyi önemli ölçüde kısaltır.

Bu protokol, damar duvarı biyolojisi üzerinde çalışan araştırmacılar için uygundur; antiaterosklerotik ilaçların etkinliğini değerlendiren ve aterosklerozda hemodinamik ile lipid metabolizması arasındaki etkileşimi araştıran araştırmacılar için uygundur. Özellikle, bu protokol karotis odaklı bir modeldir ve sigara, diyabet, hipertansiyon ve obezite dahil ancak bunlarla sınırlı olmak üzere sistemik insan risk faktörlerinin tüm yönlerini tam olarak kopyalayamaz. Aşağıda model oluşturma ve lezyon değerlendirmesi için adım adım bir rehber yer almaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm prosedürler, Pekin Birliği Tıp Fakültesi Hayvan Etik Komitesi'nin Hayvan Etik Komitesi (ACUC-A02-2024-006) tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uygundur.

1. Deneysel hayvan hazırlığı

  1. 6-8 haftalık erkek C57BL/6 fareleri satın alın (vücut ağırlığı: 22-25 g).
  2. Sıçrayı, belirli bir patojensiz (SPF) ortamda, sıkı kontrollü koşullarda ev sahipliği yapar: sıcaklık (23 ± 1°C), nem (%50 ± 5) ve 12 saat ışık/karanlık döngü (aydınlatma: 07:00-19:00).
  3. Deneyden önce, farelere standart bir yemek diyeti (%10 yağ enerji oranı) ve steril su, ücretsiz yiyecek ve suya erişim sağlayan 1 haftalık bir alışma süreci sunun.

2. PCSK9 -AAV'nin hazırlanması ve uygulanması

DIKKAT: AAV'yi biyogüvenlik tehlikesi olarak ele alın ve tüm işlemleri uygun kurumsal biyogüvenlik seviyesi (genellikle BSL-2) altında yürütün. Çift eldiven, göz koruma ve koruyucu giysiler giyin. Kullanım sırasında aerosol oluşumundan kaçının. AAV ile kirlenmiş malzemeleri uygun dezenfektanlarla (örneğin %10 çamaşır suyu açıcı) dezinfekte edin ve açıkça tanımlanmış sorumluluk ile olay müdahale protokollerini takip edin. Virüsle kirlenmiş tüm atıklar, klor içeren dezenfektanlara daldırarak inaktive edilmelidir.

  1. Rekombinant PCSK9-AAV satın alın (rAAV8-HCRApoE/hAAT-D377Y-mPCSK9).
  2. CMV promotörünü hedefleyen nicel gerçek zamanlı PCR ile AAV titresini doğrulayın: nihai titre 6.10×10¹³ vg/mL (mililitre başına vektör genomları) idi. AAV'yi -80°C'de sakla ve tekrar eden donma-erime döngülerinden (≤3 donma-erime döngüsünden) kaçın.
  3. AAV'yi buzda 15-20 dakika eritin, ardından santrifüj tüpünü 3-5 kez nazikçe ters çevirerek karıştırın (vortexlemeyi önleyin).
  4. PCSK9-AAV'yi steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ile fare başına 2×10¹¹ vg/200 μL nihai konsantrasyona kadar seyreltirin.
  5. Kuyruk damarı enjeksiyonu ile uygulanır (damar): Fareyi damar görselleştiren fare kuyruğu enjeksiyon tutucusuyla sabitleyin ve yavaşça 200 μL seyreltilmiş AAV insülin şırıngasıyla enjekte edin (enjeksiyon oranı: 10 μL/s). Enjeksiyon zaman noktası PCL'den 1 hafta öncedir (Şekil 1A).

3. Kısmi karotis ligasyonu için ameliyat öncesi hazırlık

DIKKAT: Tribromoetanol aşırı doz riski taşıyan kontrollü bir reaktiftir. Vücut ağırlığına göre sıkı şekilde uygulayın, tekrar enjeksiyonlardan kaçının ve dozlama süresi ile hacmini doğru şekilde belgeleyin. Kilitli bir kapta saklanın ve hazırlık ile kullanım yalnızca eğitimli personel tarafından yapıldığından emin olun. Şüpheli aşırı doz durumunda, acil durum yönetimini başlatın ve olayı belgeleyin.

  1. Fareleri, düz refleks kaybolana kadar (yaklaşık 2-3 dakika) intraperitoneal tribromoetanol (%2,5 Avertin, 0,18 mL/10 g) enjeksiyonu ile anestezi yapın. Sonra fareyi bir ısıtma pedine (37 ± 0.5°C) aktarın. Anestezi etkisini parmakları sıkıştırarak kontrol et.
    NOT: Anestezi, başarılı bir cerrahi için kritik öneme sahiptir. Anestezi risklerini en aza indirmek için birden fazla anestezi enjeksiyonundan kaçınılmalıdır. Ameliyat başlamadan önce, anestezi dozu beklenen cerrahi süreye göre belirlenmelidir. Ayrıca, uzun süreli işlemlerle ilgili riskleri azaltmak için her farenin ameliyat süresinin <30 dakika olması önerilir.
  2. Ameliyat sırasında, farenin solunum hızını (normal: 40-60 nefes/dakika) ve plantar refleksini kontrol edin; arka pati pedini her 5 dakikada bir pensle nazikçe sıkıştırın.
  3. Farenin ön servikal cildine depilasyon kremi iyice uygulayın. 2-3 dakika sonra, ön servikal tüyleri pamuk çubuklarıyla çıkarın ve kalan tüyleri normal salinle temizleyin. Açıkta kalan cildi %5 povidon-iyot ile üç kez dezenfekte edin.
  4. Aseptik fare odasında bir biyogüvenlik kabinde ameliyat yapın. Cerrahi alanı ultraviyole ışıkla sterilize ederek asepsi mümkün olduğunca koruyun ve tüm metal aletleri otoklav yapın.
    NOT: Aseptik bir ortam ve kapsamlı dezenfekte cerrahi hayatta kalma ve fare fizyolojik stabilitesi için gereklidir.

4. Kısmi karotis ligasyonu - cerrahi işlem

  1. Farenin boynunda steril cerrahi makasla yaklaşık 1,0-1,5 cm uzunluğunda bir orta hat kesi yapın; Sol ortak karotis arteri (LCCA) ortaya çıkmak için deri altı dokuları ve sternokleidomastoid kası kör forseps ile ayrı bırakın.
    NOT: Ameliyat bölgesi, damar/doku kuruluğundan kaynaklanan ek travmaları önlemek için sürekli ısıtılmış normal salinle nemlendirilmelidir.
  2. LCCA'yı vagus sinirinden (arterin bitişiğinde bulunan) kesik şekilde ayırarak vagus sinirine zarar vermemek için (bu solunum depresyonuna neden olabilir).
  3. LCCA boyunca yukarıya doğru diseksiye ederek iç karotis arter (ICA), dış karotis arter (ECA), oksipital arter (OA) ve üst tiroid arteri (STA) ortaya çıkarın (Şekil 1B).
  4. STA üzerindeki sol dış karotis arteri bağlamak için 6-0 steril ipek dikişler kullanın. Sonra, ICA ve OA köklerini aynı anda bağlamak için başka bir 6-0 steril ipek dikiş kullanın.
    NOT: Sinirleri ve çevresindeki diğer dokuları bağlamaktan kaçının. ECA/ICA/OA'nın şant akışını tamamen engelleyin ve LCCA'da belirli bir derecede retrograd akışı korursunuz. Ligasyon etkisi, kanama/kan akışı durumu ve distal arter nabız gözlemlenerek değerlendirilmelidir.
  5. Ameliyat bölgesinde kanamayı kontrol edin. Kanama olursa, steril pamuklu çubuklarla 30-60 saniye boyunca nazikçe bastırarak hemostaz sağlanır. Deriyi doku yapışkanı veya cerrahi dikiş ile dikin.
    NOT: Deri altı dokuya aşırı doku yapışkanının sızmasını önleyin.

5. Kısmi karotis ligasyonu sonrası bakım ve yüksek yağlı diyet müdahalesi

  1. Ameliyat sonrası sıvı değişimi için intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 0,5 ml sıcak normal salin uygulanır.
  2. Ağrıyı ameliyattan hemen sonra ve ameliyattan 12 saat sonra deri altı meloksikam (0,1 mg/kg) enjeksiyonuyla hafifletebilirsiniz.
  3. Fareyi düzeltme refleksi geri kazanana kadar (yaklaşık 15-30 dakika) ısıtılmış bir kurtarma kafesine (37°C) yerleştirin. Ameliyattan sonraki 24 saat içinde fareyi anormal davranışlar (örneğin, halsizlik, nefes nefesi) açısından izleyin.
  4. Veterinerlerin önerisine göre, ameliyat sonrası enfeksiyonu önlemek için antibiyotik içeren içme suyu gibi antibiyotik sağlamak için ameliyattan sonraki 7 gün boyunca antibiyotik içme suyu verin.
  5. Lezyon değerlendirmesine kadar (ameliyattan 4 hafta sonra) Batı tarzı HFD ile (%40 yağ enerji oranı ve %1,25 kolesterol içeriğiyle) besleyin.
    NOT: HFD'yi yağ oksidasyonunu önlemek için 4°C'de saklayın ve açıldıktan sonraki 2 hafta içinde kullanın. HFD'yi her 2 günde bir değiştirin ve tazeliği sağlamak için farelerin günlük beslenme alımını izleyin (normal gıda alımı: fare başına yaklaşık 4-5 g günde bir alın). HFD beslemesinin PCSK9-AAV kaynaklı hiperkolesterolemi ile senkronize edilmesi, karotis arterde lipid birikimini maksimize eder; HFD'nin başlanmasını geciktirmek lezyonun şiddetini azaltır.

6. Örnek toplama ve işleme

DIKKAT: Paraformaldehit zehirli buharlar yayar. Hazırlık, kullanım ve çıkarma işlemleri, uygun PPE (eldiven, koruma gözlüğü ve laboratuvar önlüğü) giyilirken kimyasal bir duman davlumonunda yapılmalıdır. Atıkları, yerleşik nötrasyon ve kimyasal atık toplama prosedürleriyle bertaraf etmektedir. Fiksatörler nötralize edilip kurumsal sıvı atık bertaraf protokollerine uygun olarak merkezi olarak toplanmalıdır.

NOT: Bu çalışmadaki insan karotis aterosklerotik örnekleri, karotis arter stenozu olan ve karotis endarterektomi geçiren hastalardan alınmıştır. Bu çalışma, Helsinki Bildirgesi ile uyumludur ve Pekin Birliği Tıp Fakültesi Hastanesi (PUMCH) Kurumsal Etik İnceleme Kurulu tarafından onaylandı (No. JS-2966). Tüm çalışma katılımcıları yazılı bilgilendirilmiş onay sağladı.

  1. Ameliyattan 4 hafta sonra, sireleri intraperitoneal tribromoetanol enjeksiyonuyla anestezi edin.
  2. Anestezi altındaki farelerde çift taraflı torakotomi yapın ve kan lipid testleri için kan örnekleri almak üzere kalbi delin. Daha sonra, sol ventriküle 20 mL buz gibi soğuk PBS ile perfüze edilip, kan damarlarından kalan kanı 3-6 mL/dakika hızla boşaltır. Perfüzyon tamamlanmasının görsel göstergesi olarak doku rengindeki değişiklikleri gözlemleyin.
    NOT: Kurumsal etik/düzenlemeler tarafından izin verilirse, alternatif yöntemler açıkça belirtilip yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) gerekliliklerine uygun şekilde uygulanırsa kullanılabilir. Hayvan leşleri, biyoatık düzenlemelerine uygun olarak kurumsal veteriner ekibi veya yetkili yükleniciler tarafından yakılması veya onaylı biyolojik tehlike bertaraf prosedürleriyle işlenmelidir.
  3. Karotis arterleri kalp ile birlikte disek ve toplayın, iki taraflı karotis arteri mikroskop altında izole edin ve 4°C'de %4 paraformaldehit (PFA) ile 24 saat boyunca sabitleyin.
  4. Sabit karotis arteri %30 sucrose çözeltisine (PBS'de çözünmüş) aktarın ve 4°C'de 24 saat boyunca kuluçka yapın (doku batana kadar). Arteri optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömüp -80°C'de sakla.
  5. Sol ortak karotis arterinin 5 μm kalınlığında kesitlerini kesmek için kriyostat kullanın (kesit konumu: ligasyon bölgesine 1 mm yakın; kesme sıcaklığı: -20°C ~ -22°C, doku su içeriğine göre ince ayar). Önceden soğutulmuş ince bir fırça kullanarak, bölümü nazikçe kriyostatın anti-roll plakasına aktararak düz durmasını sağlar. Poli-L-lizin kaplamalı bir sürgüyü neredeyse dikey bir açıyla tutun ve onu bölüme yavaşça temas ettirin.
    NOT: Perfüzyon adımı, kalıntı kanın alınması için kritiktir; aksi takdirde, lezyon lekelenmesine engel olur. Ötenazi sonrası 30 dakika içinde tamamen arterial fiksasyonu doku morfolojisini korumak için gereklidir.

7. Aterosklerotik lezyon değerlendirmesi 1 - Yağ Kırmızı O boyama

  1. Bölümleri oda sıcaklığında (20-25 °C) 30 dakika boyunca hava kurutma; %60 izopropanolde 1 dakika bekletin, ardından Yağlı Kırmızı O çalışma çözeltisinde (%60 izopropanol ile 3:2 seyreltilmiş) oda sıcaklığında (20-25 °C) 10 dakika kuluçka yapın.
  2. Slaytı tamamen %60 izopropanol içinde oda sıcaklığında ~5-10 saniye boyunca nazikçe çaltarak ayırt et; 30 saniye boyunca hematoksilinle boyama; Musluk suyu ile 5 saniye boyunca durulayın (hücre çekirdeklerini mavi etmek için).
  3. Slayt tarayıcı veya optik mikroskop ile 5x, 10x ve 20x büyütme ile kesit görüntüleri yakalamak; ImageJ yazılımı (Sürüm 1.54p) kullanarak lipid birikme alanını nicel olarak analiz eder - Yağ Kırmızısı O pozitif alanın toplam intimal alana göre yüzdesini hesaplar.
  4. Görüntü J nicellendirme prosedürleri
    1. Görüntüyü aç; Intima-Media alanını manuel olarak çizmek için Freehand Selection aracını seçin. Analiz > Araçlar > ROI Manager bölümüne gidin ve Ekle'e tıklayın.
    2. Görüntü > Renk Eşiğini >Ayarlayın; Ton ve Parlaklık parametrelerini Yağ Kırmızısı O-pozitif bölgelerle uyumlu hale getirin. Select'e tıklayın, sonra ROI Yöneticisi'ne Ekle.
    3. Hem intima-media ROI'sini hem de lekelenmiş ROI'yi seçin, AND tuşuna tıklayarak intima-media bölgesinde Yağ Kırmızısı O-pozitif alanını elde edin.
    4. Intima-media ve Oil Red O-pozitif bölgelerin alanlarını hesaplamak için Add ve Measure tuşuna tıklayın.
    5. Hesaplama formülü:
      Yağlı Kırmızı O alanı (%) = (Yağlı Kırmızı O_positive_area / intimal_media_area) × 100

8. Aterosklerotik lezyon değerlendirmesi 2 - Verhoeff'in Van Gieson boyama

  1. Slaytlarda OCT bileşik gömülü donmuş bölümleri alın.
  2. Kaydırakları oda sıcaklığında (20-25°C) damıtılmış suya 10-15 dakika boyunca batırın; nazikçe çalkalayın (2-3 kez) ve OCT bileşiği tamamen çözülür.
  3. OCT bileşiği içeren suyu atın, ardından kalan OCT bileşiğini çıkarmak için bölümleri taze damıtılmış suyla 2 dakika boyunca durulayın.
  4. Bölümleri Verhoeff boyasında (hematoksilin, iyot ve ferrik klorür içeren) oda sıcaklığında (20-25°C) 15 dakika kuluçka edin; inkubasyon sırasında sürgü rafını 2-3 kez nazikçe sallayarak eşit bir boyama sağlanır.
  5. Bölümleri iki kez, her seferinde 10 saniye damıtılmış suyla hızlıca durulayın.
  6. %2 ferrik klorür çözeltisinde 30-60 saniye diferensiya edilir; Elastik lifler mavi-siyah ve arka plan gri görünene kadar mikroskop altında gözlemleyin. İki kez, her seferinde 1 dakika boyunca damıtılmış suyla durulayın.
  7. Bölümleri %5 sodyum tiosülfat çözeltisinde 1-2 dakika boyunca işleyip kalan iyotu çıkarın.
  8. 2 dakika boyunca damıtılmış suyla durulayın, ardından Van Gieson boyama (asit fuşsin + pikrik asit) ile 5 dakika boyunca karşı boyama uygulayarak kolajen liflerini parlak kırmızıya boyayabilirsiniz.
  9. %95 etanol (iki kez, her biri 1 dakika) ve %100 etanol (iki kez, her biri 1 dakika) ile sıralı olarak kurutun; 5 dakika boyunca ksilen içinde şeffaf olur; Bölümler sentetik reçine montaj ortamı kullanılarak örtü kaydırıldı.
  10. Bölüm görüntüleri yakalamak; Dijital görüntü analiz yazılımı kullanarak plakların intima-media kalınlığını veya intimal kalınlığını dört yönde (ön, arka, sol, sağ) uzunluk ölçüm aracıyla ölçün ve ardından ortalama değeri hesaplayın.
    1. Slaytı açın, hedef geminin kesit alanına yakınlaştırın ve Ölçüm Aracı'na tıklayın.
    2. İntim/ortamın iç ve dış kenarlarını ön, arka, sol ve sağ yönlerde sırayla tıklayın ve dört kalınlık değerini kaydedin.
    3. Ortalama değeri hesaplayın ve ölçümleri kaydedin.
      Ortalama değer = (ön + arka + sol + sağ) ÷ 4

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yağ Kırmızı O boyama sonuçları, bağlanmış arterlerde şiddetli aterosklerotik plak oluşumu, belirgin lipid çekirdekleri ve nekrotik alanlar göstermiştir. Sol karotis arteride lipid bölgelerinin oranı, sağ karotis arter kontrolüne göre anlamlı derecede yüksekti (p < 0.001) (Şekil 2A). VVG boyama, intimada elastik liflerin yok olması veya yok olması, plak intimasında önemli ölçüde kalınlaşma ortaya çıkardı. Sol karotis arter kontrolüne kıyasla hem intima-media ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, PCSK9-AAV kaynaklı hiperkolesterolemi, yüksek yağlı diyet (HFD) ve ortak karotis arterinin kısmi ligasyonu (PCL) birleştirilerek C57BL/6 farelerinde karotis ateroskleroz modeli oluşturmak için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar.

ApoE -/- veya LDLR-/- gibi geleneksel modellerle veya WT fare5 kullanan PCL modelleriyle karşılaştırıldığında, bu model ateroskleroz araştırmalarında benzersiz avantajlar sunar. İlk o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82470516, 8227022021), Merkezi Üniversiteler için Özel Araştırma Fonu, Pekin Birliği Tıp Fakültesi (3332025111), Ulusal Yüksek Düzey Hastane Klinik Araştırma Fonu (2025-PUMCH-A-181, 2025-PUMCH-D-001) ve Sichuan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2024NSFC0715) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6-0 steril naylon dikişJinhuan TıpF602NA
C57BL/6 fareleriŞanghay Model Organizmalar Merkezi, Inc. (SMOC)SM-001NA
Yemeklik deitXietong BiyografisiHayır. XT93GNA
Cryostat Leica CM1950NA
Yıkıcı kremVeetRB Health LLCNA
Yüksek yağlı diyetXietong BiyografisiXT108cNA
EKIM'DENSakura4582NA
Yağlı Kırmızı O Çözeltisiservicebio G1017-100mLNA
Optik mikroskopLeicaDM4BNA
Paraformaldehit Servicebio G1101-500mLNA
PCSK9-AAVWZBioscience AV208001-AV8NA
Poli-L-lizin kaplamalı kaydıraklarSigmaP0425NA
Kaydırma tarayıcı3DHISTECHPannoramik TARAMANA
SülfametoksazolSelleckS1915 NA
Doku yapıştırıcısı3M Vetbond1469SBNA
Damar görselleştirme fare kuyruğu enjeksiyon tutucusu Jinan Yiyan Bilim & Teknoloji Geliştirme Şirketi, LtdYLS-Q9GNA

Kaynaklar

  1. Vaduganathan, M., Mensah, G. A., Turco, J. V., Fuster, V., Roth, G. A. The global burden of cardiovascular diseases and risk: A compass for future health. J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2361-2371 (2022).
  2. Saba, L., et al. Carotid artery atherosclerosis: Mechanisms of instability and clinical implications. Eur Heart J. 46 (10), 904-921 (2025).
  3. Soehnlein, O., Lutgens, E., Döring, Y. Distinct inflammatory pathways shape atherosclerosis in different vascular beds. Eur Heart J. 46 (33), 3261-3272 (2025).
  4. Aburahma, A. F., et al. Society for vascular surgery clinical practice guidelines for management of extracranial cerebrovascular disease. J Vasc Surg. 75 (1s), 4s-22s (2022).
  5. Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), e1861(2010).
  6. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
  7. Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), e66-e73 (2010).
  8. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. Apoe-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14 (1), 133-140 (1994).
  9. Ma, Y., et al. Hyperlipidemia and atherosclerotic lesion development in ldlr-deficient mice on a long-term high-fat diet. PLoS One. 7 (4), e35835(2012).
  10. Maxwell, K. N., Fisher, E. A., Breslow, J. L. Overexpression of pcsk9 accelerates the degradation of the ldlr in a post-endoplasmic reticulum compartment. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (6), 2069-2074 (2005).
  11. Keeter, W. C., Carter, N. M., Nadler, J. L., Galkina, E. V. The aav-pcsk9 murine model of atherosclerosis and metabolic dysfunction. Eur Heart J Open. 2 (3), oeac028(2022).
  12. Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in c57bl6 mice by overexpressing aav-mediated pcsk9 and partial carotid ligation. Lab Invest. 97 (8), 935-945 (2017).
  13. Gogulamudi, V. R., Durrant, J. R., Adeyemo, A. O., Ho, H. M., Walker, A. E., Lesniewski, L. A. Advancing age increases the size and severity of spontaneous atheromas in mouse models of atherosclerosis. Geroscience. 45 (3), 1913-1931 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

PCSK9 A r fadesiY ksek Ya l DiyetC57BL 6 FareleriAdeno li kili Vir sPlak Olu umuOil Red O BoyamaVerhoeff Van Gieson BoyamaHiperlipidemi

İlgili makaleler